WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Короленкова Любовь Ивановна

Клинические и молекулярно-генетические основы предрака и ранних форм рака шейки матки

Онкология 14.01.12

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина»

Российской академии медицинских наук

(директор – академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович)

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

  Анатолий Юрьевич Барышников

Официальные оппоненты:

Кузнецов Виктор Васильевич

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, заведующий отделением гинекологии

Прилепская Вера Николаевна

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России,  заместитель директора по научной работе, руководитель поликлинического отделения

Поддубная Ирина Владимировна

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России, заведующая кафедрой онкологии

Ведущая организация:

ФГБУ "НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова" Минздравсоцразвития России

Защита состоится «___» _________ 201___г. в ___часов на заседании диссертационного совета Д001.017.01 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр

им. Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

(115478, Москва, Каширское шоссе, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (115478, г.Москва Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан «__»______201_г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, 

доктор медицинских наук,

профессор                      Юрий Владимирович Шишкин

Актуальность исследования

Рак шейки матки (РШМ) – третье наиболее распространенное злокачественное новообразование среди женщин в мире, первое по частоте – среди женщин 15-39 лет и самая частая причина смерти от онкологических заболеваний в развивающихся странах (Jemal A. et al., 2011).

Предрак шейки матки – цервикальные интраэпителиальные неоплазии (Cervical Intraepithelial Neoplasia, CIN) – инициируются и поддерживаются персистирующей инфекцией, вызванной вирусами папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР). CIN предшествуют РШМ на протяжении нескольких лет и даже десятилетий. За столь длительный период они могут быть выявлены и излечены до развития инвазивного рака.

Открытие роли ВПЧ ВКР в возникновении CIN и РШМ кардинально изменило стратегию скрининга и профилактики заболевания (zur Hausen H., 1982, 2002; Stern P., 2008). Тестирование на ВПЧ ВКР в дополнение к цитологическому методу существенно улучшило диагностику, а разработка и применение вакцин против инфицирования ВПЧ 16 и 18 типов внушает надежды на выраженное снижение заболеваемости РШМ (Stern P., 2008; Arbyn et al., 2005, 2006; Bosch X. et al., 2008; Cuzick J. et al., 2006, 2008; Harper D., 2010; Heideman D. et al., 2008). Однако, в России вакцинация не имеет широкого распространения из-за высокой стоимости вакцин и консервативных взглядов населения. Заболеваемость РШМ в стране высока (12,9 на 100 000 женщин) и выросла за последние 5 лет на 12,4%, а запущенность составила 39,8% вновь выявленных случаев заболевания (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2011). На стадии CIN и микроинвазивного рака шейки матки (МРШМ) заболевание диагностируется нечасто. Это связано с отсутствием государственной программы организованного скрининга и неполноценным использованием современных его инструментов  – тестирования на ВПЧ ВКР – в скрининге оппортунистическом, присутствующем лишь в некоторых центральных регионах.

Частота персистирующей инфекции, вызванной  ВПЧ ВКР, крайне высока - от 10 до 20-40% молодых женщин в популяции, а  CIN и тем более РШМ развиваются лишь в единичных случаях (Huang C., 2007; Bosch X. et al., 2002). В мире в результате скрининга в 2008г зарегистрировано 300 млн инфицированных ВПЧ высокого и низкого канцерогенного риска и 10 млн CIN3.  CIN являются этапами цервикального канцерогенеза: CIN1 (легкая дисплазия), CIN2 (умеренная дисплазия), CIN3 (тяжелая дисплазия и преинвазивный рак, т.е. carcinoma in situ, CIS). На каждом этапе возможна персистенция, прогрессия или регрессия (Tranbaloc P., 2008). Для обозначения относительного риска прогрессии до цервикального рака CIN1 в классической концепции относят к легким повреждениям, а CIN2 и CIN3, включающую CIS – к тяжелым, истинно предраковым повреждениям. В дальнейшем для обозначения тяжелых повреждений будет использоваться термин  CIN2-3/CIS.

При CIN1 вероятность регрессии высока (60-70%), а регрессирующие крайне редко CIN2-3/CIS являются облигатным предраком (Shadeo A. et al., 2008; Song S. et al., 2006; Trabanloc P., 2008). Молекулярно-генетические механизмы персистенции, регрессии или прогрессии вплоть до инвазивного рака не до конца исследованы и не ясны.

Для предсказания исхода неоплазии и построения индивидуального прогноза изучается продукция молекулярных маркеров при разных степенях CIN и стадиях РШМ и их экспрессия под влиянием отдельных генов ВПЧ, в основном Е6 и Е7, на этапах вирусного канцерогенеза. Наиболее изученным маркером является p16INK4a, однако данные о других маркерах инициируемой ВПЧ ВКР опухолевой трансформации клеток через различные сигнальные пути часто противоречивы и критериев течения CIN пока не существует (Branca M. et al., 2004, 2008; Cricca M. et al, 2007; Dursun P. et al., 2007; Tsoumpou I. et al., 2009; Valasoulis G. et al, 2011).

Диагностика микроинвазивного рака шейки матки (МРШМ) крайне трудна из-за отсутствия макроскопических признаков опухолевого роста. Обнаружение в сыворотке маркеров инвазии позволило бы диагностировать микроинвазию до операции, однако экспрессия этих маркеров, изучаемая при РШМ, почти не исследовалась при CIN и МРШМ.

В клинической практике часты случаи расхождения результатов цитологических и гистологических исследований, несовпадения гистологических диагнозов у одной больной, недооценки степени эпителиальных повреждений по материалу ограниченных биопсий, повлекшие за собой неправильное ведение пациенток. Нередко в анамнезе больных инвазивным раком обнаруживаются факты неадекватного лечения или наблюдения CIN, а также очевидные ошибки в определении степени неоплазии. Часто отсутствует эффект от деструктивных воздействий.

Не до конца изучены диагностическая ценность расширенной кольпоскопии для предварительной диагностики неоплазии, и причины несовпадения результатов кольпоскопии с цитологическими и гистологическими данными, в частности, значимость отсутствия аномальных кольпоскопических картин при тяжелых повреждениях в цитологических мазках.

В России предлагаемые рекомендации по ведению больных CIN практическими врачами не соблюдаются, а стандартов не существует. Недостаточно изучена эффективность и целесообразность применения иммуномодуляторов с предполагаемым противовирусным действием у больных c CIN1 и в комбинированном лечении CIN2-3/CIS. Неясны критерии выбора между консервативным ведением или деструкцией при CIN1, между деструкцией и петлевой эксцизией зоны трансформации (Large Loop Electrosurgical Excision of the Transformation Zone (LLETZ), Loop Electrosurgical Excision Procedure (LEEP)) при CIN2, между LLETZ и ее более глубоким вариантом – конизацией при CIN3/CIS. Не существует однозначного мнения о достаточности конизации при обнаружении в конусе МРШМ, что особенно важно для молодых пациенток, желающих сохранить фертильность (Mota F., 2003 Smrkolj S. et al., 2012; Takeda N. et al., 2012; Costa S., 2012 Wright J. et al., 2010; Petry K., 2009, Park J. et al., 2007; Rogers L., Luesley D., 2009; Jordan J. et al., 2009). Недостаточно разработаны и внедрены критерии оценки эффективности лечения CIN2-3/CIS и МРШМ, в частности, полноценности эксцизии пораженной части шейки матки при наиболее часто выполняемых органосохраняющих операциях.

Поскольку CIS и МРШМ часто встречаются у женщин детородного возраста (Jemal A. et al., 2011; Bosch X et al., 2008), особенные трудности возникают при выявлении заболевания, особенно преинвазивного и микроинвазивного рака, во время беременности. При обнаружении CIN3/CIS беременным в России абсолютное большинство врачей предлагает прервать беременность, что не соответствует мировым стандартам. В России нет адекватных рекомендаций по ведению беременных с впервые выявленным неопластическим процессом шейки матки, особенно с МРШМ.

Молекулярно-генетические, морфологические, иммуногистохимические, вирусологические и клинические исследования ведутся в разных областях, но не составляют целостной картины и не взаимосвязаны. Стройная клинико-морфологическая концепция развития и течения CIN и РШМ, близкая для  понимания практических врачей и позволяющая уменьшить число диагностических и тактических ошибок, отсутствует. 

Все это позволяет считать актуальным решение проблемы разработки клинико-морфологических и молекулярно-генетических основ диагностики и лечения больных предраком (CIN) и начальными формами РШМ.

Цель исследования

Улучшение эффективности диагностики и лечения CIN, преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки путем разработки клинико-морфологической и молекулярно-биологической концепций их развития и течения. 

Задачи исследования:

  1. Определить морфологические особенности шейки матки и цервикальных неоплазий, влияющие на информативность диагностики и выбор способа получения материала для адекватной гистологической верификации диагноза.
  2. Оценить значение тестирования на ВПЧ ВКР методами гибридного захвата (НС2) и ПЦР в первичной диагностике CIN и МРШМ и в оценке эффективности  органосохраняющего лечения.
  3. Определить роль и эффективность органосохраняющего лечения в объёме электрорадиохирургической конизации шейки матки для CIN2-3/CIS и МРШМ 1а1 стадии, выявить наиболее частые технические ошибки операции и пути их коррекции. 
  4. Изучить особенности клинического течения  CIN2-3/CIS и МРШМ у беременных и значение консервативного ведения для прогноза заболевания и исхода беременности. 
  5. Определить по изменению вирусной нагрузки НС2 ВПЧ ВКР эффективность отечественного иммунокорректора «аллокина-альфа» при использовании его в предоперационном режиме в  комбинированном лечении CIN2-3/CIS.
  6. Оценить прогностическое значение различных онкомаркеров (Ki-67, тимидинфосфорилазы, PTEN, VEGF, COX2, е-кадгерина, Bcl-2, Bax, pAkt, MMP-2, MMP-9, ламинина-52-цепей, коллагена IV типа), а также активности теломеразы в зависимости от ее сплайсированных форм для прогрессии CIN и возможность их использования в тестовой системе диагностики степени повреждений и прогнозирования течения CIN и МРШМ.
  7. Исследовать белки семейства инсулиноподобных факторов роста и эпидермального фактора роста в сыворотке больных CIN1-2, МРШМ и инвазивным РШМ для определения их роли в цервикальном канцерогенезе, прогностической и диагностической ценности.
  8. Изучить сывороточное содержание дифференцировочных молекул CD54 (ICAM-1), CD-50 (ICAM-3), CD18, CD8, CD38, CD95 и HLA1 , отвечающих за адгезию и эффекторные пути врожденного и приобретенного иммунитета, а также их ассоциатов на различных этапах цервикального канцерогенеза для определения их влияния на патогенез и прогноз течения CIN.

Научная новизна

Впервые на обширном клиническом материале (880 больных CIN1-3 и МРШМ) доказано исключительное значение зоны трансформации (ЗТ) и эндоцервикальных крипт  шейки матки, как мишени для поражения ВПЧ ВКР и места возникновения предрака и рака шейки матки, выявлена взаимосвязь анатомических и возрастных особенностей ЗТ с клиническими проявлениями, эффективностью диагностики и лечения CIN и МРШМ. 

Впервые показано изменение информативности расширенной кольпоскопии  и шансов гиподиагностики тяжелых CIN и МРШМ в зависимости от видимости ЗТ, возраста больных и оценена значимость кольпоскопии для выбора метода получения первичного морфологического материала (ограниченная биопсия, петлевая эксцизия, конизация) и адекватной гистологической верификации диагноза.

Впервые изучена частота сочетания эпителиальных повреждений разной степени, отражающего единый непрерывный процесс канцерогенеза, и выявлена роль полиморфности поражений в гиподиагностике степени неоплазии шейки матки.

Впервые доказана важность вовлеченности эндоцервикальных крипт в неопластический процесс, как основной причины неполного удаления неоплазированного эпителия при петлевых эксцизиях и конизациях и негативного фактора прогноза, оценено значение кольпоскопической диагностики поражения крипт для выбора метода лечения CIN и обосновано предпочтение эксцизионного метода перед деструкцией.

Впервые в России  показана роль тестирования на ДНК ВПЧ ВКР методом гибридного захвата в диагностике CIN и МРШМ и его высокая информативность, и необходимость использования в оценке эффективности органосохраняющих операций и наблюдении за больными.

Впервые по изменению вирусной нагрузки HC2 ВПЧ ВКР оценена эффективность предэксцизионного лечения CIN2-3/CIS  иммуномодулятором аллокин-альфа, доказана патогенетическая оправданность его применения в консервативном и комбинированном лечении CIN разной степени.

Впервые разработан алгоритм информирования беременных женщин с HSIL и более в мазках и подозрением на CIN2-3, включая CIS, и МРШМ, помогающий женщине принять решение о судьбе ребенка.

Впервые изучена  прогностическая и диагностическая роль совокупности 14 маркеров (Ki-67, тимидинфосфорилазы, PTEN, VEGF, COX2, е-кадгерина, ламинина-52, коллагена IV типа, Bcl-2, Bax, pAkt, MMP-2, MMP-9, теломеразы) при CIN и МРШМ для  оценки целесообразности их включения в панель тестовой системы с целью уточнения степени повреждений и индивидуального прогнозирования течения CIN. 

Впервые в мире исследована присутствие pAkt в тканях шейки матки больных CIN и МРШМ, показана прямая зависимость экспрессии маркера от степени эпителиальных повреждений и его высокая диагностическая и прогностическая ценность.

Впервые на материале собранной автором большой коллекции сывороток от 173 больных CIN и РШМ изучено сывороточное содержание дифференцировочных молекул адгезии, Fas-опосредованного апоптоза, главного комплекса гистосовместимости и других молекул адаптивного иммунитета (CD54, CD50, CD18, CD95, HLAI, CD8, CD38 и их ассоциатов), показано их участие в возникновении неоплазии, выявлен прогностически неблагоприятный вариант сочетания значений маркеров.

Впервые с использованием той же коллекции  изучено содержание в сыворотке крови больных CIN и РШМ белков семейства инсулиноподобных факторов роста и EGF и отмечены прогностически неблагоприятные их соотношения и значения.

Впервые оценена взаимосвязь сплайсированных форм мРНК hTERT с экспрессией мРНК hTERT и активностью теломеразы при CIN и МРШМ.

Научно-практическая значимость

Полученные данные значимы для практических врачей: онкологов, акушеров-гинекологов, кольпоскопистов, так как обосновывают и определяют тактику диагностики, лечения и наблюдения больных CIN и МРШМ. Разработана стройная клинико-морфологическая концепция развития и течения CIN и РШМ, позволяющая уменьшить число диагностических и тактических ошибок. Предложены современные алгоритмы диагностики, оценки эффективности лечения и наблюдения за больными CIN и МРШМ с использованием теста гибридного захвата на ДНК ВПЧ ВКР. Раскрыты объективные причины ошибок в определении степени повреждений, влекущих за собой неправильное ведение больных. Предложены критерии выбора метода получения материала для гистологической верификации диагноза во избежание гиподиагностики. Рассмотрены технические особенности и ошибки  при выполнении электрорадиохирургической конизации, описаны пути их коррекции. Обоснована целесообразность иммуномодулирующей терапии в комбинированном лечении больных CIN.

Показана безопасность донашивания беременности при CIN3, в том числе преинвазивном раке, и МРШМ.

