WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Снигур Григорий Леонидович

ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПАТОМОРФОЗ ЭНДОКРИННОЙ ЧАСТИ

ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ

САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

14.03.02 патологическая анатомия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Волгоград 2012

Работа выполнена в ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» Министерства здравоохранения Волгоградской области и ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Смирнов Алексей Владимирович

Член-корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Писарев Вячеслав Борисович

Официальные оппоненты:

Туманов Владимир Павлович

доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии №2 педиатрического факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития России, лауреат Государственной премии РФ.

Даниленко Виталий Иванович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко» Минздравсоцразвития России.

Доманин Андрей Александрович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомией ГБОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН (г. Москва)

Защита состоится «               »  2012 г. в ____ ч. на заседании диссертационного совета Д 208.008.01 ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов,1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Автореферат разослан «____»  2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор                                                                                               Н.В. Григорьева

Актуальность проблемы.

Сахарный диабет (СД) является одним из социально значимых заболеваний, что обусловлено его повсеместной распространённость и быстрыми темпами роста [Дедов И.И., 2010]. Сахарным диабетом страдают более чем 150 млн. человек по всему миру, количество которых удваивается каждые 12-15 лет [Дедов И.И. с соавт., 2008; Аметов А.С., 2008]. Однако фактическая распространенность СД в 3-4 раза превосходит данные официальной статистики, что свидетельствует о масштабах неинфекционной эпидемии диабета [Балаболкин И.И. с соавт., 2008].

Несмотря на разнообразие лекарственных средств для лечения СД одним из приоритетных направлений в современной эндокринологии и фармакологии является активный поиск новых мишеней для действия антидиабетических средств [Петров В.И., Спасов А.А., 2007; Дедов И.И., 2010; Петров В.И. с соавт., 2010; Спасов А.А., Чепурнова М.В., 2011]. Для скрининга и детального изучения механизма действия антидиабетических препаратов используют различные экспериментальные модели СД, обусловленные введением селективных В-цитотоксических веществ (аллоксан, стрептозотоцин, и др.) [Mythili D.M. et al., 2004;        Islam S., Loots D.T., 2009]. В зависимости от применяемой в эксперименте дозы цитотоксина и пути его введения, возможно моделирование различных состояний нарушения углеводного обмена, соответствующих определенным клиническим типам диабета (СД тип 1, СД тип 2, латентный СД, скрытый СД) [Srinivasan K. et al., 2007]. При этом клинико-биохимические признаки СД (гипергликемия, глюкозурия, полиурия, полидипсия, потеря веса, снижение концентрации С-пептида и инсулина, увеличение концентрации гликолизированного гемоглобина и др.), не позволяют достоверно оценить степень повреждения эндокриноцитов панкреатических островков и определить потенциальные тканевые мишени для лекарственных средств [        Reed J.C., Green D.R., 2011].

Достаточно детально изучены основные звенья пато- и морфогенеза СД, приводящие к расстройству гомеостаза глюкозы: аутоиммунная деструкция В-клеток панкреатических островков, инсулинорезистентность периферических тканей, избыточная продукция глюкозы печенью, нарушение секреции инсулина В-клетками панкреатических островков, снижение продукции инкретинов, и др. [Aronoff S.L., 2004; Балаболкин М.И., 2007]. В современной литературе широко освещены особенности структурных изменений органов и тканей при СД (диабетическая ангиопатия, нефропатия, кардиопатия и т.д.) [Jennette J.C., Heptinstall R.H., 2007;        Burke A.P., Tavora F., 2010], однако, сведения об особенностях патогистологических изменений в панкреатических островках с учетом современных представлений о повреждении и регенерации В-клеток в литературе представлены не достаточно и без учета лекарственного патоморфоза.

С позиций современных представлений о патоморфогенезе и лекарственном патоморфозе сахарного диабета, большое значение придается состоянию эндокринной части поджелудочной железы, особенно А- и В-клеток [Reed J.C., Green D.R., 2011]. Способность повреждать В-клетки панкреатических островков при введении селективных цитотоксических соединений широко используется для моделирования СД при проведении доклинического этапа испытаний новых лекарственных средств [Хабриев Р.У., 2005]. Известно, что эффекты токсического действия на В-клетки зависят от дозировки и способа введения цитотоксинов и могут проявляться некротическими изменениями различной степени выраженности или быть представлены запрограммированной клеточной гибелью [Lenzen S., 2008]. Однако, современные представления о механизмах повреждения в-клеток при различных моделях экспериментального диабета требуют уточнения путей активации апоптоза и стимуляции регенерации эндокриноцитов В. Детально изучен механизм действия большинства антидиабетических лекарственных средств, однако данные о комплексных морфофункциональных изменениях эндокринной части поджелудочной железы в зависимости от экспериментальной модели диабета противоречивы и разрознены, а данные о патогистологических изменениях инновационных отечественных противодиабетических лекарственных средств отсутствуют.

Значимость процессов повреждения и репарации предопределяет переориентацию направленности медико-биологических исследований из области теоретической биологии в сферу интересов клинической медицины [Саркисов Д.С., 1988]. Изучение процессов повреждения и репарации В-клеток поджелудочной железы при СД является актуальной задачей, поскольку каждый уровень и элемент регуляции секреторной активности инсулоцитов служит потенциальной мишенью для действия лекарственных средств и биологически активных веществ. Таким образом, возможность целенаправленного управления процессами повреждения и репарации, является основой для создания новых лекарственных средств применяемых в терапии социально значимых заболеваний, а особенности лекарственного патоморфоза помогают выявить специфические клеточные компоненты для инновационных антидиабетических лекарственных препаратов [        Karp G., 2010; Reed J.C., Green D.R., 2011].

С этих позиций изучение патогистологических аспектов повреждения и регенерации инсулоцитов при экспериментальном диабете с учетом лекарственного патоморфоза, обусловленного действием различных групп антидиабетических лекарственных препаратов и лекарственных веществ является актуальным.

Тема утверждена на заседании Ученого Совета ГБУ ВМНЦ (протокол №5 от 27 декабря 2006 г.) и включена в план НИР в рамках темы: «Патоморфологические изменения и лекарственный патоморфоз внутренних органов при нарушениях различных видов обмена веществ» (регистрационный №01200904037).

Целью исследования явилось выявление морфофункциональных закономерностей процессов повреждения и репарации эндокриноцитов В островков Лангерганса поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете с учётом его лекарственного патоморфоза.

Задачи исследования.

  1. Провести комплексную морфофункциональную оценку изменений островкового аппарата поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете с учётом его лекарственного патоморфоза.
  2. С использованием иммуногистохимического метода исследования выявить закономерности апоптоза эндокриноцитов В панкреатических островков на различных экспериментальных моделях сахарного диабета.
  3. С применением иммуногистохимического метода исследования выявить патоморфоз эндокринной части поджелудочной железы и особенности апоптоза эндокриноцитов В панкреатических островков при фармакологической коррекции.
  4. Выявить морфофункциональные закономерности репарации эндокриноцитов В островков Лангерганса поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете с учётом его лекарственного патоморфоза с использованием иммуногистохимического метода исследования.
  5. На основании качественной и количественной патогистологической оценки обосновать концепцию структурных преобразований панкреатических островков при СД с учетом фармакологической коррекции различными группами антидиабетических лекарственных средств.

Научная новизна.

Впервые в сравнительном аспекте показаны морфофункциональные особенности эндокриноцитов панкреатических островков при моделировании аллоксан-, стрептозотоцин-, стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного сахарного диабета. С применением методов морфометрического анализа впервые выявлены инициаторные пути активации апоптоза В-клеток на различных моделях экспериментального сахарного диабета с учётом сроков его развития.

С помощью морфометрических, иммуногистохимических и электронно-микроскопических методов исследования обоснованы закономерности повреждения и репарации эндокриноцитов островков Лангерганса, а также определены возможности блокады апоптоза В-клеток при лечении экспериментального сахарного диабета.

Впервые изучены комплексные морфологические изменения эндокринной части поджелудочной железы, возникающие под влиянием нового отечественного противодиабетического лекарственного препарата. Впервые проведен сравнительный анализ и установлены особенности лекарственного патоморфоза эндокринной части поджелудочной железы под воздействием известных и инновационных противодиабетических лекарственных средств.

На основе полученных данных сформулирована теоретическая концепция о фенотипической вариабельности эндокриноцитов панкреатических островков, которая рассматривается как ключевой морфофункциональный субстрат реализации клеточного повреждения, компенсаторно-приспособительных процессов и репарации при действии различных цитотоксических веществ и коррекции морфофункциональных изменений под влиянием противодиабетических лекарственных препаратов.

Практическая значимость.

Полученные данные существенно расширяют современные фундаментальные представления о процессах повреждения и репаративной регенерации В-клеток островков поджелудочной железы.

Сведения о инициаторных путях ингибирования и активации апоптоза В-клеток панкреатических островков посредством TRAIL-индуцированного апоптоза позволяют использовать их как потенциальную мишень для создания новых противодиабетических лекарственных препаратов.

Результаты исследования могут быть использованы в научных целях и патологоанатомической практике для оценки патоморфоза эндокринной части поджелудочной железы в результате лечения сахарного диабета.

Работа носит фундаментальный характер и представляет развернутую морфологическую характеристику тканевых, клеточных, иммуногистохимических, ультраструктурных и морфометрических изменений в эндокринном аппарате поджелудочной железы в условиях моделирования сахарного диабета и при его лекарственном патоморфозе.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Комплексные морфофункциональные изменения, выявленные в островковом аппарате поджелудочной железы на различных моделях экспериментального сахарного диабета отражают основные этапы его морфогенеза и лекарственного патоморфоза.
  2. В условиях моделирования сахарного диабета различными селективными в-цитотоксическими веществами определяются различные пути активации апоптоза эндокриноцитов В островков Лангерганса, выявляемые с помощью иммуногистохимического метода.
  3. Лекарственный патоморфоз эндокринной части поджелудочной железы при различных экспериментальных моделях сахарного диабета характеризуется значимыми морфофункциональными изменениями, определяемыми с помощью биохимических, гистологических, иммуногистохимических, электронно-микроскопических, морфометрических методов, что отражает динамику процессов повреждения и регенерации эндокриноцитов и зависит от механизма действия используемых лекарственных средств.

