WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

  На правах рукописи

                               

Гичкун Ольга Евгеньевна

Клиническое значение

растворимой формы лиганда CD40

при трансплантации печени

детям раннего возраста

  14.01.24 -  ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ И ИСКУССТВЕННЫЕ ОРГАНЫ

  14.03.10 -  КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

 

Москва – 2012

Работа выполнена в ФГБУ

«Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России

и ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия

последипломного образования» Минздрава России

Научные руководители:

Доктор медицинских наук,  Долгов Владимир

профессор  Владимирович

Академик РАМН,

доктор медицинских наук, Готье Сергей

профессор  Владимирович

Официальные оппоненты:

Чжао Алексей Владимирович — доктор  медицинских  наук, профессор, заместитель  директора  по научной работе ФГБУ  «Институт хирургии имени А. В. Вишневского» Минздрава России

Сухоруков Владимир Сергеевич — доктор медицинских  наук,

профессор, руководитель  научно-исследовательской  лаборатории  общей патологии  ФГБУ  «Московский  научно-исследовательский институт педиатрии и детской  хирургии» Минздрава России

Ведущая организация: ФГБУ  «Российский  научный  центр  радиологии

и хирургических технологий» Минздрава России

Защита состоится 11 декабря 2012 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.055.01  при ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России

по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России

Автореферат разослан:  09 ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Шевченко

доктор медицинских наук, профессор Ольга Павловна



Актуальность темы

Трансплантация печени (ТП) – эффективный и единственный радикальный метод лечения цирроза печени в исходе врожденных и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы у детей раннего возраста. В России программа родственной трансплантации фрагмента печени детям осуществляется с 1997 года. В настоящее время в ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России ежегодно выполняется более 60 таких операций [Готье С.В. и соавт., 2012].

Успехи в осуществлении клинической трансплантации печени делают актуальными задачи, связанные с прогнозированием течения послеоперационного периода и отдаленных результатов трансплантации, оценки эффективности терапии.

В последние годы много исследований в клинической трансплантологии посвящено изучению эффективности биохимических и иммунологических маркеров, позволяющих осуществлять мониторинг посттрансплантационного периода с помощью неинвазивных (или малоинвазивных) лабораторных технологий. Особое место среди них занимает лиганд CD40 (CD40L), непосредственно участвующий в ключевых механизмах взаимоотношений трансплантата и организма реципиента.

Молекула CD154, или CD40L - трансмембранный гликопротеин, с молекулярной массой 33-39 кDa, член суперсемейства фактора некроза опухоли (ФНО). Влияние CD40L на функциональное состояние трансплантата печени может осуществляться различными путями. Взаимодействие CD40L, встроенного в мембрану Т-клетки, с рецептором CD40 на поверхности антигенпредставляющих клеток играет ключевую роль в костимуляции Т-лимфоцитов и регулирует важные механизмы отторжения/толерантности [Guo Y. et al., 1996]. Взаимодействие CD40L, находящегося на поверхности тромбоцитов, с рецептором CD40, встроенным в мембрану гепатоцита, может приводить к активации процессов Fas-опосредованного апоптоза и гибели гепатоцитов [Bhogal R.H. et al., 2012].

В кровотоке CD40L находится в виде растворимого фрагмента (soluble CD40L, sCD40L), секретируемого активированными Т-клетками и тромбоцитами [Daoussis D. et al., 2004].

Установлено, что измерение содержания в крови sCD40L позволяет прогнозировать развитие таких серьезных осложнений у реципиентов сердца, как развитие васкулопатии трансплантата, острая коронарная смерть и тромботические осложнения [Шевченко О.П. и соавт., 2008; Antoniades C. et al., 2009]. При трансплантации печени значение растворимой формы лиганда CD40 изучено недостаточно, подобных исследований при пересадке печени детям не проводилось.

Цель исследования

Оценить клиническое значение sCD40L при трансплантации печени детям с врожденными и наследственными заболеваниями гепатобилиарной системы.

Задачи исследования

  1. Оценить концентрацию sCD40L в плазме крови детей с циррозом печени в исходе врожденных и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы и охарактеризовать её связь с возрастом, полом, клиническими данными, результатами биохимических, общеклинических и коагулологических исследований.
  2. У детей с циррозом печени охарактеризовать связь концентрации sCD40L с уровнями биомаркеров активации клеток иммунной системы (растворимой формы CD30, sCD30, неоптерина), воспаления (С-реактивного белка), апоптоза (растворимых форм Fas, sFas, и лиганда Fas, sFasL).
  3. Выявить связь уровней sCD40L и гомоцистеина и оценить её возможное клиническое значение при трансплантации печени детям.
  4. У детей с циррозом печени оценить связь sCD40L с наличием аутоантител против антигенов системы HLA и их динамикой после трансплантации печени.
  5. Изучить изменения уровня sCD40L у реципиентов при трансплантации печени и доноров при резекции левого латерального сектора печени и их зависимость от течения посттрансплантационного периода.
  6. Охарактеризовать прогностическое значение уровня sCD40L, определяемого в плазме крови пациентов на этапе дотрансплантационного обследования.