Созданные автором коллекции образцов тканей шейки матки, взятых под кольпоскопическим контролем, сыворотки и плазмы больных CIN и РШМ, позволили провести комплексный анализ прогностической ценности большой совокупности маркеров для создания тестовых панелей с целью построения индивидуального прогноза CIN. Полученные данные о молекулярно-биологических и иммунологических характеристиках CIN и РШМ задают направления для дальнейших исследований. Некоторые из определенных в тканях шейки матки часто экспрессирующихся маркеров в дальнейшем могут быть использованы как молекулярные мишени для  профилактики и лечения РШМ.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Практически все тяжелые CIN2-3, в том числе преинвазивный рак, и МРШМ ассоциированы с ВПЧ ВКР. Чувствительность и прогностическая ценность отрицательного результата теста гибридного захвата (НС2) на ДНК ВПЧ ВКР для диагностики и оценки эффективности лечения CIN2-3/CIS  и МРШМ после органосохраняющих операций составляют практически 100% – отрицательный результат теста предсказывает отсутствие тяжелых эпителиальных повреждений шейки матки и неизлеченности. Специфичность и предсказательная ценность положительного результата НС2 выше, чем ПЦР.
  2. Тяжелые  CIN2-3/CIS и МРШМ развиваются сугубо в зоне трансформации и эндоцервикальных криптах и с возрастом «смещаются» вглубь цервикального канала. Существуют три объективные причины возможной гиподиагностики степени  эпителиальных повреждений  и снижения эффективности лечения: неполная видимость зоны трансформации с очагами неоплазии, чаще наблюдаемая у женщин старше 35 лет,  сочетание неоплазий разной степени у одной больной (71,8% пациенток) и вовлеченность или развитие процесса в эндоцервикальных криптах.  С увеличением возраста степень неоплазии увеличивается, а площадь видимых на эктоцервиксе эпителиальных повреждений уменьшается, информативность кольпоскопии и достоверность результатов ограниченных биопсий снижается.
  3. Донашивание беременности при CIN2-3/CIS безопасно, риск прогрессии при МРШМ минимален.
  4. В тестовую систему для диагностики и построения индивидуального прогноза CIN и МРШМ необходимо включить Е-кадгерин, Ki-67, pAkt, ТФ, VEGF и COX2, предсказание микроинвазии возможно по экспрессии COX2. Включение MMP-2, MMP-9, bax, bcl-2, PTEN, активности TERT также целесообразно для построения индивидуального прогноза, но не для уточнения степени повреждений .
  5. IGF-1, IGF-2, IGFBP-3, IGFBP-1, EGF, присутствующие в сыворотке крови больных CIN и РШМ, вовлечены в цервикальный канцерогенез, данные маркеры можно использовать для предсказания скрытой инвазии и прогрессии при CIN3.
  6. Дифференцировочные молекулы -  CD54, CD50, CD18, CD8, CD38, CD95,  молекулы главного комплекса гистосовместимости – HLAI, и их ассоциаты, присутствующие в сыворотке крови больных CIN и РШМ, участвуют в развитии заболевания за счет нарушения активации адаптивного иммунного ответа и имеют прогностическое значение.
  7. Активация теломеразного комплекса в виде экспрессии мРНК hTERT в эпителии шейки матки наблюдается уже в начале неопластического процесса во всех случаях CIN и МРШМ, и более чем в образцов прилежащего к CIN условно неизмененного эпителия, но активность теломеразы, как маркера потенциальной прогрессии,  выявляют только в половине случаев  независимо от степени неоплазии. Активность теломеразы не связана с вариантами сплайсинга мРНК hTERT, ее обнаружение не может служить маркером для определения  степени CIN и инвазии, но может выделить больных с неблагоприятным прогнозом.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения

Результаты работы  внедрены и широко используются в  работе поликлиники, отделения оперативной, гинекологии и отделения опухолей женской репродуктивной системы ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. В результате обучения автором врачей из регионов на рабочем месте и чтения докладов на множестве значимых международных, общероссийских и региональных конференциях современные алгоритмы диагностики, лечения и оценки его эффективности с использованием метода НС2 ДНК ВПЧ ВКР внедрены в клиниках Москвы, Приморского Края, г.Ташкента. Результаты исследований активно внедряются  в лекциях, читаемых автором при обучении и повышении квалификации врачей в РМАПО.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась 14 сентября 2012 года на научно-практической конференции ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН с участием поликлиники (отделение амбулаторных методов диагностики и лечения), отделения гинекологии, отделения опухолей женской репродуктивной системы, патологоанатомического отделения, лаборатории клинической цитологии, лаборатории клинической иммунологии опухолей НИИ клинической онкологии; отделения по внедрению и оценке эффективности методов профилактики опухолей, лаборатории молекулярной биологии вирусов, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов, лаборатории вирусного канцерогенеза, лаборатории иммунологии онкогенных вирусов НИИ канцерогенеза; лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории комбинированной терапии опухолей, лаборатории биомаркеров  и механизмов опухолевого ангиогенеза НИИ ЭДиТО.

Результаты работы доложены на Российской конференции по онкогинекологии (Москва, 8-9 апреля 2009 г), 16th ESGO International Meeting (Белград, Сербия 11-14 октября 2009 г), XIII Российском Онкологическом Конгрессе (Москва, 19 ноября 2009 г), IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 18-21 января 2010 г), Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты» (Москва, 29 марта – 2 апреля 2010 г),  Ташкентском международном форуме по раку молочной железы (Ташкент, 14-15 мая 2010), IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Н.Новгород, 18-19 мая 2010 г), X, XI и XII Всероссийских научных форумах «Мать и дитя» (Москва, 2010, 2011, 2012гг), V и VI Международных конгрессах по репродуктивной медицине, (Москва, 2011, 2012гг), Х Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011 г),  II научно-практической конференции «Современные научные направления и актуальные клинические вопросы в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2011 г), XIV международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 6-9 июня 2011 г), заседании общества онкологов №546 (Москва, 27 марта 2008 г),  Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология – практическому здравоохранению» (Москва, 20-21 февраля 2012 г), Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика – в эпицентре женского здоровья» (Москва, 20-23 марта 2012 г), конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 17-19 ноября 2010 г), заседании московского общества онкологов (Москва, 29 марта 2012 г), конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2012» (Санкт-Петербург, 20 апреля 2012 г), научно-практической         конференции «Пролиферативные заболевания женской репродуктивной системы в практике врача акушера-гинеколога», (Москва, 13 июня 2012 г.

Публикации.  По теме диссертации опубликовано 56 научных работ, из них 21 статья - в журналах, рецензируемых ВАК.        

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 337 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 8 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 432 источника, из них 60 отечественных и 372  зарубежных. Работа иллюстрирована 74 таблицами, 87 рисунками.

Материалы и методы

В исследование вошли 880 больных CIN разной степени и МРШМ, лечившихся и наблюдавшихся в РОНЦ с 2006 по 2011 год, из них 596 - обследованных по стандартному протоколу, включающему расширенную кольпоскопию (кольпоскоп 3MV (Leisegang, Германия)) с регистрацией кольпоскопических изображений в динамике в рабочей видеостанции врача (ПО Leisecap), цитологическое исследование мазков по классификации Bethesda, 2001, вирусологическое исследование двумя методами (ПЦР с типированием ВПЧ ВКР и полуколичественный тест гибридного захвата 13 типов ВПЧ ВКР НС2 (Hybrid CaptureТМ 2,  High-Risk HPV DNA Test, Qiagen, Inc. Gaithersburg) с определением вирусной нагрузки в относительных световых единицах, отражающей только клинически значимые концентрации вируса: >1 pg/мл, 100000 на образец или 5000 копий/мл). Тест выполняли в соответствии с инструкциями производителя. Все гистологические препараты были пересмотрены морфологом (в.н.с. отделения патологической анатомии НИИ КО РОНЦ к.м.н. Ермиловой В.Д.) для уточнения морфологического диагноза, состояния краев резекции и распространенности неоплазии по криптам. Разделение больных на группы по степени неоплазии выполняли согласно классификации Bethesda, принятой в 1988г.

Распределение больных по возрасту и диагнозу показано в таблице 1.

Таблица –– 1 Распределение больных по степени эпителиальных повреждений и возрасту

Диагноз

Количество (%)

Средний возраст ± ст. отклон.

Стандартная ошибка среднего

Медиана возраста

CIN 1

74 (8,4)

32,9±10,9

1,3

29

CIN 2

142 (16,1)

33,8±10,1

0,8

31,0

CIN 3: Тяжелая дисплазия

229 (26,0)

35,1±9,5

0,6

33,0

CIN 3: Преинвазивный рак

290 (33,0)

36,9±10,8

0,6

35,0

Плоскоклеточный рак 1А1

106 (12,0)

40,9±11,6

1,1

40,0

Плоскоклеточный рак 1А2

34 (3,9)

43,3±12,6

2,2

41,5

Аденокарцинома 1А1

5 (0,6)

39,8±13,8

6,2

34,0

Всего

880 (100,0)

36,3±10,9

0,36

34,0

Гистологическую верификацию проводили по материалам биопсии, петлевой эксцизии или электрорадиохирургической высокочастотной конизации (ЭХВЧ) аппаратом ФОТЕК ЕМ-80 (Фотек, Екатеринбург, Россия) и соскоба цервикального канала (рис. 1).

По указанному выше протоколу было обследовано также 187 больных, обратившихся с изменениями в мазках от ASCUS и более, у которых CIN не подтвердилась морфологически. Группа послужила контролем для оценки диагностической эффективности ВПЧ-тестирования.

Из всей когорты больных формировали группы, отвечающие критериям выбора для каждой задачи исследования. Автором с помощью программного обеспечения Leisecap создана электронная база кольпоскопических видеоизображений и разработана оригинальная  методика определения относительной площади поражения. База послужила основой для документированного изучения зависимости площади неоплазии на эктоцервиксе от степени повреждения, видимости ЗТ, возраста больных, а также для сравнения информативности цитологического и кольпоскопического методов и оценки эффективности лечения.

Рисунок 1 — Алгоритм обследования и наблюдения больных CIN и МРШМ, вошедших в исследование

У 602 больных, имевших два последовательных гистологических исследования тканей от биопсии и (или) петлевой эксцизии и конизации, было изучено соответствие максимальной степени неоплазии в обоих материалах и частота недооценки степени неоплазии по результатам ограниченной биопсии. 

При достаточной площади поражения эктоцервикса из участков неоплазии и из неизмененной части шейки матки брали материал для исследования теломеразы – ее активности, экспрессии мРНК, и вариантов сплайсинга hTERT (88 объектов от 51 пациентки (CIN1 – 10, CIN2 – 9, CIN3 – 15, МРШМ – 17)). Была использована оригинальная методика получения материала, предложенная автором. Предварительно выполняли расширенную кольпоскопию с определением и видеорегистрацией топографии участков CIN разной степени. На другой день  под контролем кольпофотограммы и простой кольпоскопии без дополнительных проб с уксусной кислотой, угнетающей теломеразную активность (Chang Chien C. et al., 1998), синхронно получали два соприкасающихся участка неоплазированного эпителия - для гистологического исследования и определения мРНК hTERT и теломеразной активности. Таким образом, полученный материал имел достоверную морфологическую верификацию и не был поврежден реагентами. После получения материал немедленно замораживался в жидком азоте. Исследование теломеразы выполняли в лаборатории молекулярной биологии вирусов (зав. лабораторией - член-корр. РАМН, профессор Ф.Л. Киселёв), на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ (зав. кафедрой член-корр. РАН О.А. Донцова) и в Медико-генетическом Центре РАМН. Для выделения РНК использовали набор RNAqueous-4PCR (Ambion, США) согласно рекомендациям производителя. РНК были обработаны ферментом ДНКазой. Концентрацию РНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop-1000. Для получения кДНК использовали обратную транскриптазу ReverdAid (Fermentas) согласно протоколу производителя. Амплификацию кДНК из образцов биопсий шейки матки проводили с праймерами к контрольному гену HPRT1 и к трем типам изоформ (++-изоформы - мРНК без альфа и бета делеций; -изоформы - мРНК с альфа делецией; -изоформы - мРНК с бета делецией) гена hTERT. Для амплификации использовали полимеразу Taq Maxima (Fermentas) согласно протоколу производителя.

Автором была создана коллекция сыворотки и плазмы крови 173 больных CIN и МРШМ - 6 пробирок по 0,5 мл от каждой больной, которые хранили при -70°С. Коллекция послужила для исследования с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с применением моноклональных антител серии ИКО содержания растворимых молекул: суммарной и олигомерной фракций CD54, CD50, CD18, CD38, CD8, CD95, а также HLAI и их комплексов (CD18-CD54, CD18-CD50, HLAI-CD8), участвующих в адгезии иммунокомпетентных клеток и формировании иммунного ответа, Fas-опосредованном апоптозе, в сравнении с показателями у здоровых женщин-доноров (n=85). Содержание дифференцировочных молекул и HLAI определяли в НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского (директор д.б.н., проф., академик РАЕН В.В. Новиков). Та же коллекция сывороток была использована для изучения иммуноферментным методом эпидермального (EGF) и инсулиноподобных факторов роста (IGF1, IGF2) и связывающих их белков (IGFBP1, IGFBP3). В исследование были включены 80 женщин, в том числе 64 больные с различными поражениями шейки матки: 22 пациентки (34,4%) с CIN 1-2; 7 пациенток (10,9%) - МРШМ 1А, 35 пациенток (54,7 %) - инвазивный РШМ 1В и более стадии. Здоровые женщины без неоплазии составили контрольную группу (n=16). Содержание белков в сыворотке крови определяли в лаборотории биохимии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (зав. лаб. член-кор. РАМН Кушлинский Н.Е.).

Ткани для криоконсервации, сыворотку и плазму получали до лечения с информированного согласия больных.

С целью определения эффективности и целесообразности использования в иммуногистохимической панели для уточнения степени повреждений, прогноза течения и предсказания скрытой инвазии выполняли иммуногистохимическое исследование экспрессии 13 маркеров пролиферации, апоптоза, межклеточных связей, неоангиогенеза, инвазии - по стандартной методике на депарафинированных срезах с блоков тканей шейки матки, полученных  от препаратов конизаций шейки матки или петлевой эксцизии ЗТ. Экспрессия Е-кадгерина, pAkt, Bcl-2, Bax, матриксных металлопротеиназ (matrix metalloproteinases, MMP) -2, и -9, коллагена IV типа и ламинина 5γ2 была исследована в 81 образце ткани шейки матки больных, а Ki-67, PTEN, VEGF, COX2, ТP – в 70 образцах. В качестве контроля использованы 10 образцов условно нормальной ткани шейки матки больных с ВПЧ-инфекцией.  Все препараты были пересмотрены морфологом для уточнения степени CIN и соответствия блоков выбранным срезам. ИГХ-исследования выполнены д.м.н. Степановой Е.В., зав. лаб. биомаркеров  и механизмов опухолевого ангиогенеза НИИ ЭДиТО.  В работе были использованы следующие первичные МКА: EP700Y (Neomarkers) для Е-кадгерина; MIB1 (Dako) для Ki-67; 124 (Dako) для Bcl-2; Анти-Вах (поликлон) (Dako) для Bax; 4G1 (Dako) для ламинина-5; T308 (Abcam) для pAkt; VP-P985 (Vector) для PTEN;  C-1 (Santa Cruz Biotech) для VEGF; козьи поликлональные (Santa Cruz Biotech) для COX-2; P-CF.44C (Calbiochem) для ТФ; CA4001/CA719E3C (Abcam) для ММР-2; поликлональные кроличьи (Abcam) для ММР-9, CIV22 (Abcam) для коллагена IV типа. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40 (с избирательным выполнением микрофотограмм). Для всех маркеров оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Результаты ИГХ анализа оценивали количественно и качественно по интенсивности окрашивания цитоплазмы: 0 - окрашивание отсутствует, 1 - слабое окрашивание, 2 - окрашивание средней интенсивности, 3 - сильное окрашивание. Количественно оценивали процент окрашенных клеток (от 0 до 100%) и содержание их в максимально насыщенных слоях эпителия. Экспрессию Е-кадгерина, ТФ и VEGF рассчитывали по формуле HScore (histochemical score – гистохимический индекс):  1а + 2b + 3с, где а – доля клеток со слабым  окрашиванием, %; b – доля клеток с умеренно выраженным окрашиванием, %; c – доля клеток с сильно выраженным окрашиванием, %.  Для оценки пролиферативной активности опухоли подсчитывали количество Ki-67 положительных клеток на 200-300 опухолевых клеток. Индекс Ki-67 определяли по формуле: ПА = число Ki-67 положительных клеток х 100/ общее количество клеток.

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ проводили на персональном компьютере с использованием программы “SPSS” (v13.0. for Windows). Для проверки достоверности различий значений признаков в группах использовали тесты «хи-квадрат» (χ2) и точный критерий Фишера. Различия считались  статистически значимыми при р<0,05 (95% ДИ). Соответствие распределению Гаусса проверяли по критерию Колмогорова-Смирнова.  Распределение показателей sCD18, sCD8, sHLAI-CD8,s CD38, sCD95, IGFBP1 достоверно отличалось от распределения Гаусса, и для обработки данных были использованы непараметрические методы статистики (тест Крушкала-Уоллиса и медианный тест для множественных сравнений). Корреляцию между показателями оценивали по коэффициенту корреляции Спирмана. Для уточнения значимости исследуемых показателей больных разделили по содержанию сывороточных маркеров по следующим критериям: ниже/равно и выше медианных значений. Анализ частот в группах был проведен по критерию 2-ιχ.

Для остальных показателей в качестве центральной характеристики брали среднее арифметическое значение, для оценки вариабельности – стандартную ошибку, для сравнения групп применяли дисперсионный анализ с учетом множественных сравнений Scheffe Test и LSD Test. Корреляционный анализ проводили по методу  Пирсона.

Результаты

CIN и МРШМ – заболевание молодых женщин репродуктивного возраста. В возрасте между 20 и 40 годами находились 67,6% больных, а до 50 лет – 88,3%;. Обнаружена прямая зависимость тяжести неоплазии от возраста. Статистически значимо различие между возрастом больных CIN1-2, преинвазивным раком (p<0,01), и МРШМ (p<0,000001). Медиана возраста больных CIN1 отличалась от CIN3/CIS на 4-6 лет, от МРШМ 1А1 – на 11 лет, 1А2 – на 12 лет, что отражает временные промежутки прогрессии неоплазии по степеням повреждений и средний срок течения заболевания.

Половую жизнь до 18 лет начали 62,8±1,6% пациенток, более 5 половых партнеров имели 45,7% опрошенных. Наше исследование показало, что в более молодых поколениях количество партнеров было больше, а возраст начала половой жизни – меньше, что связано с пропагандой в России «свободных» сексуальных связей в постперестроечный период и привело к уменьшению возраста начала заболевания.