Публикации и апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 42 печатных работы (в т.ч. в журналах перечня ВАК – 14 и 1 монография). Результаты диссертации докладывались и обсуждались в материалах: научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции» (Волгоград, 2005); II Всероссийской конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты эндокринопатий» (Белгород, 2006); XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 2007); «The next line of defense» International conference on diabetes. Synergy and strategy (Анталия, Турция, 2007); III Съезда Фармакологов России «Фармакология – практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); II Международной научной конференции "Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений" (Алматы, Казахстан, 2007); Международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения» (Гродно, Беларусь, 2007); IV Всероссийского диабетологического конгресса (Москва, 2008); IV Конгрессе международной ассоциации морфологов (Москва, 2008); IX Конгресса международной ассоциации морфологов (Бухара, Узбекистан, 2008); Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов (Красноярск, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (Чита, 2008); Всероссийской научной конференции по патологической анатомии (Санкт-Петербург, 2009); Российско-Белорусской научно-практической конференции «Роль коммуникационных систем в развитии опухолевых процессов» (Смоленск, 2009); 56 и 57 Региональной научно-практической конференции ВолгГМУ (Волгоград 2009 и 2010); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 2010); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); X Конгресса международной ассоциации морфологов «Функциональная морфология человека и животных» (Ярославль, 2010); Научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН (Курск, 2011); Ежегодной научно-практической конференции «Биомедицина и биомоделирование» (Москва, 2011); Российско-Индийской выставке-семинаре «От генериков к инновационным препаратам» (Волгоград, 2011); III Эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио-2011» (Ханты-Мансийск, 2011); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии. Геронтологические аспекты патологических процессов» (Волгоград, 2012). Апробация работы состоялась 24.03.2012 г. на заседании межкафедральной научной конференции с участием кафедр ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздравсоцразвития России и лабораторий ГБУ ВМНЦ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 264 страницах машинописного текста, иллюстрирована 54 таблицами, 66 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, практических рекомендаций и выводов. Список литературы включает 325 источников (из них - 93 отечественных и 232 иностранных).

Материалы и методы исследования.

Эксперименты выполнены на 610 половозрелых нелинейных белых крысах самцах массой от 280,0 до 300,0 г (табл. 1). Животные содержались в стандартных условиях вивария кафедры фармакологии ВолгГМУ на диете для лабораторных животных согласно ГОСТ Р50258 - 92. Проведение экспериментальной части исследования одобрено решением регионального независимого этического комитета (протокол №1-06; №43-2006; №70-2008; №89-2009) и выполнены согласно методическим руководствам и нормативным документам: правила лабораторной практики (GLP) при проведении доклинических исследований в РФ; Федеральный закон "О лекарственных средствах" N86-ФЗ от 22.06.1998 (Собрание законодательства РФ от 29.06.1998 г., N26, ст. 3006; от 13.01.2003 г. N2 ст. 167; от 10.01.2000 г., N2, ст. 126; от 07.01.2002 г. (Часть I), N1, ст. 2) и положение о Министерстве здравоохранения РФ, утвержденное постановлением Правительства РФ от 29.04.2002 N 284 (Собрание законодательства РФ, 06.05.2002 г., N18, ст. 1771), а также в соответствии с ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96. На момент проведения экспериментов животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было. Все манипуляции с животными проводили с соблюдением международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных (1997).

Таблица 1

Распределение животных по экспериментальным группам

Группы

Время наблюдения, сутки

Количество животных

Интактный контроль

3, 7, 14, 21, 28

50

Аллоксан-индуцированный СД

3, 7, 14, 28

50

Аллоксан-индуцированный СД+инкретиномиметики

3, 7, 14, 28

50

Стрептозотоцин-индуцированный СД

7, 21

30

Стрептозотоцин-индуцированный СД +инкретиномиметики

7, 21

30

Иммунозависимый СД

3, 7, 14, 21

50

Иммунозависимый СД+инкретиномиметики

3, 7, 14, 21

50

Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД

3, 7, 21, 28

50

Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+бигуаниды

3, 7, 21, 28

50

Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+препараты сульфонилмочевины 2-го поколения

3, 7, 21, 28

50

Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+ингибиторы дипептидилпептидазы IV типа

3, 7, 21, 28

50

Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+антиоксиданты

3, 7, 21, 28

50

Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+секретогены

3, 7, 21, 28

50

ВСЕГО

610

При проведении эксперимента у лабораторных животных контролировали массу тела, объём потребляемой жидкости, проводили глюкозотолерантный тест, а так же определяли уровень кетоновых тел в моче по стандартным методикам. В эксперимент производился отбор животных с уровнем сахара крови не ниже 15 ммоль/л., то есть крысы с индуцированным сахарным диабетом [Akbarzadeh A. et al., 2007]. Содержание гликозилированного гемоглобина (HbA1c) определяли методом катион-обменной хроматографии низкого давления со стандартными наборами («Фосфосорб», Россия). Концентрацию инсулина и С-пептида определяли в плазме крови брюшной аорты крыс на автоматическом иммуноферментном анализаторе «SUNRISE» фирмы TECAN (Австрия) с использованием наборов DRG Insulin Elisa Kit и DRG C-peptide Elisa Kit.

Экспериментальные формы сахарного диабета1:

Аллоксан-индуцированный СД вызывали внутрибрюшинным введением аллоксана в дозе 120 мг/кг [Srinivasan K., Ramarao P., 2007] с последующим введением экстракта Гимнемы лесной (перорально 280 мг/кг водного раствора, 2 р/сут.). Забор тканей для патогистологического исследования осуществляли на 3, 7, 14 и 28 сутки. Стрептозотоцин-индуцированный СД моделировали однократной в/в инъекцией стрептозотоцина (45 мг/кг) [Баранов А.Г., 1985]. На фоне развития диабета осуществляли введение экстракта Гимнемы лесной (перорально 280 мг/кг, 2 р/сут.). Забор тканей для патогистологического исследования осуществляли на 7 и 21 сутки. Иммунозависимый СД осуществляли инъекцией 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда п/к с последующими ежедневными в/в введением стрептозотоцина 20 мг/кг в течение 5 суток [Ziegler B. et al., 1990]. На фоне развития иммунозависимого СД осуществляли введение экстракта Гимнемы лесной (per os 280 мг/кг, 2 р/сут.). Забор тканей для патогистологического исследования осуществляли на 3, 7, 14 и 21 сутки. Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД вызывали инъекцией стрептозотоцина (интраперитониально – 65 мг/кг) с предварительным (за 15 минут) введением никотинамида (интраперитониально – 230 мг/кг на 0,9% р-ре хлорида натрия) [Islam S. et al. 2007]. На фоне развития экспериментального диабета осуществляли введение: Метформин («Харман Файнокем», Индия) (интрагастрально, с 7 сут. после моделирования СД, в течение 28 сут. 1 р/сут. по 100 мг/кг); Глибенкламид («Hyderabad-500082», Индия) (интрагастрально, с 7 суток после моделирования СД, в течение 28 суток 1 р/сут. по 5 мг/кг); Диабенол («ООО След», Россия) (интрагастрально, с 7 сут. после моделирования СД, в течение 28 сут. 1 р/сут. по 25 мг/кг); Ванадий содержащий комплекс (интрагастрально, 100 мг/кг ежедневно в течение 14 сут., с 3 сут. после введения стрептозотоцина); Гликлазид (интрагастрально, 7,5 мг/кг, ежедневно в течение 14 суток, с 3 суток после введения стрептозотоцина); -липоевая кислота (18 мг/кг). Забор тканей для гистологического исследования осуществляли на 3, 7, 21 и 28 сутки (табл. 2).

Таблица 2

Антидиабетические лекарственные средства (ЛС) и лекарственные вещества (ЛВ), используемые для лечения экспериментального сахарного диабета

№ п/п

Группы антидиабетических ЛС и ЛВ

ЛС, ЛВ

1.

Лекарственные средства, повышающие секрецию инсулина (секретогены)

Производные сульфонилмочевины (ПСМ)

1. Глибенкламид

2. Гликлазид

3. Диабенол

2.

Лекарственные средства, преимущественно повышающие чувствительность периферических тканей к инсулину (сенситайзеры действия инсулина)

Бигуаниды

Метформин

3.

Лекарственные вещества, преимущественно повышающие чувствительность периферических тканей к инсулину (сенситайзеры действия инсулина)

Соли ванадия

Ванадий содержащий комплекс

4.

Антиоксиданты

Липоевая кислота

-липоевая кислота

5.

Инкретиномиметики

Гимнемовые кислоты

экстракт Гимнемы лесной

       Морфологические методы исследования:

Для патогистологического исследования поджелудочную железу разделяли на три фрагмента: кишечную, желудочную и селезеночную, затем фрагменты фиксировали в 10% р-ре нейтрального забуференного формалина. Парафиновые срезы монтировали на предметные стёкла, обработанные адгезивным покрытием. Микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятым методикам [Коржевский Д.Э., 2005]. Иммуногистохимическое исследование выполнено в лаборатории морфологии и иммуногистохимии ГБУ ВМНЦ. Для типирования А- и В-клеток островков использовали первичные антитела к инсулину и глюкагону, для изучения апоптоза и пролиферативной активности - первичные антитела к про- и антиапоптогенным белкам (табл. 3).

Иммуногистохимическое исследование проводили в соответствии с протоколами фирм производителей с использованием систем детекции ABC, «UltraVision, «EnVision» и хромогеном – диаминобензидином (ДАБ), используя протокол высокотемпературной демаскировки антигенов [Kumar G.L. et al., 2009]. Характер иммуногистохимической реакции оценивали с помощью визуально-аналоговой шкалы по Allred D.C. et al. (1998) или определяли удельное количество позитивно окрашенных клеток стандартизированными методами морфометрии в иммуногистохимии с помощью системы анализа изображений [Dabbs D.J., 2010].

Таблица 3

Первичные антитела, используемые при проведении ИГХ

№ п/п

Антитела

Клон

Производитель

1.

Инсулин

Поликлональные

DakoCytomation, Дания

клон Ab-6 (INS04 + INS05)

LabVision, Великобритания

2.

Глюкагон

Поликлональные

Novocastra, Великобритания

3.

Каспаза-3

JHM62

Novocastra, Великобритания

Rb-1197-P0

NeoMarkers, США

4.

TRAIL(апоптоз индуцирующий лиганд фактора некроза опухоли)

27B12

Novocastra, Великобритания

5.

MDM2

1B10

Novocastra, Великобритания

6.

Bcl-2

sc-7382

Santa Cruz Biotechnology, США

7.

p53

(Pab 240) MS-104-P0

NeoMarkers, США

8.

Bax

Поликлональные

BD Biosciences Pharmingen, США

9.

PCNA

Поликлональные

Dako Cytomation, Дания

(PC10) MS-106-P0

NeoMarkers, США

10.

Ki-67 (ядерный антиген пролиферирующих клеток)

MIB-1

Dako Cytomation, Дания

MM1

Novocastra, Великобритания

11.

NOS-3 (эндотелиальная NO-синтаза)

RN5

Novocastra, Великобритания

12.

NF-kB (ядерный фактор kB)

Поликлональные

DiagnosticBioSystems, США

Для выявления олигонуклеосомальной фрагментации ДНК in situ2 В-клеток панкреатических островков выполняли TUNEL-метод (терминальное дезоксиуридиновое нуклеотидное мечение «концов» с проявлением меченых биотином диаминобензидином) по стандартной методике [Петров С.В., Райхлин Н.Т. 2004].

