WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

  СЯСИНА

Татьяна  Владимировна

ОСОБЕННОСТИ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ  КЛЕТОК  КОСТНОГО  МОЗГА  У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ

14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика

14.01.21    гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2012

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. 

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор

Козлов Антон Владимирович

доктор медицинских наук профессор

Бессмельцев Станислав Семенович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доцент кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики  Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова АНТОНОВ Виктор Георгиевич;

доктор медицинских наук профессор кафедры последипломного медицинского  образования медицинского факультета Санкт-Петербургского Государственного университета БОГДАНОВ Александр Николаевич.

Ведущая организация: медицинский центр «ФГУЗ Центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова МЧС России».

Защита состоится 27 ноября 2012 года в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.08 при ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ.

Автореферат разослан «____» октября 2012 года

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук, профессор

  Митин Юрий Алексеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Хронический миелолейкоз (ХМЛ) представляет собой клональное миелопролиферативное заболевание, возникающее вследствие реципрокной транслокации t(9;22)(q34;ql1) между хромосомами 9 и 22. В результате данной транслокации на 22 хромосоме образуется химерный ген BCR-ABL, кодирующий синтез белка с высокой тирозинкиназной  активностью [Pellicano F. et al.,  2011]. Заболеваемость ХМЛ в мире составляет 1 – 2 случая на 100 тыс. населения [Ries  L.A.G. et al.,  2004].

Долгое время лечение заболевания оставалось малоэффективным и позволяло лишь несколько снизить объем опухолевой массы [Абдулкадыров К.М. и др., 1998]. Применение цитостатических препаратов (бусульфан, гидроксимочевина) позволило увеличить выживаемость больных в среднем до 3-5 лет в хронической фазе болезни, не оказывая влияния на продолжительность жизни в фазе акселерации и бластного криза [Fausel C., 2007]. Аллотрансплантация  гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК) стала важным этапом в лечении больных ХМЛ. Тем не менее, проведение  аллоТГСК у большинства больных затруднено из-за высокого риска осложнений [Туркина А.Г. и др., 2003; Moen M.D. et al., 2007].

Новой эпохой в терапии больных ХМЛ стали препараты, обладающие способностью ингибировать реакции фосфорилирования специфических белков в опухолевой клетке. Один из представителей данной группы препаратов иматиниб – ингибитор BCR-ABL тирозинкиназы, в настоящее время является препаратом первой линии терапии у больных ХМЛ [Baccarani M. et al., 2009]. Несмотря на высокую эффективность иматиниба, у части больных не  удается  получить  полный  цитогенетический ответ. Другой проблемой является развитие невосприимчивости у определенной части больных. В связи с этим не теряет актуальности проблема поиска путей преодоления резистентности к препаратам, используемым для лечения ХМЛ, в частности к иматинибу [O’Hare T. et al., 2009; Eiring A.M. et al., 2011].

Торможение апоптоза является механизмом, путем которого опухолевые клетки приобретают устойчивость к лекарственным препаратам [Владимирская Е.Б., 2002]. Противоопухолевые эффекты иматиниба связывают с его способностью угнетать пролиферативную активность опухолевых клеток и восстанавливать апоптотическую активность клеток [Chomel J.C. et al., 2011]. Полагают, что иматиниб принимает участие в блокаде антиапоптотических сигналов не только на уровне протеинкиназ (тирозинкиназа BCR-ABL, c-Kit и PDGFR), но и на уровне сигнальных путей, подавляющих апоптоз, в частности RAS и STAT  [Kantarjian H.M. et al., 2011]. 

В механизме действия иматиниба важная роль отводится его способности угнетать процессы обмена глюкозы опухолевыми клетками  [Gottschalk S. et al., 2004]. Изучение апоптоза на клеточных культурах с помощью набора классических биохимических, микроскопических и современных методов (проточной цитометрии и полимеразной цепной реакции) позволило связать гибель опухолевых клеток с нарушением процессов утилизации глюкозы под влиянием иматиниба [Giuntoli S. et al., 2011]. Полагают, что он замедляет поступление глюкозы в клетку, способствует её перераспределению между различными метаболическими путями [Kominsky D.J. et al., 2009].

Тем не менее, механизмы вмешательства иматиниба в обмен глюкозы в опухолевых клетках выяснены недостаточно. Ряд авторов утверждают, что иматиниб эффективно подавляет метаболизм глюкозы, замедляет рост злокачественных клеток и угнетает их пролиферативную активность за счет индукции апоптоза [Cullinane  C. et al., 2005; Giuntoli S. et al., 2011]. В экспериментах на клеточных культурах было показано параллельное снижение активности Bcr-Abl, скорости поглощения глюкозы и увеличения апоптотической активности клеток [Barnes K. et al., 2005].

В то же время, остаются практически неизученными взаимоотношения между способностью злокачественных клеток к восстановлению апоптоза и  потреблением ими глюкозы у больных хроническим миелолейкозом. Нет ответа на вопрос, могут ли быть использованы в диагностических и прогностических целях показатели апоптоза и потребления глюкозы клетками костного мозга как лабораторные маркеры для оценки эффективности лечения больных ХМЛ. Решение этого  вопроса  будет способствовать выбору наиболее целесообразных схем терапии, и в ряде случаев, индивидуализации терапии. 

Цель исследования

Изучить апоптотическую активность клеток костного мозга и их способность к поглощению глюкозы у больных хроническим миелолейкозом и оценить значимость этих лабораторных маркеров для диагностики и прогнозирования течения заболевания. 