При изучении семейного анамнеза у 664 больных CIN3/CIS и МРШМ отмечено 11 (1,7%) случаев рака шейки матки у матерей и/или бабок по материнской линии. Частота кажется небольшой, но при перерасчете на 100000 она составляет 1700  - в 132 раза больше, чем заболеваемость РШМ в России (12,9 на 100000 женщин). Это позволяет предположить генетическую предрасположенность к дефекту иммунного ответа, обуславливающему невозможность элиминации ВПЧ ВКР. Детям пациенток с CIN3/CIS и МРШМ автор рекомендует в обязательном порядке вакцинацию против инфицирования 16 и 18 типом ВПЧ ВКР (вакцины Гардасил, Церварикс) в подростковом возрасте. 

Клинические и морфологические характеристики CIN и МРШМ, влияющие на эффективность диагностики и лечения

При исследовании клинико-морфологических соответствий окончательного диагноза с результатами исследования кольпоскопически направленных биопсий было выявлено три основных объективных причины снижения эффективности диагностики и лечения эпителиальных повреждений: 1) тип и возрастное смещение ЗТ в цервикальный канал; 2) одномоментное присутствие на шейке эпителиальных поражений разной степени; 3) вовлеченность эндоцервикальных крипт.

Больные были распределены на три группы в зависимости от видимости ЗТ: I группа, ЗТ I типа (видна полностью) – 314 больных, средний возраст 29,1±7,1 года (все больные от 18 до 35 лет); 2 группа, ЗТ II типа (видна частично) – 142 больных, средний возраст 38,3±6,9 года;  3 группа, ЗТ III типа (верхняя граница не видна, основная часть в цервикальном канале, занимает не более 5% площади эктоцервикса) — 47 больных, средний возраст 48,0±7,8 года (все больные старше 36 лет). Средний возраст больных увеличивался с увеличением степени CIN, а видимость ЗТ и площадь повреждений на эктоцервиксе с возрастом уменьшалась (р=0,00001). Различия между группами больных до и после 35 лет в частоте удовлетворительных и неудовлетворительных условий кольпоскопии высокозначимы (p=0,0001), и 67,8% старше 35 лет больных имели неполную видимость ЗТ с очагами CIN.

Частота недооценки тяжести повреждений составила 12,0% в группе с полностью видимой ЗТ, достигала 20,7% у больных с неполно видимой ЗТ и 42,1% в III группе, увеличиваясь по мере уменьшения видимости ЗТ и значимо различаясь между I и II группами (p=0,045), между II и III группами (p=0,016), различия между I и III группами были высоко значимы (p<0,0001).

Критическим в отношении риска гиподиагностики был возраст 35 лет, так как все больные с полностью видимой ЗТ были младше 35 лет, а больные с невидимой ЗТ — старше 36. У большинства больных старше 35 лет верхняя граница ЗТ — переходная зона —  была не видна. У большинства больных старше 50 лет была не видна даже нижняя граница ЗТ из-за атрофии, инволюции, и смещения ЗТ в канал, а шейка покрыта неизмененным эпителием.

Риск недооценки степени неоплазии по результатам ограниченной биопсии в группе с ЗТ II типа был выше в 1,92 раза, чем при ЗТ I типа (OR=1,92, 95% ДИ=1,06-3,47), а в группе с невидимой ЗТ – в 2,79 раза (OR=2,79, 95% ДИ=1,27-6,11) по сравнению с больными с неполно видимой ЗТ. При сравнении групп с I и III типом ЗТ соотношение шансов недооценки составило 5,34 (95%ДИ=2,52-11,33).

Гиподиагностика степени неоплазии при ЗТ I типа связана со сложностью выбора места биопсии на фоне причудливых кольпоскопических картин в АЗТ при сочетании разных степеней CIN, а рост недооценки во второй и третьей группах — еще и с расположением более тяжелых повреждений в невидимой части ЗТ и криптах.

Анализ позволяет считать, что информативность кольпоскопии уменьшается с возрастом, но при полной видимости ЗТ чувствительность ее в выборе места адекватной биопсии высока (88%). В случае полной видимости верхней границы ЗТ – переходной зоны можно видеть почти все очаги CIN, за исключением расположенных внутри крипт. При уменьшении видимости скрытая часть ЗТ, вследствие сочетания поражений (см. ниже), может содержать CIN более тяжелой степени, чем удается верифицировать на эктоцервиксе, а в некоторых случаях все эпителиальные повреждения расположены исключительно в невидимой части ЗТ и криптах. У больных с HSIL в мазках и положительным HC2-тестом у больных со II и III типом ЗТ биопсии и выскабливания канала может быть недостаточно для верификации диагноза. В этих случаях предпочтительно выполнить LLETZ или конизацию, при которых удаляют наиболее часто поражаемую нижнюю часть ЗТ или извлекают ЗТ почти полностью, рассчитывая на достаточную диагностическую ценность и выраженный лечебный эффект операции.  У большинства больных CIN 2-3 конизация или LLETZ является окончательным лечебным мероприятием при условии отсутствия CIN в краях резекции и последующем соскобе, хотя по нашим данным петлевая эксцизия оказывается недостаточно эффективной значимо чаще, чем конизация (p=0,0001; OR=5,42, 95% ДИ=2.64–11.86).

Более чем у 2/3 больных (71,9±1,5%) CIN и МРШМ в шейке матки одновременно присутствуют эпителиальные повреждения разной степени в разном сочетании от CIN1-2 до микроинвазивного рака, что отражает процесс канцерогенеза, свидетельствуя о прогрессии неопластического процесса в результате появления все новых очагов неоплазии от эпителиальных клонов с нарастающими генетическими повреждениями. В связи с этим разделение предрака шейки матки на 3 степени CIN условно и необходимо для воспроизведения диагноза, который должен устанавливаться  по максимальной степени повреждений.

Все случаи периферических поражений эктоцервикса, сопутствующих CIN2-3 в центральной части ЗТ, как сателлитных (в третьей зоне), так и переходящих на влагалищные своды, были представлены легкими эпителиальными повреждениями – CIN1 или сочетанием CIN1-2. Легкая степень этих повреждений может быть связана с их развитием в более ранние сроки при значительных размерах эктопии и ЗТ. Более тяжелые повреждения могут находиться выше, следуя за смещающейся переходной зоной,  и глубже – в криптах. Таким образом, периферические поражения не играют решающей роли в развитии инвазивного процесса, в отличие от поражений, расположенных центрально, ближе к переходной зоне.

В клинической практике сочетание CIN является объективной причиной гиподиагностики степени повреждений по ограниченным биоптатам, часто не отражающим максимальную степень неоплазии не только при произвольных, но и при кольпоскопически направленных биопсиях. В группе с полиморфными поражениями гиподиагностика имела место у 139 из 510 больных (27,3±2,0%), что значимо чаще, чем у больных с мономорфными повреждениями (6,1±2,4%) (p<0,0001). Шанс недооценки степени повреждений в группе с полиморфными поражениями был в 5,81 раз больше, чем при мономорфных поражениях (OR=5,81 95% ДИ=2.49-13.56).

Даже среди пациенток с МРШМ участки CIN1-2 были отмечены у 51 больной из 145 (35,1%). Инвазия у 38,3% больных МРШМ не была обнаружена в биоптатах, и была «находкой» в препаратах конизации, выполненной по поводу CIN2-3. Обнаружение в биоптате только легкой CIN, сопутствующей скрытым тяжелым повреждениям, что возможно у женщин с II и III типом ЗТ, влечет за собой неверную тактику — наблюдение или поверхностную деструкцию. Это может привести к запущенности заболевания, что подтверждают данные анамнеза больных распространенным РШМ, в недавнем времени лечившихся по поводу CIN.

У больных с видимой ЗТ и площадью поражения эктоцервикса >10% изучены кольпоскопические признаки, позволяющие предположить поражение крипт. Анализировали зависимость частоты вовлеченности крипт от степени неоплазии, возраста пациенток и максимально возможного срока персистенции ВПЧ. Морфологически была оценена глубина поражения крипт CIN и расположение их по отношению к эктоцервиксу, а также влияние поражения крипт на адекватность эксцизии ЗТ и чистоту краев резекции.

Обнаружено возрастание частоты  вовлеченности крипт по мере утяжеления степени неоплазии: 30,8±12,8% при CIN1, 31,7±7,3% при CIN2, 74,6±2% при CIN3/CIS, 100%  при МРШМ (P<0,0001). Из-за распространения процесса по криптам у больных CIN2 дозволенные деструктивные методы лечения (лазеровапоризация, радиоволновая или криодеструкция) могут оказаться  недостаточными для  излечения. «Замурованные» в криптах после деструкции остатки неоплазированного эпителия могут стать причиной скрытой прогрессии заболевания.

Чувствительность кольпоскопии для диагностики поражения крипт на фоне CIN составила 64,8±2,8%, предсказательная ценность положительного результата — 91,5±1,9%, отрицательного результата — 46,2±3,6%, но определить глубину их вовлеченности возможно только после гистологической оценки операционного материала. Однако, чем старше пациентка и больше предполагаемое время персистенции ВПЧ, тем глубже и выше по ходу канала поражены крипты. У больных старше 30 лет частота вовлеченности крипт была значимо выше, чем у больных до 30 лет— 80,6±1,9% против 65,0±3,5%, соответственно (P<0,00001).

У больных с подозрением на CIN2-3 рекомендуется выполнить LLETZ на глубину 7 мм (Jordan J. et al., 2009). Действительно, у 93,7% больных глубина вовлеченности крипт была от 1 до 5 мм, и лишь у 6,3% составляла более 5 мм в связи с поражением кистозно расширенных крипт. Однако, кроме горизонтальной вовлеченности крипт необходимо учитывать глубину залегания пораженных крипт вверх по ходу канала до 2,0-2,9 см от эктоцервикса, что при конусовидной или полушаровидной форме изымаемого материала служит причиной неполного  удаления CIN в области эндоцервикального края, а также  по латеральному краю резекции в верхних отделах конуса (рис.2).

У наших больных из-за распространения неоплазии вглубь цервикального канала и по эндоцервикальным криптам петлевая эксцизия на глубину до 7 мм оказалась недостаточной для излечения у 53 из 156 пациенток (34,0%±3,8%), а конизация — только у 13 из 416 больных CIN3/CIS и МРШМ (3,1±0,8%) (различия высокозначимы p=0,0001). Из 53 больных с неполноценной LLETZ 49 (92,5±3,6%) были старше 35 лет. Представленная зависимость демонстрирует очевидное негативное влияние вовлеченности крипт на адекватность эксцизии.

Рисунок 2 — Схема поражения экто- и эндоцервикса неопластическим процессом с вовлечением крипт, объясняющая недостаточность эксцизии CIN. Размер электрода для конизации достаточен для эксцизии видимых поражений эктоцервикса, но недостаточен для полного иссечения  глубоко распространенного процесса по эндоцервикальным криптам и по ходу цервикального канала – край резекции будет «положительным», микроинвазия (обозначена пунктирными стрелками)  останется не диагностированной.

Учитывая глубину возможного распространение тяжелых эпителиальных повреждений по эндоцервикальным криптам вверх и вглубь, а также вероятность микроинвазии через базальную мембрану крипты (Al-Nafussi A., 2000), у больных CIN 2-3/CIS старше 35 лет петлевая эксцизия ЗТ (LEEP/LLETZ) при II и III типах ЗТ часто является слишком поверхностной процедурой, недостаточной для лечения и установки окончательного диагноза. В возрасте старше 35 лет при HSIL и более в мазках ей следует предпочесть конизацию, как процедуру с извлечением  большей части ЗТ. После конизации вероятность  положительных  краев резекции в результате среза по пораженным криптам меньше, чем после LLETZ, что и демонстрирует наше исследование.

Результаты клинико-морфологических исследований свидетельствуют о том, что в процессе формирования цервикальной неоплазии ВПЧ ВКР поражает стволовые (резервные) клетки, лежащие не под плоским эпителием, а в переходной зоне, под цилиндрическим эпителием ЗТ и эндоцервикальных крипт. Вирус использует для размножения  процессы плоскоэпителиальной метаплазии, в том числе запуская ее в эндоцервикальных криптах. ВПЧ ВКР инициирует здесь пролиферацию незрелых плоскоэпителиальных клеток с последующим возможным нарастанием в них генетических нарушений и усугублением степени повреждений.

Клинические и технические особенности электрорадиохирургической конизации у больных CIN3/CIS и МРШМ, обеспечивающие эффективность операции

В исследование вошли 474 больные CIN3/CIS и МРШМ, которым  была выполнена ЭХВЧ-конизация с выскабливанием остатка канала, и 85 больных, обратившихся в РОНЦ из других учреждений  после электрохирургической конизации. Морфологически были оценены целостность и размеры конуса, состояние покровного эпителия, краев резекции и соскоба.  Проанализированы причины неполного удаления неоплазированного эпителия и частота осложнений.

Мы выполняли ЭХВЧ-конизацию под местной анестезией при CIN3/CIS и HSIL и более в мазках в сочетании с позитивным НС2-тестом , так как она вполне удовлетворяет лечебно-диагностическим целям — адекватному изъятию ЗТ с очагами CIN для оценки степени неоплазии, глубины распространения в канал, наличия или отсутствия инвазии — и безопасна. В подтверждении этого следует заметить, что на 474 операции было всего 5 (1,1%) случаев непосредственных кровотечений с кровопотерей до 100 мл, остановленных наложением швов, и 5 (1,1%) случаев поздних послеоперационных кровотечений, остановленных тампонадой. Отсроченно оценить эффективность конизации можно было у 416 больных CIN3/CIS и МРШМ, не подвергнутых дополнительным вмешательствам и оставшихся под наблюдением. Неизлеченность или рецидив в виде CIN1-3 были диагностированы всего у 13 из них (3,1±0,8%), что достоверно ниже, чем после более поверхностной эксцизии ЗТ при LLETZ (p<0,0001).

Проведен анализ эффективности конизации в отношении излечения МРШМ. После конизации дополнительную операцию не выполняли 52 пациенткам с МРШМ  (плоскоклеточным раком без лимфоваскулярной инвазии 1а1 - 44, 1а2 - 7 и аденокарцинома 1а1 – 1 больная) в связи с желанием больных сохранить репродуктивную функцию или отказом их от более радикального вмешательства. У всех больных в препаратах конизации от края резекции до фокусов микроинвазии имелось расстояние более 1 см. Больные наблюдались каждые 3 месяца с цитологическим и кольпоскопическим контролем и контролем НС2-теста 1 раз в 6 мес. Срок наблюдения составил от 14 до 60 месяцев, средний срок 39,25 месяца. Из 52 больных в процессе наблюдения неизлеченность или рецидив неоплазии обнаружены у 7 (13,5±4,7%), причем лишь у одной диагностирован МРШМ 1А1, а у 6 — CIN: у трех CIN2 и у трех CIN3. Таким образом, шести больным из 7 с рецидивом неоплазии очевидно могла быть достаточна реконизация или ампутация шейки.

  По мнению Tulunay и Ozgul (2009) вероятность излечения при конизации CIN3 и МРШМ не меньше, чем при гистерэктомии. Это же подтверждают в своем исследовании Prato c соавт. (2008). Rogers с соавт. (2009) считает, что при «положительных краях резекции» материала шейки с МРШМ допустима реконизация, однако лимфоваскулярная инвазия служит показанием к реконизации с тазовой лимфаденоэктомией или к радикальной трахелэктомии с тазовой лимфаденоэктомией. В то же время Park и соавт. (2007), выполнив гистерэктомию 21 больной МРШМ при «положительном крае резекции» конуса, не обнаружили остатков МРШМ ни у одной из них, и лишь у 9 была обнаружена CIN2-3.

Оценивая ретроспективно эти результаты и сравнивая их с полученными нами данными, можно считать, что для излечения МРШМ 1А1 стадии без лимфоваскулярной инвазии в большинстве случаев конизации достаточно. У больных МРШМ 1А1 с CIN в крае резекции можно ограничиться органосохраняющей операцией, выполнив реконизацию или ампутацию шейки, при условии возможности дальнейшего наблюдения.

Больным, у которых край резекции проходил близь наружной границы повреждений эктоцервикса, или при подозрении на микроинвазию в предварительной биопсии, после изъятия конуса мы выполняли одномоментные дополнительные эксцизии электродами разных форм или немедленную реконизацию. Применением дополнительных резекцией можно объяснить отсутствие у нас случаев с положительным эктоцервикальным краем и низкую частоту положительного эндоцервикального края (7,0±1,2%). Кроме того, дополнительные эксцизии обеспечивают двойной контроль края по материалу второй эксцизии, что важно для решения вопроса о достаточности операции при выявлении МРШМ в удаленном конусе.