Научная новизна исследования

Впервые выявлены различия референтных значений уровня sCD40L у детей и взрослых и установлено, что для детей характерны более высокие концентрации этого биомаркера. Впервые установлено, что содержание sCD40L в плазме крови детей с циррозом печени ниже, чем у здоровых детей того же возраста.

Новыми являются данные о динамике sCD40L после родственной трансплантации фрагмента печени детям младшего возраста: впервые обнаружена ее связь с течением посттрансплантационного периода; выявлено увеличение уровня sCD40L в плазме крови реципиентов печени при остром отторжении и снижение его после эффективного лечения.

Впервые установлено негативное прогностическое значение исходно высокого (2,6 нг/мл) уровня sCD40L у реципиентов печени и охарактеризована его связь с риском развития осложнений, сопровождающихся нарушением функции трансплантата.

Практическая значимость исследования

Обнаруженный факт возрастных различий содержания sCD40L в плазме крови имеет практическое значение при клинической интерпретации результатов исследований этого биомаркера у детей и взрослых, как до, так и после трансплантации.

Результаты исследования могут служить основанием для выявления на этапе дооперационного обследования пациентов с повышенным риском развития осложнений, сопровождающихся нарушением функции трансплантата в раннем посттрансплантационном периоде.

Измерение содержания sCD40L в плазме крови может быть полезным при контроле течения посттрансплантационного периода у реципиентов печени и коррекции проводимого лечения.


Положения, выносимые на защиту

1. Уровень sСD40L зависит от возраста: у детей концентрация выше, чем у взрослых. У детей с циррозом печени в исходе врожденных и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы уровень sCD40L ниже, чем у здоровых детей того же возраста.

2. Уровень sCD40L, определяемый на этапе дотрансплантационного обследования, имеет прогностическое значение: у детей с исходно высоким уровнем (2,6 нг/мл) выше риск развития осложнений, сопровождающихся нарушением функции трансплантата.

3. Изменение концентрации sCD40L после трансплантации печени связано с особенностями течения посттрансплантационного периода. Острое отторжение сопровождается значительным повышением уровня sCD40L и его снижением после успешного лечения.

Внедрение в практику

Результаты исследования используются в хирургическом отделении №2 отдела абдоминальной хирургии и трансплантации ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России, в учебном процессе на циклах повышения квалификации врачей на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России, на кафедре трансплантологии и искусственных органов лечебного факультета ГБОУ ВПО «Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 3 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 4 работы в зарубежной печати.

Апробация работы

Апробация работы состоялась 28 июня 2012 года на совместной конференции научных и клинических подразделений ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России (ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова) и кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на V Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 8-10 октября 2010 г.), Всероссийской конференции с международным участием «Трансплантация печени в России: 20 лет спустя» (Москва, 14 февраля, 2010 г.), ХXIII Международном конгрессе трансплантологического общества (Ванкувер, Канада, 15-19 августа, 2010) (ХXIII International Congress of the Transplantation Society,Vancouver, Canada, 15-19 Аugust, 2010), 21-ом Международном конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине, Берлин, 15-19 мая, 2011 (IFCC WorldLab and EuroMedLab, Berlin, 15-19 May, 2011), 6 Конгрессе международной ассоциации трансплантаций у детей, Монреаль, Канада, 25-28 июня, 2011(6th Congress of the International Pediatric Transplant Association, Montreal, Canada, June 25-28, 2011), XVI научно-практической конференции «Высокие технологии и модернизация в лабораторной медицине (Москва, 29-30 марта, 2011 г.), 15-ом Конгрессе Европейского общества по трансплантации органов, Глазго, Великобритания, 4-6 сентября, 2011 (15th Congress of the European Society for Organ Transplantation, Glasgow, UK, 04.09-06.09. 2011), IV Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2011» (Санкт-Петербург, 7-9 декабря, 2011 г.); VI Всероссийском съезде трансплантологов, (Москва, 24-27 сентября, 2012 г.), XVI Форуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2-4 октября, 2012 г.).





Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики больных и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, 7 выводов, практических рекомендаций и указателя используемой литературы, включающего 32 отечественных и 120 зарубежных источников. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 46 рисунками.

Материалы и методы исследования

В исследование включены 99 детей с циррозом печени в исходе врожденных и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы в возрасте от 3 до 50 (средний возраст 12±10) месяцев. Основными заболеваниями, которые привели к развитию терминальной стадии цирроза печени, являлись: атрезия желчевыводящих путей – у 53 (54%) пациентов, болезнь Байлера – у 12 (12%), синдром Алажилля – у 7 (7%), синдром Кароли – у 5 (5%), билиарная гипоплазия – у 7 (7%) пациентов и у 15 (15%) – другие заболевания, среди которых дефицит 1-антитрипсина, синдром Криглера-Найяра I типа, синдром Бадда-Киари, тирозинемия, гликогеноз I типа (болезнь Гирке).

Обследовано также 38 родственных доноров фрагмента печени, в возрасте от 18 до 56 (37±19) лет.