Задачи исследования

  1. Сравнить результаты определения апоптоза в клетках костного мозга у больных хроническим миелолейкозом двумя методами: флуоресцентной микроскопией и проточной цитометрией. 
  2. Сопоставить  процессы спонтанного и индуцированного апоптоза  в  клетках  костного  мозга  с их способностью поглощать глюкозу у больных хроническим миелолейкозом в разных фазах заболевания.
  3. Изучить динамику изменения количества акридин связывающих  клеток и скорость поглощения ими глюкозы при положительном ответе на проводимую  терапию у больных хроническим миелолейкозом. 
  4. Выяснить влияние иматиниба на апоптоз и потребление глюкозы клетками костного мозга у больных хроническим миелолейкозом в разных фазах заболевания. 
  5. Установить значимость апоптоза  в  клетках  костного  мозга и их способность к поглощению глюкозы для оценки эффективности направленной терапии и прогнозирования течения хронического миелолейкоза.

Научная новизна

Впервые на достаточном клиническом материале, включающем 95 больных ХМЛ, в клетках костного мозга изучены апоптотическая  активность и скорость поглощения глюкозы  на фоне лечения иматинибом.

Установлено, что способность клеток вступать в апоптоз и интенсивность поглощения глюкозы клетками костного мозга  взаимосвязаны и значительно различаются в хронической фазе, фазе акселерации и бластного криза.

Получены доказательства того, что минимальная скорость апоптотических реакций опухолевых клеток у нелеченных больных в хронической фазе и фазе акселерации существенно отличаются при сравнении с больными в фазе бластного криза,  в то время как максимальная скорость поглощения глюкозы одинакова.

Показано, что максимальная скорость апоптотических реакций и минимальное поглощение глюкозы клетками костного мозга наблюдается у больных в хронической фазе, находящихся в полной цитогенетической ремиссии. 

Получены новые данные о прогностическом потенциале апоптоза опухолевых клеток у больных хроническим миелолейкозом, леченных иматинибом. Изучение характера апоптотических реакций в клетках костного мозга по связыванию ими акридин оранжа в сочетании с количественной оценкой их способности поглощать глюкозу позволяет выделить больных с благоприятным ответом на проводимое лечение или прогнозировать дальнейшее развитие заболевания в фазу акселерации и бластного криза.

Практическая значимость

Полученные данные о прогностическом значении апоптоза клеток костного мозга диктуют целесообразность включения исследования скорости спонтанного и индуцированного апоптоза опухолевых клеток в сочетании с определением интенсивности потребления глюкозы в алгоритм обследования больных хроническим миелолейкозом.

Использование результатов исследования апоптоза клеток костного мозга у больных хроническим миелолейкозом может способствовать раннему выявлению прогрессии заболевания и химиорезистентности, а также делению больных на группы риска, что важно для выбора адекватной терапии.

Данные о характере апоптотических реакций в клетках костного мозга в сочетании с количественной оценкой их способности поглощать глюкозу позволяют выделить пациентов с неблагоприятным течением  хронического миелолейкоза.

Положения, выносимые на защиту

    1. Способность клеток костного мозга вступать в апоптоз и интенсивность поглощения ими глюкозы взаимосвязаны и значительно различаются  в хронической фазе, фазе акселерации и бластного криза. 
    2. У больных хроническим миелолейкозом в хронической фазе, в фазе акселерации и бластного криза в клетках костного мозга наблюдается резкое замедление спонтанного и индуцированного апоптоза на фоне выраженного поглощения глюкозы.
    3. Максимальное усиление апоптотических реакций, как при спонтанном, так и при индуцированном апоптозе и минимальное поглощение глюкозы наблюдается в клетках костного мозга у больных в хронической фазе, достигших при лечении иматинибом цитогенетической ремиссии.
    4. Изучение апоптотических реакций в клетках костного мозга в сочетании с количественной оценкой их способности поглощать глюкозу способствует определению прогноза течения хронического миелолейкоза и подбора адекватной терапии.

Реализация результатов исследования

Результаты  исследования  используются  в учебном процессе на циклах «Клиническая лабораторная диагностика», «Гематологические и общеклинические методы исследований» на кафедре клинической лабораторной  диагностики  ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздравсоцразвития России, кафедре гематологии и трансфузиологии в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России», и  работе поликлинического отделения и клинического отдела «Химиотерапии гемобластозов, депрессий гемопоэза и трансплантации костного мозга  ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России».

Апробация работы

Материалы диссертационного исследования были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Сочи, 2010),  Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2011), юбилейной научно-практической конференции молодых ученых Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации по теме диссертации: Опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 в изданиях, поименованных перечнем ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа  изложена  на 119 страницах  и  включает следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты  и  их  обсуждение,  заключение, выводы и практические рекомендации. Список  литературы  содержит 190 источников,  из  которых 31 отечественный и 159 зарубежных. Работа иллюстрирована 9 таблицами, 11 рисунками, 1 микрофотографией.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включили 95 пациентов с Ph-позитивным хроническим миелолейкозом (ХМЛ), наблюдавшихся и проходивших лечение в двух лечебных учреждениях  г. Санкт-Петербурга – в  ФГБУ "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" и в ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Представленная в работе информация основана на результатах изучения костного мозга больных ХМЛ в хронической фазе заболевания (68 чел.),  фазе  акселерации (15 чел.)  и фазе бластного криза (12 чел.).