По результатам нашего исследования, вероятность неполной эксцизии неоплазии в возрасте старше 50 лет выше, чем у более молодых больных, что подтверждают и литературные данные (European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening, 2008). Все больные с положительным эндоцервикальным краем после конизации были старше 35 лет, а 45,5% из них — старше 50 лет. Неполноценность эксцизии в первую очередь сопряжена с высоким расположением в цервикальном канале ЗТ с поражениями, а также с глубоким вовлечением эндоцервикальных крипт у пациенток старше 35 лет. У больных со II и III типом ЗТ повреждения на эктоцервиксе вокруг наружного зева могут быть минимальными по площади или отсутствовать вообще, не отражая значительно большую протяженность процесса по эндоцервикальным криптам. По этой причине  у таких больных и особенно находящихся в постменопаузе выбирать электрод-«парус» для ЭХВЧ-конизации следует, ориентируясь не на контур видимых на эктоцервиксе повреждений, но на размер шейки. Стеноз верхней трети цервикального канала у больных с атрофичной шейкой в постменопаузе ограничивает введение электрода на достаточную глубину, в результате чего конус получится слишком малого размера или фрагментируется. В подобных случаях цервикальный канал необходимо предварительно бужировать, обеспечив полное введение электрода в канал до основания «паруса».

В некоторых странах выскабливание цервикального канала сразу после конизации не является обязательным и показано только при сохранении положительного НС2, положительном эндоцервикальном крае резекции или повторном неоднократном выявлении ASCUS и более в мазках при наблюдении (Driggers R., 2008; Rogers L., 2009). Мы считаем выскабливание канала обязательным. Присутствие CIN в соскобе эндоцервикса следует трактовать как «положительный» эндоцервикальный край резекции, но только если выскабливание выполняют после изъятия конуса. У 12 из 31 больной с CIN в соскобе цервикального канала, оперированных вне РОНЦ, выскабливание цервикального канала выполняли до конизации, что привело к невозможности достоверной оценки края резекции.

Согласно полученным данным, наиболее частыми причинами затрудненной трактовки степени неоплазии и краев резекции по материалу конизации были: обугливание и коагуляция краев конуса (5,2%), невыполнение выскабливания цервикального канала (4,5%) или его выскабливание до конизации (4,1%), а также фрагментация конуса (2,9%). Обугливания краев резекции легко избежать при использовании режима «резание» современных электрорадиохирургических высокочастотных аппаратов.

У каждой второй больной с фрагментированным конусом при невозможности оценки краев резекции сохранилась вирусная нагрузка, свидетельствовавшая о неполной эффективности операции, у каждой четвертой диагностирован рецидив через 12 месяцев после операции. Фрагментация конуса способствует оставлению участков неоплазированного эпителия по ходу канала с прилежащими криптами и  уменьшает эффективность операции. Следует особо отметить, что частой причиной фрагментации конуса является поворот электрода-«паруса» по циркулярной траектории без учета деформации шейки и канала. Электрод следует прижимать к стенке деформированного канала на стороне резания, так, чтобы стержень электрода одновременно с поворотом «режущей струны» совершал движение по ходу стенки деформированного канала с последующим одновременным выполнением пластики.

Оценка информативности морфологических исследований в определении достигнутой степени повреждений в предыдущих главах свидетельствовала о наибольшей диагностической эффективности конизации в сравнении с биопсиями и даже LLETZ. Неизлеченность или рецидив в виде CIN1-3 были диагностированы всего у 13 из 416 больных CIN3/CIS и МРШМ (3,1±0,8%). Таким образом, очевидно, что ЭХВЧ-конизация при соблюдении техники и применении дополнительных резекций высокоэффективна как лечебная и диагностическая операция при CIN3/CIS, а также при МРШМ 1А1 стадии без лимфоваскулярной инвазии, рецидивы и неизлеченность после нее крайне редки.

Оценка целесообразности предэксцизионной терапии иммуномодуляторами в комбинированном лечении тяжелых CIN по изменению вирусной нагрузки HC2

Основным диагностическим и лечебным мероприятием при CIN2-3/CIS является адекватное изъятие ЗТ с очагами неоплазии (конизация, LLETZ), необходимость дополнительной иммуномодулирующей терапии остается неясной.

Изменения характеристик общего иммунитета под влиянием иммуномодулирующих препаратов, отражающие улучшение иммунного статуса, показательны при вирусных заболеваниях, сопровождающихся виремией, но не при CIN, так как ВПЧ ВКР развивается в пределах эпителиального пласта, и виремия отсутствует. Показателем эффективности иммуномодулирующей терапии у больных CIN2-3/CIS может служить снижение вирусной нагрузки в ЗТ до эксцизионных манипуляций на шейке матки.

В исследование  с информированного согласия было включено 60 пациенток: 32 больные CIN2-3/CIS (8 больных CIN2, 24 – CIN3/CIS), получавшие предэксцизионную терапию аллокином-альфа (аллофероном), и 28 больных контрольной группы, сравнимой по степени неоплазии (6 – CIN2, 22 – CIN3/CIS), возрасту, типу ВПЧ, не получавших иммуномодулирующей терапии, которым конизация была отсрочена на 40-60 дней. Все больные были обследованы цитологически, кольпоскопически и вирусологически методом HC2 на ДНК ВПЧ ВКР с определением вирусной нагрузки при первичном обращении и через 40-60 дней перед выполнением  электрорадиохирургической конизации для оценки динамики показателей.  Все больные были ВПЧ ВКР-позитивны и  имели вирусную нагрузку не менее 20 RLU. Аллокин-альфа вводили  по 1 ампуле на 1 мл физиологического раствора для инъекций подкожно 1 раз в 48 часов – всего 6 инъекций.

У 23 из 32 больных CIN2-3/CIS через 2 месяца после лечения аллокином-альфа перед операцией выявлено снижение вирусной нагрузки, у 1 больной значение HC2 не изменилось, у 8 — выросло. Частота снижения вирусной нагрузки (71,9%) значимо превысила частоту отсутствия эффекта (28,1%) (р<0,001).

В группе контроля из 28 больных CIN2-3/CIS, не получавших лечение аллокином-альфа, напротив, не было ни одной больной со снижением вирусной нагрузки (0%), у 26 выявлено ее повышение, у 2 — значения теста не изменились. Таким образом, различия в частоте снижения HC2 между группами больных CIN2-3/CIS, получавших (71,9% [95%CI=53,2-86,2%%]) и не получавших аллокин-альфа (0% [95%CI=0-15,9%%]), высоко значимы (р<0,0001). Медиана вирусной нагрузки НС2 у больных CIN2-3/CIS, получавших лечение аллокином-альфа снизилась в 5 раз (с 340 до 68 RLU), а среди  не получавших — выросла.

У девяти больных основной группы при кольпоскопии наблюдалось некоторое уменьшение площади поражения и толщины АБЭ. У пяти из восьми больных, имевших кондиломы вульвы, отмечено их исчезновение. У больных контрольной группы изменения площади поражения и исчезновения кондилом не наблюдалось.

Исследование в контрольной группе больных CIN2-3/CIS показало, что тяжелые CIN, которым не свойственна регрессия, отличаются стабильной или прогрессивно растущей вирусной нагрузкой. Снижение ее в ЗТ после лечения аллокином-альфа у 71,9% больных CIN2-3/CIS свидетельствует об эффективности иммуномодулирующего лечения продуктивной вирусной инфекции, вызванной ВПЧ ВКР.

У всех больных НС2-тест, взятый через два месяца после эксцизии, стал отрицательным. Таким образом, решающее значение в лечении CIN имеет адекватная эксцизия поврежденной части ЗТ, однако иммуномодулирующие препараты могут воздействовать на очаги ВПЧ в эпителии за пределами поражений, а также фокусы CIN, которые могут сохраняться в эндоцервикальных криптах после эксцизии.

Лечение иммуномодуляторами без эксцизии не приводит к излечению облигатного предрака и в качестве единственного метода лечения при CIN2 и более применяться не может. Однако, уменьшение вирусной нагрузки является отражением лечебного действия на продуктивную ВПЧ-инфекцию, инициирующую, сопровождающую и поддерживающую CIN, поэтому сочетание подобной терапии с эксцизией патогенетически оправдано. Таким образом, лечение аллокином-альфа может быть эффективно в комбинированном лечении больных CIN 2-3/CIS в дополнение к эксцизии ЗТ или конизации.

 

Роль ВПЧ-тестирования методом гибридного захвата (HC2) в оценке эффективности органосохраняющего лечения CIN2-3/CIS и МРШМ

Возможность отсроченной оценки эффективности лечения с применением ВПЧ-тестов имелась у 525 больных  (20 больных после деструкции, 95 — после LLETZ, 416 — после конизации), которым до и после лечения было выполнено тестирование на ВПЧ ВКР двумя методами: ПЦР и HC2. Для оценки эффективности лечения по изменению вирусной нагрузки наиболее репрезентативной была группа из 416 пациенток, у которых конизация была окончательным вмешательством.

Распределение результатов ВПЧ-тестирования различными методами после хирургического лечения в зависимости от типа вмешательства представлено в таблице 2.

Из 35 (30,4±4,3% от 115) больных с положительным HC2 после деструкции или петлевой эксцизии, 19 пациенток в дальнейшем имели признаки неизлеченности или рецидива.

После конизации HC2 стал отрицательным у 387 из 416 больных (93±1,3%), у остальных 29 больных обнаружено снижение вирусной нагрузки. У 19 больных из этих 29 через 6—12 месяцев отмечен рост вирусной нагрузки: у 11 — до 300 RLU и у 8 — от 300 до 1500 RLU. У первой группы в мазках отмечены дискариоз и койлоцитоз, в соскобе канала у пяти из них диагностирована CIN1. Во второй группе через шесть месяцев после повышения вирусной нагрузки выявлены аномалии в мазках. У пятерых больных с HSIL выполнена реконизация, обнаружен рецидив CIN3, без инвазии. Из трех больных с LSIL и ASCUS у двух выявлены CIN1-2, у одной — койлоцитоз. Всего при отсроченной оценке эффективности конизации неизлеченность или рецидив в виде CIN1-3 были диагностированы у 13 больных (3,1±0,8% от 416 больных). При этом лишь у 6 из них отмечены аномальные кольпоскопические картины малой площади.

При деструкции или LLETZ, глубина которых около 5 и 7 мм, соответственно, неизлеченность отмечена у 19 из 115, а после конизации – у 13 из 416. Шанс неизлеченности при деструкции или LLETZ в 6,14 раз больше, чем при конизации (OR=6,14, 95% ДИ=2,93–12,86). Частота отрицательного НС2 после конизации была значимо выше, чем после LLETZ или деструкции (p < 0,0001). По-видимому, при петлевой эксцизии не все участки CIN оказываются иссеченными из-за недостаточной глубины изъятия поврежденной части ЗТ. В связи с этим, у больных CIN2 с ЗТ II-III типа, а также с вовлеченностью крипт, предпочтительна конизация, также как и при CIN3/CIS.

Следует отметить разницу между предсказательной ценностью различных методов ВПЧ-тестирования — ПЦР и НС2. В нашем исследовании положительная ПЦР при отрицательном HC2 после хирургического лечения не была сопряжена с неизлеченностью или рецидивом заболевания. После конизации рецидив или неизлеченность в виде CIN1-3 были диагностированы только в группе с положительным и прогрессивно растущим результатом HC2,  отражающим клинически значимые концентрации вируса. При отрицательном HC2, включая пациентов с положительной ПЦР, рецидивов или неизлеченности не наблюдалось.

Таблица — 2 Результаты ВПЧ-тестирования методами ПЦР и HC2 и их соотношение после различных вмешательств

Вид вмешательства

Результаты ВПЧ-тестирования

после вмешательства

Деструкция (n=20)

Петлевая эксцизия

(n=95)

Конизация

(n=416)

ПЦР «+»

9 (45%)

35 (36,8%)

97 (23,3%)

ПЦР «-»

11 (55%)

60 (63,2%)

319 (76,7%)

НС2 «+» ПЦР «+» 

(риск неизлеченности/рецидива)

7 (35%)

28 (29,5%)

29 (7%)

НС2 «-»

13 (65%)

67 (70,5%)

387 (93%)

ПЦР «+» / НС2 «-»

2 (10%)

7 (7,4%)

68 (16,3%)

«+» — положительный результат, «-»— отрицательный результат

Чувствительность и предсказательная ценность негативного результата в отношении рецидива или неизлеченности как для HC2, так и для ПЦР составила, таким образом, 100%. Однако HC2 по сравнению с ПЦР обладал большей предсказательной ценностью положительного результата (44,8% против 13,4%) и специфичностью (96% против 79,2%). Прогрессивный рост НС2 после конизации может свидетельствовать о рецидиве CIN до появления изменений в мазках.

CIN2-3/CIS и МРШМ у беременных

В исследование включены 36 женщин с CIN2-3/CIS и МРШМ на фоне желанной беременности. Больные при продолжении беременности наблюдались с кольпоскопическим и цитологическим контролем каждые 2-3 мес. Через 6-8 недель после родов (n=33) или по завершению беременности (n=3) выполнено хирургическое лечение с морфологической верификацией диагноза. Контрольную группу составили 248 небеременных больных со сходными клиническими характеристиками, отобранных методом свободной выборки, а также 25 беременных женщин с подозрением на рак или клетками рака в мазках при отсутствии видимой опухоли для анализа чувствительности и специфичности цитологических мазков. Среди последних лишь у двух обнаружен МРШМ и у 16 – CIN2-3/CIS,  а 7 женщин имели гипердиагностику повреждений и не вошли в основную группу. Таким образом, только у двух женщин из 25 вынашивание беременности было сопряжено с минимальным риском прогрессии, все же не реализовавшимся и не повлиявшим на прогноз заболевания. У небеременных контрольной группы значимо выше были показатели вирусной нагрузки и более ранний возраст начала половой жизни, остальные параметры не отличались от беременных.

Из-за невозможности кольпоскопически исключить микроинвазию 27 беременным из 36 во время беременности процесс был гистологически верифицирован по результатам биопсии (20 женщин) или петлевой эксцизии/конизации (7 женщин), остальных наблюдали без биопсии. Такая тактика соответствует рекомендациям IARC и ASCCP по ведению беременных женщин с подозрением на CIN и МРШМ, согласно которым процедуры диагностической эксцизии показаны лишь для исключения инвазии (Amant F. et al., 2009; Apgar B. et al., 2009; Fader A. et al., 2010; Schaefer K. et al., 2012; Vlahos G. et al., 2002), а биопсия (строго под кольпоскопическим контролем) — при подозрении на тяжелые степени CIN и инвазию, хотя и допустима в других случаях (Apgar B. et al., 2009; Wright J. et al., 2010; Wright T. et al, 2007).

При наблюдении у 10 больных из 33 видеокольпоскопически зарегистрировано ухудшение колькоскопических картин в виде огрубления их, утолщения АБЭ, увеличения площади АЗТ без изменения степени повреждений в мазках и в материале повторной биопсии, выполненной  4 больным. Имитация прогрессии связана с усугублением гравидарной эктопии, сопровождающимся обнажением участков CIN, ранее скрытых внутри цервикального канала.

Из 36 женщин 33 благополучно доносили беременность. У двух пациенток с CIN2-3 с неразвивающейся беременностью произошел самопроизвольный выкидыш, причем биопсии им не выполнялись. Лишь одна пациентка с CIN3 приняла решение прервать беременность в сроке 10 недель и имела наименее благоприятное течение заболевания с развитием МРШМ (обнаружен через два месяца после прерывания в препарате конизации) и метастазированием в подвздошные лимфоузлы, выявленным через год.

  В трех случаях роды были преждевременными на 34-36 неделе (9,1%), у 30 больных роды произошли в срок, из них у 7 – кесаревым сечением (в том числе у шести больных с МРШМ, и одной с CIN3/CIS), у 26 – через естественные родовые пути.

Через 6-8 недель после разрешения беременности было проведено хирургическое лечение в объеме конизации с выскабливанием остатка цервикального канала (29 больных) или ампутации (2 больные), трахелэктомии (1 больная МРШМ), расширенной экстирпации матки (4 больные МРШМ). Хотя у беременных больных между биопсией и операцией проходило не менее 6 мес., худшие повреждения в повторном гистологическом исследовании наблюдались у них также часто, как и у небеременных (в 33,4% и 32,8%, соответственно). У беременных пациенток, таким образом, большую степень повреждения в операционном материале по сравнению с биопсией нельзя рассматривать как прогрессию заболевания, но как результат гиподиагностики максимальной степени повреждений по ограниченной биопсии.

Меньшую степень CIN в операционном материале по сравнению с биопсией (у 22,2% беременных больных) мы также не расценивали как регрессию, а связывали ее с терапевтическим эффектом биопсии или петлевой эксцизии. У четырех из семи больных, которым неглубокая конизация выполнена в первом триместре беременности ( в том числе – у трех с МРШМ), она привела к излечению - в операционном материале после родов повреждений не найдено. В нашем исследовании об истинной регрессии CIN после родов можно говорить с уверенностью лишь в одном случае, зарегистрированном в динамике на кольпофотограммах, в остальных мы лишь с удовлетворением констатировали, что после родоразрешения и в процессе наблюдения прогрессии CIN и МРШМ не отмечено.