Обследование и лечение больных проводилось в хирургическом отделении №2 ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова. Плановое обследование пациентов включало: клиническую оценку состояния больного, общий анализ крови, общий анализ мочи, определение клиренса креатинина, измерение концентрации общего белка, альбумина, активности ферментов аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, -глутамилтранспептидазы, содержания билирубина, общего холестерина и липопротеинов высокой и низкой плотности, триглицеридов, глюкозы, мочевины, микроэлементов (Сa, Mg, P), электролитов, исследование коагулограммы (активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновый индекс (ПТИ), концентрация фибриногена) (в клинико-диагностической лаборатории, зав. – к.м.н. Н.П. Шмерко), бактериологические исследования крови, мочи, отделяемого из зева (в бактериологической лаборатории, зав. – д.м.н. Н.И. Габриэлян), анализ на вирусные инфекции (СМV, EBV, HCV, HBV) (в лаборатории иммунологии, и.о. зав. – д.м.н. Р.Я. Войлокова).

Пациентам выполнялась ортотопическая трансплантация левого латерального сектора печени от живого родственного донора, двум пациентам была выполнена split-трансплантация. После трансплантации печени все реципиенты получали двух-трех компонентную иммуносупрессивную терапию, включающую такролимус, метилпреднизолон и микофенолаты (при трехкомпонентной терапии).

Группу сравнения составили 25 детей-реконвалесцентов, получивших лечение в стационаре по поводу дисбактериоза, в возрасте от 7 до 24 мес., без других заболеваний (таблица 1).

Концентрацию sCD40L, sCD30, sFas и sFasL в плазме крови измеряли методом иммуноферментного анализа с помощью наборов реагентов «BenderMedSystems», Австрия, неоптерина – «IBL», Германия, гомоцистеина - «Axis-Shield», Германия-Норвегия, антител к HLA I и II класса – «GTi Diagnostic», США. Концентрацию такролимуса определяли на автоматическом анализаторе Siemens Dimension Xpand, США, наборы реагентов Tacrolimus - Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США. Концентрацию С-реактивного белка определяли методом иммунотурбидиметрии с усилением частицами латекса («Dyasis», Германия).

Таблица 1

Характеристика обследованных пациентов

Параметр

Значения

Реципиенты:  количество, n

  возраст, мес., M±SD

диапазон вариаций

пол: мальчики/девочки

99

12±10

от 3 до 50

45/54

Доноры:  количество, n

  возраст, лет, M±SD

диапазон вариаций

пол: мужчины/женщины

38

37±19

от 18 до 56

16/22

Группа сравнения: количество, n

возраст, мес., M±SD

диапазон вариаций

пол: мальчики/девочки

25

14±7

от 7 до 24

11/14

Статистическая обработка результатов исследования производилась с использованием пакета статистических программ Statistica 7.0 (Statsoft, Россия) и MS Office Excel. При анализе и документировании результатов исследования использовали методы описательной статистики: вычисление среднего арифметического (М), среднего стандартного отклонения (SD), верхней и нижней границ 95%-го доверительного интервала (95% ДИ), медианы распределения, 25% и 75% процентилей. Достоверность различий количественных параметров в двух группах определялась по t-критерию Стьюдента (для признаков с нормальным распределением) или по U-критерию Манна-Уитни (задавалось число степеней свободы при р=0,05).

Результаты исследования

Концентрация sCD40L у детей с циррозом печени в исходе врожденных

и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы

У детей с циррозом печени в исходе врожденных и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы уровень sCD40L составил 3,2±2,3 нг/мл (медиана – 2,6 нг/мл, 25-й процентиль – 1,54 нг/мл, 75-й процентиль – 4,67 нг/мл) и достоверно отличался от такового у детей того же возраста, составивших группу сравнения, 4,7±2,3 нг/мл, р=0,004. У здоровых взрослых – родственных доноров печени уровень sCD40L был достоверно ниже (1,07±1,1 нг/мл), чем у детей с циррозом печени и детей группы сравнения (рисунок 1).

среднее содержание

Наличие возрастных различий концентрации sCD40L необходимо учитывать при интерпретации результатов определения уровня указанного маркера.

Уровень sCD40L не различался у мальчиков и девочек (3,4±2,4 нг/мл и 3,0±2,2 нг/мл, соотв., р>0,05); не выявлено значимых различий среднего уровня этого маркера у мужчин и женщин (1,07±1,29 нг/мл и 1,08±0,89 нг/мл, соотв., р=0,25).

Концентрация sCD40L у детей с синдромом Алажилля, болезнью Байлера и синдромом Кароли не отличалась от таковой у детей группы сравнения, в то время как у детей с атрезией желчевыводящих путей, билиарной гипоплазией и другими заболеваниями была достоверно ниже (рисунок 2).

АЖВП-атрезия желчевыводящих путей

БГ-билиарная гипоплазия

Допустимо предположить, что обнаруженные различия в средних уровнях sCD40L при разных заболеваниях могут быть следствием особенностей первичной патологии и тяжести поражения гепатобилиарной системы.

При анализе связи уровня sCD40L со значениями общеклинических лабораторных параметров выявлена отрицательная достоверная связь между уровнем sCD40L и относительным количеством лимфоцитов (таблица 2).