Электронно-микроскопическое исследование3 выполнено на фрагментах поджелудочной железы фиксированных в 4% р-ре параформа с последующей постфиксацией в 1% растворе тетраокиси осмия. После заливки в эпон-аралдит изготавливали полутонкие срезы с окраской метиленовым синим. Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5%-м растворе уранилацетата на 50о этаноле в течение 40 минут и 0,3%-м растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ.

Морфометрический анализ проводили с помощью компьютерной программы «Видео ТестМорфо-4» (Россия). Определяли объемную долю (ОД, %) островков по отношению к экзокринной части железы; площадь островков (S, мкм2), объёмную долю эндокриноцитов А и В по отношению к площади островков (ОД, %), удельное количество В-клеток панкреатических островков по отношению ко всей клеточной популяции островков (%), площадь ядер эндокриноцитов В (S, мкм2), а также объёмную долю (ОД, %) и диаметр (Д, нм) секреторных гранул при ультраморфометрии. Проводили определение индекса апоптоза и пролиферации, путем подсчёта каспаза-3-, TUNEL-, Ki-67-, и PCNA-позитивных эндокриноцитов панкреатических островков от общего количества клеток островков (%).

Результаты экспериментов обрабатывались методами базисного статистического анализа на ПК с использованием программ Excel Microsoft Office (Microsoft, USA) и STATISTICA 6.0 (Stat Soft Inc., USA). Анализ параметров при нормальном распределении значений проводили с помощью критерия Стьюдента с вероятностью ошибки р<0,05, анализ непараметрических количественных признаков - с помощью критерия Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков использовали критерии 2 и Фишера. Проводили анализ корреляционной зависимости между морфометрическими и иммуногистохимическими показателями [Кучеренко В.З., 2006].

Результаты исследования и их обсуждение.        Развитие аллоксан-, стрептозотоцин-, стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного и иммунозависимого СД по сравнению с контрольной интактной группой животных сопровождалось статистически достоверными (р<0,05) изменениями клинико-биохимическими показателей: снижением массы тела, увеличением потребления жидкости, гипергликемией и уменьшением концентрации инсулина и С-пептида плазмы крови, увеличением концентрации гликозилированного гемоглобина.

Течение аллоксан-индуцированного диабета во все сроки наблюдения сопровождалось микроскопически явлениями полнокровия, отека и деструктивных изменений панкреатических островков с тенденцией к уменьшению на 14 сутки эксперимента. Морфометрически с 7 по 14 сутки эксперимента отмечалось статистически достоверное уменьшение объёмной доли и удельного количества В-клеток и достоверное увеличение объёмной доли А-клеток желудочного и селезеночного отделов поджелудочной железы. На 21 сутки объёмная доля и удельное количество В-клеток были достоверно снижены во всех отделах, а объёмная доля А-клеток - увеличена. Достоверных изменений в объёмной доле островков их размеров и площади ядер не отмечалось на протяжении всего эксперимента. При иммуногистохимическом исследовании наряду с выраженными некротическими изменениями клеток островков поджелудочной железы определялось увеличение апоптогенной активности эндокриноцитов в период с 7 по 14 сутки. Отмечалось умеренное цитоплазматическое окрашивание при использовании антител к каспазе-3, Bax и негативное окрашивание к белкам p53, TRAIL и Bcl-2. Различия интенсивности иммунного окрашивания клеток, вступающих в апоптоз при определении белка р53 и каспазы 3, вероятнее всего, можно объяснимы тем, что активация апоптоза не сопровождается накоплением протеина р53 в количествах необходимых для его визуализации или осуществляется без его участия. Каспаза 3, напротив, является ключевым ферментом каскадного цикла, участвующим в протеолизе белков ядра и цитоплазмы клетки, и может экспрессироваться не только при активации гена р53, но и при активации других сигнальных путей [Петров С.В., Райхлин Н.Р., 2004]. В эндотелии кровеносных капилляров визуализировалась умеренная экспрессия эндотелиальной NOS-3, что согласуется с литературными данными об участии оксида азота (NO) в цитотоксических эффектах, так как низкая концентрация NO в клетках ингибирует индуцибельные формы NO-синтазы, уменьшая повреждение ДНК [Cnop M., 2008]. Индекс апоптоза по сравнению с интактной группой достоверно увеличивался во все сроки наблюдения и достигал максимума (17,4±0,9%) на 7 сутки. Происходило уменьшение экспрессии ядерных белков NF-kB и MDM2, что свидетельствовало о развитии оксидативного стресса [Mariappan N., 2010]. К 21 суткам интенсивность экспрессии маркеров апоптоза значительно уменьшалась. При проведении TUNEL-метода, обнаруживалось увеличение количества клеток с позитивно окрашенными ядрами во все сроки эксперимента (рис. 1). Начиная с 7 суток эксперимента, в панкреатических островках происходило достоверное увеличение (р<0,05) количества PCNA-позитивных клеток по отношению к интактной группе. Достоверных изменений количества Ki-67-позитивных эндокриноцитов по сравнению с группой интактного контроля не отмечалось на протяжении всего эксперимента (рис. 2). Увеличение количества PCNA-позитивных клеток на фоне низкой пролиферативной активности можно расценивать как активацию внутриклеточных репаративных процессов в эндокриноцитах В, т.к. ядерный антиген пролиферирующих клеток экспрессируется не только при делении клеток, но и при репарации ДНК [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004;        Essers J. et al., 2005].

Из литературных данных известно, что токсичность аллоксана обусловлена образованием активных форм кислорода и перекиси водорода, что сопровождается окислением SH-групп белков и повреждением ДНК, с выраженным развитием некротических изменений В-клеток [Szkudelski T., 2001; Szkudelski T., 2012]. Однако, важным эффектом аллоксановой цитотоксичности является нарушение интрацеллюлярного гомеостаза кальция, что влечет за собой поступление кальция из внеклеточной жидкости и его мобилизацией из внутриклеточных депо, в силу деполяризации клеточных мембран и мембран митохондрий В-клеток [                Sakurai K. et al., 2001; Srinivasan K., Ramarao P., 2007]. На этом фоне сверхсинтез белка-промотора Вах приводит к дестабилизации мембран митохондрий с высвобождение цитохрома С в цитоплазму и активацией эффекторных каспаз [Wu H.C., et al., 2011], что ведет к завершению митохондриального сигнального пути апоптоза, вызванный повреждением ДНК [Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003;        Nakayama T. et al., 2004; Karp G., 2010].

Развитие стрептозотоцин-индуцированного СД сопровождалось характерными патогистологическими изменениями в виде выраженных некробиотических изменений эндокриноцитов островков в период с 7 по 21 сутки эксперимента. По сравнению с интактным контролем начиная с 7 суток происходило статистически значимое уменьшение объёмной доли и удельного количества В-клеток во всех изучаемых отделах железа, с достоверным увеличением объёмной доли А-клеток только в селезеночном отделе. В островках селезеночного отдела поджелудочной железы также прослеживалось увеличение площади ядер эндокриноцитов. Иммуногистохимически в большинстве эндокриноцитов отмечалось выраженное иммунное окрашивание к проапоптотическим белкам - каспаза-3, TRAIL, NOS-3 и Bax на 7 сутки, которое уменьшалось к 21 суткам эксперимента.

В многочисленных экспериментах показано, что основной причиной индуцированной стрептозотоцином гибели B-клеток является алкилирование ДНК за счет образования таких токсических соединений как супероксид анион, пероксинитрит и оксид азота [Bedoya F. et al., 1996; Elsner M. et al., 2000]. Таким образом, избирательная цитотоксичность стрептозотоцина обусловлена разрушением системы антиоксидантной защиты и фрагментацией ДНК B-клеток и не имеет индивидуальной вариабельности, так как он повреждает В-клетки у всех животных разных видов [Morgan N.G. et al., 1994]. На клеточном уровне токсические эффекты стрептозотоцина реализуются за счет развития некротических процессов и апоптоза. Выраженная экспрессия проапоптогенных протеинов каспаза-3 и TRAIL свидетельствует об инициации внешнего рецепторного пути активации апоптоза, так как экстрацеллюлярная активация апоптоза осуществляется в результате взаимодействия специфических лигандов с соответствующими клеточными рецепторами, в том числе и TRAIL [Baud V., Karin M., 2001; Alladina S.J. et al., 2005; Кротова Ю.Н., Каркищенко В.Н., Хлопонин Д.П., 2005; Князькин И.В., Цыган В.Н., 2007]. Доказано, что активация каспазного каскада может осуществляться при экспрессии протеина TRAIL, однако, эффективность TRAIL-индуцированного апоптоза определяется процессами синтеза и распада эндогенного фактора NF-kB [Рыжов С.В., Новиков В.В., 2002; Alladina S.J. et al. 2005]. Протеин NF-kB один из главных внутриклеточных мишеней при гипергликемии и окислительном стрессе, который играет ключевую роль в реакции воспаления, иммунном ответе и апоптозе В-клеток [Evans J. L., 2002]. Известно, что ингибирование синтеза белка NF-kB защищает в-клетки панкреатических островков человека от рецепторного пути активации апоптоза [Giannoukakis N. et al., 2000        ], также имеются экспериментальные данные по ингибированию индуцированного фактором NF-kB В-клеточного апоптоза на очищенной культуре инсулиноцитов крыс [Heimberg H. et al., 2001; Maedler K. et al., 2002].

TUNEL-позитивные клетки обнаруживались как в центральных, так и в периферических отделах островков на протяжении всего периода исследования. Экспрессия протеинов Bcl-2, MDM2, NF-kB была значительно снижена. На 7 сутки статистически достоверно увеличивался индекс апоптоза с тенденцией к уменьшению к 21 суткам наблюдения (рис. 1). Во все сроки наблюдения отмечалось умеренная экспрессия эндотелиальной NOS-3 в капиллярах панкреатических островков, что расценивается как признак эндотелиальной дисфункции [Calles-Escandon J., 2001; Hadi A.R., 2007]. PCNA- и Ki-67-позитивно окрашенные клетки определялись в составе эндокриноцитов панкреатических островков, а также встречались единичные иммунопозитивные клетки среди ацинарной ткани и эпителия внутридольковых протоков, что свидетельствует об активации регенераторных процессов. Однако, наличие единичных внеостровковых инсулиноцитов может встречаться в поджелудочной железе интактных животных [Trucco М., 2005].

По сравнению с контрольной интактной группой индекс пролиферации оставался достоверно выше (рис. 2). Что согласуется с литературными данными о подавлении синтеза ДНК и пролиферации клеток, ингибированием митоза и активацией апоптоза на фоне действия стрептозотоцина [Szkudelski T., 2012].