В случае обнаружения у беременной HSIL, клеток рака или подозрении на них в мазках с шейки матки при отсутствии видимой опухоли не следует настаивать на прерывании беременности даже в первом триместре. При исследовании мазков и кольпоскопии у беременных возможна гипердиагностика предполагаемой степени эпителиальной неоплазии. Окончательная степень повреждений может быть определена только по результатам гистологического исследования, которое при отсутствии подозрении на микроинвазию, может быть отсрочено на послеродовый период при условии регулярного наблюдения во время беременности (1 раз в 3 мес.).  Ограниченные биопсии под кольпоскопическим контролем могут применяться при уточнении степени CIN при подозрении на тяжелые повреждения при невозможности исключить микроинвазию, но LLETZ может применяться лишь в исключительных случаях при большой вероятности МРШМ.

У наших больных CIN2-3/CIS и МРШМ вынашивание беременности было безопасным, прогрессии заболевания и влияния на исход беременности не отмечено. Между тем, при выявлении в первом триместре беременности тяжелых эпителиальных повреждений, в том числе не позволяющих исключить РШМ, многие практические врачи неадекватно и безальтернативно настаивают на прерывании беременности. Решение о судьбе беременности пациентка должна принимать при условии информированности об отсутствии негативного влияния донашивания беременности на исход заболевания и плод, минимальном риске прогрессии и близкой к 100% вероятности благоприятного исхода. Нами рекомендован следующий алгоритм беседы с беременными больными с подозрением на CIN2-3/CIS и МРШМ, который может быть использован практическими врачами в достижении согласия с больной. Эти данные следует включить в протокол информированного согласия.

  1. Больным CIN 2-3, в том числе преинвазивным раком, можно вынашивать беременность практически без риска прогрессирования.
  2. Отсрочка лечения у больных МРШМ до родоразрешения кесаревым сечением не ухудшает прогноза заболевания. При отрицательной динамике показано родоразрешение по достижении зрелости плода.
  3. Хотя вынашивание беременности сопровождается естественной иммуносупрессией, вероятность прогрессии до инвазивного рака очень мала.
  4. Регулярное наблюдение в течение беременности (1 раз в 3 мес) не позволит пропустить маловероятное прогрессирование и скорректировать сроки и характер родоразрешения.
  5. На фоне беременности возможна гипердиагностика повреждений по результатам цитологии и кольпоскопии, степень их может быть меньше. После родоразрешения возможна регрессия заболевания.
  6. Заболевание выявлено рано – на стадии предрака (CIN2-3) или МРШМ. У большинства больных РШМ заболевание выявляют в более поздней стадии (IB), и все-таки исход может быть благоприятным.
  7. Множество женщин вынашивают беременность, не зная о наличии у них заболевания. Прогрессия от CIN3 до инвазивного рака может занимать от 3 до 30 лет и срок донашивания беременности (обычно до полугода), как правило, не усугубляет тяжести процесса.
  8. Сразу или через короткое время после родоразрешения возможно полноценное хирургическое лечение с благополучным исходом.
  9. Наличие заболевания не вредит плоду.
  10. Влияние прерывания беременности на течение заболевания не изучено и скорее всего негативно.
  11. Даже в случае прерывания беременности с немедленной конизацией или иной органосохраняющей операцией больная остается в группе повышенного риска развития РШМ. Этот факт не позволяет исключить аналогичные сложности в течении последующей беременности и даже ее невозможность. Женщина должна понимать исключительную ценность уже имеющейся беременности.

  Абсолютное большинство пациенток, информированное подобным образом, принимают решение о донашивании беременности, как видно по результатам нашего исследования. 

Молекулярно-биологические маркеры CIN и МРШМ, перспективные для использования в иммуногистохимической панели с целью прогнозирования течения CIN и обнаружения скрытой инвазии

Сводные данные о частоте экспрессии 13 молекулярно-биологических маркеров, отражающих пролиферативную активность, нарушения апоптоза, межклеточных связей, процессы неоангиогенеза, состояние базальной мембраны в образцах CIN, МРШМ и «нормального эпителия» с признаками ВПЧ-инфекции представлены в таблице 3.

Таблица — 3 Экспрессия молекулярно-биологических маркеров в образцах CIN, МРШМ и «нормального эпителия» с ВПЧ

Степень  повреждения

Маркер

Случаи с экспрессией, n (%)

Общий характер изменений

Перемещение в вышележащие слои

«Нормальный эпителий»

CIN1

CIN2

CIN3

МРШМ

Е-кадгерин

10 (100)

27 (100)

24 (96)

16 (73)

3 (43)

?

Ki-67

10 (100)

17 (100)

17 (100)

27 (100)

9 (100)

+

pAkt

0 (0)

1 (4)

14 (56)

17 (77)

4 (57)

=

PTEN

10 (100)

17 (100)

17 (100)

22 (81)

5 (56)

+

Bcl-2

7 (70)

21 (78)

15 (60)

18 (82)

3 (43)

?

+

Bax

0 (0)

1 (4)

3 (12)

7 (32)

3 (43)

+

VEGF

1 (10)

6 (35)

8 (47)

15 (56)

7 (78)

++

COX2

1 (10)

5 (30)

5 (30)

18 (67)

7 (78)

++

ТФ

10 (100)

17 (100)

16 (94)

27 (100)

9 (100)

?

++

MMP-2

1 (10)

5 (18)

2 (8)

8 (36)

6 (86)

+

MMP-9

1 (10)

8 (30)

4 (16)

8 (36)

5 (71)

+

Коллаген IV типа

0 (0)

0 (0)

0 (0)

2 (9)

0 (0)

?

?

Ламинин 5γ2

0 (0)

0 (0)

0 (0)

3 (14)

0 (0)

?

?

Примечание: - снижение, различия значимы; - повышение, различия значимы; - повышение, различия высокозначимы; ? – корреляции не обнаружено; = - перемещения в вышележащие слои нет

Е-кадгерин. Е-кадгерин играет важную роль в поддержании межклеточных связей, нормальной адгезии эпителиальных клеток и подавляет инвазию.

  Показатель Hscore для Е-кадгерина был значимо ниже при CIN3 (36±37) и МРШМ (9±11), чем в других группах (р<0,001 при сравнении с «нормальным» эпителием (186±90),  CIN1 (120±68) и CIN2 (178±114)). Имеется тенденция к снижению Hscore при МРШМ по сравнению с CIN3 (р=0,062). Повышение экспрессии Е-кадгерина при CIN2 по сравнению с CIN1 в нашем исследовании можно связать с защитной ролью этого белка, усиливающего миграцию дендритных клеток Лангерганса,  адгезию их к ВПЧ-инфицированным кератиноцитам и антиген-презентацию ими ВПЧ ВКР лимфоцитам, что необходимо для регрессии CIN легкой степени. Однако в ряде случаев CIN2 и большинстве случаев CIN3 мы наблюдали резкое снижение экспрессии маркера, что вероятно ассоциировано с перспективой прогрессирования болезни, так как  при CIN3 экспрессия Е-кадгерина подавляется белком Е7 ВПЧ (Caberg J. et al., 2008; Laurson J. et al., 2010).

Экспрессию Е-кадгерина следует рассматривать как важный маркер для прогнозирования течения CIN - утрата экспрессии, определяемая как в гистологических, так и в цитологических препаратах, может помочь в выявлении CIN тяжелой степени с худшим прогнозом, но не в определении скрытой микроинвазии или предсказания ее близости.

Ki-67. Белок Ki-67 присутствует в клетках, готовящихся или участвующих в митозе, и отсутствует  в клетках в состоянии покоя, являясь маркером клеточной пролиферации.

Частота экспрессии Ki-67, количество Ki-67 положительных клеток в вышележащих слоях и индекс Ki-67 прямо коррелировали со степенью повреждений. Индекс Ki-67 составлял 8±4 в эпителии с ВПЧ, 18±11 при CIN1, 57±16 при CIN2, 85±8 при CIN3 и 88±8 при МРШМ. Индекс был значительно выше при CIN1-3 и МРШМ, чем в неизмененном эпителии (р=0,008 для CIN1,  р<0,001 для остальных групп), при CIN2-3 или МРШМ по сравнению с CIN1, при CIN3 или МРШМ по сравнению с CIN2 с (р<0,001 для всех групп). Значимых различий  в индексе Ki-67 между CIN3 и МРШМ не получено (р=0,369). Полученные нами результаты подтверждают перспективность использования индекса Ki-67 для разделения легких и тяжелых повреждений, определения риска близкой прогрессии до следующей степени CIN или предсказания регрессии при CIN1-2, но не для диагностики скрытой инвазии.

pAkt. Белки семейства Akt блокируют апоптоз, запускают клеточный цикл, способствуя выживанию генетически трансформированных клеток и неоангиогенезу (Bhaskar P., 2007).

В неизмененном эпителии с ВПЧ окрашивания антителами к pAkt не отмечено.  При CIN1 экспрессии pAkt обнаружена только в одном случае из 27, при CIN2 – уже в 14 (56%) случаях и в основном (93%) во всех слоях эпителия. При этом средний процент положительных клеток составил 7±5%.  При CIN 3 окрашивание антителами к pAkt обнаружено в 17 (77%) случаях, причем во всех слоях эпителия. Средний процент pAkt-положительных клеток составил 15±13%. При МРШМ экспрессия pAkt выявлена в 4 (57%) случаях, также во всех слоях эпителия. Средний процент положительных клеток составил 17±15%.

Наблюдалось статистически значимое увеличение процента pAkt-положительных клеток при CIN3 (р=0,007 по сравнению с CIN2, р<0,001 по сравнению с CIN1, р=0,007 по сравнению с нормой) и МРШМ (р=0,001 по сравнению с CIN1 и р=0,049 – с нормой). Статистически значимых различий между CIN3 и МРШМ получено не было (р=0,79).

При разделении образцов на положительные по pAkt (окрашено не менее 10% эпителиальных клеток) и отрицательные (при окрашивании менее 10%) количество pAkt-положительных случаев при CIN3 было примерно в два раза выше, чем при CIN2.

Наше исследование является первым сообщением о возможной роли pAkt в прогрессии CIN. Оно показало, что pAkt – важный маркер для разделения легких и тяжелых эпителиальных повреждений, так как «скачок» экспрессии происходит уже при переходе от CIN1 к CIN2. Экспрессия маркера коррелирует со степенью повреждений, но статистически значимых различий между CIN3 и МРШМ не отмечено. Определение pAkt может применяться в тестовой системе для  прогноза течения CIN,  определения степени повреждения до эксцизии и планирования ее глубины, но не для предсказания микроинвазии.

PTEN. Ген PTEN является опухолевым супрессором. Его продукт — фосфатаза — регулирует клеточный цикл, подавляет сигнальный путь AKT, уменьшая скорость роста и размножения клеток  и запуская поврежденные клетки в апоптоз. Утрату экспрессии PTEN наблюдают при прогрессии многих злокачественных опухолей (Di Cristofano A., 2000). В нашем исследовании наличие или утрата экспрессии PTEN плохо коррелировали со степенью CIN. При CIN1 и CIN2 сохранилась высокая  экспрессия PTEN, характерная для «нормального эпителия». При CIN3 и МРШМ нарастала частота случаев с полной или частичной потерей PTEN. Однако, сохранившаяся экспрессия PTEN не только при CIN1, но и в большинстве случаев CIN2-3/CIS затрудняет использование этого маркера для прогнозирования течения CIN. Результаты нашего исследования свидетельствуют о невысокой значимости определения маркера PTEN в ИГХ-исследованиях для дифференциальной диагностики легких и тяжелых повреждений, однако утрата экспрессии PTEN, по нашим данным наблюдавшаяся в 15% случаев CIN3, может ассоциироваться с худшим прогнозом и предсказывать прогрессию CIN. 

Белки семейства Bcl-2. Была исследована экспрессия двух белков семейства Bcl-2: ингибитора апоптоза – Bcl-2 и индуктора – Вах.

Литературные данные относительно экспрессии Bcl-2 при CIN и РШМ противоречивы. Исследователи наблюдали как увеличение экспрессии Bcl-2, рассматривая его как маркер прогрессии до CIN3 (Koskimaa H. et al., 2010), так и снижение при CIN и РШМ по сравнению с контролем (Пономарёва Ю.Н. и соавт., 2010; Хунова Л.З., 2011; Soufla G. et al, 2005). Имеются сходные противоречия и в результатах немногочисленных исследований по экспрессии Bax (Alerta C. et al., 2000; Cheung T. et al., 2002; Soufla G. et al, 2005).

В нашем исследовании в неизмененном эпителии с ВПЧ и при CIN1 окрашивание на Bcl-2 локализовалось в базальном слое эпителия, тогда как во всех случаях МРШМ Bcl-2-положительные клетки располагались во всех слоях. Наблюдалось значимое повышение частоты экспрессии Bcl-2 во всех слоях эпителия при увеличении степени неоплазии, свидетельствующее о подавлении апоптоза в вышележащих слоях эпителия. Также отмечено повышение частоты экспрессии Вах и вовлечения всех слоев эпителия по мере увеличения степени CIN, что, по-видимому, является компенсаторной реакцией – попытками индуцировать апоптоз на фоне его подавления вирусными белками Е6 и Е7.

Неоднозначное изменение экспрессии маркеров семейства Bcl-2 при эпителиальных неоплазиях разной степени свидетельствует о включении сложных адаптивных механизмов, предупреждающих дальнейшую прогрессию CIN, что не позволяет изолировано использовать их для определения степени неоплазии и прогноза. Известно, что готовность клеток к  апоптозу определяется динамическим соотношением Bcl-2 и Вах, так как белки могут блокировать друг друга. Проведено изучение ко-экспрессии Bcl-2 и Вах при CIN и МРШМ. Даже при увеличении частоты экспрессии Вах в неоплазированном эпителии наиболее часто (57%) наблюдалась  высокая экспрессия Bcl-2 при отсутствии экспрессии Вах – фенотип, характерный для резистентных к апоптозу клеток, и только 4% случаев имели Вах+/Bcl-2-, т.е. чувствительный к апоптозу фенотип. 

Изолированное исследование экспрессии Bcl-2 и Вах нецелесообразно использовать для определения степени тяжести эпителиальных повреждений.  Однако их можно включить в панель маркеров для индивидуального прогнозирования CIN, так как сочетание Bcl-2+/Bax- является неблагоприятным прогностическим фактором и может свидетельствовать о близком переходе в следующую степень неоплазии.

VEGF. Экспрессия основного стимулятора ангиогенеза – VEGF –  возрастала по мере увеличения тяжести эпителиальных повреждений от CIN1 к МРШМ. Частота случаев с экспрессией высоко значимо возрастала (с 10% в контроле до 77,8% при МРШМ),  как и частота поражения всех слоев (с 0% в контроле до 77,8% при МРШМ), (р<0,0001). Наблюдалось статистически значимое увеличение частоты экспрессии VEGF-положительных клеток во всех слоях эпителия при CIN3 и МРШМ по сравнению с CIN2 (р=0,009 и 0,001, соответственно). Показатель Hscore для VEGF был значимо выше при CIN3 (108±113) и МРШМ (190±127), чем в неизмененном эпителии с ВПЧ (1±3) (р=0,005 и р<0,001, соответственно), CIN1 (5±9) (р=0,001 и р<0,001, соответственно) или CIN2 (35+43) (р=0,014 и  р<0,001, соответственно); значимых различий не получено только между CIN3 и МРШМ (р=0,077).

Мы полагаем, что прогрессивное увеличение экспрессии VEGF при CIN связано с необходимостью трофического обеспечения растущей массы неоплазированных клеток и сопровождается образованием неоваскулярной сети. Последняя тем обильнее, чем активнее метаболизм и больше пролиферативный потенциал клеток. Неоваскулярная сеть является важной составляющей аномальных кольпоскопических картин. Высокая интенсивность окрашивания  на VEGF, присутствие VEGF-положительных клеток во всех слоях эпителия и количество баллов по Hscore более 100 являются негативными прогностическими  факторами близкой прогрессии до следующей степени неоплазии.

Экспрессия VEGF, определенная иммуногистохимически, обладает значимой диагностической ценностью и может использоваться в тестовой системе для разделения легких и тяжелых повреждений в сомнительных случаях, а также для многофакторной оценки индивидуального прогноза, однако не позволяет дифференцировать CIN3 и МРШМ.

  COX2. Экспрессия фермента циклооксигеназы-2 (COX2), создающего условия для развития опухолей, ассоциирована не только с пролиферацией опухолевых клеток, но и с активацией неоангиогенеза, блокированием апоптоза и неблагоприятным прогнозом некоторых опухолей (Ferrandina G., 2002; Hammes L. et al., 2008; Ronco G. et al., 2006). Онкобелки Е6 и Е7 ВПЧ 16 типа увеличивают транскрипцию COX2 через EGFR-сигнальный путь (Sui W. et al., 2009).

В нашем исследовании экспрессия COX2 увеличивалась прямо пропорционально степени повреждений. По частоте экспрессии СОХ2 группа CIN3 значимо отличалась от группы контроля (р=0,003), от CIN1 или CIN2 (р=0,029), также как и группа МРШМ (р=0,005 при сравнении с «нормальным эпителием», р=0,038 при сравнении с CIN1 или CIN2). При анализе накопления СОХ2 по слоям при увеличении тяжести заболевания высоко значимо повышалась частота экспрессии во всех слоях эпителия (с 0% в контроле и при CIN1-2 до 44,4% при CIN3, и 77,8% - при микроинвазии), (р<0,0001). Процент окрашенных клеток также увеличивался пропорционально степени повреждений с медианами 5% при CIN1, 30% при CIN2 и 100% при CIN3 и МРШМ.