При  поступлении или очередном наблюдении, а так же в динамике  на фоне лечения обследование всех  больных  включало  данные анамнеза, объективного и лабораторного обследования: показатели периферической крови (с подсчетом лейкоцитарной формулы и определения количества тромбоцитов), исследование костного мозга с подсчетом миелограммы, цитогенетический анализ клеток костного мозга, молекулярно-генетическое исследование, оценка размеров печени и селезенки.

Все больные были разделены на шесть групп в зависимости от фазы заболевания и ответа на терапию:

  1. Впервые выявленные больные в хронической фазе ХМЛ (первичные);
  2. Больные в хронической фазе ХМЛ с полным гематологическим ответом (ПГО);
  3. Больные в хронической фазе ХМЛ с минимальным и малым цитогенетическим ответом (МЦО);
  4. Больные в хронической фазе ХМЛ, с частичным и полным цитогенетическим ответом (ЧЦО, ПЦО);
  5. Больные ХМЛ в  фазе акселерации (ФА);
  6. Больные ХМЛ в  фазе бластного криза  (БК).

Возраст больных колебался от 18 до 78 лет, большинство – лица среднего возраста (40 - 65 лет). Средний возраст больных в хронической фазе составлял: в 1-й группе (первичные) – 43 года, во 2-й группе (ПГО) – 52,5 года, в 3-й группе (МЦО) – 39 лет и в 4-й группе (ЧЦО, ПЦО) – 42 года. У больных в фазе акселерации и в фазе бластного криза средний возраст равнялся 50 и 55,5 годам, соответственно. Соотношение мужчины: женщины составило 54:41.

Цитогенетическое определение Ph хромосомы в клетках костного мозга было выполнено всем больным. В 4-й группе (ЧЦО, ПЦО) Ph-позитивные клетки были обнаружены только у 15 больных из 29. В остальных группах Ph-позитивные клетки были выявлены у всех больных.

У больных, достигших гематологической ремиссии: 2-я (ПГО), 3-я (МЦО) и 4-я (ЧЦО, ПЦО) группы, жалоб не было, спленомегалии и гепатомегалии не обнаружено. Общее состояние их расценено, как удовлетворительное. У  больных  1-й  (первичные),  5-й  (фаза акселерации) и 6-й (бластный криз) групп были жалобы на слабость, повышение температуры до субфебрильных цифр, потливость, потерю аппетита, боли в костях. Общее состояние пациентов 1-й и 5-й группы оценено, как средней тяжести и у пациентов 6-й группы как тяжелое. При пальпации у преобладающего числа больных этих групп было обнаружено увеличение селезенки (край селезенки выступал из-под реберной дуги на 1 – 4 см) и печени (край печени выступал из-под реберной дуги на 1 – 3 см).

Диагноз ХМЛ и фазу заболевания устанавливали на основании результатов клинического анализа крови, морфологического, цитогенетического и молекулярного  исследования аспирата костного мозга. Патологию кариотипа клеток оценивали в соответствии с Международной номенклатурой дифференциально окрашенных хромосом ISCN (1995) [Mitelman F., 1995]. Диагноз хронической фазы, фазы акселерации и бластного криза ставился на основании критериев ВОЗ [Yin C.C., Medeiros L.J., Bueso-Ramos C.E., 2010]. Эффективность лечения оценивали согласно рекомендациям European LeukemiaNet по лечению ХМЛ иматинибом и ингибиторами тирозинкиназ II поколения [Baccarani M., Cortes G., at al., 2009]. Полноту гематологической и цитогенетической ремиссии определяли по гематологическому ответу (ПГО) и цитогенетическому ответу (ЦО) [Baccarani M., Saglio G. at al., 2006].

Преобладающее количество больных находилось в хронической фазе заболевания – 71,6%. К ним относятся впервые выявленные больные ХМЛ и больные, достигшие гематологической и цитогенетической ремиссии, разной степени выраженности. Число больных в фазе акселерации равнялось 15,8%, а в фазе бластного криза – 12,6%.

В периферической  крови у больных ХМЛ  2-й (ПГО), 3-й (МЦО) и 4-й (ЧЦО, ПЦО) группы достоверных отличий по количеству лейкоцитов, гранулоцитов, тромбоцитов и концентрации гемоглобина не выявлено. Нарушений клеточного состава и присутствия незрелых форм клеток гранулоцитарного ростка не было обнаружено, что соответствует установленным критериям достижения полного гематологического ответа. У больных 1-й (первичные), 5-й (фаза акселерации) и 6-й (бластный криз) группы было зафиксировано достоверное увеличение (p<0,05) числа лейкоцитов, гранулоцитов, снижение концентрации гемоглобина, тромбоцитоз (в 1-й и 5-й группе) и тромбоцитопения (в 6-й группе). Максимальное количество лейкоцитов и самая низкая концентрация гемоглобина были обнаружены  в 6-й группе больных в фазе бластного криза. Так же у пациентов 1-й, 5-й и 6-й группы при подсчете клеток обнаружен сдвиг лейкоцитарной формулы влево до бластных форм гранулоцитов.

Таким образом, наличие эозинофильно-базофильной ассоциации и бластных клеток в разном количестве послужили диагностическим критерием для определения фазы заболевания ХМЛ.

Результаты подсчета миелограммы больных ХМЛ, включенных в исследование, представлены в таблице 1.

