WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ПЕТЕНКО НАТАЛИЯ НИКОЛАЕВНА

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ АУТОЛОГИЧНЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК В ВАКЦИНОТЕРАПИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ

Специальность: 14.01.12 онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина»

Российской академии медицинских наук

Директор

академик РАН и РАМН, профессор                         Давыдов Михаил Иванович

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор  Лев Вадимович Демидов

доктор медицинских наук, профессор  Анатолий Юрьевич Барышников

Официальные оппоненты:

Гуторов Сергей Львович

доктор медицинских наук,

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, ведущий научный сотрудник отделения комбинированных методов лечения

Якубовская Раиса Ивановна

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России, руководитель отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии

Ведущая организация:

ФГБУ "НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова" Минздрава России

Защита состоится «___» ___ 2012 г. в __часов на заседании диссертационного совета Д001.017.02 Федерального ггосударственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва Каширское шоссе, 24.

Автореферат разослан «__»______2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор                                                      Юрий Андреевич Барсуков

АКУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Согласно современным эпидемиологическим данным в России, а также во многих других странах отмечен стремительный рост заболеваемости меланомой кожи (МК), что позволяет рассматривать этот факт, как общую тенденцию в мире. Средний показатель заболеваемости МК в России в 2007 году составил 5,4 случаев на 100 тыс. человек в год (4,4 у женщин и 6,3 у мужчин), при этом с 2002 по 2007 г. прирост абсолютного числа заболевших составил 17%. Средний возраст заболевших составляет 59 лет. C 2002 по 2007 гг. в России отмечен значительный рост смертности от МК, у мужчин на 20% (второе место по приросту смертности после рака предстательной железы), у женщин на 16,7% (первое место). Смертность при этом составляет в среднем 2,2  случая на 100 тыс. человек в год (2,2 у женщин и 2,2 у мужчин).

Несмотря на внешнюю локализацию около 30% случаев МК в нашей стране выявляется на III-IV стадиях, при этом показатель пятилетней выживаемости по международным данным варьирует от 27 до 69% для III стадии и от 9 до 19% для IV стадии заболевания, в то время как для локальной МК (I-II стадии) он составляет от 45-ти до 100%. В структуре смертности в группе злокачественных опухолей кожи МК составляет 80%.

МК является иммуногенной опухолью, то есть способной индуцировать Т-клеточный иммунный ответ in vivo против опухолевых антигенов (АГ) [Boon T. et al., 2006]. Таким примером может служить феномен спонтанной регрессии, встречающийся при МК наиболее часто. При этом в 30% случаев первичной МК отмечаются признаки некоторой регрессии [Morton D., 1996], а частота спонтанной регрессии метастатической МК, включающая полную и частичную клиническую ремиссию, составляет от 0,25 до 1,0% [Bodurtha A., 1979; Baldo M. et al., 1992]. Многие клинические исследования свидетельствуют о корреляции между регрессией МК и активацией противоопухолевых Т-лимфоцитов, которые обнаруживают в периферической крови и регрессирующих метастазах [Lonchay C. et al., 2004; Vries I. et al., 2005].

Дендритные клетки (ДК) являются главными антиген-презентирующими клетками способными эффективно индуцировать и регулировать клеточный иммунный ответ. По данным преклинических и клинических исследований вакцина на основе ДК обладают иммунологической и клинической активностью в отношении целого ряда опухолей, включая МК, при этом у трети пациентов может наблюдаться регресс опухоли [Nestle F., 1998; O’Rourke M., 2003]. Основой исследуемой противоопухолевой вакцины являются аутологичные ДК больного МК, стимулированные опухолевыми антигенами (АГ) in vitro и введенные обратно пациенту с целью индукции противоопухолевого иммунитета in vivo и контроля заболевания.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью исследования является оценка клинической и иммунологической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных дендритных клеток у больных метастатической МК, а также у больных с метастатической МК после радикального удаления метастазов.

ЗАДАЧИ

1. Оценить клиническую эффективность дендритной вакцины при лечении больных метастатической меланомой (терапевтическая группа), оценить выживаемость пациентов после вакцинотерапии;

2. Оценить время до прогрессирования и общую выживаемость у больных, получающих дендритную вакцину в профилактическом режиме после радикального хирургического удаления региональных и отдаленных метастазов МК (профилактическая группа) по сравнению с группой наблюдения;

3. Оценить противоопухолевый иммунный ответ, индуцированный вакциной на основе аутологичных дендритных клеток;

4. Оценить корреляцию иммунологической и клинической эффективности вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками;

5. Оценить прогностические факторы, влияющие на клиническое течение заболевания и ответ на проводимое лечение.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые исследована клиническая и иммунологическая эффективность аутологичной дендритной вакцины у больных с метастатической МК, а также у больных с регионарными и отдаленными метастазами МК после радикального хирургического лечения, то есть в профилактическом режиме. А также была произведена оценка специфического противоопухолевого иммунного ответа. Впервые исследована корреляция специфического иммунного ответа и клинической эффективности противоопухолевой дендритной вакцины с оценкой прогностических факторов, влияющих на клиническое течение заболевания и ответ на проводимое лечение.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Лечение метастатической меланомы представляет серьезную проблему, поскольку системная терапия не приводит к значимому увеличению продолжительности жизни больных; не существует стандартной и эффективной адъювантной терапии для пациентов с высоким риском рецидива заболевания после хирургического лечения.