Таблица 2

Средние значения общеклинических лабораторных параметров

у детей с циррозом печени и их корреляция с уровнем sCD40L

Параметр

Значение

(M±m)

Связь с концентрацией sCD40L

в плазме крови

Коэффициент корреляции, rs

Достоверность,

р

Эритроциты, 1012

3,34±0,57

- 0,13

0,22

Гемоглобин, г/л

92,2±14,6

- 0,16

0,12

Тромбоциты, 109

201±92,5

0,003

0,97

Лейкоциты, 109

8,02±3,9

- 0,0075

0,48

Нейтрофилы, 109

3,8±2,4

0,057

0,68

Лимфоциты, 109

2,8±1,9

- 0,197

0,069

Лимфоциты,%

34,9±14,8

- 0,22

0,042

У пациентов с исходно низким (ниже медианы распределения, 36,2%) количеством лимфоцитов уровень sCD40L был достоверно выше, чем с исходно высоким содержанием (выше медианы распределения) - 3,92±2,56 нг/мл и 2,67±1,96 нг/мл, соотв., р=0,03. Связь с абсолютным содержанием лимфоцитов носила характер тенденции и не достигла статистической значимости.

Выявленные корреляционные связи уровня sCD40L c количеством лимфоцитов в крови могут указывать на вовлечение исследуемого маркера в иммунологические механизмы повреждения печени при врожденных и наследственных заболеваниях гепатобилиарной системы.

Анализ показал отсутствие корреляционной связи уровня sCD40L с величиной рутинно используемых биохимических показателей, отражающих состояние гепатобилиарной системы (таблица 3).

Таблица 3

Средние значения биохимических показателей

у детей с циррозом печени и их корреляция с уровнем sCD40L

Параметр

Значение (M±m)

Связь с концентрацией sCD40L в плазме крови

Коэффициент корреляции, rs

Достоверность,

р

Глюкоза, ммоль/л

3,86±1,17

0,013

0,9

Аланинаминотрансфераза, Ед/л

138,9±121,5

0,089

0,41

Аспартатаминотрансфераза, Ед/л

221,8±170,4

0,098

0,36

-Глутамилтрансфераза, Ед/л

122,7±125,0

- 0,1

0,36

Щелочная фосфатаза, Ед/л

620,9±386,1

0,15

0,18

Альбумин, г/л

37,1±7,4

- 0,11

0,29

Общий белок, г/л

73,0±10,0

- 0,15

0,16

Общий билирубин, мкмоль/л

311,9±255,8

0,21

0,054

Прямой билирубин, мкмоль/л

177,2±155,3

0,18

0,11

Креатинин, мкмоль/л

21,1±10,8

0,011

0,91

Мочевина, ммоль/л

4,17±2,03

- 0,038

0,72

Не выявлено зависимости между уровнем sCD40L и показателями системы гемостаза (таблица 4).

Таблица 4

Средние значения параметров системы гемостаза

у детей с циррозом печени и их корреляция с уровнем sCD40L

Параметр

Значение

(M±m)

Связь с концентрацией sCD40L

в плазме крови

Коэффициент корреляции, rs

Достоверность,

р

АЧТВ, сек

44,7±19,7

0,011

0,92

ПТИ, %

64,5±16,8

-0,09

0,4

Фибриноген, мг/л

2494±819

-0,21

0,053

Антитромбин III,%

45,8±18,8

-0,069

0,74

При сравнительном анализе уровня sCD40L и содержания в плазме крови биомаркеров активации клеток иммунной системы, воспаления и апоптоза не выявлена корреляции между этими показателями (таблица 5).

Таблица 5

Средние значения содержания биомаркеров

у детей с циррозом печени и их корреляция с уровнем sCD40L

Параметр

Значение (M±m)

Связь с концентрацией sCD40L

в плазме крови

Коэффициент корреляции, rs

Достоверность,

р

Неоптерин, нмоль/л

22,8±17,9

- 0,11

0,36

sCD30, нг/мл

84,9±43,8

0,062

0,64

СРБ, мг/л

10,2±10,5

0,007

0,96

sFas, пг/мл

589,3±418,3

- 0,15

0,75

sFasL, пг/мл

15,4±19,3

0,18

0,56

Результаты проведенных исследований показали, что у детей с циррозом печени уровень sCD40L является независимым параметром, не связанным с большей частью показателей общего анализа крови, параметрами системы гемостаза и биохимическими показателями, отражающими состояние гепатобилиарной системы, а также с содержанием биомаркеров, отражающих активность воспаления, апоптоза и степень активации клеток иммунной системы.

Анализ связи уровня sCD40L и гомоцистеина

При исследовании связи концентраций гомоцистеина и sCD40L у детей с циррозом печени в исходе врожденных и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы была выявлена положительная корреляция между этими показателями (rs=0,28, p=0,01).

У детей с печеночной недостаточностью часто развивается гипергомоцистеинемия. Нарушения метаболизма, возникающие при гипергомоцистеинемии, сопровождаются повышенным тромбообразованием, развитием оксидативного стресса, снижением биодоступности оксида азота и др.