Индекс HSCORE для COX2 при различных степенях эпителиальных повреждений представлен в таблице 4. Важно отметить, что индекс HScore при микроинвазии был значимо выше, чем при CIN3 (р=0,002). Показатель Hscore  более 100 баллов является негативным прогностическим фактором близкой прогрессии, а более 200 баллов — близости или наличия микроинвазии.

COX2, таким образом, представляет собой особенно ценный маркер прогрессии CIN, так как его экспрессия, прямо коррелирующая со степенью неоплазии, по результатам Hscore отличается при МРШМ от CIN3. Он должен использоваться в тестовой системе для предсказания прогрессии и микроинвазии и построения индивидуального прогноза.

Таблица — 4 HScore СОХ2 при CIN, МРШМ и в группе контроля

Частота экспрессии и стат. показатели HScore (баллы)

Контроль 0

Больные

CIN1 1

CIN2 2

CIN3 3

МРШМ 4

Кол-во

1 из 10

5 из 17

5 из 17

18 из 27

7 из 9

HScore, медиана

10

10

30,0

140

270

HScore, квартили

7,5-10

10-10

30-60

100-180

200-300

HScore, пределы

5-10

10-30

30-60

100-200

100-300

Примечание: 0-1,2 p>0,5; 0-3,4 p=0,0001; 1-3,4 p=0,0001; 2-3,4 p<0,01; 3-4 p=0,002.

Тимидинфосфорилаза. Роль экспрессии ТФ в прогрессии CIN изучена недостаточно.  В немногих исследованиях было показано, что ТФ может быть вовлечена в активацию ангиогенеза при CIS и РШМ, хотя интенсивность экспрессии ее не коррелирует с плотностью микрососудов в окружающей ткани (Dobbs S. et al., 2000; Isaka S. et al, 2002). В работе Подистова Ю.И. (2006) при ИГХ-исследовании тканей 18 больных тяжелой дисплазией отмечено повышение количества ТФ по сравнению с нормальным эпителием без ВПЧ.

В нашем исследовании ТФ экспрессировалась практически всегда, но в норме экспрессия была в основном слабой интенсивности и локализовалась исключительно в базальном и парабазальном слоях. При увеличении тяжести повреждений высокозначимо повышалась частота высокоинтенсивного окрашивания (с 0% в норме до 85% при CIN3 и 89% при МРШМ) и экспрессии во всех слоях (с 0% в норме и при CIN1 до 47,1% при CIN2, 88,9% при CIN3 и 77,8% при МРШМ) (р=0,0001). 

Средний балл экспрессии ТФ, определенный по Hscore, также увеличивался по мере увеличения степени неоплазии, составил в неизмененном эпителии с ВПЧ 21±7, при CIN1 - 91±35, при CIN2 - 205±67, при CIN 3 - 260±70 и при МРШМ - 266±52 и был значимо выше при CIN1-3 и МРШМ, чем в неизменном эпителии с ВПЧ (р<0,001), а также при CIN1 по сравнению с CIN2, CIN3 и МРШМ (р<0,001 для всех групп), CIN2 по сравнению с CIN3 или МРШМ (р=0,013 или 0,027, соответственно). Не обнаружено статистически значимых различий Hscore только между группой CIN3 и МРШМ (р=0,84).

ТФ как маркер прогрессии цервикальной неоплазии может играть роль в тестовой системе для разделения легких и тяжелых повреждений, построения индивидуального прогноза, однако она не дает возможности определить скрытую микроинвазию.

ММР 2 и 9. MMP играют главную роль в процессах индуцированного опухолью ангиогенеза, клеточной миграции, пролиферации, апоптоза и деградации соединительной ткани, инвазии и метастазирования, а также способны разлагать компоненты базальной мембраны и внеклеточного матрикса (Brummer O. et al., 2002; Malina R. et al., 2004; Minami R. et al., 2003; Polette M. et al., 2004; Zhai Y. et al., 2005).

Была исследована экспрессия двух ММР: ММР-2 и ММР-9. В «нормальном эпителии», CIN1 и CIN2 экспрессия ММР-2 в эпителиальных клетках практически отсутствовала. Статистически значимое увеличение частоты экспрессии ММР-2 наблюдалось при сравнении CIN3 (36%) с CIN2 (8%) (р=0,03), а также МРШМ (86%) –  с «нормальным эпителием» (р=0,004),  CIN1 (р=0,002) и  CIN2 (р<0,001). Статистически значимых различий между CIN3 и МРШМ, несмотря на очевидный «скачок» частоты экспрессии при МРШМ, получено не было (р=0,382), что, очевидно, связано с малочисленностью группы МРШМ.

Частота экспрессии ММР-9 коррелировала со степенью неоплазии, возрастая с 10% до 71% и особенно резко повышаясь при МРШМ (р=0,035 при сравнении с неизмененным эпителием и р=0,01 при сравнении с CIN2).

Выраженное повышение частоты экспрессии при МРШМ ММР-9, как и ММР-2, позволяет рассматривать эти маркеры как перспективные в отношении предсказания скрытой инвазии – они могут быть включены в диагностическую панель. Необходимы дополнительные исследования прогностической ценности ММР-2 и 9 с большим числом случаев МРШМ.

Белки базальной мембраны. Была исследована экспрессия белков базальных мембран - коллагена IV типа и ламинина 5γ2-цепей – как маркеров инвазии неопластических клеток.

В нашем исследовании в большинстве случаев не обнаружено окрашивания базальных мембран цервикального эпителия, тогда как окрашивание базальных мембран микрососудов наблюдалось во всех случаях. Частичное окрашивание мембран антителами к ламинину 5γ2 наблюдалось только в 3 (14%), а к коллагену IV типа – в 2 (9%) случаях CIN3. Включение их в ИГХ-панель малоцелесообразно.

Заключение. Из 13 маркеров, исследованных нами иммуногистохимически, значение для отделения легких эпителиальных повреждений от тяжелых и построения индивидуального прогноза имеют Е-кадгерин, Ki-67, pAkt, VEGF, COX2 и ТФ. Для определения скрытой или грядущей микроинвазии можно использовать только COX2, так как ее экспрессия значимо отличалась при МРШМ от CIN3/CIS. Маркеры PTEN, Bcl-2, Bax, MMP2 и MMP9 также могут быть включены как перспективные для построения индивидуального прогноза, но не для разделения по степеням повреждений, хотя при увеличении числа наблюдений МРШМ, возможно, ММР-2 и -9 также окажутся перспективными для предсказания микроинвазии.

Изменения и прогностическое значение сывороточного содержания молекул, играющих роль в формировании иммунного ответа при ВПЧ-ассоциированных CIN и МРШМ: дифференцировочных молекул CD54 (ICAM-1), CD-50 (ICAM-3), CD18, CD8, CD38, CD95, главного комплекса гистосовместимости (HLA1) и их ассоциатов

Возможность персистенции ВПЧ ВКР и возникновения CIN связана с нарушениями  иммунологического контроля со стороны врожденного и адаптивного иммунитета у этих больных, в том числе антигенпрезентации, адгезии, взаимодействия и активации иммунокомпетентных клеток. Полнота и тип активации T-клеток зависят от экспрессии на поверхности кератиноцитов и антигенпрезентирующих клеток Лангерганса молекул главного комплекса гистосовместимости (HLAI), костимулирующих молекул адгезии CD54 (ICAM-1), CD-50 (ICAM-3), и некоторых других, связанных с ними функционально молекул, экспрессируемых лимфоцитами: CD18, CD8, CD38, а также их ассоциатов. Биологическими маркерами прогрессии онкологических и вирусных заболеваний могут быть растворимые рецепторы эффекторов иммунитета, в частности CD95, подавляющий апоптоз трансформированных клеток.

В сыворотке крови больных CIN и РШМ можно ожидать изменения количества молекул главного комплекса гистосовместимости, адгезии и костимулирующих молекул (HLAI, CD54, CD50,CD18, CD8, CD38, CD95), а также их ассоциатов вследствие «слущивания» с поверхности взаимодействующих иммунокомпетентных клеток, приводящего к уменьшению плотности экспрессии этих молекул на мембране неоплазированных клеток. Подобный комплекс дифференцировочных молекул при CIN и МРШМ ранее не изучался. Количество и соотношение данных молекул определяет возможность элиминации или персистенции ВПЧ, регрессии или прогрессии CIN и может иметь прогностическую ценность.

Наше исследование показало, что многофункциональные дифференцировочные молекулы, участвующие в адгезии и антигенпрезентации ВПЧ ВКР, FAS-опосредованном апоптозе, молекулы главного комплекса гистосовместимости I типа и их ассоциаты очевидно вовлечены в формирование иммунного ответа при цервикальном канцерогенезе. Об этом свидетельствуют выявленные нами достоверные повышение в сыворотке крови CD54, CD18, CD8, CD38 и ассоциатов CD18-CD54, CD8- HLAI в 1,2-1,9 раза, и понижение CD50,  olCD50, HLAI в 1,1-1,8 раза по сравнению с контрольной группой – что отражает таблица 5.

Сывороточное содержание суммарной и олигомерной фракций CD54, CD50, а также CD8, CD18, CD38, CD95, HLAI и их ассоциатов при CIN и РШМ достоверно отличается от аналогичных показателей в норме, но слабо отражает тяжесть повреждений. У  больных разными степенями неоплазии достоверно отличались лишь показатели CD54, olCD54 и CD18-CD50, повышаясь при начальных CIN и ВПЧ-инфекции, но возвращаясь к исходным значениям при увеличении тяжести неоплазии.  Содержание  CD54 значимо различалось  между группами CIN1-2 и CIN2-3 (p=0,004) и CIN1-2 и МРШМ (p=0,02); олигомерной фракции CD54 - между группами контроля и CIN1 (p=0,01), CIN1-2 (p=0,0006), между группами CIN1-2 и CIN2-3 (p=0,04), и CIN1-2 и МРШМ (p=0,02).  Обнаруженное достоверное повышение показателей CD54 и olCD54 в группе CIN1-2 по сравнению с группами больных с тяжелыми повреждениями и МРШМ может свидетельствовать об активации иммунного ответа у многих больных этой группы, имеющих благоприятный прогноз за счет усиления антиген-презентации в попытке обеспечить регрессию повреждений.

Нами выявлено повышение сывороточного содержания растворимых белковых комплексов CD18-CD50 при CIN. Взаимодействие между белками LFA-1 (CD11a/CD18) и CD50 инициирует первичный контакт Т-лимфоцита и антигенпрезентирующей клетки в процессе иммунного ответа. Это взаимодействие стимулирует конформационные изменения LFA-1, создавая оптимальные условия для взаимодействия LFA-1 с CD54 с последующим формированием полноценного контакта иммунокомпетентных клеток. В связи с этим закономерно и обнаруженное увеличение сывороточного содержания суммарной фракции молекулы CD54 по сравнению с контролем.

Несмотря на достоверные различия большинства показателей в группах больных по сравнению с контрольной группой, сывороточное содержание растворимых дифференцировочных молекул CD8, CD18, CD38 и HLAI слабо отражало тяжесть повреждений. Однако показатели CD54, CD50, CD95 и ассоциата CD18-CD54 могут быть использованы для построения индивидуального прогноза. Так, увеличение суммарной сывороточной фракции CD54, ассоциатов CD18-CD54 при снижении суммарной фракции CD50 у больных CIN указывает на неблагоприятный прогноз.

Высокие значения CD95 (>900 U/ml), свидетельствующие о подавлении Fas-опосредованного апоптоза за счет блокирования CD95-лиганда, также неблагоприятны и предсказывают большую вероятность инвазивного характера заболевания, что представляется чрезвычайно важным, поскольку больные CIN2-3/CIS по большинству других параметров не отличаются от больных МРШМ. Дальнейшее изучения профиля дифференцировочных молекул позволит уточнить комбинацию, обладающую прогностической ценностью в отношении прогрессии до инвазивного рака.

Увеличение содержания растворимых молекул адгезии у больных по сравнению с группой контроля относительно невелико – в 1.1-1.9 раза, что, по-видимому, свидетельствует о монотонной невысокой результативности у больных презентации ВПЧ ВКР антигенпрезентирующими клетками и нарушении активации адаптивного иммунного ответа. На это косвенно указывает также более низкий уровень сывороточного HLAI у всех групп пациенток по сравнению со здоровыми донорами (табл. 5).

Таблица — 5 Характер и кратность изменения сывороточного содержания дифференцировочных молекул иммунного ответа при эпителиальных повреждениях разной степени по сравнению с контрольной группой

Степень повреждений

Маркер

ВПЧ

CIN1

CIN2

CIN2-3/CIS

МРШМ

РШМ

CD54

x1,6

x1,7

x1,6

x1,5

x1,5

olCD54

x1,1

x1,4

x1,1

=

=

CD50

=

x1,5

x1,3

x1,2

x1,3

olCD50

x1,2

x1,2

=

x1,2

x1,1

CD18

x1,4

x1,3

x1,2

x1,3

x1,3

CD8

x1,9

x1,8

x1,9

x1,9

x1,9

HLAI

x1,7

x1,8

x1,8

x1,7

x1,6

CD38

x1,3

x1,1

x1,2

x1,1

x1,2

CD95

x1,3

x1,3

x1,5

x1,3

x1,4

CD18-50

x1,4

=

x1,3

=

=

CD18-54

x1,6

x1,5

x1,5

x1,5

x1,5

CD8-HLAI

x1,2

x1,2

x1,2

x1,2

x1,2

Возможно, у больных CIN и РШМ изначально имеется предрасположенность к развитию заболевания при инфицировании ВПЧ ВКР, связанная с врожденной несостоятельностью адгезионных молекул и HLAI.  Дальнейшее изучение дифференцировочных молекул позволит обнаружить точки приложения фармакологических препаратов, в том числе иммунокорректоров, для лечения персистирующей ВПЧ-инфекции и профилактики РШМ.  Необходимы дополнительные исследования по изучению их эффективности, которую целесообразно оценивать в первую очередь по снижению вирусной нагрузки в ЗТ.

Инсулиноподобные факторы роста, связывающие их белки, и эпидермальный фактор роста в сыворотке крови больных CIN, МРШМ и РШМ как перспективные маркеры диагностики и прогрессии цервикальных неоплазий

Важную роль в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза играют эпидермальный фактор роста (EGF) и семейство инсулиноподобных факторов роста (insulin-like growth factors, IGF), включающее IGF-1, IGF-2 и несколько IGF-связывающих белков (IGFBP). Они производят анаболический эффект, а  также действуют как митогены, увеличивая синтез ДНК и стимулируя экспрессию циклина D1. IGF-1, кроме того, усиливает экспрессию белков группы Bcl и подавляет Вах, блокируя апоптоз (Lee S. et al., 2010). Биодоступность белков семейства IGF регулируется белками IGFBP, которые подавляют перенос IGF в ткани, тормозя пролиферацию. Сигнальный путь IGF вовлечен в канцерогенез гинекологических раков, в том числе – РШМ (Hirano S. et al., 2004; Pollak M., 2000).  Данные малочисленных публикаций по исследованию EGF и белков семейства IGF в сыворотке и плазме крови больных CIN взаимопротивоположны. Нами в сыворотке крови были исследованы IGF-1, IGF-2, IGFBP-1, IGFBP-3, EGF и их соотношения в начале опухолевой конверсии (при CIN 1-2), а также при МРШМ и инвазивном РШМ. Подобный набор инсулиноподобных факторов и связывающих их белков и EGF при CIN и МРШМ изучен впервые.

Нами обнаружены закономерности изменения содержания белков семейства IGF и EGF при CIN и РШМ. Отмечено значимое снижение в сыворотке крови у больных РШМ по сравнению с контрольной группой IGF-1 (p=0,006), IGF-2 (p=0,03), IGFBP-3 (p=0,022) и повышение IGFBP-1 (p=0,038), соотношения IGFBP1/IGFBP3 (р=0,027), а также EGF (p=0,034). Несмотря на кажущуюся парадоксальность полученных результатов с точки зрения биологических функций IGF-1 и IGF-2, их снижение при CIN, РШМ и других опухолях обнаружено также Serrano c соавт. (2006). IGFBP-3 обычно подавляет стимулирующее опухолевый рост действие IGF-1, обладает антипролиферативным и проапоптотическим действием (LeRoith D., 2003). Выработка IGFBP-3 активируется p53, а поскольку последний деградирует под действием белка E6 ВПЧ ВКР, то снижение IGFBP-3 при CIN и РШМ закономерно (Mathur S. et al., 2000; 2003; 2005). IGFВP-3 в норме связывает 90% IGF-1, поэтому снижение первого приводит к несоизмеримому увеличению биодоступности даже сниженных количеств IGF-1. Таким образом можно объяснить парадоксальное снижение при CIN и РШМ IGF-1.