В данном исследовании продемонстрировано, что вакцинотерапия дендритными клетками обладает клинической и иммунологической эффективностью в лечении больных с метастатической меланомой кожи, главным образом, у пациентов с ограниченной распространенностью заболевания, а также у больных после хирургического удаления метастазов, то есть в профилактическом режиме. Установлено, что индуцированный вакциной противоопухолевый иммунный ответ достоверно коррелирует с клинической эффективностью и способствует увеличению безрецидивной и общей выживаемости вакцинируемых больных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Апробация диссертации состоялась 13 декабря 2011 г. на совместной научной конференции с участием отделения биотерапии опухолей, отделения общей онкологии, отделения химиотерапии и комбинированного лечения злокачественных опухолей, отделения клинической фармакологии и химиотерапии, лаборатории клинической иммунологии опухолей НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН.

Результаты работы были представлены во время 48-го ежегодного конгресса Американского общества клинических онкологов 2012 (ASCO 2012, poster discussion session).

ПУБЛИКАЦИИ

       По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы работы изложены на 118 страницах машинописного текста и состоят из введения, обзора литературы, глав включающих «материалы и методы», «результаты», обсуждения, выводов, списка литературы, представленного 159 источником (7 отечественных и 152 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 27 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ранее в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН  была отработана и адаптирована методика культивирования дендритных клеток для клинического применения. Дендритная вакцина являлась аутологичной и изготавливалась индивидуально для каждого пациента в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей на базе НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (см рис. 1). Клиническое применение дендритной вакцины было одобрено Центральным этическим комитетом Российской Федерации; получено разрешение Минздрава России для проведения клинических исследований дендритной вакцины I и II фаз.

Исследование дендритной вакцины происходило в 2 этапа: на I ЭТАПЕ оценивалась безопасность и эффективность вакцины у пациентов с метастатической МК, у которых стандартное лечение оказалось неэффективным. Далее был проведен II ЭТАП исследования по оценке эффективности вакцины в профилактическом режиме лечения МК после радикального хирургического удаления региональных и отдаленных метастазов по сравнению c группой наблюдения. Дизайн исследования представлен на рис. 2.

Исследование проводилось на базе отделения биотерапии опухолей НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. В период с 2003 по 2008 гг. в исследовании приняли участие 136 пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом МК.

Рисунок 1. Получение вакцины на основе дендритных клеток.

Рисунок 2. Дизайн исследования.

Пациенты, включенные в исследование:

А. Терапевтическая группа: больным с метастатической меланомой кожи (III-IV стадий AJCC 2002), которым невозможно выполнить хирургическое удаление метастазов, проводилось стандартное лекарственное лечение (химиотерапия/химиоиммунотерапия). В случае прогрессирования заболевания пациентам с терапевтической целью назначалась аутологичная дендритная вакцина. Лечение этой группы пациентов проводилось в рамках клинического исследования I фазы с оценкой безопасности и эффективности исследуемой вакцины. Всего в эту группу включен 21 пациент (n=21), (таблица 1).

Таблица 1. Характеристика пациентов терапевтической группы.

Признак

Количество, %

Количество больных (включено)

n=21

Количество больных (оценено)

n=17 из 21

ПОЛ: мужской/женский

8 (47%)/ 9 (53%)

Возраст, годы

53,6 (среднее)

51 (медиана)

от 26 до 82 лет

Диапазон

Стадия заболевания

III

В

1 (5,9%)

23,5%

С

3 (17,6%)

IV

М1а

7 (41,2%)

76,5%

М1b

1 (5,9%)

M1c

5 (29,4%)

Предшествующая терапия по-поводу метастатической меланомы

ХТ

10 (58,8%)

∑*

ХИТ

8 (47%)

ИТ

  1. (47%)

>1 линии лекарственной терапии

12 (70,6%)

Не получали лекарственного лечения

2 (11,8%)

Х

16 (94,1%)

ХТ химиотерапия, ХИТ химиоиммунотерапия, ИТ иммунотерапия, Х хирургическое лечение (> более 1 вмешательства);

* сумма больше 100%, т.к. перед вакцинотерапией пациенты могли получать несколько видов лечения.

Б. Профилактическая группа: больным с метастатической меланомой кожи (III-IV стадии AJCC 2002) выполнялось радикальное хирургическое иссечение метастазов. Далее пациентам проводилась вакцинотерапия аутологичными дендритными клетками с профилактической целью. Лечение этой группы пациентов проводилось в рамках пилотного клинического исследования  с оценкой эффективности вакцины по сравнению с группой наблюдения. Всего в опытную группу включено 63 пациента (n=63), (таблица 2).