Средний уровень гомоцистеина у детей с циррозом печени составил 6,71±6,1 мкмоль/л (медиана – 5,1 мкмоль/л, 25-й процентиль равен 2,27 мкмоль/л, 75-й процентиль – 9,07 мкмоль/л) (рисунок 3). У 27 % обследованных пациентов имела место умеренная, либо средняя гипергомоцистеинемия, то есть уровень гомоцистеина был выше верхней границы референтных значений для детей данного возраста. Причинами гипергомоцистеинемии у этих пациентов могут быть нарушение функции печени и почек, дефицит витаминов.

  среднее содержание

--------  - верхняя граница референтных значений

У пациентов с исходно низким содержанием гомоцистеина (ниже медианы распределения, <5,1 мкмоль/л) уровень sCD40L составил 2,8±2,0 нг/мл; у пациентов с исходным содержанием гомоцистеина, превышающим медиану распределения этого показателя (5,1 мкмоль/л), средняя концентрация sCD40L составила 3,45±2,45 нг/мл. Различия между концентрацией sCD40L у пациентов c исходно низким и высоким содержанием гомоцистеина в крови не достигли уровня статистической значимости (р=0,2).

На рисунке 4 представлен сравнительный анализ исходного уровня гомоцистеина у реципиентов печени с удовлетворительной в течение всего раннего посттрансплантационного периода (до 90 дней после трансплантации) функцией трансплантата и пациентов с нарушением функции трансплантата (дисфункция трансплантата), возникшим на фоне преходящих осложнений, таких как инфекции, тромбозы, развитие острого отторжения, и диагностированным на основании клинических и лабораторных данных. Средний уровень гомоцистеина у пациентов с нормальной функцией трансплантата в течение всего раннего посттрансплантационного периода (75 реципиентов) был достоверно ниже (5,7±4,7 мкмоль/л), чем у пациентов, у которых возникали осложнения (9,3±8,7 мкмоль/л), сопровождающиеся нарушением функции трансплантата (24 реципиента, р=0,04).

Рисунок 4. Уровни гомоцистеина до трансплантации печени в плазме крови пациентов с нарушением функции трансплантата и без такового.

Сравнительный анализ сочетанного влияния исходно низких и исходно высоких уровней и гомоцистеина, и sCD40L показал, что частота встречаемости осложнений, сопровождающихся нарушением функции трансплантата у пациентов с исходно высокими (выше медианы распределения) уровнями и sCD40L, и гомоцистеина оказалась выше (45% от общего числа осложнений с нарушением функции трансплантата), чем у пациентов с исходно низкими уровнями обоих маркеров (26% от общего числа осложнений с нарушением функции трансплантата, рисунок 5).

А  Б

Результаты настоящего исследования могут указывать на участие сигнальной системы CD40/CD40L в регуляции нарушений метаболизма, связанных с нарушением обмена гомоцистеина, при заболеваниях печени и в условиях функционирования печеночного трансплантата в организме реципиента.

Сравнительный анализ содержания sCD40L и аутоантител против HLA у детей с циррозом печени до и после трансплантации

Среди пациентов, включенных в исследование, у 58 (59%) – не было выявлено предсуществующих антител к HLA; антитела к HLA I класса (анти-HLA I) были выявлены у 11 (11%) детей, анти-HLA II – у 13 (13%), и антитела к HLA обоих классов – у 17 (17%) пациентов. Через месяц после трансплантации частота встречаемости анти-HLA не отличалась от таковой, определяемой на этапе дотрансплантационного обследования. Через год после трансплантации частота выявления анти-HLA в плазме крови увеличилась с 41 % до 58%, преимущественно за счет повышения частоты встречаемости анти-HLA I (рисунок 6).

А Б

Рисунок 6. Выявление анти-HLA у пациентов до (А) и через год (Б) после трансплантации печени.

До трансплантации, через месяц и год после трансплантации средние уровни sCD40L не отличались в группах пациентов как с наличием анти-HLA, так и без таковых. Предсуществующие анти-HLA I выявлялись преимущественно у пациентов с исходно высоким уровнем sCD40L (у 9 из 11 пациентов, 82% случаев).

Кроме того, концентрация sCD40L после трансплантации печени достоверно увеличивалась (с 3,6±1,8 нг/мл до трансплантации до 6,6±4,6 нг/мл через год после неё) именно у пациентов, у которых в крови выявлялись антитела к HLA (рисунок 7).

Рисунок 7. Увеличение концентрации sCD40L после трансплантации печени у пациентов с выявляемыми анти-HLA.

У пациентов, у которых не выявлялись анти-HLA, напротив, достоверных изменений в среднем уровне sCD40L через месяц и через год после трансплантации не обнаружено.

Представленные данные указывают на наличие связи уровня sCD40L c выявлением аутоантител к HLA I класса и могут служить дополнительным, хотя и косвенным основанием для предположения об участии sCD40L в формировании иммунных взаимоотношений трансплантата и реципиента.