Таблица 1 

Показатели миелограммы

Показатель

1-я группа (Первичные)

2-я группа (ПГО)

3-я группа  (МЦО)

4-я  группа (ЧЦО, ПЦО)

5-я группа (ФА)

6-я группа  (БК)

Миелокариоциты  • 109/л

445,8 ±96,5

119,2±14,0

118,6±16,2

126,1 ±25,9

200,3±21,8

298,8±88,1

Миелобласты, %

2,2±0,4

1,5±0,4

1,1±0,5

1,0±0,5

12,3 ±1,4

47,1 ±10,1

Промиелоциты, %

6,0±1,6

2,5±1,0

2,6±0,8

2,1±0,7

8,1±1,8

7,3±1,9

Сумма бластов и промиелоцитов, %

8,1±1,8

4,2±1,1

3,7±1,2

3,1±1,0

20,4 ±2,3

54,4  ±8,6

Сумма клеток нейтрофильного ряда, %

79,9 ±4,2

66,1 ±2,7

61,9 ±2,7

57,9 ±3,3

63,2 ±2,4

80,6 ±3,9

Сумма клеток эозинофильного ряда, %

4,0±0,2

2,1±0,8

3,3±0,1

2,2±0,9

3,4±0,4

1,1±0,4

Сумма клеток базофильного ряда, %

3,2±0,3

0,3±0,1

0,3±0,1

0,2±0,1

9,1±1,3

2,8±0,6

Сумма клеток эритроидного  ряда, %

8,2±1,6

19,9± 1,0

21,3± 2,1

22,7± 3,3

8,0± 0,9

5,1±1,2

Лейкоэритроидное соотношение (:1)

12,1±2,6

4,1±0,3

3,8±0,5

3,5±0,6

11,8±1,5

19,8±4,7

Индекс созревания нейтрофилов

1,2±0,1

0,6±0,1

0,7±0,1

0,7±0,1

1,3±0,1

1,4±0,1

Индекс созревания эритрокариоцитов

0,9±0,1

0,9±0,1

0,9±0,1

0,9±0,1

0,9±0,1

0,6±0,1

Как видно из представленных в таблице 1 данных, нарушение миелокариоцитопоэза наблюдается у всех пациентов 1-й группы (первичные), 5-й группы (фаза акселерации) и 6-й группы (фаза бластного криза). У пациентов 2-й (ПГО), 3-й (МЦО) и 4-й (ЧЦО, ПЦО) нарушений в миелограмме не было обнаружено.

В хронической фазе заболевания повышение числа бластных клеток отмечалось у больных 1-й группы (впервые выявленные), 5-й (фаза акселерации) и 6-й (фаза бластного криза). Максимальное значение бластных клеток наблюдалась у пациентов 6-й группы в бластном кризе и составило в среднем 47,1±10,1%. Повышение уровня промиелоцитов отмечалось у больных 1-й, 5-й  и 6-й групп. 

У больных 2-й, 3-й и 4-й группы в хронической фазе заболевания определялись нормальные значения лейкоэритроидного соотношения: 4,1:1, 3,8:1 и 3,5:1. У больных 1-й группы было обнаружено повышение лейкоэритроидного соотношения до 10,3:1 и 13,0:1.  У больных 5-й группы отношение лейко/эритро составило в среднем 11,8:1 (9:1 – 15:1), у больных 6-й группы – 19,8:1 (от 13:1 до 28:1), что значительно превышало аналогичный показатель в других группах.

Большинство больных  в  хронической  фазе  находились  на  лечении  иматинибом (гливек) 400 мг/сут. Часть больных получала гидреа (гидроксимочевина) 0,5-2 г/сут или -интерферон (реаферон, роферон) 9-21  млн. ед./над. Больные в фазе акселерации и бластного криза были обследованы до начала терапии. Лечение больных в прогрессирующей стадии заболевания проводилось иматинибом 600 мг/сут или малыми дозами цитозин-арабинозида 20 мг/м2/сутки в течение 14-21 дней). В фазе бластного криза использовался иматиниб (гливек) или программы химиотерапии «7+3» (при миелоидном варианте криза) и «CHOP» (при лимфобластном варианте).

Лабораторные методы

Подсчет миелограммы. Препараты костного мозга готовили непосредственно после получения материала. Подсчет миелограммы (500 клеток) проводили в световом микроскопе с увеличением в 630 раз после окрашивания по Майн-Грюнвальду-Романовскому-Гимза.

Выделение клеток костного мозга. Костный мозг (1-2 мл) получали при стернальной пункции или трепанобиопсии подвздошной кости и помещали в 2 мл буферного раствора следующего состава (ммоль/л): NaCl – 119; KCl – 4,69; CaCl2 – 2,52; MgCl2 – 1,18; глюкоза – 5,5; KH2PO4 – 1,18; HEPES – 25; pH = 7,4 с добавлением 60 г/л  раствора ЭДТА в соотношении  1/20  от объема костного мозга [Kizaki H. et al., 1990]. Не позднее, чем через 1 час после получения пунктата надосадочную жидкость осторожно наслаивали на раствор фиколла-верографина (2 мл) с относительной  плотностью 1,077 г/мл [Boyum A., 1968; Клаус Дж., 1990]. После центрифугирования (40 минут при 1500 об/мин)  отделяли клеточную фракцию, которую  трижды отмывали раствором  хлорида натрия (9 г/л). Выделенные клетки инкубировали при постоянном встряхивании  пробирок  (1 час при + 37оС) в буферном растворе из расчета 1 мл раствора на 106 клеток [Паньков В.Н., Рябов Н.В., 1985].

На каждом этапе выделения  клеток костного мозга подсчитывали их количество в камере Горяева и определяли жизнеспособность по связыванию трипанового синего.  Жизнеспособные клетки составляли в среднем 92-99% от их общего числа.