Таблица 2. Характеристика пациентов профилактической группы

и группы наблюдения.

Характеристики

Группы больных

Стат.

критерий

Профилактическая

Наблюдение

Количество пациентов (включено)

63

52

-

Количество пациентов (оценено)

56

52

-

Пол

-мужской

-женский

31 (55,4%)

25 (44,6%)

16 (31%)

36 (69%)

p=0,0203*,1

p=0,0121*,1

Возраст, годы

- диапазон

52 (среднее)

(23-89)

53 (среднее)

(31-79)

p=0,77582

Локализация первичной опухоли

-туловище

-конечности

-голова и шея

-без ВПО (выявленного первичного очага)

21 (37,5%)

25 (44,6%)

8 (14,3%)

2 (3,6%)

14 (27%)

28 (53%)

5 (10%)

5 (10%)

p=0,30461

p=0,44121

p=0,56191

p=0,25811

Изъязвление

-есть

-нет

-неизвестно

18 (32%)

20 (36%)

18 (32%)

14 (27%)

16 (31%)

22 (42%)

p=0,67391

p=0,68391

p=0,32131

Стадия заболевания

III

В

14        (25%)

46 (82%)

20 (38,5%)

47 (90,4)

p=0,27111

С

24 (43%)

17 (32,7%)

IIITx

8 (14%)

10 (19,2%)

IV

М1а

7 (12,6%)

10(18%)

1 (1,9%)

5 (9,6%)

p=0,27111

М1b

2 (3,6%)

0

M1c

1 (1,8%)

4 (7,7)

* Отличие считается достоверным при р0,05%; 1 точный критерий Фишера (двухсторонний) для качественных признаков; 2 критерий Манна-Уитни (двухсторонний) для количественных признаков; IIITx - III стадия МК с неизвестным статусом первичной опухоли.

В. Группа наблюдения: Из архива отделения биотерапии опухолей НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (за период 2003-2008 годов) была набрана группа пациентов с метастатической меланомой кожи (III-IV стадии AJCC 2002), которым было выполнено хирургическое удаление метастазов. Далее пациенты  наблюдались (контрольное  обследование каждые 3 мес). Всего в эту группу включено 52 пациента (n=52). Пациенты были отобраны таким образом, чтобы группа наблюдения по клиническим и прогностическим характеристикам соответствовала группе, получавшей профилактическую вакцину, для сравнения показателей выживаемости этих групп, (таблица 2).

               Сравниваемые группы (профилактическая группа и группа наблюдения) являются однородными по факторам определяющим прогноз клинического течения заболевания (возраст, локализация первичной опухоли, наличие/отсутствие изъязвления первичной опухоли, стадия заболевания), поэтому  сравнение показателей выживаемости между группами правомерно. Некоторая несбалансированность групп по полу, а именно примерно одинаковое количество мужчин и женщин в группе вакцины [м/ж = 31(55,4%)/25(44,6%)] и преобладание женщин над мужчинами в группе наблюдения [м/ж = 16(31%)/36(69%)] не оказывает влияния на прогноз и клиническое течение МК III и IV стадий [Balch C.M., 2001], поскольку пол является прогностическим фактором только для МК I-II стадии [Homsi J., 2005; Sobin L.H., 2010].

Оценка клинической эффективности

Оценка клинической эффективности в терапевтической группе производилась при помощи критериев RECIST (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) версия 1.0, оценивалась частота наилучших объективных ответов, медиана общей продолжительности жизни, 1-летняя, 2-летняя и 3-летняя выживаемость, кривые выживаемости анализировались по методу Kaplan-Meier. Также оценивалась частота стабилизаций заболевания продолжительностью 5 и более месяцев.

Оценка клинической эффективности в профилактической группе проводилась путем сравнения показателей выживаемости пациентов профилактической группы и группы наблюдения. Оценивались медиана времени до прогрессирования, 1-летняя, 2-летняя и 3-летняя общая выживаемость, медиана общей продолжительности жизни, анализировались кривые выживаемости по методу Kaplan-Meier, оценивались hazard ratio для общей и безрецидивной выживаемости пациентов в профилактической группе по сравнению группой наблюдения.

Оценка иммунологической эффективности вакцины

       Оценка иммунологической эффективности производилась при помощи оценки реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ), после каждой вакцинации для пациентов терапевтической и профилактической групп лечения. РГЗТ оценивалась как положительная при наличии гиперемии более или равно 5 мм в месте введения вакцины через 48 часов. РГЗТ оценивалась как отрицательная при отсутствии гиперемии или при размерах гиперемии  5 мм через 48 часов. Для оценки степени развития положительной РГЗТ была разработана бальная шкала оценки (см таблицу 3).

  Таблица 3. Бальная шкала оценки РГЗТ (+).