Динамика уровня sCD40L у реципиентов после трансплантации печени

Средний уровень sCD40L у реципиентов на 5-7 сутки после трансплантации составил 4,2±2,7 нг/мл и не отличался от такового, определяемого до трансплантации; на 10-14 сутки среднее содержание маркера достигло 5,4±4,9 нг/мл, что достоверно выше исходного уровня (р=0,01). В последующем уровень sCD40L постепенно снижался и к концу первого месяца не отличался от исходного (3,9±3,5 нг/мл и 3,2±2,3 нг/мл, соотв., р=0,07). В отличие от реципиентов, у здоровых взрослых доноров резекция части печени не приводила к достоверным изменениям уровня этого биомаркера (рисунок 8).

Рисунок 8. Динамика уровня sCD40L в плазме крови реципиентов после трансплантации и доноров после резекции печени.

Таким образом, анализ динамики уровня sCD40L в плазме крови реципиентов после трансплантации левого латерального сектора печени от живого родственного донора и split-трансплантации показал, что трансплантация печени детям с циррозом в исходе врожденных и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы сопровождается увеличением концентрации sCD40L, максимальным к концу 2-ой недели после трансплантации, и последующим снижением уровня биомаркера.

Анализ связи уровня sCD40L с особенностями течения посттрансплантационного периода

Для сравнительной оценки динамики уровня sCD40L у пациентов с различным течением посттрансплантационного периода всех пациентов разделили на 4 группы, в зависимости от наличия и характера осложнений, а также от состояния функции трансплантата в течение раннего посттрансплантационного периода (до 90 дней после операции).

В первую группу, далее обозначаемую «без осложнений», включено 35 пациентов с удовлетворительной функцией трансплантата и гладким (без инфекционных, билиарных и каких-либо других осложнений) течением посттрансплантационного периода.

У 40 реципиентов в раннем посттрансплантационном периоде имели место преходящие осложнения: инфекции (30%), свищи (47,5%), несостоятельность билиодегистивного анастамоза (9%) и др., которые поддавались лечению и/или хирургической коррекции, при этом функция трансплантата в течение всего периода наблюдения была удовлетворительной. Эти пациенты составили группу, условно обозначенную «без дисфункции».

У 17 реципиентов в посттрансплантационном периоде имела место дисфункция трансплантата, развившаяся в период от 20 до 34 суток на фоне инфекционно-септических осложнений (70,6%) и тромбозов (29,4%), диагностированная на основании клинических и лабораторных данных (повышение концентрации общего билирубина, активности ферментов холестаза и цитолиза). Нарушения функции трансплантата клинически были расценены как вторичные, обусловленные указанными осложнениями. Эта группа пациентов, у которых осложнения в посттрансплантационном периоде сопровождались нарушением функции трансплантата, условно обозначена далее как «дисфункция трансплантата».

К группе, обозначенной как «отторжение», были отнесены 7 пациентов. У этих детей в сроки от 25 до 70 дней после трансплантации на основании клинических и лабораторных данных была диагностирована дисфункция трансплантата, расцененная как острое отторжение, которое было купировано после проведения пульс-терапии.

Динамика концентрации sCD40L различалась в выделенных группах пациентов.

Концентрация sCD40L в группе пациентов «без осложнений» изменялась с 2,5±1,84 нг/мл, на этапе дотрансплантационного обследования, до 1,59±2,67 нг/мл – на 21-23 сутки и 3,83±2,7 нг/мл - к концу месяца. В группах «без дисфункции» и «без осложнений» в указанные периоды наблюдения в средних уровнях sCD40L достоверных различий не выявлено. У реципиентов группы «дисфункция трансплантата» на 21-23 сутки после трансплантации уровень sCD40L составил 2,06±1,67 нг/мл и к 30-45 суткам повышался до 4,84±3,64 нг/мл; достоверных различий с концентрацией sCD40L у реципиентов «без осложнений» выявлено не было. Однако средний уровень sCD40L в этой группе реципиентов до трансплантации (3,75±2,69 нг/мл) был достоверно выше такового у реципиентов группы «без осложнений» (рисунок 9).

*- p<0,05 в сравнении с уровнем sCD40L в группе «без осложнений».

Рисунок 9. Динамика уровней sCD40L у реципиентов печени групп «без осложнений» и «дисфункция трансплантата».

У 7 реципиентов печени в раннем посттрансплантационном периоде развилось нарушение функции трансплантата предположительно иммунной природы, расцененное как острое отторжение. Средняя концентрация sCD40L у реципиентов при развитии клинической и лабораторной картины отторжения составила 9,4±3,4 нг/мл и была достоверно выше исходного уровня. После проведения пульс-терапии и нормализации функции трансплантированной печени уровень sCD40L снижался и спустя 2-3 недели был достоверно ниже такового, определяемого в период проявления дисфункции трансплантата, расцененной как острое отторжение (рисунок 11).

*-р=0,014 в сравнении с уровнем до трансплантации

**- р=0,004 в сравнении с уровнем при клинических проявлениях

Рисунок 11. Динамика уровня sCD40L у реципиентов печени группы «отторжение».

Таким образом, согласно полученным данным, развитие острого отторжения сопровождается резким, более чем вдвое увеличением уровня sCD40L и достоверным снижением концентрации этого биомаркера после лечения.