Индукция апоптоза. Апоптоз индуцировали путем создания в среде инкубации дефицита глюкозы. Ее дефицит вызывали  путем инкубации клеток костного мозга  (в среднем, 4 • 106) в минимальном объеме  (50 мкл)  буферного раствора. Для оценки спонтанного апоптоза то же  количество клеток инкубировали в 1 мл буферного раствора. Обе пробы выдерживали  в термостате при температуре 37оС  в течение 18 часов.  После инкубации в обеих пробах  определяли количество клеток, связавших акридин оранж (АО).

Апоптотическую активность клеток костного мозга определяли с помощью метода флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Флуоресцентная микроскопия. Оценку связывания клеток с АО проводили по методу Е.Б. Ласунской [Ласунская Е.Б., Кравцов В.Д., Фрейдлин И. С.,1989; Черныш Н.Ю., 2002; Зимина В.А., 2003]. После инкубации клеток в буферном растворе 5 мкл пробы помещали на предметное стекло, смешивали с равным объемом раствора  АО (100 мкг/мл), накрывали покровным стеклом и просматривали под масляной иммерсией. Микроскопию проводили непосредственно после  приготовления препарата в люминесцентном микроскопе Leica DM4000B в ультрафиолетовом свете (светофильтр H3). Подсчитывали не менее 100 клеток в разных полях зрения.  Оценивали процент клеток с типичными для апоптоза изменениями [Mekori Y.A., Oh C.K., 1993; Hibner U., Coutinho A., 1994].

Проточная цитофлуориметрия. Апоптотическую активность клеток костного мозга определяли по связыванию клетками антител, меченных флюоресцеин изоцианатом (FITC), к аннексину V (аннексин V+ клетки). Краситель пропидий йодид (PI) употребляли в качестве маркера жизнеспособности клеток (аннексин V    PI    клетки) и клеточного некроза (аннексин V   PI+ клетки). Интенсивность флюоресценции оценивали с помощью анализатора Beckman Coulter Cytomics FC500.  Использовали набор реактивов ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I («BD Pharmingem™», США).

Определение концентрации глюкозы в среде инкубации. О скорости поглощения глюкозы  судили по её убыли в среде инкубации через 18 часов. Содержание глюкозы в инкубационной среде оценивали глюкозооксидазным  методом, используя реактивы фирмы «Biosub® GLU». Результаты представляли в виде количества поглощенной за 18 часов глюкозы (мкмоль/106 клеток костного мозга).

Кариотипирование клеток костного мозга проводили в цитогенетической лаборатории Российского НИИ гематологии и трансфузиологии Санкт-Петербурга, руководитель д.б.н. Мартынкевич И.С. Дифференциальное окрашивание проводили по методу GTG (дифференциальная G-окраска) [Паткин Е.Л. и соавт., 1992]. Препараты анализировали с учетом рекомендаций Международной классификации хромосом ISCN (1995) [Mitelman F., 1995].

Статистическая обработка и построение диаграмм проводили с помощью пакета «Statistica 6.0»  и электронных таблиц «Excel». В тексте и таблицах значения представлены в виде Х±m. Для всех имеющихся выборок данных была проведена  проверка  нормальности распределения по критерию Колмогорова-Смирнова. В случаях, когда гипотеза нормальности отвергалась, показатель достоверности р рассчитывали на основе ранговых непараметрических критериев Вилкоксона и Манна-Уитни. В остальных случаях расчёт проводили с помощью критерия Стьюдента и парного Т-критерия. Выявление связи между параметрами осуществлялось на основе линейного корреляционного анализа с расчетом коэффициента корреляции (r). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы р принимался равным 0,05.

Автор приносит искреннюю благодарность коллективу клинико-диагностической и цитогенетической лаборатории Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (Санкт-Петербург),  коллективу иммунологической лаборатории ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздравсоцразвития России и сотрудникам центра лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации  за помощь и содействие при выполнении данной работы. 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение результатов определения апоптоза методом проточной цитометрии и люминесцентной микроскопии. Апоптоз в клетках костного мозга изучали с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии на  гетерогенной  популяции  клеток костного мозга, выделенных  у двух групп больных: больных 4-й группы (n=14), достигших  ЧЦО и  ПЦО и  количеством бластных клеток от 0,2 до 2,4%  и 6-й группы (n=6), находящихся в бластном кризе и количеством бластных клеток  от 32 до 65,4%. Количество клеток, находящихся в апоптозе, выражали в процентах от общего числа клеток. Мононуклеарные клетки костного мозга идентифицировали на основе CD45 флюоресценции (CD45+ клетки). Недифференцированный клеточный пул анализировали по общему лейкоцитарному маркеру CD34 (CD34+ клетки).

Рис. 1. Связывание  аннексина V и АО клетками костного мозга больных 4-й группы (хроническая фаза, ПЦО), (%).

Из представленных на рисунке 1 данных следует, что при проточной цитометрии и люминесцентной микроскопии наибольшее количество клеток в состоянии спонтанного и индуцированного апоптоза приходится на  гранулоцитарный  пул. Количество клеток в состоянии спонтанного апоптоза (14,1%) в общеклеточном пуле при проточной цитометрии  достоверно не отличалось (p>0,05) от результатов спонтанного апоптоза (11,0%) при люминесцентной микроскопии. Количество клеток в состоянии индуцированного апоптоза (23,8%) в общеклеточном пуле при проточной цитометрии  достоверно не отличалось (p>0,05) от результатов, полученных при люминесцентной микроскопии  (20,2%).

Рис. 2. Связывание аннексина V и АО  клетками костного мозга у больных 6-й группы (бластный криз), (%).