Местные реакции

Оценка

Эритема/гиперемия

0,5-1 см

1 балл

+1 см

+1 балл

Наличие зуда/индурации

+1 балл

РГЗТ (+) положительная

Результат

РГЗТ (+) оценивалась как минимальная

при 1-2 баллах

РГЗТ (+) оценивалась как максимальная

при 3 баллов

       Иммунологическая эффективность также оценивалась методом  ELISPOT (Enzyme-linked immuno-sorbent spot), при помощи которого производилась количественная оценка появившихся в крови пациентов в процессе вакцинотерапии специфических противоопухолевых Т-лимфоцитов (оценка проводилась перед 1, 3, 5 и 10 вакцинациями). Для подсчета количества противоопухолевых Т-лимфоцитов выделенные из периферической крови пациентов мононуклеарные клетки обрабатывали опухолевым лизатом, после такой стимуляции активированные опухолеспецифичные Т-клетки начинали секретировать ИФН-γ, по которому их и регистрировали. Для  стимуляции лимфоцитов в реакции ELISPOT использовался опухолевый лизат клеточной линии МК MelKor, которая ранее была получена в НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. В клетках линии MelKor экспрессируется большое количество опухолеассоциированных АГ, среди которых дифференцировочные АГ (CD63, НМВ45, HMW, MelanA, Tyrosinase) и раково-тестикулярный АГ (MAGE-3).

       Оценка клинической и иммунологической эффективности в терапевтической и профилактической группах проводилась у пациентов, получивших 4 и более вакцинации.

Цитокиновый профиль и факторы роста в сыворотке больных МК 

в процессе вакцинотерапии

При помощи иммуноферментного анализа оценивалась концентрация в сыворотке крови пациентов, получающих дендритную вакцину, таких цитокинов как ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12, факторов роста TGF-бета, VEGF, а также сывороточного маркера меланомы S100. Для оценки состояния иммунной системы вакцинируемых пациентов проводилось сравнение показателией цитокинового профиля перед лечением с показателями здоровых доноров. Также изучалось возможное влияние дендритной вакцины на уровень цитокинов в сыворотке крови в процессе вакцинотерапии.

Статистический анализ

       Корреляционную связь для исследования взаимосвязи количественных признаков независимо от вида их распределения, а также количественного и качественного признаков оценивали при помощи непараметрического метода корреляционного анализа Спирмена. Корреляционную связь между качественными признаками оценивали при помощи ранговой корреляции по Кендаллу. При значении коэффициента корреляции r 0,25 корреляция оценивалась как слабая,  при 0,25 r 0,75 умеренная корреляция, при r 0,75 сильная корреляция. Сравнение кривых выживаемости, построенных по методу Kaplan-Meier, производился с использованием Logrank теста. Различия между группами считали статистически значимыми при p<0,05.

       Для сравнения независимых групп по качественному признаку был выбран точный критерий Фишера в связи с небольшой выборкой. Анализ проводили в два этапа: вначале составляли четырехпольную таблицу сопряжённости (этот критерий используется при сравнении частот бинарного признака, имеющего два возможных значения – «да» или «нет»), затем непосредственно применяли точный критерий Фишера. Для сравнения независимых групп по количественному признаку был использован критерий Манна-Уитни. Для сравнения зависимых групп по количественному признаку был использован критерий Вилкоксона. Различия между группами считали статистически значимыми при p<0,05.

       Для статистического анализа использовалось программное обеспечение IBM SPSS Statistics версия 19 и Medcalc bdbv версия 11.6.0.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

I ЭТАП: ВАКЦИНОТЕРАПИЯ В ТЕРАПЕВТИЧЕСКОМ РЕЖИМЕ

       На фоне проводимой терапии у 2-х из 17-ти больных (11,8%) были  зарегистрированы объективные ответы: 1 полный ответ (продолжительность жизни пациента 60+ мес.) и 1 частичный ответ (продолжительность жизни пациента 30 мес.). У 5-ти из 17-ти больных (29,4%) отмечена стабилизация заболевания (продолжительностью от 5 до 16+ мес.). Частота контроля над заболеванием (объективные ответы + стабилизации заболевания 5 мес.) составила 41,2%, то есть у 7-ми из 17-ти пациентов. Таким образом, применение дендритной вакцины, несмотря на прогрессирование после предшествующего лечения, позволило контролировать заболевание у 41,2% пациентов. У 10-ти пациентов, несмотря на проводимое лечение, отмечено прогрессирование заболевания.

       Отмечена корреляционная связь между эффектом от лечения (объективные ответы + стабилизации заболевания 5 мес.) и размерами метастазов, коэффициент корреляции Спирмена составил 0,4 (p=0,061; 95% ДИ, от 0,1 до +0,7). Таким образом, лечение было более эффективно при метастазах небольших размеров, и неэффективно при больших метастазах. Объективные ответы и стабилизации заболевания были отмечены у пациентов с метастазами МК небольших размеров в мягкие ткани и лимфатические узлы. У пациентов с метастазами МК больших размеров или локализацией очагов во внутренних органах вакцина эффекта не оказывала. Тем не менее медиана общей продолжительности жизни пациентов с метастатической МК на фоне вакцинотерапии достигла 29 мес. (95% ДИ, от 6,2 до 51,8 мес.), (см рис 3). При этом 1-летняя общая выживаемость пациентов терапевтической группы составила 70%, 2-летняя – 56%, 3-летняя – 32%.