Во всех описанных случаях отторжение было диагностировано на основании клинических и лабораторных данных и не было подтверждено результатами морфологического исследования биоптата. Однако в настоящем исследовании удалось проследить динамику sCD40L у пациентки К., с острым гуморальным отторжением, развившимся спустя 2,5 года после трансплантации левого латерального сектора печени от родственного донора (бабушки) и подтвержденным данными иммуноморфологического исследования биоптата. Развитие острого отторжения у этой пациентки сопровождалось резким, 3-4 кратным, увеличением концентрации sCD40L c последующим её снижением (рисунок 12).

Рисунок 12. Динамика уровня sCD40L у реципиентки К. с острым отторжением, возникшим через 2,5 года после трансплантации.

Представленные данные являются косвенным подтверждением сделанного заключения о связи увеличения уровня sCD40L c иммунной природой дисфункции трансплантата (отторжением).

Для оценки прогностического значения sCD40L провели сравнительный анализ течения посттрансплантационного периода в зависимости от уровня sCD40L до трансплантации: выше и ниже медианы распределения – 2,6 нг/мл.

Из 42 пациентов c исходно высоким (2,6 нг/мл) уровнем sCD40L осложнения, сопровождающиеся нарушением функции трансплантата, развились у 11 пациентов (26%), а из 57 пациентов с исходно низким уровнем sCD40L – у шести (10%). Сравнительный анализ выживаемости без нежелательных событий показал достоверные различия в группах пациентов с исходным уровнем sCD40L выше и ниже медианы распределения (p=0,03).

Оценка связи уровня sCD40L, определяемого на этапе дотрансплантационного обследования, с прогнозом развития осложнений, сопровождающихся нарушением функции трансплантата, показала, что исходно высокий уровень sCD40L, определяемый на этапе дотрансплантационного обследования, имеет негативное прогностическое значение в отношении развития осложнений, сопровождающихся нарушением функции пересаженной печени (рисунок 13).

При расчете величины относительного риска (ОР) установлено, что у пациентов с исходно высоким уровнем sCD40L (2,6 нг/мл) риск развития осложнений, сопровождающихся нарушением функции трансплантата, оказался в 2,26 раза выше (ОР-95%, доверительный интервал попадал в пределы 1,02 – 5,02, p=0,03 по Фишеру), чем у пациентов с исходно низким (< 2,6 нг/мл) уровнем sCD40L.

Результаты настоящей работы показали, что sCD40L является не зависимым от других лабораторных показателей — биохимических, коагулологических и общего анализа крови, биомаркером. Обнаруженная связь уровня sCD40L c количеством лимфоцитов крови, наличием аутоантител к антигенам системы HLA и уровнем гомоцистеина может указывать на участие лиганда CD40 в иммунных и метаболических процессах при циррозе печени и после трансплантации печени детям раннего возраста. Изменения концентрации sCD40L после трансплантации связаны с особенностями течения посттрансплантационного периода, а величина уровня sCD40L, определяемого на этапе дотрансплантационного обследования, имеет прогностическое значение.

ВЫВОДЫ

1. У детей с циррозом печени в исходе врожденных и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы уровень sCD40L ниже, чем у здоровых детей того же возраста. Концентрация sCD40L в плазме крови не зависит от пола, но зависит от возраста: у здоровых взрослых содержание биомаркера ниже (1,07±1,1 нг/мл), чем у детей младшего возраста (4,7±2,3 нг/мл, р=0,001).

2. Концентрация sCD40L в плазме крови не зависит от биохимических (содержание альбумина, билирубина, креатинина, активности ферментов, отражающих состояние гепатобилиарной системы), коагулологических (активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновый индекс, концентрация фибриногена, антитромбина III) и большей части показателей общего анализа крови (количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, уровень гемоглобина), но находится в обратной зависимости (rs=-0,22, p=0,042) от содержания лимфоцитов.

3. Уровень sCD40L в плазме крови детей с циррозом печени не зависит от концентрации биомаркеров воспаления (С-реактивного белка), активации клеток иммунной системы (sCD30, неоптерина) и апоптоза (sFas, sFasL).

4. Содержание sCD40L в плазме крови детей с циррозом печени коррелирует с концентрацией гомоцистеина (rs=0,28, p=0,01); гипергомоцистеинемия имеет место у 27% пациентов. У детей с гипергомоцистеинемией и исходно высоким уровнем sCD40L чаще развиваются посттрансплантационные осложнения, сопровождающиеся нарушением функции трансплантата.

5. У детей с циррозом печени при исходно высоком уровне sCD40L частота встречаемости предсуществующих аутоантител к HLA I класса выше (82%), чем при исходно низком (18%) уровне этого биомаркера; увеличение концентрации sCD40L после трансплантации связано с наличием антител к HLA, что может указывать на участие sCD40L в формировании иммунных взаимоотношений трансплантата и реципиента.

6. Трансплантация печени сопровождается повышением концентрации sCD40L в плазме крови детей-реципиентов, c максимальным значением к концу 2-ой недели после трансплантации и последующим снижением. Динамика sCD40L зависит от особенностей течения посттрансплантационного периода: развитие острого отторжения сопровождается резким увеличением уровня sCD40L и его снижением после успешного лечения.