Для МРШМ характерным по результатам нашего исследования оказалось лишь снижение IGF-1 и повышение IGFBP-1. Тем не менее, совокупность показателей, характерных для РШМ, целесообразно определять до конизации у больных CIN тяжелой степени. Выявление показателей «панели», характерных для инвазивного рака (высокие значения EGF (>65 пг/мл) и IGFBP-1 (>7,8 нг/мл), увеличение соотношения IGFBP-1/IGFBP-3 и низкие значения IGF-1 (<160 нг/мл) и IGF-2 (<1,4 мкг/мл)), у больных CIN2-3 и преинвазивным раком позволит предположить скрытую инвазию, и, увеличив объем изымаемого конуса, сделать это органосохраняющее вмешательство радикальным и окончательным. Подобные значения маркеров являются негативными факторами прогноза.

Теломеразная активность как потенциальный маркер прогрессии CIN и варианты сплайсированных форм РНК hTERT

Одним из перспективных маркеров прогрессии CIN является теломераза – фермент, компенсирующий укорочение 3' конца хромосом за счет добавления повторяющейся последовательности из шести нуклеотидов 5'-ТТАГГГ, что увеличивает естественный лимит делений эукариотической клетки. Теломераза состоит из двух субъединиц: каталитической субъединицы TERT (теломеразная обратная транскриптаза, hTERT) и РНК-шаблона TERC (или hTR) (Hiyama K., 2009).

В нашем исследовании при CIN и МРШМ  РНК hTERT присутствовала во всех образцах CIN и МРШМ и в 78% условно неизмененной прилежащей ткани. Теломеразная же активность обнаружена лишь в 45-60% образцов CIN и МРШМ, а в условно неизменной ткани, прилежащей к неоплазированному эпителию разной степени CIN – в 27%. При этом значимых различий в частоте активности теломеразы при разных степенях повреждений нами не обнаружено, хотя имеется тенденция к различию между группой условно неизмененных тканей и CIN3 (p=0,08). Возможно, дополнительные исследования с большим числом наблюдений позволят установить корреляцию между степенью CIN и активностью теломеразы. Определение активности теломеразы в прилежащем условно неизмененном эпителии свидетельствует о ранней активации теломеразы под действием гена Е6 ВПЧ ВКР.

Поскольку активность теломеразы наблюдалась лишь в части образцов CIN и МРШМ, мы попытались выяснить, связано ли это с различиями в паттернах экспрессии РНК, которая кодирует каталитическую субъединицу фермента (hTERT). Известно несколько изоформ этой РНК: с отсутствием делеций (именно эта форма кодирует белок, осуществляющий синтез теломерных повторов) и несколько форм с делецией,  из которых наиболее часто встречаются альфа и бета формы. Нормально сплайсированная мРНК hTERT, кодирующая функционально активный фермент, выявлялась в 80% образцов условно нормального  эпителия и во всех образцах CIN различной степени, в то время как теломеразная активность – не более чем в 60% из них. Следовательно, вариации в уровнях теломеразной активности не связаны с исследованными нами типами сплайсинга мРНК hTERT.

Отсутствие теломеразной активности в образцах неоплазированного эпителия при одновременном выявлении изоформ мРНК без альфа- и бета-делеций можно объяснить несколькими способами. Во-первых, в образцах без теломеразной активности может выявляться не правильно сплайсированная мРНК, а изоформы, которые не имеют альфа- и бета-делеций, однако подверглись альтернативному сплайсингу в другой районе мРНК (гамма-делеция или несколько типов вставок INS 1-4), что привело к потере ими возможности кодировать активный фермент. С другой стороны, регуляция теломеразы может осуществляться или на посттрансляционном уровне, или в результате регуляции кофакторов теломеразы, также приводя к отсутствию теломеразной активности в исследованных клетках.  Расхождение уровня теломеразной активности и экспрессии мРНК hTERT отмечено и другими авторами, которые связывают его сучастием контрольных механизмов, реализующих мРНК в белок. (Koskimaa H. et al., 2010).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что высокий уровень мРНК hTERT необходим на ранних этапах цервикального канцерогенеза, на уровне CIN. Учитывая, что активность теломеразы дает иммортализованным клеткам приоритет роста с постепенным вымещением клеток без теломеразной активности, можно считать, что именно в этих случаях повреждения носят необратимый характер с перспективой ближайшего перехода в следующую степень неоплазии. Хотя по результатам нашего исследования активность теломеразы не может быть использована как диагностический маркер для разделения по степеням CIN и определения микроинвазии, но может являться маркером для определения индивидуального прогноза, и может быть включена в иммуногистохимическую или иммуноцитохимическую панель.

Выводы:

1.Тяжелые CIN (CIN2-3/CIS) и МРШМ возникают и прогрессируют сугубо в зоне трансформации (ЗТ) и эндоцервикальных криптах, и возможность визуализации этих повреждений зависит от типа ЗТ и возрастного смещения ЗТ в цервикальный канал. С  возрастом тяжесть  неоплазий увеличивается, а  видимая на эктоцервиксе площадь их уменьшается (р=0,00001). Возраст старше 35 лет является критическим в отношении значимого увеличения частоты неудовлетворительных условий кольпоскопии и риска гиподиагностики степени неоплазии (p=0,0001). Чувствительность кольпоскопии в выборе места адекватной биопсии при CIN высока только при ЗТ I типа (88%), и резко снижается при II и особенно III типе из-за присутствия наиболее тяжелых повреждений в скрытой части ЗТ и криптах. Риск гиподиагностики по материалам ограниченных биопсий возрастает в 1,92 раза при II типе ЗТ (OR=1,92, 95% ДИ=1,06-3,47), в 2,79 раза при III типе (OR=2,79, 95% ДИ=1,27-6,11), и в 5,34 раза выше при III типе ЗТ по сравнению с I типом  (OR=5,34, 95%ДИ=2,52-11,33). При II и III типе ЗТ при подозрении на тяжелые эпителиальные повреждения ограниченной биопсии следует предпочесть петлевую эксцизию ЗТ (LLETZ).

2. У 71,8±1,5% больных CIN и МРШМ имеется сочетание эпителиальных поражений разной степени, отражающее сосуществование клонов с разным мутагенным потенциалом и служащее объективной причиной недооценки степени неоплазии по данным ограниченной биопсии. Деление на три степени CIN условно. Диагноз должен быть установлен по максимальной степени неоплазии, шанс недооценки степени неоплазии по ограниченному биоптату в 5,81 раз больше при полиморфных поражениях, чем при мономорфных (OR=5,81 95% ДИ=2.49-13.56).

3. Поражение крипт, обнаруженное нами у 74,6% больных CIN3/CIS и у всех больных МРШМ, является неблагоприятным прогностическим фактором (p<0,001). Частота поражения крипт растет с увеличением тяжести CIN и возраста. Глубина поражения крипт CIN чаще всего не превышает 5 мм (93,7%), но  расположение их на глубине до 2,9 см от эктоцервикса служит причиной неполноценности эксцизии в области эндоцервикального края  и неизлеченности – чаще при более поверхностной LLETZ, чем при конизации (p=0,0001).

4. CIN3 и МРШМ связаны с ВПЧ ВКР практически в 100% случаев, а CIN2 — в 97,9%, что определяет высокую информативность тестирования на ВПЧ ВКР в диагностике, при оценке эффективности органосохраняющего лечения и наблюдении за больными, учитывая 100% чувствительность и предсказательную ценность негативного результата. Отрицательный результат теста на ДНК ВПЧ ВКР является показателем адекватности эксцизии и благоприятного прогноза у больных CIN2-3/CIS и МРШМ. Тест HC2 более эффективен для диагностики рецидива и неизлеченности, чем ПЦР, так как имеет более высокую специфичность и предсказательную ценность положительного результата (96% против 79,2% и 44,8% против 13,4%, соответственно). После конизации НС2 стал отрицательным у 93±1,3% больных,  неизлеченность или рецидив обнаружены лишь у 3,1±0,8%больных, и только в группе с сохранившимся позитивным НС2. Прогрессивный рост вирусной нагрузки НС2 после конизации может свидетельствовать о рецидиве CIN до появления изменений в мазках.

5. Электрорадиохирургическая конизация шейки матки эффективна и безопасна для лечения CIN2—3/CIS и МРШМ 1А1 без лимфоваскулярной инвазии за счет полноценного изъятия ЗТ с очагами неоплазированного эпителия. Эффективность операции может быть увеличена за счет единовременных дополнительных резекций и составляет 96,9%±0,8%больных. Остатки CIN в эндоцервикальном крае резекции связаны с высоким поражением  скрытой части ЗТ и глубокой вовлеченностью крипт, ошибочным выбором электрода недостаточного размера у больных старше 35 лет или стенозом цервикального канала, ограничивающим глубину введения электрода.

6. Сочетание с беременностью тяжелых CIN и МРШМ закономерно, так как CIN и МРШМ – заболевание молодых женщин репродуктивного возраста (78,7% больных CIN2, 67,6% больных CIN3/CIS и 47,6% МРШМ были моложе 40 лет). У больных с CIN2-3/CIS и МРШМ донашивание беременности безопасно -  прогрессирования заболевания не отмечено. Кольпоскопически направленные биопсии у беременных безопасны, но целесообразны только при подозрении на CIN3/CIS, а эксцизия ЗТ без выскабливания цервикального канала – только при кольпоскопических и цитологических признаках МРШМ. Оперативное лечение должно быть отложено на послеродовый период (через 6-12 недель после родов).

7. Предоперационная иммунотерапия аллокином-альфа при CIN2–3/CIS позволила достоверно снизить  показатели вирусной нагрузки HC2-теста у 71,9% больных [95%CI=53,2-86,2%%] в сравнении с отсутствием положительной динамики в группе без лечения [95%CI=0-15,9%%] (р<0,0001). Применение аллокина-альфа в комбинированном лечении больных CIN 2-3/CIS в дополнение к эксцизии ЗТ или конизации патогенетически оправдано.

8. Из изученных маркеров в панель тестовой системы для отделения легких эпителиальных повреждений от тяжелых и построения индивидуального прогноза необходимо включить Е-кадгерин, Ki-67, pAkt, ТФ, VEGF и COX2. Маркеры hTERT, PTEN, Bcl-2, Bax, MMP2 и MMP9 также могут быть включены как перспективные для построения индивидуального прогноза, но не для разделения по степеням повреждений. Для определения скрытой или грядущей инвазии перспективна COX2, так как ее экспрессия значимо отличается при МРШМ от CIN3/CIS (p=0,002). Включение в тестовую систему коллагена IV типа и ламинина 5γ2 нецелесообразно.

9. Изменения экспрессии теломеразного комплекса возникают на ранних этапах цервикального канцерогенеза – во всех образцах CIN и МРШМ обнаружена мРНК hTERT, а активность теломеразы, свидетельствующая о необратимости неопластического процесса и худшем прогнозе, – в 45-60%  образцов.  Связь между активностью теломеразы и вариантами сплайсинга мРНК hTERT (изоформ с отсутствием делеций, с - и -делециями) отсутствует. В прилежащем к неоплазии условно неизмененном эпителии также определяются мРНК hTERT (78%) и активность теломеразы (27%).

10. При РШМ отмечено значимое снижение в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой IGF-1 (p=0,006), IGF-2 (p=0,03), IGFBP-3 (p=0,022) и повышение IGFBP-1 (p=0,038), соотношения IGFBP1/IGFBP3 (р=0,027), а также EGF (p=0,034), что свидетельствует о вовлечении данных белков в канцерогенез и возможности их включения в панель сывороточных маркеров для построения прогноза и предположения скрытой инвазии на фоне CIN. Особо значимо снижение IGF-1 и повышение IGFBP-1, характерное уже для МРШМ.

11. Показатели дифференцировочных молекул в сыворотке крови больных CIN и РШМ достоверно отличались от контроля в сторону повышения - CD54, CD18, CD8, CD38, CD18-CD54, CD8-HLAI в 1,2-1,9 раза, или понижения - CD50,  olCD50,  HLAI в 1,1-1,8 раза. Полученные данные свидетельствуют о монотонной невысокой результативности у больных CIN и РШМ презентации ВПЧ ВКР и нарушении адгезии иммунокомпетентных клеток и активации адаптивного иммунного ответа. Увеличение суммарной сывороточной фракции CD54, ассоциатов CD18-CD54 при снижении суммарной фракции CD50, высокие значения сывороточного содержания CD95>900 U/ml у больных CIN указывают на неблагоприятный прогноз.  Последний показатель ассоциирован с большой вероятностью инвазии.

Практические рекомендации

  1. Тестирование на ВПЧ ВКР методом НС2 следует включить в протокол обследования женщин с аномальными цервикальными мазками, а также наблюдения за больными CIN2-3/CIS и МРШМ после органосохраняющих операций,  учитывая 100% предсказательную ценность отрицательного результата в отношении тяжелых эпителиальных повреждений, их неизлеченности и рецидива. При сохранении или появлении вирусной нагрузки интервал между обследованиями следует укоротить до 6 месяцев для более раннего обнаружения рецидива по результатам цитологических мазков и (или) кольпоскопии.
  2. При оценке значений вирусной нагрузки НС2-теста следует учитывать возраст больной. Высокая вирусная нагрузка (более 300 RLU) у больных старше 30 лет чаще связана с тяжелыми повреждениями, а у молодых женщин чаще сопряжена с продуктивной транзиторной ВПЧ-инфекцией и легкой CIN, что, однако, не исключает тяжелых повреждений в молодом возрасте.
  3. В триаде: цитология, ВПЧ-тестирование, кольпоскопия – в возрасте старше 35 лет диагностическая ценность первых двух тестов возрастает, а ценность кольпоскопии – снижается из-за расположения повреждений в скрытой в цервикальном канале части ЗТ и криптах. При ЗТ II и III типа и аномальных мазках от ASCUS и более следует предпочесть ограниченной биопсии петлевую эксцизию. При HSIL и более в мазках и положительном НС2 в возрасте старше 35 лет целесообразна конизация без предварительной биопсии и выскабливания.
  4. Если в цитологических мазках обнаружены повреждения от ASCUS и более, видимое поражение эктоцервикса отсутствует, но условия кольпоскопии неудовлетворительные, то решение об эксцизии ЗТ следует принимать, ориентируясь не на данные повторных мазков, но на показания ВПЧ-теста. При положительном тесте следует выполнить конизацию или LLETZ. Наблюдение за пациентками показано лишь при отрицательном ВПЧ-тесте – в этом случае мазки целесообразно повторять через 6 и 12 месяцев.
  5. Необходимо указывать отдельным пунктом в кольпоскопическом протоколе наличие пластов, гребней и сосочков толстого АБЭ. Они чаще всего встречаются при CIN3/CIS и более, и частота их обнаружения значимо возрастает от CIN1 к МРШМ (p=0,0006), указывая на то, что эти признаки являются неблагоприятным прогностическим фактором.
  6. Диаметр и глубину удаляемого конуса при II и III типе ЗТ следует подбирать, ориентируясь не на контур поражения эктоцервикса, но на размер шейки. Адекватный  выбор размера электрода при электрорадиохирургической конизации, а также бужирование стенозированного цервикального канала для введения электрода на полную глубину позволят  избежать положительного эндоцервикального края резекции у многих больных старше 35 лет, а также фрагментации конуса у женщин в постменопаузе.
  7. В процедуру конизации необходимо включать выскабливание остатка цервикального канала и выполнять его после изъятия конуса — тогда CIN в соскобе канала можно будет однозначно трактовать как положительный эндоцервикальный край.
  8. Во избежание положительного эктоцервикального края резекции после конизации у больных CIN3 и МРШМ при обширных поражениях и в сомнительных случаях, когда край разреза проходит близко к границе повреждений, следует применять дополнительные резекции – немедленную реконизацию или эксцизию наружного края петлей другой конфигурации. Это делает эксцизию ЗТ более радикальной и дает также возможность двойного морфологического контроля по материалу основной и дополнительной эксцизии, что особенно важно при подозрении на микроинвазию или выявление МРШМ в удаленном конусе.
  9. Чтобы при выполнении электрохирургической конизации избежать артефактов конуса, следует предпочесть диатермоконизации электрорадиохирургическую конизацию, а режиму «коагуляция» — режим «резание». При послеродовой деформации цервикального канала и шейки необходимо перемещать стержень электрода по ходу деформированного канала, прижимая его к стенке на стороне резания — это позволит сохранить целостность конуса, адекватно оценить степень неоплазии и улучшить эффективность эксцизии.
  10. При обнаружении у беременной HSIL, клеток рака или подозрении на них в мазках с шейки матки и отсутствии видимой опухоли не следует настаивать на прерывании беременности даже в первом триместре. При исследовании мазков и кольпоскопии у беременных нередко возможна гипердиагностика степени эпителиальной неоплазии. Целесообразно ВПЧ-тестирование HC2 для исключения пациенток с ложноположительными результатами мазков без риска возникновения тяжелых CIN и РШМ. Биопсии и эксцизии при отсутствии признаков инвазии должны быть отложены  на послеродовый период – через 6-12 недель после родов. Биопсия для морфологической верификации диагноза показана лишь при подозрении на CIN3/CIS и микроинвазию. Разработанный алгоритм беседы с беременной  необходимо внедрить как протокол информированного согласия.
  11. Во избежание неадекватности диагностики  и лечения у больных CIN2 при кольпоскопических признаках вовлеченности крипт следует избегать деструкции и предпочесть петлевую эксцизию, а в возрасте старше 35 лет при II и III типе ЗТ — конизацию.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:        