       Кривые общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования построенные по методу Kaplan-Meier представлены на рис. 3. При медиане наблюдения 29 мес. в живых остается 6 пациентов (35,3%), без прогрессирования заболевания 2 пациента (11,8%). При подгрупповом анализе медиана общей продолжительности жизни пациентов III стадии составила 31 мес. (95% ДИ, от 0 до 66,9 мес.), а для пациентов IV стадии – 17 мес. (95% ДИ, от 0 до 40,3 мес.).

Иммунологическая эффективность дендритной вакцины

в терапевтическом режиме

       Иммунологическая эффективность дендритной вакцины в терапевтической группе, свидетельствующая о появлении специфических противоопухолевых лимфоцитов в крови, оценивалась при помощи РГЗТ, которая расценивается как положительная при появлении в месте инъекции вакцины эритемы/гиперемии или индурации 5 мм и более в диаметре через 48 ч после введения. Степень положительной РГЗТ(+) оценивалась как минимальная (MIN) или максимальная (MAX) при помощи разработанной бальной шкалы, (табл. 1). Результаты представлены на рис. 4. РГЗТ(), свидетельствующая об иммунологической ареативности пациентов, отмечена у 3-х пациентов (17,6%) из 17-ти оцененных. РГЗТ(+) у 14-ти из 17-ти (82,4%), при этом максимальная степень выраженности РГЗТ(+)MAX отмечена только у 4-х, у остальных 10-ти пациентов РГЗТ(+)MIN.

       У 3-х пациентов из 17-ти (17,6%) в процессе лечения развилась витилиго, у одного из них зарегистрирован полный и длительный клинический ответ. У всех 3-х пациентов с витилиго отмечена положительная РГЗТ, при этом у 2 из 3 пациентов степень ее выраженности была максимальна (см рис. 4). Медиана общей продолжительности жизни пациентов с витилиго составила 35 мес.

       Несмотря на небольшую выборку отмечена выраженная тенденция к увеличению продолжительности жизни пациентов с более выраженной иммунологической реакцией на вакцинацию РГЗТ(+)MAX, по сравнению с пациентами, у которых эта реакция отсутствует РГЗТ() или выражена минимально РГЗТ(+)MIN (p=0,29).

По результатам I ЭТАПА исследования отмечена безопасность и хорошая переносимость вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками. Продемонстрирована активность данного подхода в лечении метастатической меланомы кожи у пациентов с небольшой распространенностью заболевания и локализацией очагов в мягких тканях и лимфатических узлах. При этом невысокая частота объективных ответов на вакцину равная 11,8%, тем не менее, сопоставима с эффективностью Дакарбазина (частота ответов 5-10%), который является стандартным вариантом паллиативной терапии для метастатической МК, не влияющим на общую выживаемость (медиана выживаемости не более 6-9 мес.), но обладающий более выраженной токсичностью [Chapman P.B., 1999; Schadendorf D., 2006].

II ЭТАП: ПРИМЕНЕНИЕ ВАЦИНЫ

В ПРОФИЛАКТИЧЕСКОМ РЕЖИМЕ

Влияние дендритной вакцины на время до прогрессирования:

               В лечебной группе получающей дендритную вакцину по сравнению с группой наблюдения отмечено статистически достоверное улучшение показателей безрецидивной выживаемости, медиана времени до прогрессирования в группе вакцины составила 10,0 мес. по сравнению с 4,8 мес. в группе наблюдения, при сравнении кривых выживаемости в двух группах разница была статистически достоверна в пользу вакцины p0,05 (Logrank test) (см рис. 5).

               Риск прогрессирования Hazard ratio (HR) заболевания в группе, получающей вакцину, по сравнению с группой наблюдения составил  HR = 0,45 (p0,05; ДИ95% от 0,29 до 0,69), Chi-square=17,02, то есть снизился на 55%.

               Влияние дендритной вакцины на общую выживаемость:

               В профилактической группе по сравнению с группой наблюдения отмечена тенденция к увеличению общей продолжительности жизни р=0,22 (Logrank test), (см рис. 6).

               Оценены показатели 1-, 2-, 3-х летней выживаемость для сравниваемых групп (см таблицу 4). Несмотря на то, что в профилактической группе показатели выживаемости несколько выше, чем в группе наблюдения, различия не являются статистически достоверными.

Таблица 4. Выживаемость в группах профилактического

лечения и наблюдения.

Группы

Выживаемость

p-value

(Logrank)

1-летняя

2-летняя

3-летняя

Вакцина

85%

70%

63%

p>0,05

Наблюдение

83%

68%

50%

p>0,05

               При медиане наблюдения 22 мес., медиана общей продолжительности жизни в профилактической группе не достигнута, тогда как в группе наблюдения она составила 29 мес. Риск смерти Hazard ratio (HR) от заболевания в профилактической группе также снизился и составил 0,71 (p=0,23; ДИ от 0,40 до 1,25), Chi-square=1,45, то есть снизился на 29% (см рис. 6).