Патогистологические изменения при иммунозависимом диабете во все сроки наблюдения свидетельствовали о значительном уменьшении объёмной доли и удельного количества В-клеток на 46,7 % (Р<0,01) и на 67,5 % (Р<0,01) соответственно по сравнению с контрольной группой, за счёт выраженных некробиотических изменений клеток и воспалительной инфильтрации панкреатических островков на 7 и 14 сутки. В селезеночном отделе железы на протяжении всего периода наблюдения отмечалось статистически значимое увеличение объёмной доли эндокриноцитов А, а на 21 сутки - в желудочном. С 14 суток определялись частично склерозированные островки. При электронной микроскопии отмечалось набухание митохондрий, кариопикноз, визуализировались фрагменты разрушенной гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС) и комплекса Гольджи (КГ). В отдельных эндокриноцитах В ядерный хроматин конденсировался и располагался в периферических отделах ядра, в цитоплазме отмечалось появление единичных липидных включений, элементы ГЭС и КГ были резко расширены и вакуолизированы. Секреторные гранулы располагались неравномерно в виде небольших скоплений у разных полюсов клетки, их объемная доля составляла 10,3%, а диаметр 302,5±43,4 нм. Аналогичные ультрамикроскопические изменения инсулиноцитов обнаруживаются при исследовании биопсий поджелудочной железы человека и экспериментальных животных при сахарном диабете [Севергина Э.С., 2002; Pavelka M., 2010].

При иммуногистохимическом исследовании во все сроки эксперимента отмечалось отсутствие или сомнительная экспрессия протеинов p53, Bax, MDM2 и Bcl-2 в единичных инсулоцитах. В большинстве эндокриноцитов В на 7 и 14 сутки происходило увеличение экспрессии проапоптогенного протеина TRAIL и каспазы 3 с незначительным уменьшением к 21 суткам, увеличение TUNEL-позитивных ядер, визуализирующихся во многих островковых клетках. Разница в количестве TUNEL-позитивных клеток и клеток, экспрессирующих каспазу-3, объяснима с позиций развития стадий апоптоза. По литературным данным процесс апоптоза занимает несколько часов, в течение которых последовательно осуществляются все стадии запрограммированной клеточной гибели: сигнальная, эффекторная и деградация [Karp G., 2010;        Reed J.C., Green D.R., 2011]. Однако активация эффекторной каспазы-3 осуществляется раньше, чем происходит олигонуклеосомальная фрагментация ДНК, чем и обусловлена разница в количестве В-клеток, выявляемых при проведении иммуногистохимического исследования и гибридизации in situ [        Манских В.Н., 2004].

Индекс апоптоза во все сроки наблюдения был достоверно увеличен по сравнению с интактной контрольной группой (рис. 1). Усиливалась экспрессия NO-синтазы в эндотелии капилляров панкреатических островков во все сроки наблюдения. Отмечалась умеренная экспрессия факторов пролиферации клетках островков Лангерганса. Достоверное увеличение PCNA-позитивных клеток отмечалось на протяжении всего эксперимента, а Ki-67-позитивных - только на 14 сутки (рис. 2).

При экспериментальном стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете отмечались мозаичные незначительные деструктивные изменения эндокриноцитов панкреатических островков с уменьшением удельного количества В-клеток на 21,8 % (р<0,05) во всех отделах поджелудочной железы и объемной доли на 26,9 и 27,4%, соответственно, в желудочном и селезеночном отделах на 21-28 сутки эксперимента. При этом определялось увеличение площади ядер В-клеток на протяжении всего наблюдения и во всех отделах железы. В части островков на 21-28 сутки исследования визуализировались очаговые склеротические изменения. Выявлялось умеренное количество TUNEL-позитивных ядер эндокриноцитов в части панкреатических островков. При иммуногистохимическом исследовании во все сроки эксперимента отмечалось отсутствие или сомнительная экспрессия проапоптогенных протеинов, за исключением умеренно выраженной экспрессии каспазы-3. Индекс апоптоза был незначительный (рис. 1). Достоверных изменений с контрольной интактной группой в экспрессии протеинов Ki-67 и PCNA не отмечалось на протяжении всего эксперимента (рис. 2).

В отличие от модели стрептозотоцин-индуцированного диабета превентивное введение никотинамида непосредственно перед инъекцией стрептозотоцина, минимизирует его повреждающее действие и оказывает цитопротективное действие на инсулиноциты островков Лангерганса. Механизм действия никотинамида связан с угнетением активности поли (АДФ-рибозо) полимеразы и (моно)АДФ-рибозилтрансфераз, что предотвращает снижение уровня NAD+ и АТФ в В-клетках и препятствует их некрозу [Полторак В.В., 2001; Szkudelski Т., 2012]. В литературе описаны важные цитопротекторные свойства никотинамида, которые заключаются в снижении повреждений ДНК, обусловленных действием стрептозотоцина [Bedoya F.J. et al., 1996; Chi T.S. et al., 2007]. По данным ряда авторов, терапия никотинамидом приводит к существенному увеличению частоты клинической ремиссии СД со снижением потребности в экзогенном инсулине [Pozzilli P., 1997; Crino A., 2004]. Однако клинико-экспериментальные исследования о профилактическом действии никотинамида противоречивы и требуют дальнейшего уточнения.

       

Рис. 1. Сравнительная характеристика индекса апоптоза эндокриноцитов при экспериментальном сахарном диабете. Примечание: Аллоксан – аллоксан-индуцированный диабет; СТЗ – стрептозотоцин-индуцированный диабет; Иммунозависимый – иммунозависимый диабет; СТЗ-НА - стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный диабет. * - достоверно по отношению к контролю.

Рис. 2. Сравнительная характеристика индекса пролиферации эндокриноцитов при экспериментальном сахарном диабете. Примечание: Аллоксан – аллоксан-индуцированный диабет; СТЗ – стрептозотоцин-индуцированный диабет; Иммунозависимый – иммунозависимый диабет; СТЗ-НА - стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный диабет. * - достоверно по отношению к контролю.

На фоне введения изучаемых групп лекарственных средств (сенситайзеры инсулина, антиоксиданты, секретогены, инкретиномиметики) отмечались статистически достоверные изменения в динамике клинико-биохимических показателей: увеличивалась массы тела (на 14 сутки), уменьшалось потребление жидкости (на 7 сутки), нормализовались уровень глюкозы крови (на 7 сутки), концентрация инсулина (на 7 сутки) и С-пептида (на 21 сутки) плазмы крови, уменьшался уровень гликозилированного гемоглобина (на 28 сутки).

Морфофункциональные изменения панкреатических островков под действием сенситайзеров инсулина (бигуаниды) на модели стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета.        При гистологическом исследовании в ткани поджелудочной железы признаки воспаления отсутствовали. Площадь панкреатических островков и их объёмная доля достоверно не изменялись как по отношению к интактному контролю, так и по отношению к группе диабета во все сроки наблюдения. Определялось достоверное уменьшение объёмной доли и удельного количества В-клеток по сравнению с интактной контрольной группой в селезеночном отделе на 7 и 21 сутки на 26,3% (р<0,05) и 21,5% (р<0,05) соответственно, а в желудочном на 21 сутки на 32,2% (р<0,05). При этом отмечалась статистически значимое увеличение площади ядер эндокриноцитов В во всех отделах железы с 7 по 21 сутки). По сравнению с группой сахарного диабета значимых статистических изменений морфометрических параметров не отмечалось. В отдельных островках определялись единичные TUNEL-позитивные В-клетки. При иммуногистохимическом исследовании во все сроки эксперимента отмечалась умеренно выраженная экспрессия каспазы-3. Индекс апоптоза был сопоставим с группой сахарного диабета (табл. 4). Достоверных изменений с контрольной группой и группой экспериментального диабета по уровню экспрессии протеинов Ki-67 и PCNA не отмечалось (табл. 4).

В последнее время широко применяется комбинированная терапия, включающая в себя, помимо ПСМ, несульфанилмочевинные стимуляторы секреции инсулина и бигуаниды, однако препараты этих групп могут оказывать действие только в присутствии эндогенного инсулина, восстанавливая раннюю секрецию инсулина. Бигуаниды не обладают панкреатотропным действием, а снижают гипергликемию путём угнетения образования глюкозы (глюконеогенеза) в печени, т.е. подавляют глюконеогенез в печени и увеличивают периферическую утилизацию глюкозы [Kirpichnikov D. et al., 2002; Robinson J.T. et al., 2005]. Учитывая литературные данные об отсутствии достоверных изменений в уровне апоптотической и пролиферативной активности В-клеток, увеличение площади ядер эндокриноцитов В во всех отделах железы вполне объяснимо с позиций их компенсаторной гипертрофии.

Таблица 4

Динамика пролиферативной активности и индекса апоптоза эндокриноцитов панкреатических островков при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения сенситайзеров инсулина (бигуаниды).

Группы

Длительность эксперимента, сутки

Индекс апоптоза, % каспаза-3 позитивных клеток

Индекс пролиферации, %

PCNA-позитивные клетки

Ki-67-позитивные клетки

Интактный контроль

7

3,9±0,1

2,8±1,0

1,2±0,3

14

4,2±1,0

3,2±0,7

1,4±0,4

21

4,0±1,1

3,1±1,0

1,6±0,2

28

3,6±0,9

2,9±1,3

0,9±1,1

СД

7

7,7±1,6*

5,3±2,2*

2,0±1,8

14

8,1±1,9*

9,2±1,6*

2,2±1,4*

21

7,3±1,6*

10,3±1,5*

2,4±1,5

28

6,2±2,1

3,5±2,7

1,9±1,2

СД+сенситайзер инсулина (метформин)

7

5,7±0,2

4,2±1,2

2,0±1,0

14

6,8±1,4

3,9±2,5

2,3±1,6

21

4,9±1,3

4,1±1,6

1,9±1,3

28

5,8±2,3

5,0±1,7

2,1±1,7

* - достоверно по отношению к интактному контролю (р<0,05).

Морфофункциональные изменения панкреатических островков под действием сенситайзеров инсулина (ванадий содержащий комплекс) на модели стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета. При микроскопическом исследовании отмечалось умеренное полнокровие капилляров островков. ОД островков по отношению к интактному контролю достоверно снижалась в желудочном и селезеночном отделах, а по сравнению с группой животных с экспериментальным диабетом – достоверно увеличивалась только в селезеночном отделе железы. Определялась мозаичность повреждения островков и эндокриноцитов: нормальные по гистологическому строению островки чередовались с островками с признаками деструкции (ранние сроки наблюдения) или с частично склерозированными островками в отдаленные сроки эксперимента. Отмечено увеличение площади ядер инсулиноцитов на 23,9% (р<0,05) в кишечном отделе железы по сравнению с интактным контролем. При иммуногистохимическом исследовании выявлялись единичные TUNEL-позитивные клетки. В отдельных эндокриноцитах определялась незначительная экспрессия каспазы-3. Индекс апоптоза был низкий, пролиферативная активность увеличивалась незначительно (табл. 5). Таким образом, структурные изменения поджелудочной железы на фоне введения ванадий содержащего комплекса характеризуются не только увеличением объёмной доли панкреатических островков, но и гипертрофией их ядер.