Как следует из представленных на рисунке 2 данных, наименьшее  количество клеток, находящихся в спонтанном и индуцированном апоптозе, (при проточной цитометрии) было обнаружено в гранулоцитарном клеточном пуле. Количество клеток в состоянии спонтанного апоптоза (4,2%) в общеклеточном пуле при проточной цитометрии  достоверно не отличалось (p>0,05) от показателей спонтанного апоптоза при люминесцентной микроскопии (4,0%). Количество клеток в состоянии индуцированного апоптоза (4,6%) в общеклеточном пуле при проточной цитометрии  достоверно (p>0,05) не отличалось от результатов индуцированного апоптоза при люминесцентной микроскопии (4,5%) .

Результаты определения прироста числа клеток, вступивших в апоптоз, в условиях индукции представлены на  рисунках 3 и 4.

Рис. 3. Прирост числа клеток костного мозга, связывающих аннексин V и АО, у больных 4-й группы (хроническая фаза, ПЦО), в условиях индукции апоптоза, (%).

Из данных, представленных на рисунке 3, следует, что прирост числа клеток  в апоптозе в условиях индукции в гранулоцитарном и общеклеточном пуле при проточной цитометрии не отличался у больных 4-й группы (хроническая фаза ПЦО) (p>0,05). По приросту числа клеток в апоптозе в условиях индукции в общеклеточном пуле результаты и проточной цитометрии  и люминесцентной микроскопии не различались (p>0,05).

У больных  6-й группы (бластный криз) (рис.4) различий по величине прироста числа апоптотических клеток в условиях индукции в гранулоцитарном, общеклеточным пуле при проточной цитометри и общеклеточным пулом при люминесцентной микроскопии не было обнаружено (p>0,05). 

Поскольку при проведении корреляционного анализа данных, полученных с помощью обеих методик,  была обнаружена высокая зависимость на общеклеточном пуле в 4-й группе r = 0,96, в 6-й группе r = 0,83, в работе был использован метод люминесцентной микроскопии.

Рис. 4. Прирост числа клеток костного мозга, связывающих аннексин V и  АО, у больных 6-й группы (фаза бластного криза) в условиях индукции апоптоза, (%).

Акридинсвязывающая способность клеток костного мозга.  Результаты  определения количества клеток костного мозга, связывающих АО в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза, представлены в таблице 2.

  Таблица 2

Связывание акридин оранжа клетками костного мозга в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза, %

Исследуемые группы больных

Апоптоз

Спонтанный

Индуцированный

1 группа (n=20) Первичные 

6,2±0,62-6 

9,4±1,0, 2-6

2 группа (n=10) ПГО

8,7±0,63-6

14,3±1,0, 3-6

3 группа (n=9)  МЦО

10,9±0,65-6

18,3±0,6, 4-6

4 группа (n=29) ЧЦО, ПЦО

11,1±1,15-6 

20,8±1,5, 5-6

5 группа (n=15)  Фаза акселерации

4,3±0,8n.s.

6,6±1,1, 6

6 группа (n=12) Бластный криз 

4,0±0,7

4,7±0,7

) достоверность различий по сравнению со значениями спонтанного апоптоза (p<0,005)

2,3,4,5,6)  достоверность различий по сравнению со значениями других групп в столбце (p<0,005)

Как следует из данных, представленных в таблице 2, при спонтанном апоптозе у больных 1-й группы количество клеток, связывающих АО,  было достоверно ниже (p<0,005) значений 2-й, 3-й и 4-й групп больных и достоверно выше (p<0,005) по сравнению со значениями 5-й и 6-й группы. Максимальное количество клеток, связывающих АО, было обнаружено у больных 3-й и 4-й групп (хроническая фаза МЦО и ЧЦО, ПЦО). Минимальное количество клеток, связывающих АО, было обнаружено у больных 5-й и 6-й групп (фаза акселерации и бластного криза).

В условиях индукции апоптоза во всех группах пациентов число клеток, связывающих АО,  достоверно увеличилось по сравнению с числом клеток при спонтанном апоптозе. При этом у впервые выявленных больных (1-я группа)  прирост числа клеток, связывающих АО при индукции апоптоза, было достоверно ниже по сравнению леченными  больными  2-й, 3-й и 4-й группы. У больных 5-й и 6- групп (фаза акселерации и бластного криза) прирост числа клеток, связывающих АО в условиях индукции, был достоверно ниже по сравнению с группами больных  ХМЛ в хронической фазе (1 – 4 группы).

Восстановление способности клеток костного мозга к апоптозу в ходе лечения ХМЛ. Данные о приросте числа клеток, связавших АО в условиях индукции, представлены на рисунке 5.

Из данных, представленных на рисунке 5, следует, что прирост числа клеток, связывающих АО в ответ на индукцию апоптоза, достоверно отличался во всех группах: в 1-й группе (первичные) был ниже (p<0,005) по сравнению со значениями 2-й (ПГО), 3-й (МЦО) и 4-й (ЧЦО, ПЦО) групп больных и выше (p<0,005) по сравнению со значениями 5-й (фаза акселерации) и 6-й (фаза бластного криза) группы больных. При сравнении групп максимальный прирост числа клеток, связывающих АО в условиях индукции апоптоза, был  определен у больных, достигших ЧЦО и/или ПЦО. Минимальный прирост – достоверно определен у больных в фазе бластного криза.

Рис. 5. Прирост числа клеток костного мозга, связывающих АО в условиях индукции апоптоза, %. 