Иммунологическая эффективность дендритной вакцины:

Реакция гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ)

       Пациенты с МК III и IV стадий после хирургического удаления метастазов являются клинически здоровыми, при этом иммуносупрессорное воздействие опухоли на иммунную систему пациентов сводится к минимуму. Возможно именно поэтому у 54-ти из 56-ти пациентов профилактической группы (96,4%) на фоне вакцинотерапии дендритными клетками отмечена положительная РГЗТ(+) и только у 2-х пациентов из 56-ти (3,6%) РГЗТ была негативна по сравнению с 17,6% иммунологически скомпрометированных РГЗТ негативных пациентов в терапевтической группе (пациенты с метастазами МК, получавшие вакцину).

       Максимальная степень РГЗТ(+)MAX зарегистрирована у 31 из 54-х пациентов  (57,4%) и минимальная степень РГЗТ(+)MIN у 23-х из 54-х пациентов (42,6%).  Результаты представлены на рис. 7.

       В процессе вакцинотерапии у 4-х пациентов из 56-ти (7,1%) развилась витилиго, у всех из них РГЗТ(+), при этом у трех РГЗТ(+) максимальна. При медиане наблюдения за этой подгруппой пациентов 30 мес. все пациенты с витилиго (n=4) живы, а трое (n=3) без признаков прогрессирования.

Рисунок 7. РГЗТ на фоне вакцинотерапии у пациентов

профилактической группы.

РГЗТ(+)МАХ свидетельствует о выраженном иммунологическом ответе на вакцину и наблюдается примерно у половины вакцинированных пациентов профилактической группы.

       Выявлена прямая корреляционная связь между степенью развития РГЗТ и эффективностью профилактического лечения (которая выражается в увеличении времени до прогрессирования и продолжительности жизни при РГЗТ(+)МАХ), (см рис. 8).

       При этом коэффициент корреляции Спирмена между РГЗТ и ВДП составил 0,33 (p=0,007; 95%ДИ, от 0,07 до 0,54), а коэффициент корреляции между РГЗТ и общей продолжительностью жизни вакцинируемых пациентов составил 0,30 (p=0,013; 95%ДИ, от 0,06 до 0,55).

       Отмечено увеличение общей продолжительности жизни у пациентов с выраженным иммунным ответом на вакцину (РГЗТ(+)МАХ) по сравнению с теми, у кото реакция была минимальна или отсутствовала (РГЗТ(+)MIN и РГЗТ()),  p=0,0541 (Logrank test) (см рис. 8).

Витилиго (аутоиммунная депигментация кожи)

       В процессе вакцинотерапии у 7-ми пациентов развилась аутоиммунная реакция – витилиго: у 3-х пациентов из терапевтической группы и у 4-х из профилактической группы. У всех пациентов с витилиго отмечена РГЗТ(+), а у 5-ти из них РГЗТ(+)MAX. При медиане наблюдения за этой подгруппой пациентов 32 мес. только 2-е из 7-ми пациентов умерли, а 3-е пациентов остаются без признаков прогрессирования заболевания.

ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot)

       Иммунологическая эффективность вакцинотерапии (т.е. появление или увеличение количества предсуществующих опухолеспецифических Т-лимфоцитов в два раза более в периферической крови пациентов) после лечения была отмечена 6-ти из 15-ти проанализированных пациентов (40%).

       Однако иммунологическая эффективность (оцененная методом Elispot) не коррелировала с клинической эффективностью. Коэффициент корреляции Кендалла был менее 0,25 при p>0,05. Несмотря на то, что медиана времени до прогрессирования в группе больных, у которых развился иммунный ответ на вакцину, составила 9,5 мес. против 6 мес. для пациентов без иммунного ответа, это различие оказалось статистически недостоверным p=0,62 (Logrank test). Такая же ситуация наблюдается и для общей выживаемости p=0,71 (Logrank test).

       Параллельно у 15-ти пациентов, у которых иммунный ответ был оценен при помощи метода ELISPOT, оценивалась и РГЗТ. При этом отмечена прямая корреляционная связь иммунологической эффективности, оцененной при помощи РГЗТ и методом ELISPOT, коэффициент корреляции Кендалла составил 0,58 (p=0,015; 95%ДИ, от 0,30 до 0,87), (см таблицу 5). Таким образом, иммунный ответ, оцененный посредством РГЗТ у всех пациентов подтвержден более специфичным методом ELISPOT у этой группы пациентов (n=15).

Таблица 5.  Иммунологическая эффективность,

оцененная при помощи методов ELISPOT и РГЗТ (n=15).

Иммунный ответ

Есть

Нет

Всего

ELISPOT

n=6

n=9

n=15

(p=0,015)

РГЗТ(+)MAX

n=10

n=5

ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ И ФАКТОРЫ РОСТА

       У пациентов с метастатической меланомой (терапевтической и профилактических групп) перед вакцинотерапией был значительно повышен уровень ИЛ-2 и ИЛ-4 (p<0,05) и снижен уровень IFN-гамма (p<0,05) по сравнению со здоровыми донорами. Также изначально в два раза был повышен уровень ИЛ-10, однако такое повышение было статистически недостоверно (p>0,05). Пациенты терапевтической группы начинали вакцинотерапию при уровне VEGF-A в 5,8 раз превышающим этот показатель у здоровых добровольцев (p=0,038), в профилактической группе уровень VEGF-A изначально был повышен в 2,5 раза (p=0,062), что может свидетельствовать о более агрессивном течении заболевания у пациентов терапевтической группы. Остальные показатели не имели достоверных отличий от показателей здоровых доноров.