Таблица 5

Динамика пролиферативной активности и индекса апоптоза эндокриноцитов панкреатических островков при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения сенситайзеров инсулина (ванадий содержащий комплекс).

Группы

Длительность эксперимента, сутки

Индекс апоптоза, % каспаза-3 позитивных клеток

Индекс пролиферации, %

PCNA-позитивные клетки

Ki-67-позитивные клетки

Интактный контроль

7

3,9±0,1

2,8±1,0

1,2±0,3

14

4,2±1,0

3,2±0,7

1,4±0,4

21

4,0±1,1

3,1±1,0

1,6±0,2

28

3,6±0,9

2,9±1,3

0,9±1,1

СД

7

7,7±1,6*

5,3±2,2*

2,0±1,8

14

8,1±1,9*

9,2±1,6*

2,2±1,4*

21

7,3±1,6*

10,3±1,5*

2,4±1,5

28

6,2±2,1

3,5±2,7

1,9±1,2

СД+ сенситайзер инсулина (ванадий содержащий комплекс)

7

5,7±0,2

5,3±1,2

2,2±1,1

14

6,8±1,4

4,9±2,4

2,4±1,2

21

4,9±1,3

5,1±1,2

2,9±1,4

28

5,8±2,3

5,2±1,4

2,2±1,3

* - достоверно по отношению к интактному контролю (р<0,05).

Морфофункциональные изменения панкреатических островков под действием секретогенов (производные сульфонилмочевины) на модели стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета. При микроскопическом исследовании отмечались мозаичные изменения в виде деструкции единичных В-клеток отдельных островков в ранние сроки наблюдения и очаговые склеротические изменения в поздние сроки. По отношению к интактному контролю объемная доля островков Лангерганса оставалась достоверно уменьшена, а по сравнению с СД - достоверно увеличивалась. Происходило уменьшение удельного количества и ОД В-клеток во всех отделах железы с достоверным увеличением по отношению к контрольной группе площади ядер В-клеток на протяжении всего эксперимента. Индекс апоптоза составлял от 2,4% до 4,5% (табл. 6), т.к. определялись единичные TUNEL-позитивные и каспазы-3 позитивные клетки. Индекс пролиферации был сопоставим с группой СД (табл. 6).

Таблица 6

Динамика пролиферативной активности и индекса апоптоза эндокриноцитов панкреатических островков при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения секретогенов (производные сульфонилмочевины).

Группы

Длительность эксперимента, сутки

Индекс апоптоза, % каспаза-3 позитивных клеток

Индекс пролиферации, %

PCNA-позитивные клетки

Ki-67-позитивные клетки

Интактный контроль

7

3,9±0,1

2,8±1,0

1,2±0,3

14

4,2±1,0

3,2±0,7

1,4±0,4

21

4,0±1,1

3,1±1,0

1,6±0,2

28

3,6±0,9

2,9±1,3

0,9±1,1

СД

7

7,7±1,6*

5,3±2,2*

2,0±1,8

14

8,1±1,9*

9,2±1,6*

2,2±1,4*

21

7,3±1,6*

10,3±1,5*

2,4±1,5

28

6,2±2,1

3,5±2,7

1,9±1,2

СД+секретогены (производные сульфонилмочевины)

7

2,4±1,2

4,3±1,4

1,7±1,1

14

3,8±2,4

4,5±1,3

1,4±1,2

21

4,5±2,3

4,2±1,2

2,0±1,1

28

4,3±1,3

5,1±1,5

2,2±1,7

* - достоверно по отношению к интактному контролю (р<0,05).

Поскольку производные сульфонилмочевины (ПСМ) влияют на способность стимулировать секрецию инсулина В-клетками поджелудочной железы [Eherli A.M., 1990; Мамедов М.Н., 2006] результатом их действия становится высвобождение запасов инсулина из внутриклеточных гранул и выброс инсулина в кровь [Галстян Г.Р., 2007]. Проведенные ранее гистологические исследования инсулярного аппарата поджелудочной железы на интактных животных выявляли панкреатотропное действие препаратов сульфонилмочевины 2-го поколения, которое заключалось в гипертрофии островков и В-клеток, слабой активации пролиферативных процессов, усилении миграции секреторных гранул и высвобождении инсулина с последующим истощением функционального резерва инсулиноцитов [Pfeiffer E.F. et al., 1974; Балаболкин М.И., 2007; Уильямз Г., Пикап Д., 2007]. Результаты нашего исследования указывают на возможность развития аналогичных структурных изменений островкового аппарата при патоморфозе стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета.

Морфофункциональные особенности панкреатических островков при введении секретогенов (Диабенол) на модели стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета. На протяжении всего эксперимента при гистологическом исследовании определялись мозаичные структурные изменения (некротические и склеротические изменения). При морфометрическом анализе были выявлены статистически недостоверные изменения в виде увеличение ОД островков, удельного количества и ОД В-клеток по отношению к группе с диабетом. Отмечалось статистически достоверное увеличение площади ядер В-клеток во всех отделах железы на 23,8%. Индексы апоптоза и пролиферации изменялись незначительно по сравнению с группой сахарного диабета (табл. 7).

В проведенных исследованиях установлено, что диабенол усиливает секрецию инсулина, усиливает биологическое действие инсулина на периферические ткани при СД и проявляет антиагрегантную активностью [Спасов А.А. с соавт., 1999; Kirpichnicov D. et al., 2002; Дедов И.И. с соавт., 2008; Fisman E.Z., Tenenbaum A., 2009]. Ранее полученные экспериментальные данные по изучению механизмов действия свидетельствуют о присутствии как панкреотропных, так и экстрапанкреатических эффектов у диабенола. В экспериментах по исследованию секретогенной активности диабенола в ответ на его внутривенное введение, наблюдалось увеличение инсулина в крови, сочетающееся с сахароснижающим эффектом, что является прямым доказательством инсулинотропного эффекта, основанного на стимулировании функционально способных В-клеток островков Лангерганса [Дудченко Г.П., 2001]. В наших исследованиях патогистологические изменения инсулярного аппарата в виде увеличения ОД островков, удельного количества и ОД В-клеток, увеличение площади ядер В-клеток, подтверждают возможность увеличения синтетической активности инсулиноцитов под влиянием диабенола.

Таблица 7

Динамика пролиферативной активности и индекса апоптоза эндокриноцитов панкреатических островков при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения секретогенов (Диабенол).

Группы

Длительность эксперимента, сутки

Индекс апоптоза, % каспаза-3 позитивных клеток

Индекс пролиферации, %

PCNA-позитивные клетки

Ki-67-позитивные клетки

Интактный контроль

7

3,9±0,1

2,8±1,0

1,2±0,3

14

4,2±1,0

3,2±0,7

1,4±0,4

21

4,0±1,1

3,1±1,0

1,6±0,2

28

3,6±0,9

2,9±1,3

0,9±1,1

СД

7

7,7±1,6*

5,3±2,2*

2,0±1,8

14

8,1±1,9*

9,2±1,6*

2,2±1,4*

21

7,3±1,6*

10,3±1,5*

2,4±1,5

28

6,2±2,1

3,5±2,7

1,9±1,2

СД+секретоген (Диабенол)

7

6,5±1,2

5,1±1,3

2,1±1,2

14

7,9±2,4

3,7±1,5

2,5±1,7

21

5,7±2,3

4,0±1,7

1,5±1,0

28

6,8±2,9

4,9±1,3

2,4±1,6

* - достоверно по отношению к интактному контролю (р<0,05).

Морфофункциональные изменения панкреатических островков под действием антиоксидантов (-липоевая кислота) на модели стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета. При морфологическом исследовании в ранние сроки эксперимента в отдельных островках поджелудочной железы определялись признаки незначительного полнокровия, отека и перифокальной инфильтрацией макрофагами и единичными нейтрофильными гранулоцитами. К 21 суткам эксперимента в островках Лангерганса определялись участки очагового склероза. Происходило увеличение удельного количества В-клеток в панкреатических островках, особенно выраженные в желудочном и селезеночном отделах на 14,2% и 13,3% (р<0,05). При этом, по сравнению с группой диабета, не обнаруживалось достоверного увеличения объёмной доли, а значимое уменьшение площади ядер отмечалось только в селезеночном отделе на 16,0% (р<0,05). Индексы апоптоза и пролиферации были сопоставимы с группой сахарного диабета (табл. 8). Таким образом, при курсовом пероральном введении антиоксидантов наблюдались мозаичные патогистологические изменения, достоверно увеличивалось удельное количество и ОД эндокриноцитов В по отношению к группе с сахарным диабетом, сохранялись признаки умеренной гипертрофии ядер инсулиноцитов. Введение антиоксидантов не препятствовало уменьшению объёмной доли панкреатических островков.

Таблица 8

Динамика пролиферативной активности и индекса апоптоза эндокриноцитов панкреатических островков при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения антиоксидантов (-липоевая кислота).

Группы

Длительность эксперимента, сутки

Индекс апоптоза, % каспаза-3 позитивных клеток

Индекс пролиферации, %

PCNA-позитивные клетки

Ki-67-позитивные клетки

Интактный контроль

7

3,9±0,1

2,8±1,0

1,2±0,3

14

4,2±1,0

3,2±0,7

1,4±0,4

21

4,0±1,1

3,1±1,0

1,6±0,2

28

3,6±0,9

2,9±1,3

0,9±1,1

СД

7

7,7±1,6*

5,3±2,2*

2,0±1,8

14

8,1±1,9*

9,2±1,6*

2,2±1,4*

21

7,3±1,6*

10,3±1,5*

2,4±1,5

28

6,2±2,1

3,5±2,7

1,9±1,2

СД+антиоксиданты (-липоевая кислота)

7

5,4±2,2

3,1±1,3

1,9±1,1

14

5,4±2,4

2,7±1,5

1,3±1,2

21

4,2±1,1

3,2±2,6

1,7±1,0

28

3,8±1,3

4,1±2,0

1,5±1,3

* - достоверно по отношению к интактному контролю (р<0,05).