7. Уровень sCD40L, определяемый на этапе дотрансплантационного обследования, имеет прогностическое значение: у детей с исходно высоким (2,6 нг/мл) уровнем sCD40L риск развития осложнений, сопровождающихся нарушением функции трансплантата, в 2,26 раза выше, чем у пациентов с исходно низкой (<2,6 нг/мл) его концентрацией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. На этапе дооперационного обследования у реципиентов печени измерение уровня sCD40L позволяет выделить группу пациентов с высоким риском развития осложнений, сопровождающихся нарушением функции трансплантата.

2. У реципиентов печени при наличии соответствующей клинической картины и изменений лабораторных показателей, обнаружение в плазме крови высокого уровня sCD40L можно использовать в качества дополнительного признака, указывающего на развитие острого отторжения.

3. При обследовании реципиентов печени в отдаленные сроки после трансплантации определение уровня sCD40L может быть использовано для мониторинга течения посттрансплантационного периода.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

  1. Шевченко О.П., Гичкун О.Е., Кунцевич Н.В. и соавт. Связь между уровнем sCD40L и характером течения посттрансплантационного периода у реципиентов печени. // Вестник трансплантологии и искусственных органов – 2010. – Том XII. – С.126-127.
  2. Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Диатроптов М.Е., Кунцевич Н.В., Макарова Л.В., Пищулина М.Э., Гичкун О.Е. и соавт. Клиническая эффективность и перспективы анализа биомаркеров при пересадке печени. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. – 2010. – №2. – С.28-29.
  3. Гичкун O.E. Маркеры Fas-опосредованного апоптоза у детей с заболеваниями гепатобилиарной системы. // Лаборатория – 2011. – №1. – С.24.
  4. Гичкун О.Е. (Долгов В.В., Готье С.В.). Прогностическое значение sCD40L и анти-HLA антител у детей после трансплантации печени» Тезисы IV Международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения – 2011», 7-9 декабря 2011 г. – С.115.
  5. Шевченко О.П., Гичкун О.Е., Долгов В.В. и соавт. Трансплантация печени: роль растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L) и антител к HLA. // Клиническая лабораторная диагностика. – 2012. – №9. – С 89.
  6. Шевченко О.П., Цирульникова О.М., Бугров А.В., Лурье Ю.Э., Цирульникова И.Е., Мнацаканян Д.С., Гичкун О.Е., Готье С.В. Инсулиноподобный фактор роста-1 при трансплантации печени детям с врожденными и наследственными заболеваниями печени. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2012. - №1. - С.50-55.
  7. Шевченко О.П., Цирульникова О.М., Гичкун О.Е., Макарова Л.В., Цирульникова И.Е., Ахаладзе Д.Г., Шмерко Н.П., Готье С.В. Прогностическое значение sCD40L при трансплантации печени детям с врожденными и наследственными заболеваниями гепатобилиарной системы. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2012. №2. С. 15-19.
  8. Шевченко О.П., Гичкун О.Е., Цирульникова О.М., Ахаладзе Д.Г., Макарова Л.В., Шмерко Н.П., Долгов В.В., Готье С.В. Уровень растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L) коррелирует с количеством лимфоцитов у детей с врожденными и наследственными заболеваниями гепатобилиарной системы. // Вестник трансплантологии и искусственных органов – 2012. – Том XIV. – С.160.
  1. Шевченко О.П., Долгов В.В., Гичкун О.Е., Кунцевич Н.В., Цирульникова О.М., Готье С.В. Гомоцистеин при трансплантации печени детям раннего возраста. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2012. №4. С. 43-46.
  2. Долгов В.В., Гичкун О.Е., Шевченко О.П. Иммуноферментный анализ аутоантител к HLA антигенам. // Лаборатория. – 2012. – №5. – С.8-9.
  3. Gautier S.V., Tsirulnikova O.M., Ammosov A.A., Gichkun O.E. et al. Pediatric living donors liver transplantation: soluble CD40 ligand as an early predictor of graft dysfunction. // Transplantation. – 2010. – Vol.90. – Issue 12. – P.853.
  4. Shevchenko O.P., Tsirulnikova O.M., Gichkun O.E. et al. Plasma levels of soluble CD30 and CD40L in pediatric patients after liver transplantation. 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 15-19 May, 2011, Berlin, Germany, Book Abstracts, P.593.
  5. Gautier S.V., Tsirulnikova O.M., Gichkun O.E. et al. Elevated plasma levels of soluble CD30 and CD40L are associated with graft dysfunction in pediatric liver recipients. // Pediatric Transplantation – 2011. – Vol.15 – Suppl.1 – P.58.
  6. Gautier S.V., Tsirulnikova O.M., Gichkun O.E. et al. The association between pretransplant soluble CD40 ligand plasma levels, the presence of anti-HLA antibodies and graft dysfunction in pediatric living donor liver transplant recipients. // Transplant International. – 2011. – Vol.24. – Issue 2. – Р.91.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.