Полученные данные позволяют  сделать ряд заключений:

– клетки костного мозга больных 5-й группы (фаза акселерации) и 6-й группы (фаза бластного криза) практически не способны в условиях индукции вступать в апоптоз;

– прирост числа клеток, связывающих АО в условиях индукции, у больных 1-й группы (впервые выявленные), 5-й группы (фаза акселерации) и 6-й группы (бластный криз) ниже соответствующих значений у больных 2-й (ПГО), 3-й (МЦО) и 4-й (ЧЦО, ПЦО) группы. Это указывает на то, что в клетках костного мозга не леченных больных в хронической фазе существует устойчивость к проапоптотическим сигналам;

– определение в динамике числа клеток, связывающих АО, в костном мозге у больных ХМЛ позволяет выделить группу пациентов с положительным ответом на химиотерапию.

Таким образом, по мере лечения и улучшения гематологических и клинических данных, происходит восстановление способности клеток костного мозга вступать в апоптоз как в условиях спонтанного, так и индуцированного апоптоза. Обнаружение того, что максимальная способность клеток костного мозга вступать в апоптоз выявлена у больных 4-й группы (ПЦО), может указывать на то, что определение в динамике способности клеток к восстановлению апоптоза может быть использовано в качестве критерия оценки эффективности терапии. 

Потребление глюкозы клетками костного мозга у больных ХМЛ. Данные о поглощении глюкозы клетками костного мозга у больных ХМЛ в разных фазах заболевания представлены на рисунке 6.

Рис.6. Потребление глюкозы клетками костного мозга в условиях инкубации, мкмоль/106кл.

Как следует из представленных данных на рисунке 6, клетки костного мозга у больных 1-й группы (первичные) и 5-й группы (фаза акселерации) не отличались по скорости поглощения глюкозы. Максимальная скорость поглощения глюкозы была выявлена у больных 6-й группы (фаза бластного криза) по сравнению с 1-й группой (p<0,05). Сравнимое по скорости поглощение глюкозы было выявлено у больных 2-й группы с ПГО и у больных 3-й группы с МЦО (p>0,05). Минимальное  потребление глюкозы клетками костного мозга у больных ХМЛ было обнаружено в 4-й группе больных с ЧЦО или ПЦО.

На рисунке 7 представлены взаимоотношения между апоптозом, поглощением глюкозы, бластными клетками и  Ph(+) клетками в костном мозге  больных ХМЛ в разных фазах заболевания. 

Рис.7. Поглощение глюкозы, скорость апоптоза, содержание  бластных клеток и  Ph(+) клеток у больных ХМЛ  в разных фазах заболевания. 

Ось Y1:  Потребление глюкозы клетками КМ, %

Количество промиелоцитов в КМ,%

Количество бластов в КМ, %

Ось Y2:  Прирост числа клеток, связывающих АО, в условиях индукции, %

Из рисунка 7 следует, что на фоне минимальной  апоптотической активности, высокого содержания бластных клеток и повышенного числа промиелоцитов обнаружена максимальная скорость поглощения глюкозы клетками костного мозга (группа 6).  У больных 1-й, 5-й и 6-й групп количество бластов и промиелоцитов было достоверно выше значений 2-й, 3-й и 4-й групп (p<0,05) и составляло: в 1-й группе – 2,2±0,4% и 6,0±1,6%, в 5-й – 12,3±1,4% и 8,1±1,8% и в 6-й – 47,1±10,1% и 7,3±2,2%, соответственно.  Достижение ПГО сопровождается  достоверным  нарастанием апоптотической активности, уменьшением количества бластных клеток и промиелоцитов до нормальных значений (1,5% и до 2,5%, соответственно) и значимым снижением скорости потребления глюкозы  с 0,67 до 0,39  мкмоль/106кл. Была выявлена высокая степень корреляции между снижением числа бластов, промиелоцитов и потреблением глюкозы r=0,73 и  r=0,69, соответственно. Эти данные могут указывать на то, что основными потребителями глюкозы являются бласты и промиелоциты. Как видно из представленных данных, больные 2-й  (хроническая фаза ПГО) и 3-й группы (хроническая фаза МЦО) достоверно  (p<0,005) отличались по интенсивности апоптоза (5,6% и 7,4%), но были сравнимы по количеству поглощенной клетками глюкозы (0,39 и 0,29 мкмоль/106кл, соответственно) и гематологическим показателям (% бластных клеток – 1,5±0,4 и 1,1±0,5 и промиелоцитов – 2,5±1,0 и 2,6±0,8 в костном мозге). Содержание Ph-позитивных клеток составляло:  у больных 2-й группы – 100%, 3-й группы – от 36% до 86%. 

В 4-й группе (ЧЦО, ПЦО) апоптоз был максимальным, поглощение глюкозы опускалось до минимума (0,16 мкмоль/106кл), и было достоверно ниже по сравнению с другими группами (p<0,005). У больных с ЧЦО количество Ph(+) клеток в костном мозге колебалось от 6% до 26%, у больных с ПЦО Ph(+) клетки не были обнаружены. Это представляло собой основной отличительный признак данной группы больных от других групп. Полученные данные мы расцениваем как существование зависимости между скоростью потребления глюкозы клетками костного мозга и количеством Ph-позитивных клеток. Коэффициент корреляции между скоростью потребления глюкозы клетками костного мозга и количеством Ph-позитивных клеток составил r = 81. Существование подобной зависимости указывает на более сложные взаимоотношения между мерой злокачественности клетки и потреблением ею глюкозы.