Учитывая низкий уровень содержания антиоксидантных ферментов, становится понятной, высокая чувствительность инсулиноцитов поджелудочной железы к повреждающему действию свободных радикалов, что влечет снижение экспрессии инсулина и активации апоптоза [Чистяков Д.А., 2000; Robertson R.P., 2004; Robertson R.P., 2007]. Являясь антиоксидантом, липоевая кислота способна реализовывать свое действие как в цитозоле, так и на уровне плазматической мембраны, препятствуя свободно-радикальным процессам вызванным введением цитотоксических агентов для моделирования СД [Biewenga G.,1997]. В эксперименте на моделях сахарного диабета 1 и 2 типа липоевая кислота проявляла гипогликемическую активность, вероятно связанную с активацией трансмембранного транспорта глюкозы и некоторых этапов сигнального каскада инсулина [Чепляева Н.И., 2012]. Способность ЛК предотвращать окислительное повреждение островков поджелудочной железы была продемонстрирована в экспериментах на животных. ЛК защищала клетки поджелудочной железы от токсического действия стрептозотоцина и тем самым способствовала снижению уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина [Budin S.B., 2007], что подтверждается в наших исследованиях структурными изменениями в виде увеличения удельного количества В-клеток в желудочном и селезеночном отделах железы.

Морфофункциональные особенности панкреатических островков при введении инкретиномиметиков (экстракт гимнемы лесной) на модели аллоксан-индуцированного диабета. При патогистологическом исследовании отмечалось восстановление ОД островков кишечного отдела железы на 21 сутки эксперимента. Происходило увеличение ОД и удельного количества В-клеток желудочного, селезеночного отделов на 7, 14 и 21 сутки, с параллельным уменьшением ОД А-клеток желудочного, селезеночного отделов на 7 сутки и во всех отделах на 21 сутки наблюдения. При этом статистически значимое увеличение площади ядер В-эндокриноцитов отмечалась на 14 сутки только в желудочном отделе на 16,9% (р<0,05). Курсовое введение гимнемовых кислот способствовало достоверному снижению индекса апоптоза во все сроки эксперимента по сравнению с группой аллоксан-индуцированного диабета наиболее выраженному на 7 сутки (табл. 9). Происходило уменьшение Ki-67-позитивных эндокриноцитов наравне с увеличением PCNA-позитивных клеток (на 62,3% и на 14,6% соответственно), что свидетельствовало об активации репаративных процессов в инсулоцитах панкреатических островков с одной стороны, и активации пролиферации с другой [Karp G., 2010]. При сопоставлении динамики изменений в индексах апоптоза и пролиферации была выявлена статистически значимая (р<0,05) обратная корреляционная зависимость (табл. 9).

Морфофункциональные особенности панкреатических островков при введении инкретиномиметиков (экстракт гимнемы лесной) на модели стрептозотоцин-индуцированного диабета. Микроскопически отмечалось достоверное увеличение ОД панкреатических островков во всех отделах железы на 21 сутки эксперимента. Определялось статистически значимое увеличение ОД и удельного количества эндокриноцитов В островков кишечного, желудочного и селезеночного отделов во все сроки наблюдения, с уменьшением ОД А-клеток во всех отделах на 14 и 21 сутки. Возникало достоверное снижение индекса апоптоза на 37,8% в сочетании с достоверным увеличением индекса пролиферации во все сроки наблюдения максимально на 39,1% по сравнению с группой иммунозависимого сахарного диабета (табл. 9).

Морфофункциональные особенности панкреатических островков при введении инкретиномиметиков (экстракт гимнемы лесной) на модели иммунозависимого диабета. На 7 сутки в панкреатических островках на фоне выраженной инфильтрации лимфоцитами, нейтрофильными гранулоцитами и макрофагами, полнокровия капилляров отмечалась выраженная деструкция эндокриноцитов. Изменения в ОД островков, их площади, ОД А-клеток были не достоверны по отношению к группе интактного контроля и группе иммунозависимого сахарного диабета на протяжении всего эксперимента, однако, ОД и удельное количество эндокриноцитов В достоверно увеличивались по отношению к группе иммунозависимого сахарного диабета во всех отделах железы. Ядра инсулоцитов находились в состоянии умеренной гипертрофии, о чем свидетельствовало увеличение, занимаемой ими площади. Инсулиноциты, с большим количество инсулин-позитивных включений, располагались поодиночке или в виде мелких скоплений в центральных отделах островков. Глюкагон-позитивные клетки визуализировались на периферии панкреатических островков. В период с 14 по 21 сутки эксперимента определялись единичные мелкие островки Лангерганса, которые располагались в тесной связи с внутридольковыми выводными протоками. Сохранялись явления полнокровия капилляров островков, неравномерного отёка и их воспалительной инфильтрации во всех отделах железы, однако эти изменения были менее выражены, чем в группе без фармакологической коррекции. В отдельных островках на 21 сутки наблюдения определялся очаговый склероз. Визуализировались островки содержащие только эндокриноциты В. Экспрессия факторов пролиферации носила выраженный характер: PCNA-позитивные клетки составляли 13,1±1,9% (р<0,05), Ki-67-позитивные – 3,2±0,2% (р<0,05), что на 12,9% и 39,1% было выше, чем в группе с СД (табл. 9). Выявлялись PCNA-позитивные и Ki-67-позитивные клетки эпителия протоков и единичные клетки, расположенные в ацинарной ткани и в непосредственной близости от островков. Известно, что белок PCNA, в отличие от протеина Ki-67, экспрессируется не только на протяжении всего цикла клеточного деления, но также активно участвует в репарации ДНК [Rosa M.A., Galli M., Fadda G. et al., 2000; Paunesku T., Mittal S., Proctiс M. et al., 2001], поэтому высокий уровень экспрессии PCNA в наших исследованиях, можно расценивать как подтверждение регенерации в ткани поджелудочной железы при моделировании сахарного диабета [Papadopoulos I., Rudolph P., Wirthetal B., 1996; Beer T. et. al., 1998]. Экспрессия белков p53, Bcl-2 носила слабо выраженный характер, Bax – негативное окрашивание. В большинстве В-клеток островков Лангерганса нарастала экспрессия протеина MDM2. В единичных В-инсулоцитах панкреатических островков отмечалась слабая экспрессия каспазы 3 и TRAIL, количество TUNEL-позитивных клеток было уменьшено (р<0,05) по сравнению с группой диабета. Количество В-клеток в состоянии апоптоза по сравнению с животными с иммунозависимым СД достоверно уменьшалось (табл. 9). При ультрамикроскопическом исследовании, выявлено, достоверное уменьшение количества эндокриноцитов В по отношению к группам сравнения с признаками конденсации хроматина ядер, наличием липидных включений в цитоплазме, расширением и вакуолизацией компонентов ГЭС, КГ и отсутствием секреторных гранул. Секреторные гранулы располагались у одного из полюсов клетки и занимали ОД до 15,6±1,0%, диаметр секреторных гранул составлял 393,2±41,6 нм, что на 4,6% и 3,6% соответственно выше по сравнению с контрольной группой.

Механизм действия инкретиномиметиков заключается в стимулировании глюкозозависимой секреции инсулина и в значительной степени потенцировании инсулинотропной активности самой глюкозы; в замедлении скорости опорожнения желудка, снижении желудочной и панкреатической секреции. Инкретиномиметики влияют на прандиальный подъем уровня глюкозы; на регуляцию пищевого поведения через центральные механизмы регуляции центра насыщения; снижают апоптоз В-клеток, увеличивают массу В-клеток из клеток предшественниц эпителия панкреатического протока, способствуя трансформации неин-сулинпродуцирующих клеток в инсулинпродуцирующие, неогенезу и пролиферации островков из стволовых клеток поджелудочной железы [Mier J.J. et al., 2001; David J.A., 2005; Rummey C., 2006; Hou J. et al., 2007]. Экспериментально установлено, одним из направлений восстановления нарушенного каскадного механизма действия инсулина, сопровождающегося инсулинорезистентностью, является регуляция количества инкретинов, в частности GLP-1 [Karasik A. et al., 2006].

Таблица 9

Динамика пролиферативной активности и индекса апоптоза эндокриноцитов панкреатических островков на фоне введения инкретиномиметиков.

Группы

Длительность эксперимента, сутки

Индекс апоптоза, % каспаза-3 позитивных клеток

Индекс пролиферации, %

PCNA-позитивные клетки

Ki-67-позитивные клетки

Интактный контроль

3

4,1±0,2

3,0±0,2

1,5±0,3

7

3,9±0,1

2,8±1,0

1,2±0,3

14

4,2±1,0

3,2±0,7

1,4±0,4

21

4,0±1,1

3,1±1,0

1,6±0,2

28

3,6±0,9

2,9±1,3

0,9±1,1

Аллоксан-индуцированный СД

3

10,2±1,2*

4,2±0,3*

2,1±0,4

7

17,4±0,9*

7,5±1,2*

4,3±2,2

14

14,9±1,0*

6,3±1,4

3,2±1,2

21

12,5±0,6*

5,5±0,9*

2,5±1,0

Аллоксан-индуцированный СД+экстракт гимнемы лесной

3

5,2±1,2**

5,1±1,2

1,7±1,1

7

6,1±1,8**

6,4±1,3

1,6±1,0

14

5,8±1,6**

5,7±1,2

1,7±0,9

21

4,7±2,0**

5,6±1,1

1,8±1,0

СТЗ-индуцированный СД

7

35,2±2,9*

10,1±0,7*

2,3±0,1*

14

27,4±2,3*

8,2±2,0*

2,0±0,8*

21

26,3±2,0*

7,4±1,9*

1,7±1,0

СТЗ-индуцированный СД+экстракт гимнемы лесной

7

13,3±1,1**

13,1±1,9

3,2±0,2**

14

13,9±1,3**

14,2±2,3

3,1±0,9**

21

14,1±1,4**

9,0±4,2

3,2±1,2**

Иммунозависимый СД

7

35,2±2,9*

10,1±0,7*

2,3±0,1*

14

33,2±2,1*

9,8±1,0*

2,2±1,0*

21

29,4±3,4*

7,8±1,1*

2,1±1,2*

Иммунозависимый СД+экстракт гимнемы лесной

7

13,3±1,1**

13,1±1,9

3,2±0,2**

14

14,5±2,1**

12,8±1,1

3,1±2,3**

21

15,2±1,7**

13,4±2,5

3,0±2,1**

* - достоверно по отношению к интактному контролю (р<0,05); ** - достоверно по отношению к группе СД (р<0,05).