  1. Волгарева, Г.М. Причастны ли вирусы папиллом человека к возникновению рака мочевого пузыря? / Г.М. Волгарева, Л.Э. Завалишина, О.Б. Трофимова, Л.И. Короленкова, А.В. Хачатурян, Ю.Ю. Андреева, В.Д. Ермилова, Н.Л. Чебан, Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина, В.А. Глазунова, Д.А. Головина, А.Н. Петров, В.Б. Матвеев, Г.А. Франк // Архив Патологии. 2010. -  Т.72, №4. - С. 24-27.
  2. Киселев, Ф.Л. Экспрессия теломеразной активности как маркер ранних стадий прогрессии рака шейки матки /Ф.Л. Киселев, А.А. Петренко, Л.И. Короленкова, Л.С. Павлова, М.Ю. Скоблов, А.В. Баранова, Д.А. Скворцов, О.А. Донцова// Сборник тезисов «10 years of collaboration of Russian scientists with George Mason University Fairfax VA (2002-2012)» - М., 2012. – С. 17. 
  3. Короленкова, Л.И.  Микроинвазивный рак шейки матки: трудности диагностики, выбора метода лечения и ведения больных /Л.И.Короленкова, В.В.Брюзгин, В.Д.Ермилова// Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.  - 2009, Т.20, №2. – С. 67-68.
  4. Короленкова, Л.И. Анализ старта транскрипции мРНК ранних генов вируса папиллом человека типа 16 на разных стадиях рака шейки матки /Л.И. Короленкова, М.Д. Федорова, Л.С. Павлова, Н.П. Киселева// Материалы конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2012» - Санкт-Петербург, 2012. - С. 145-146.
  5. Короленкова, Л.И. Аномальные цервикальные мазки при неизменной шейке матки трудности скрининга, диагностики и лечения CIN и микроинвазивного рака /Л.И. Короленкова, Брюзгин В.В.// Опухоли женской репродуктивной системы. 2011. - №3. С. 74-78.
  6. Короленкова, Л.И. Ассоциированные с инфекцией вируса папилломы человека маркеры возникновения и прогрессии цервикальных интраэпителиальных неоплазий: от научных разработок к клинической практике /Л.И. Короленкова // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2010. - №4. - С. 64-70.  
  7. Короленкова, Л.И. Ведение беременных с подозрением на рак шейки матки /Л.И. Короленкова// Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя» - М., 2011. – С. 94-95.
  8. Короленкова, Л.И. Влияние взаимоотношений информированного согласия врача и пациентки на выбор исхода беременности больными преинвазивным раком и микрокарциномой шейки матки /Л.И. Короленкова// Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя» - М., 2010. – С. 100-101
  9. Короленкова, Л.И. Вовлеченность эндоцервикальных крипт как негативный фактор прогноза интраэпителиальных неоплазий и микроинвазивного рака шейки матки /Л.И. Короленкова, Ермилова В.Д.// Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. - 2011. Т.22, №3. С. 70-76.
  10. Короленкова, Л.И. ВПЧ-тестирование методом гибридного захвата НС2 (Digene/Qiagen) как критерий эффективности конизаций при преинвазивном и микроинвазивном раке шейки матки. /Л.И. Короленкова// Сборник тезисов Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы» - М., 2011. - С. 225-226
  11. Короленкова, Л.И. Геном ВПЧ – основной маркер предрака и ранних форм рака шейки матки. Клиническое значение ВПЧ-тестирования /Л.И. Короленкова// Российский Биотерапевтический журнал. – 2011. - №1. - С. 35.
  12. Короленкова, Л.И. Диагностика неизлеченности и рецидивов преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки с помощью ВПЧ-тестирования методом гибридного захвата (Hybrid Capture 2) после конизации /Л.И. Короленкова// Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2011. - №12. С. 23-27.
  13. Короленкова, Л.И. Диагностические ошибки в оценке степени цервикальных неоплазий /Л.И. Короленкова, Брюзгин В.В., Ермилова В.Д.// Сборник тезисов II научно-практической конференции «Современные научные направления и актуальные клинические вопросы в акушерстве и гинекологии» - М., 2011. - С. 45-46.
  14. Короленкова, Л.И. Диагностическое и прогностическое значение P16INK4a у больных с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями и микрокарциномой шейки матки. /Л.И. Короленкова// Технологии живых систем. 2011. Т.8, №4. С. 38-43.
  15. Короленкова, Л.И. Значимость расширенной кольпоскопии в морфологической верификации цервикальных интраэпителиальных неоплазий (СIN) и микрокарциномы шейки  матки. / Л.И.Короленкова, В.В. Брюзгин // Материалы XIII Российского Онкологического Конгресса. - М., 2009. - С. 222.
  16. Короленкова, Л.И. Зона трансформации шейки матки как объект канцерогенного действия вирусов папилломы человека при возникновении CIN и инвазивного рака отражение в клинике /Л.И. Короленкова, Ермилова В.Д.// Архив патологии. 2011. Т.73, №6. С. 33-37.
  17. Короленкова, Л.И. Изучение экспрессии MMP-2 и MMP-9 в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и микроинвазивном раке шейки матки как маркеров прогрессии и инвазии /Л.И. Короленкова, Е.В. Степанова, А.Ю. Барышников, В.Д. Ермилова, В.В.Брюзгин// Технологии живых систем. - 2012. Т.9, №3. С. 32-36.
  18. Короленкова, Л.И. Инвазивный рак шейки матки – упущенные возможности диагностики CIN /Л.И. Короленкова//  Онкогинекология. – 2012. – №2. – С.19-23.
  19. Короленкова, Л.И. Инсулиноподобные факторы роста в сыворотке крови больных CIN, микроинвазивным и инвазивным раком шейки матки как перспективные маркеры диагностики и прогрессии цервикальных неоплазий /Л.И. Короленкова,  Е.С. Герштейн, Е.К. Дворова, Д.Н. Кушлинский// Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2012. - №10. С. 21-25.
  20. Короленкова, Л.И. Исследование экспрессии е-кадгерина как биомаркера прогрессии цервикальных интраэпителиальных неоплазий /Л.И. Короленкова, Е.В. Степанова, В.Д. Ермилова, А.Ю. Барышников, В.В. Брюзгин// Вестник Московского Университета. Серия 2. Химия. 2012. - №4. - С. 272277.
  21. Короленкова, Л.И. Клетки рака в цервикальных мазках у беременных что делать? /Л.И. Короленкова, Брюзгин В.В.// Проблемы репродукции. Т. 17, №2. - 2011 . С. 94-98.
  22. Короленкова, Л.И. Клинические и морфогенетические основы предрака и ранних форм рака шейки матки / Л.И. Короленкова// Материалы XII Российского Онкологического Конгресса. - М., 2008. - С. 26-28.
  23. Короленкова, Л.И. Клинические и морфологические особенности тяжелых интраэпителиальных неоплазий, преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки при беременности /Л.И. Короленкова, В.В. Брюзгин// Проблемы репродукции. – 2011. - Специальный выпуск. - С. 208.
  24. Короленкова, Л.И. Клинические и технические особенности электрохирургической  конизации шейки матки у больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией III /Л.И. Короленкова// Акушерство и гинекология. 2012. - №3. С.54-60.
  25. Короленкова, Л.И. Комбинированное лечение дисплазий шейки матки тяжелой степени с применением иммуномодуляторов.  /Л.И. Короленкова// Российский аллергологический журнал. – 2012. – Т.1, №1. - С. 156-158.
  26. Короленкова, Л.И. Конизации шейки матки в амбулаторной практике у больных CIN тяжелой степени – как повысить эффективность операции. /Л.И. Короленкова// Материалы всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика – в эпицентре женского здоровья» - М, 2012. - С. 255-256.
  27. Короленкова, Л.И. Конизация в амбулаторном лечении больных тяжелыми цервикальными интраэпителиальными неоплазиями / Л.И. Короленкова, В.В. Брюзгин//  Сборник тезисов Всероссийского конгресса  «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты» - М., 2010. – С. 160-161.
  28. Короленкова, Л.И. Криогенное лечение цервикальных интраэпителиальных неоплазий легкой степени и фоновых заболеваний шейки матки при персистирующей ВПЧ-инфекции /Л.И. Короленкова// Сборник тезисов IV ежегодной научно-практической конференции с международным участием – М., 2010. - С. 44.
  29. Короленкова, Л.И. Микроинвазивный рак шейки матки: трудности диагностики, выбора метода лечения и ведения больных /Короленкова Л.И., Брюзгин В.В., Ермилова В.Д. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2009. – Т.20, №2 (76). – С. 67-68.
  30. Короленкова, Л.И. Молекулярно-биологическая характеристика внутриэпителиальных неоплазий шейки матки /Л.И. Короленкова, Е.В. Степанова, В.Д. Ермилова, А.Ю. Барышников, В.В. Брюзгин// Российский Биотерапевтический Журнал. – 2010. - №2. – С.53-54.
  31. Короленкова, Л.И. Молекулярно-биологические маркеры адгезии, утраты межклеточных связей, инвазии и неоангиогенеза, как факторы прогрессии цервикальных неоплазий и рака шейки матки /Л.И. Короленкова, Е.В. Степанова, А.Ю. Барышников// Российский Биотерапевтический журнал. 2011. - Т. 10, №2. С. 13-19.
  32. Короленкова, Л.И. Молекулярно-биологические маркеры пролиферации и апоптоза как факторы прогрессии цервикальных интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки /Л.И. Короленкова, Е.В.Степанова, А.Ю.Барышников// Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9, №.4 - С.11-16.
  33. Короленкова, Л.И. Объективные причины гиподиагностики степени эпителиальной неоплазии при предраке и ранних формах рака шейки матки /Л.И. Короленкова, Брюзгин В.В., Ермилова В.Д.// Тезисы первой конференции Общества специалистов-онкологов по опухолям репродуктивной системы. – М., 2011. - С. 37-38.
  34. Короленкова, Л.И. Предрак и ранние формы рака шейки матки у беременных. /Л.И. Короленкова// Тезисы первой конференции Общества специалистов-онкологов по опухолям репродуктивной системы. – М., 2011. - С. 37-38.
  35. Короленкова, Л.И. Предрак и ранние формы рака шейки матки: ошибки в диагностике степени неоплазии /Л.И. Короленкова// Проблемы репродукции. – 2012. – Спец. выпуск: тезисы VI международного конгресса по репродуктивной медицине. – С. 212.
  36. Короленкова, Л.И. Распространенные ошибки электрохирургической конизации у больных преинвазивным и микроинвазивным раком шейки матки /Л.И. Короленкова//  Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя» - М., 2011.– С. 328-330.
  37. Короленкова, Л.И. Растворимые дифференцировочные молекулы адаптивного иммунного ответа у больных CIN, микроинвазивным и инвазивным раком шейки матки  /Л.И. Короленкова, Е.В. Анисенкова,  А.А. Бабаев, В.В. Новиковым// Материалы глобального онкологического форума EAFO. – М., 2012 – С. 95.
  38. Короленкова, Л.И. Растворимые дифференцировочные молекулы адгезии (CD54, CD50, CD18) как отражение иммунных взаимодействий у больных CIN и раком шейки матки /Л.И. Короленкова, Е.В. Анисенкова,  А.А. Бабаев, В.В. Новиков// Российский Биотерапевтический Журнал. – 2012. – Т.11, №2. - С. 29.
  39. Короленкова, Л.И. Роль ВПЧ-тестирования методом гибридного захвата (Hybrid Capture 2) в оценке эффективности органосохраняющего лечения тяжелых интраэпителиальных неоплазий, преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки /Л.И. Короленкова// Вопросы онкологии. 2011. Т.57, №3. С. 322-326.
  40. Короленкова, Л.И. Снижение вирусной нагрузки Hybrid Capture II как результат эффективной предэксцизионной терапии аллокином-альфа у больных CIN2-3/преинвазивным раком шейки матки /Л.И. Короленкова, Брюзгин В.В.// Сборник тезисов II научно-практической конференции «Современные научные направления и актуальные клинические вопросы в акушерстве и гинекологии» - М., 2011. - С. 43-44.
  41. Короленкова, Л.И. Снижение вирусной нагрузки, определенной методом гибридного захвата (НС2 DNA HPV HR), у больных тяжелыми интраэпителиальными неоплазиями шейки матки как результат эффективной предэксцизионной  терапии Аллокином-альфа /Л.И. Короленкова//  Акушерство и гинекология 2012. Т.4, №2. С. 78-82.
  42. Короленкова, Л.И. Современные методы оценки эффективности лечения и прогноза исхода тяжелых интраэпителиальных неоплазий после конизаций шейки матки /Л.И. Короленкова// Сборник тезисов Всероссийского конгресса  «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты» - М., 2010. – С. 162-163.
  43. Короленкова, Л.И. Современный лечебно-диагностический алгоритм ведения больных преинвазивным и микроинвазивным раком шейки матки с использованием метода гибридного захвата Hybrid Capture 2 /Л.И. Короленкова, Брюзгин В.В.// Сборник тезисов XIV международного конгресса с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» - М., 2011. – С. 192-193.
  44. Короленкова, Л.И. Сочетание цервикальных эпителиальных неоплазий разной степени в процессе канцерогенеза - объективная причина диагностических ошибок при CIN и микроинвазивном раке шейки матки. /Л.И. Короленкова// Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2011. Т. 22, №1. С. 50-54.
  45. Короленкова, Л.И. Сравнительная оценка эффективности вирусологических методов обследования ВПЧ-инфицированных женщин с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями и микрокарциномой шейки матки (ПЦР и Hybrid Capture 2) / Л.И. Короленкова// Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя» - М.,2010. – С. 407-408.
  46. Короленкова, Л.И. Тяжелые цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN 2-3/ преинвазивный рак) и микрокарцинома шейки матки у беременных /Л.И. Короленкова, В.В. Брюзгин// Акушерство и гинекология. 2011. - Т.5. С.68-73.
  47. Короленкова, Л.И. Факторы прогноза развития и исхода тяжелых интраэпителиальных неоплазий шейки матки (CIN 2-3/CIS) /Л.И. Короленкова, В.В. Брюзгин// Проблемы репродукции. Специальный выпуск «IV Международный конгресс по репродуктивной медицине». - М., 2010. - С. 290-291.
  48. Короленкова, Л.И. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и микроинвазивный рак шейки матки – этапы единого процесса канцерогенеза, трудности клинической и морфологической диагностики /Л.И. Короленкова// Материалы X Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - М., 2009. - С. 331-332.
  49. Короленкова, Л.И. Экспрессия KI-67, тимидин фосфорилазы (ТФ) И PTEN в интраэпителиальных неоплазиях шейки матки /Л.И. Короленкова, Е.В. Степанова, В.Д. Ермилова, А.Ю. Барышников, В.В. Брюзгин// Вопросы онкологии. - 2011. - Т. 57, № 2. -  С. 199-203.
  50. Роговская, С.И. Новое в кольпоскопии /С.И. Роговская, Л.И.Короленкова, Н.М. Подзолкова, Г.Н. Минкина, Е.С. Акопова// Гинекология. 2011. Т.13, №6. С. 20-25.
  51. Скворцов, Д.А. Теломераза как потенциальный маркер для ранней диагностики рака шейки матки / Д.А. Скворцов, М.П. Рубцова, М.Э. Зверева, Л.И. Короленкова, Л.С. Павлова, Т.Л. Найденова, О.А. Донцова, Ф.Л. Киселев // Выставка инновационных проектов МГУ им. М.В. Ломоносова (сборник тезисов). - М., 2008. - С. 52.
  52. Kisseljov, F. Spliced hTERT RNA types and cervical cancer progression / F.Kisseljov, A.Petrenko, L. Korolenkova, D.Skvortsov, T.Naidenova, L. Pavlova // 25th International Papillomavirus Conference. Abstract book. – 2009. – Р. 18-22
  53. Korolenkova, L. Expression of molecular markers in CIN / L. Korolenkova, E. Stepanova, V. Ermilova, A. Barishnicov, V. Bryuzgin //  International Journal of Gynecological Cancer. – 2009. - Vol. 19, Supplement 2. - P. 845
  54. Korolenkova, L. Prognostic Value OF HPV-PCR and Digene Test in patients with cin and microinvasive cervical cancer / L. Korolenkova //  International Journal of Gynecological Cancer. – 2009. - Vol. 19, Supplement 2. - P. 745
  55. Korolenkova, L. Telomerase activity as potential marker for diagnosis and progression of CIN / L. Korolenkova, A. Petrenko, D. Skvorcov, M. Zvereva  // International Journal of Gynecological Cancer. – 2009. - Vol. 19, Supplement 2. - P. 846 
  56. Petrenko, A Cervical intraepithelial neoplasia: Telomerase activity and splice pattern of hTERT mRNA. /Petrenko A, Korolenkova L, Skvortsov D, Fedorova M, Skoblov M, Baranova A, Zvereva M, Rubtsova M, Kisseljov F// Biochimie. 2010. - Vol.92, №12. -  P. 1827-31.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.