Таким образом, по мере улучшения гематологических и клинических данных у больных ХМЛ  происходит снижение скорости поглощения глюкозы и нарастание апоптотической активности в клетках  костного мозга. Это указывает на то, что  оценка этих показателей в динамике может быть использована в качестве критерия эффективности терапии.

ВЫВОДЫ

1.  Апоптотическая активность клеток костного мозга и их способность поглощать глюкозу являются лабораторными маркерами, характеризующими ответ опухолевых клеток больных хроническим миелолейкозом на действие направленной терапии. 

2.        Апоптотическая активность опухолевых клеток в хронической фазе хронического миелолейкоза при положительном ответе на проводимое лечение достоверно увеличивается, в то время как их способность  поглощать глюкозу уменьшается. При достижении полного  цитогенетического ответа у больных, получающих иматиниб, наблюдается максимальное ускорение процессов спонтанного и индуцированного апоптоза.

3.        У больных в фазе акселерации и бластного криза выявляется резкое замедление апоптотических реакций, как при спонтанном, так и индуцированном апоптозе на фоне выраженного поглощения глюкозы.

4.        Обнаружение низкого числа клеток, связывающих акридин оранж, на фоне высокой скорости поглощения глюкозы, позволяет отнести этих больных в прогностически неблагоприятную группу и, наоборот, при высоком количестве клеток и низком уровне поглощения глюкозы вероятность достижения цитогенетической ремиссии хронического миелолейкоза достоверно выше.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение количества клеток костного мозга,  связывающих АО в сочетании с количественным определением поглощения глюкозы целесообразно использовать при диагностике хронического миелолейкоза в дополнении к стандартным методам исследования.

2. Обнаружение низкого числа клеток костного мозга, связывающих АО на фоне высокого поглощения глюкозы, позволяет отнести этих больных к прогностически неблагоприятной группе и, наоборот, при высоком количестве клеток, связывающих АО в сочетании с низким уровнем поглощения глюкозы прогнозировать вероятность достижения ремиссии.

3. Изучение количества акридин связывающих  клеток костного мозга и степени поглощения ими глюкозы могут быть использованы для формирования групп риска больных хроническим миелолейкозом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Сясина Т.В. Особенности апоптотической активности клеток костного мозга  у больных хроническим миелолейкозом / А.В. Козлов, С.С. Бессмельцев, В.Ю. Удальева // Материалы международной конференции: научное студенческое сообщество и современность. Медико-биологические науки. – Турция, 2004. – Фундаментальные исследования.    2004.    №2.    С.133.
  2. Сясина Т.В. Апоптотическая активность клеток костного мозга у больных хроническим миелолейкозом на фоне лечения иматинибом (Гливеком) / А.В. Козлов, С.С. Бессмельцев, В.Ю. Удальева // Материалы конференции: фундаментальные и прикладные исследования в медицине. – Россия, 2010. – Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований.    2010.    № 11.    С.46    47.
  3. Сясина Т.В. Сравнение методов определения количества клеток в апоптозе в костном мозге больных хроническим миелолейкозом проточной цитометрией и флуоресцентной микроскопией / А.В. Козлов, С.С. Бессмельцев, В.Ю. Удальева // Материалы конференции: приоритетные направления развития науки, технологий и техники. – Египет, 2010. – Современные наукоемкие технологии. – 2011.  №1.    С. 63    64.
  4. Сясина Т.В. Апоптотическая активность клеток костного мозга у больных хроническим миелолейкозом на фоне лечения иматинибом (гливеком) / А.В. Козлов, С.С. Бессмельцев, В.Ю. Удальева, А.Ю. Зарицкий // Биомедицинский журнал medline.ru    2010.    Т.11, ст. 21.    С. 268 283.
  5. Сясина Т.В. Интенсивность апоптоза в клетках костного мозга больных хроническим миелолейкозом как критерий эффективности терапии / Материалы всероссийской научно-практической конференции молодых ученых: современные проблемы гематологии и трансфузиологии. – Россия (СПб), 2011. – Вестник гематологии. – 2011.    Т. VII, №1.    С.50    51.
  6. Сясина Т.В. Потребление глюкозы клетками костного мозга больных хроническим миелолейкозом, леченных иматинибом / Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». – СПб, 2011.    С.47  48
  7. Сясина Т.В. Сравнительная оценка методов определения апоптотической активности  клеток  костного  мозга у больных хроническим миелолейкозом (флуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия) / А.В. Козлов, С.С. Бессмельцев, В.Ю. Удальева // Фундаментальные исследования. 2011.   №10. С. 33-36.
  8. Сясина Т.В. Лабораторные маркеры хронического миелолейкоза / А.В. Козлов, С.С. Бессмельцев, В.Ю. Удальева // Биомедицинский журнал medline.ru 2011.    Т. 12, ст. 80.    С. 959  979.
  9. Сясина Т.В. Оценка интенсивности апоптотических реакций и потребления глюкозы клетками костного мозга у больных хроническим миелолейкозом при использовании иматиниба / А.В. Козлов, С.С. Бессмельцев, В.Ю. Удальева // Материалы всероссийской научно-практической конференции: клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови. – Россия (СПб), 2011. –  Вестник гематологии.    2011.   Т. VII, №4.    С.47   48.
  10. Сясина Т.В. Потребление глюкозы клетками костного мозга больных хроническим миелолейкозом, леченных иматинибом (гливеком) / А.В. Козлов, С.С. Бессмельцев, В.Ю. Удальева, А.Ю. Зарицкий // Вестник Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования.    2011.    Т. 3, №4.    С.90    96.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.