Способность инкретиномиметиков влияют на секрецию GLP-1, посредством которого усиливается секреторная активность, активируется регенерация В-клеток, а также ингибируется апоптоз подтверждена многими исследователями [Gymnema Lawrence Rev. 1993; Kieffer T.J., 2005; Kim D., 2005]. Полученные результаты вполне согласуются с литературными данными о способности инкретинов не только увеличивать уровень секреции инсулина, но и снижать скорость апоптоза В-эндокриноцитов, а также стимулировать их пролиферацию [Fushiki T. et al., 1992]. Предполагается, что фармакологические эффекты при применении инкретиномиметиков реализуются с помощью следующих механизмов: модуляция активности инкретинов; стимуляция секреции и высвобождения инсулина; регенерация В-клеток островков Лангерганса [Shanmugasundaram E.R., 1990]. Кроме того, в наших исследованиях на моделях аллоксан-, стрептозотоцин-индуцированного и иммунозависимого СД при применении инкретиномиметиков определены морфологические признаки достоверного увеличения секреторной активности и регенерации В-клеток со снижением индекса апоптоза инсулиноцитов. Возможность регенерации эндокриноцитов В путем неогенеза панкреатических островков из эпителия протоков, ациноинсулярной трансформации или по альтернативному пути – дифференцировке клеток-предшественниц, расположенных в панкреатических островках, обусловлена особенностями эмбрионального развития железы и сохранением клеток-предшественниц [Иванова В.Ф., Пузырев А.А., 2006]. Полученные нами результаты вполне согласуются с материалами исследования, в котором авторы предложили, что применение инкретиномиметиков увеличивало уровень инсулина, за счет регенерации В-клеток поджелудочной железы, а не за счёт истощающей секреции инсулина [Chattopadhyay R.R., 1998; Ogawa Y., 2004]. Значит, есть вероятность того, что гипертрофия эндокриноцитов В происходит за счет повышения секреции GLP-1 и GIP [Murakami N., 1996].

Таким образом, результаты эксперимента свидетельствуют о том, что антидиабетические эффекты препаратов с инкретиномиметическим действием проявляются на различных моделях экспериментального диабета в виде повышения статистически достоверных структурных изменений: восстановления ОД островков на 21 сутки эксперимента; увеличения ОД и удельного количества В-клеток на 7, 14 и 21 сутки во всех отделах; уменьшения ОД А-клеток желудочного, селезеночного отделов на 7 сутки и во всех отделах на 21 сутки. Курсовое введение инкретиномиметиков вызывало достоверное снижение индекса апоптоза и способствовало репаративной регенерации в-эндокриноцитов (увеличение индекса пролиферации) во все сроки наблюдения.

Изучение структурных преобразований в эндокринном аппарате поджелудочной железы при сахарном диабете представляет собой динамически развивающийся процесс, который требует исследования особенностей морфофункциональных изменений при разработке новых антидиабетических лекарственных средств. Поэтому сопоставление структурных изменений в В-клетках в одном исследовании на всех моделях экспериментального сахарного диабета без лечения и при его фармакологической коррекции практически невозможно. Нами проведено выявление фенотипических особенностей эндокриноцитов В с использованием комплексного многоуровневого морфологического анализа, включающего иммуногистохимическое, электронно-микроскопическое исследование и количественную обработку данных, что позволило выявить на моделях цитотоксически-индуцированного сахарного диабета различные пути реализации повреждения В-клеток, в т.ч. апоптоза, а также охарактеризовать закономерности репаративных изменений в островковом аппарате поджелудочной железы с учётом её зональности.