Вакцинотерапия дендритными клетками и клиническое течение заболевания не оказывали существенного влияния на концентрацию исследованных цитокинов и факторов роста у пациентов терапевтической группы. Однако в процессе лечения отмечено статистически достоверное и выраженное повышение уровня S100 в терапевтической группе (со 102,9 до 399,7 pg/ml, p=0,023). В профилактической группе пациентов уровень S100 в процессе лечения незначительно, но достоверно повышался с 81,8 до 115,2 pg/ml, p=0,002. Уровень S100 характеризует степень распространенности заболевания, поэтому данное увеличение является лабораторным свидетельством прогрессирования заболевания, которое в конечном итоге зарегистрировано у 15 из 17-ти больных терапевтической группы и у 42 из 56-ти больных профилактической группы. У пациентов профилактической группы, в отсутствии клинически выявляемых метастазов до начала лечения динамика маркера менее выражена.

Также в профилактической группе в процессе лечения отмечена тенденция к снижению уровня ИЛ-4, VEGF-A, TGF-2, однако эти изменения статистически недостоверны (p>0,05), уровни остальных цитокинов без существенных изменений.

       На основании данных полученных можно сделать вывод о том, что у пациентов с метастатической меланомой кожи по сравнению со здоровыми донорами происходит нарушение клеточного иммунного ответа (Th1), который главным образом отвечает за противоопухолевый иммунный контроль, и сдвига в сторону гуморального (Th2).

В настоящем исследовании вакцина на основе аутологичных дендритнымх клеток, изготавливаемая индивидуально для каждого пациента с использованием мононуклеарных клеток, полученных от пациента, безопасна и хорошо переносима при лечении метастатической МК. Несмотря на некоторую трудоемкость метода, персонализированный подход обеспечивает отсутствие выраженных побочных эффектов.

       Дендритная вакцина иммунологически компетентна, у значительной части больных она вызывает развитие противоопухолевого иммунного ответа, который благоприятно сказывается на клиническом течении заболевания и способствует увеличению безрецидивной и общей выживаемости пациентов. Эффективность вакцины выше при небольшом объеме опухолевого поражения и максимальна после полного удаления метастазов, то есть в профилактическом режиме.

Выводы

  1. Терапия метастатической меланомы кожи аутологичной дендритной вакциной малоэффективна. Частота объективных ответов на вакцину составляет 11,8% и сопоставима с эффективностью химиотерапии дакарбазином, однако медиана общей продолжительности жизни больных МК IV стадии на фоне вакцины (17 мес.) оказалась существенно выше данных исторического контроля (6-9 мес.).
  2. На фоне дендритной вакцинотерапии отмечено достоверное увеличение безрецидивной выживаемости в профилактической группе по сравнению с группой наблюдения, при этом медиана времени до прогрессирования в группе вакцины составила 10,0 мес. по сравнению с 4,8 мес. в группе наблюдения,  p0,05 (logrank test). Отмечена тенденция к увеличению общей продолжительности жизни в профилактической группе по сравнению с группой наблюдения, р=0,22 (logrank test).
  3. Дендритная вакцина вызывает развитие противоопухолевого иммунного ответа у значительной части больных: в терапевтическом режиме выраженный иммунный ответ зарегистрирован у 4 из 17 больных (23%), а в профилактическом режиме у 31 из 56 больных (55,4%).
  4. Выраженный противоопухолевый иммунный ответ на фоне вакцины (оценка методом РГЗТ) достоверно коррелирует с клинической эффективностью - способствует увеличению безрецидивной и общей выживаемости пациентов профилактической группы (p<0,05). Специфичность противоопухолевого иммунного ответа подтверждена методом ELISPOT.
  5. У больных МК (в терапевтической и профилактических группах) перед началом лечения был значительно снижен уровень IFN-гамма (p<0,05) и повышены  ИЛ-2 и ИЛ-4 (p<0,05) в сыворотке по сравнению со здоровыми донорами, что свидетельствует о нарушении клеточного звена противоопухолевого иммунитета (Th1) со сдвигом в сторону гуморального (Th2). При этом дендритная вакцина и клиническое течение заболевания не оказывали достоверного влияния на концентрацию цитокинов в сыворотке.

Список работ опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК:

  1. Барышников, А.Ю. Вакцинотерапия рака: от эксперимента к клинике / Демидов Л.В., Михайлова И.Н., Петенко Н.Н. // Вестник Российской Академии Медицинских наук. — 2007. — №10. — C. 46-8.
  2. Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия меланомы дендритными клетками / Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Демидов Л.В. // Российский биотерапевтический журнал. — 2007. — №3(6). — C. 8-18.
  3. Михайлова, И.Н. Внутрикожная клеточная реакция на фоне вакцинотерапии меланомы кожи / Михайлова И.Н., Иванов П.В., Петенко Н.Н., Барышников К.А., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Черемушкин Е.А., Субраманиан С., Чкадуа Г.З., Барышников А.Ю., Демидов Л.В. // Российский биотерапевтический журнал. — 2010. — №1. — С. 63-67.
  4. Никитин, К.Д. Метод ELISpot для оценки иммунного ответа у больных, получающих противоопухолевую вакцину на основе дендритных клеток / Никитин К.Д., Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Утяшев И.А., Парсункова К. А., Рубцова М.А., Чкадуа Г.З., Барышников К.А., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. // Российский биотерапевтический журнал. — 2010, №4. — C.55-60.
  5. Парсункова, К.А. Сравнительный анализ содержания S-100, CD44, TGF-2, VEGF-A в сыворотке крови больных с диссеминированной меланомой на фоне вакцинотерапии / Парсункова К.А.,  Михайлова И.Н., Евсегнеева И.В., Чкадуа Г.З., Петенко Н.Н., Караулов А.В., Барышников А.Ю., Ворожцов Г.Н. // Молекулярная медицина. — 2010. № 6. — С. 34-39.

Список других работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Иванов, П.В. Aнализ изменений лимфоидных структур кожи человека при проведении внутрикожной вакцинотерапии / Иванов П.В., Петенко Н.Н. // Вестник Российского государственного медицинского университета. — 2006. — №2. — С. 373. 
  2. Михайлова, И.Н. Иммунные реакции кожи у больных с меланомой при проведении вакцинотерапии / Михайлова И.Н., Иванов П.В., Лукашина М.И., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Петенко Н.Н., Черемушкин Е.А., Чкадуа Г.З., Демидов Л.В, Барышников А.Ю. // Российский биотерапевтический журнал. — 2006. — №1 (5). — C. 5.
  3. Mikhaylova, I.N. Autologous dendritic cell based of melanoma / Mikhaylova I.N., Chkadua G.Z, Borunova A.A., Petenko N.N., Parsunkova K.A., Balatskaya N.V., Cheremushkin E.A., Titov K.S.,  Krasnova B.K, Kadagidze Z.G., Demidov L.V., Barishnikov A.U. // 8-th International Symposium Biological Therapy of Cancer – 2006. – June 21-24. – Dresden
  4. Иванов, П.В. Aнализ изменений лимфоидных структур кожи человека при проведении внутрикожной вакцинотерапии / Иванов П.В., Петенко Н.Н. // Вестник Российского государственного медицинского университета. — 2006. — №2. — С. 373. 
  5. Барышников, А.Ю. Биотерапия в онкологии / Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Кадагидзе З.Г., Михайлова И.Н., Харкевич Г.Ю., Заботина Т.Н., Борунова А.А., Тимофеев И.В., Лукашина М.И., Чкадуа Г.З., Барышников К.А., Петенко Н.Н. // Вестник московского Онкологического общества. — 2008. — №. 544. — С. 6-10.
  6. Парсункова, К.А. Цитокиновый профиль на фоне вакцинотерапии у больных диссеминированной меланомой. / Парсункова К.А., Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Чкадуа Г.З., Барышников А.Ю., Демидов Л.В. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Опухоли кожи и мягких тканей». – 2009. – 3-4 сентября Санкт-Петербург. – С. 31-34.
  7. Демидов, Л.В. Новые направления в лечении больных меланомой кожи. / Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю., Михайлова И.Н., Петенко И.Н., Самойленко И.В., Утяшев И.А. // Вестник Московского онкологического общества. — 2011. — №9. — С.4-6.
  8. Mikhailova, I. Clinical Immunological Parameters of Patients with Skin Melanoma during Anti-Tumor Vaccine Therapy / Mikhailova I, Parsunkova K, Chkadua G, Manina I, Shubina I, Petenko N., Evsegneeva I, Demidov L, Baryshnikov A, Karaulov A. // World immune Regulation Meeting-VI 18 March – 21 March 2012 Davos, Switzerland Abstract S47.
  9. Petenko, N.N. Adjuvant dendritic cell (DC)-based vaccine therapy of melanoma patients / Petenko N.N., Mikhaylova I.N., Chkadua G.Z., Baryshnikov A.Y., Demidov L.V. // J Clin Oncol. — 2012. — V. 30 (suppl. abstr. 2524).
  10. Парсункова, К.А. Динамика уровней цитокинов в сыворотке крови при диссеминированной меланоме / Парсункова К.А., Михайлова И.Н., Евсегнеева И.В., Петенко Н.Н., Краснова Л.Б., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н., Чкадуа Г.З., Огодникова Е.В., Вишнякова Л.Ю., Черемушкин Е.А., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. // Научно-практическая конференция Актуальные вопросы онкологии 23-24 апреля 2007 г., Элиста. С. 30.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.