Выводы

  1. Морфофункциональные изменения при аллоксан-индуцированном сахарном диабете характеризуются патогномоничными клинико-лабораторными признаками, а также преобладанием некротических изменений в В-клетках с уменьшением их объёмной доли на 16,7 и 35,7% (р<0,05) и удельного количества на 53,3 и 56,8% (р<0,05) на 7 и 21 сутки соответственно в селезеночном отделе, относительным увеличением объёмной доли А-клеток и статистически значимым увеличением индекса апоптоза в 4,5 раза (р<0,05) на 7 сутки по сравнению с контрольной группой.
  2. Структурные изменения при стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете сопровождаются достоверными изменениями динамики биохимических показателей, характеризуются сочетанием некротических изменений с активацией апоптоза В-клеток (увеличение индекса апоптоза в 8,3 раза (р<0,05) на 7 сутки по сравнению с контрольной группой). Во всех отделах поджелудочной железы происходит уменьшение объёмной доли, удельного количества и гипертрофия ядер эндокриноцитов В во все сроки наблюдения на фоне увеличения PCNA-позитивных и Ki-67 клеток (максимально в 6,5 и 7,8 раза соответственно на 7 сутки), а также увеличение объёмной доли А-клеток, что свидетельствует о селективном повреждении инсулиноцитов и активации в них регенераторных процессов.
  3. Развитие иммунозависимого сахарного диабета по сравнению с контрольной группой сопровождается уменьшением объёмной доли эндокриноцитов В на 46,7%, развитием воспалительной реакции (инсулитов) с инфильтрацией островков лимфоцитами, нейтрофильными гранулоцитами и макрофагами, выраженными некротическими изменениями на фоне активации апоптоза в В-клетках, начиная с 7 суток (увеличение в 7,3 раза каспаза-3 и в 4,3 раза TUNEL-позитивных клеток).
  4. Морфофункциональные изменения при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном сахарном диабете характеризуются мозаичностью процессов повреждения эндокринного аппарата с наличием незначительных некротических изменений в отдельных островках, статистически достоверным уменьшением объёмной доли инсулиноцитов селезеночного отдела (на 7 и 21 сутки), уменьшением удельного количества, гипертрофией ядер и умеренной активацией апоптоза (увеличение TUNEL-позитивных клеток на 30 % по сравнению с контрольной группой) в В-клетках всех отделов поджелудочной железы.
  5. Реализация запрограммированной клеточной смерти при аллоксан-индуцированном сахарном диабете осуществляется посредством активации внутреннего сигнального пути апоптоза при увеличении экспрессии митохондриального проапоптогенного белка Bax. При моделировании сахарного диабета введением стрептозотоцина индукция апоптоза происходит за счёт активации внешнего сигнального пути посредством TRAIL-рецепторов.
  6. При введении бигуанидов и производных сульфонилмочевины 2-го поколения животным со стрептозотоцин-никотинамид-индуцированным сахарным диабетом в панкреатических островках сохраняются комплексные патогистологические изменения (мозаичность некротических изменений в отдельных островках, уменьшение объёмной доли и удельного количества В-клеток, гипертрофией их ядер и активацией апоптоза), характерные для данной модели заболевания, что свидетельствует о слабой выраженности лекарственного патоморфоза эндокринной части.
  7. Структурные изменения эндокринной части поджелудочной железы при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения сенситайзеров инсулина (ванадий содержащий комплекс) сопровождаются достоверным увеличением объёмной доли панкреатических островков, выраженной гипертрофией ядер В-клеток, сохранением высокого уровня каспаза-3 и TUNEL-позитивных клеток по сравнению с группой интактного контроля и сахарного диабета.
  8. Морфофункциональные изменения у животных с моделью стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета при введении антиоксидантов характеризуется статистически значимым увеличением удельного количества и объёмной доли эндокриноцитов В на фоне гипертрофии их ядер по сравнению с крысами диабетиками. Происходит снижение степени выраженности апоптотических процессов на 13,2% (р<0,05) по сравнению с группой экспериментального диабета.
  9. Лекарственный патоморфоз при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения секретогенов характеризуется наличием морфологических изменений эндокринного аппарата поджелудочной железы характерных для индуцированного диабета с сохранением мозаичных структурных изменений В-эндокриноцитов и сопровождается гипертрофией их ядер с выраженным цитоплазматическим накоплением инсулинпозитивного материала.
  10. При аллоксан-индуцированном, стрептозотоцин-индуцированном и иммунозависимом сахарном диабете на фоне введения инкретиномиметиков на 7 сутки достоверно снижается индекс апоптоза в 4,5 раза (р<0,05) и 3,8 (р<0,05) соответственно, определяемый с помощью выявления каспаза-3 и TUNEL-позитивных клеток. Происходит статистически значимое увеличение объёмной доли островков, удельного количества В-клеток, во все сроки наблюдения, увеличение количества PCNA-, Ki-67-позитивных эндокриноцитов В на 13,1% и 3,2% соответственно по сравнению с группой животных с сахарным диабетом, что отражает блокаду апоптоза (гиперэкспрессия MDM2, NF-kB) и активацию репаративной регенерации В-клеток.
  11. При проведении комплексного сравнительного анализа для верификации патогистологических изменений, характерных для патоморфогенеза сахарного диабета и лекарственного патоморфоза эндокринного аппарата поджелудочной железы на экспериментальных моделях, наиболее информативными дифференциально-диагностическими критериями являются: объёмная доля, удельное количество, относительная площадь ядер В-клеток, индексы апоптоза и пролиферации (по результатам иммуногистохимического исследования и гибридизации in situ).
  12. Фенотипическая вариабельность инсулиноцитов панкреатических островков в различных отделах поджелудочной железы позволяет рассматривать их как ключевой морфофункциональный субстрат реализации клеточного повреждения (некроз, апоптоз) при действии В-цитотоксических веществ и развитии лекарственного патоморфоза. На фоне введения различных групп противодиабетических лекарственных средств и лекарственных веществ отмечается различная степень изменений морфофункциональных показателей, активация компенсаторно-приспособительных процессов (гипертрофия ядер, увеличение объёмной доли В-клеток) и репаративной регенерации (увеличение индекса пролиферации и экспрессии PCNA).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Снигур Г.Л. Использование экстракта гимнемы лесной в лечении сахарного диабета / А.А. Спасов, М.П. Самохина, В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур // Материалы научно-практической конференции. Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции. – Волгоград. – 2005. – С. 104-105.
  2. Снигур Г.Л. Морфологические особенности панкреатических островков крыс при моделировании стрептозотоцин-индуцированного иммунозависимого сахарного диабета на фоне применения экстракта гимнемы лесной / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Самохина, А.Е. Буланов // Материалы II Всероссийской конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты эндокринопатий». – Белгород. – 2006. – С. 88-92.
  3. Снигур Г.Л. Использование раствора – gewf для макроскопической оценки поджелудочной железы у крыс с экспериментальным сахарным диабетом / Г.Л. Снигур, М.П. Самохина // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области. – 2006. - №4. – С. 23-24.
  4. Снигур Г.Л. Влияние Диа- на регенерацию -клеток поджелудочной железы / М.П. Самохина, А.А. Спасов, Г.Л. Снигур, В.Б. Писарев, В.А. Косолапов // Информационный бюллетень Российского НИИ здоровья. – 2006. - №1. – С. 6-7.
  5. Снигур Г.Л. Гипогликемические свойства экстракта Гимнемы лесной / А.А. Спасов, М.П. Самохина, В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, Д.Ю. Агарков, Е.В. Сорокина, А.Е. Буланов // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2007. - №1. - (21).- С.79-82.
  6. Snigur G.L. Antidiabetic properties of Dia-: experimental and clinical investigation. The next of defense / A.A. Spasov, V.A. Kosolapov, M.P. Samokhina, V.B. Pisarev, G.L. Snigur, A.E. Bulanov, M.E. Balabolkin // Intertational conference on diabetes. Synergy and strategy. – 2007. – Р. 11-12.
  7. Снигур Г.Л. Влияние гимнемы лесной на регенерацию -клеток поджелудочной железы / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Самохина, В.А. Косолапов, А.Е. Буланов // XIV Национальный конгресс «Человек и лекарство». – 2007. – С. 863.
  8. Снигур Г.Л. Противодабетические свойства Диа-в: экспериментальные и клинические исследования / А.А. Спасов, В.А. Косолапов, М.П. Самохина, В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.Е. Буланов, М.И. Балаболкин // Материалы международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения». – Гродно. – 2007. – С. 152-154.
  9. Снигур Г.Л. Особенности распределения панкреатических островков крыс в норме и при моделировании сахарного диабета / Г.Л. Снигур, П.О. Матвеев, В.Н. Довженко, А.В. Новикова, М.П. Озёрина // Материалы 65-й итоговой научной конф. студентов и молодых учёных ВолГМУ. – Волгоград. – 2007. – С. 181-182.
  10. Снигур Г.Л. Влияние на регенерацию в-клеток поджелудочной железы комплексного препарата «Диа-» / М.П. Самохина, А.А. Спасов, Г.Л. Снигур, В.Б. Писарев, А.Е. Буланов // Материалы II международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений». – Алмата. – 2007. – С. 135.
  11. Снигур Г.Л. Влияние препарата «Диа-» стимуляцию секреции инсулина, ингибирование апоптоза и стимуляцию репаративных процессов в эндокриноцитах / А.А. Спасов, М.П. Самохина, Г.Л. Снигур, В.Б. Писарев, А.Е. Буланов // Материалы III съезда фармакологов России. Фармакология – практическому здравоохранению. – Санкт-Петербург. – 2007. – Т.7 (2). – С. 1964.
  12. Снигур Г.Л. Ультраструктурные изменения -клеток поджелудочной железы крыс при моделировании сахарного диабета на фоне введения препарата "Диабета" / А.А. Спасов, Г.Л. Снигур, М.П. Самохина, А.Е. Буланов, А.Я. Почепцов // Морфология. 2008. Т.133. - №2. С. 127.
  13. Снигур Г.Л. Влияние препарата «Диабета» на апоптоз в-эндокриноцитов / Г.Л. Снигур, В.Б. Писарев, А.А. Спасов, М.П. Самохина, А.Е. Буланов // Морфология. 2008. Т.133. - №4. С. 93.
  14. Снигур Г.Л. Структурные изменения в островках Лангерганса при экспериментальном сахарном диабете на фоне введения биологически активной добавки на основе гимнемы лесной / Г.Л. Снигур, М.П. Самохина, В.Б. Писарев, А.А. Спасов, А.Е. Буланов // Морфология. 2008. - Т. 133. - №1. С. 60-64.
  15. Снигур Г.Л. Фармакологическая коррекция апоптоза Гимнемовыми кислотами / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, М.П. Самохина, А.Е. Буланов // Материалы IV всероссийского диабетологического конгресса. – Москва. – 2008. – С. 335.
  16. Снигур Г.Л. Механизмы токсического действия стрептозотоцина на в-клетки островков Лангерганса / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Самохина, А.Е. Буланов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. Т.148. - №12. С. 700-702.
  17. Снигур Г.Л. Влияние экстракта гимнемы лесной на регенерацию В-клеток панкреатических островков при экспериментальном сахарном диабете / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Самохина, А.Е. Буланов // Материалы всероссийской научно-практической конференции. Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины. – Чита. – 2008. – С. 202-203.
  18. Снигур Г.Л. Структурные изменения эндокриноцитов поджелудочной железы при диабете на фоне введения гимнемовых кислот / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Самохина, А.Е. Буланов // Проблемы и перспективы современной морфологии. Сб. науч. трудов 1. – Томск. – 2008. – С. 40-41.
  19. Снигур Г.Л. Особенности цитотоксического действия аллоксана на В-клетки панкреатических островков / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Самохина // Проблемы и перспективы современной морфологии. Сб. науч. трудов 1. – Томск – 2008. – С. 41-42.
  20. Снигур Г.Л. О возможности применения автоматизированного морфометрического анализа микропрепаратов при проведении иммуногистохимического исследования эндокриноцитов панкреатических островков / Г.Л. Снигур // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. – 2008. - №3. – С. 59.
  21. Снигур Г.Л. Клеточная гибель В-эндокриноцитов панкреатических островков, обусловленная аллоксановой цитотоксичностью / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Самохина // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. – 2008. - №4. – С. 24-25.
  22. Снигур Г.Л. Ультрамикроскопические изменения в-эндокриноцитов при сахарном диабете на фоне введения гимнемовых кислот / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Самохина, А.Е. Буланов // Материалы всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова. – СПб. – 2009. – С. 96-98.
  23. Снигур Г.Л. Ультраструктурные изменения В-клеток панкреатических островков при сахарном диабете на фоне введения БАД Диабета / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Самохина, А.Е. Буланов // Морфологические ведомости. 2010. - №1. С. 78-81.
  24. Снигур Г.Л. Влияние гимнемовых кислот на гибель и репарацию В-эндокриноцитов при стрептозотоци-индуцированном диабете / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Воронкова, А.Е. Буланов // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2010. - №1 (33). С. 38-40.
  25. Снигур Г.Л. Пролиферативные и антиапоптогенные свойства гимнемовых кислот / А.А. Спасов, В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, М.П. Воронкова // Сборник научных трудов. Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии / под ред. В. И. Петрова. – Волгоград. – 2010. – С. 132-136.
  26. Снигур Г.Л. Профилактика сахарного диабета типа 1 с помощью антиоксидантных веществ в эксперименте / Е.В. Тибирькова, В.А. Косолапов, А.А. Спасов, Г.Л. Снигур, В.А. Анисимова // Сборник научных трудов / Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии / под ред. В. И. Петрова. – Волгоград. – 2010. – С. 139-145.
  27. Снигур Г.Л. Особенности развития апоптоза эндокриноцитов островков Лангерганса при экспериментальном сахарном диабете / Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Воронкова // Морфология. Т 137. - №4 2010. С. 175.
  28. Снигур Г.Л. Особенности повреждения и регенерации В-клеток панкреатических островков при экспериментальном сахарном диабете / Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Воронкова, А.Е. Буланов // Сборник научных трудов VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. – Москва. – 2010. – С. 232-233.
  29. Снигур Г.Л. Алгоритм патогистологического исследования эндокринного аппарата поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете / Г.Л. Снигур, А.В. Смирнов // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. – 2010. - №3 – С. 58-59.
  30. Снигур Г.Л. К вопросу стандартизации патогистологической диагностики сахарного диабета / Г.Л. Снигур, А.В. Смирнов // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2010. Т.35. - №3. С. 112-115.
  31. Снигур Г.Л. Свободнорадикальные процессы в ткани поджелудочной железы при моделировании экспериментального диабета типа 2 / Н.И. Чепляева, М.В. Чепурнова, Г.Л. Снигур, М.П. Воронкова // Сб. науч. трудов «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранения Волгоградской обл.». – Волгоград. – 2010. – С. 240-241.
  32. Снигур Г.Л. Структурные изменения в поджелудочной железе при алиментарном дефиците магния / Е.С. Голубева, Г.Л. Снигур // Сб. науч. трудов 68 научно-практической конф. молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». – Волгоград. – 2010. – С. 220.
  33. Снигур Г.Л. Протекторное действие нового производного [1,2-А]бензимидазола при интоксикации стрептозотоцином / Е.В. Тибирькова, Г.Л. Снигур // Сборник научных трудов 68-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». – Волгоград. – 2010. – С. 184.
  34. Снигур Г.Л. Патоморфоз экспериментального сахарного диабета / Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Воронкова // Университетская наука: Взгляд в будущее / Материалы итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвящённой 76-летию Курского гос. мед. университета / Курск. – 2011. – Т.I.– С. 383-386.
  35. Снигур Г.Л. Лекарственный патоморфоз экспериментального сахарного диабета / Г.Л. Снигур, А.В. Смирнов, А.А. Спасов, М.П. Воронкова // Вестник новых медицинских технологий. 2011 Т.ХVIII. - № 2 С. 169-173.
  36. Снигур Г.Л. Экспериментальная модель сахарного диабета типа 2 / А.А. Спасов, М.П. Воронкова, Г.Л. Снигур, Н.И. Чепляева, М.В. Чепурнова // Биомедицина. 2011. - №3. С. 12-19.
  37. Снигур Г.Л. Гимнема лесная, как источник для создания гипогликемических средств / А.А. Спасов, М.П. Воронкова, Г.Л. Снигур // Вестник ВолгГМУ: приложение (Материалы Российско-Индийской выставки-семинара «От генериков к инновационным препаратам»). – Волгоград. – 2011. – С. 41-43.
  38. Снигур Г.Л. Особенности структурных изменений поджелудочной железы при фармакологической коррекции экспериментального сахарного диабета / Г.Л. Снигур, А.В. Смирнов // Морфология. 2011. Т.140. - №5. С. 115-116.
  39. Снигур Г.Л. Изучение влияния сулодексида на эндотелий зависимую вазодилатацию мозговых сосудов у животных со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.А. Слиецанс, Е.В. Петрова, Г.Л. Снигур // Сахарный диабет. 2011. Т.52. - №3. С. 12-15.
  40. Снигур Г.Л. Влияние мексидола и сулодексида на уровень специфических маркеров развития эндотелиальной дисфункции у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.А. Слиецанс, Г.Л. Снигур // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2012. - №5. Т. 75. С. 14-16.
  41. Снигур Г.Л. Апоптоз В-инсулоцитов панкреатических островков и пути его фармакокоррекции / Г.Л. Снигур, А.А. Спасов, М.П. Воронкова // Бюллетень Волгоградского медицинского научного центра. – 2012. - №2 – С 6-8.

Монографии:

  1. Снигур Г.Л. Гимнема лесная (ботаника, фармакогнозия, фармакология, клиническая эффективность): Монография / А.А. Спасов, М.П. Воронкова, Г.Л. Снигур, Д.Ю. Агарков // под общей редакцией академика РАМН А.А. Спасова. – Волгоград: Изд-во ВолгГМУ. – 2012. – 200 с.

1 Выражаем благодарность заведующему кафедрой фармакологии ВолгГМУ, академику РАМН, ЗДН РФ, д.м.н., профессору А.А. Спасову, д.б.н., доценту М.П. Воронковой, к.м.н. ассистенту М.В. Чепурновой, к.м.н., ассистенту Н.И. Чепляевой за помощь в проведении исследования.

2 Выражаем благодарность заведующему лабораторией патоморфологии ФГУП НИИ гигиены, токсикологии и проф. патологии ФМБА России А.Я. Почепцову и н.с. Ю.И. Великородной за помощь в проведении исследования.

3 Выражаем благодарность сотруднику лаборатории морфологии и иммуногистохимии Волгоградского медицинского научного центра н.с., к.м.н. М.В. Шмидту за помощь в проведении исследования.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.