WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

       

Юшковец Евгения Николаевна

Изучение эффекторных свойств белков γ-глобулиновой фракции плазмы крови, модифицированных  катионами меди и цинка

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

заведующий лабораторией

ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

доктор медицинских наук

Сергей Борисович Чекнёв.

Официальные оппоненты:

заведующий отделом

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии»

ФМБА России

доктор медицинских наук, профессор

Борис Владимирович Пинегин,

заведующий лабораторией

ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

доктор медицинских наук

Анатолий Петрович Суслов.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им.Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 21 декабря 2012 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.130.01 при ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России.

Автореферат разослан 14 ноября 2012 г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета

доктор медицинских наук,

  профессор  Е.В.Русакова 

ОБЩАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА  РАБОТЫ

Актуальность темы.

Известно, что катионы меди и цинка оказывают существенное влияние на основные процессы иммунопоэза и иммуногенеза.

Медь обеспечивает нормальное развитие миелоидного и лимфоидного ростков кроветворения, реализацию механизмов противоинфекционной защиты, регулирует фагоцитарную активность нейтрофилов и пролиферацию Т-лимфоцитов, влияет на синтез антител, продукцию цитокинов, определяет активность тимуса [Hopkins R.G., Failla M.L., 1997, 1999; Percival S.S., 1995, 1998]. Участие металла в иммунных реакциях во многом связано с его способностью ослаблять активацию фактора транскрипции NF kappa В и генерацию свободных радикалов, обеcпечивать транспорт железа.

Цинк обусловливает биологическую активность тимулина, контролирует ранние стадии созревания Т-лимфоцитов, апоптоз, играет важную роль в обеспечении выработки и рецепции иммуноактивных цитокинов, непосредственно участвует в основных иммунных реакциях [Bao B. et al., 2003; Carpentieri U. et al., 1988; Flynn, 1984; Hopkins R.G., Failla M.L., 1997; Lukasewycz O.A. et al., 1985; Percival S.S., 1995, 1998; Rink L., Kirchner H., 2000; Rink L., Haase H., 2007; Ventura M.T. et al, 1986].

Процессы обмена катионами цинка или меди между биомакромолекулами в окружении лимфоцита имеют большое значение для регуляции функции клетки, так как в ходе такого обмена содержание металла в примембранном пространстве может изменяться. Одновременно, связывающие или донорствующие металл белки будут претерпевать конформационные преобразования, что может сказываться на реализации их эффекторных функций в отношении клеток иммунной системы.

Работами лаборатории межклеточных взаимодействий НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи обнаружена способность катионов меди и цинка связываться с белками -глобулиновой фракции плазмы крови [Бабаева Е.Е. и др., 2006; Чекнёв С.Б. и др., 2006]. Установлено, что это связывание приводит к изменениям конформации белковой глобулы [Чекнёв С.Б. и др., 2005]. Получены первые указания на то, что преимущественным изменениям при этом подвергаются Fc фрагменты молекул антител [Чекнёв С.Б. и др., 2006, 2007]. В результате, меняется их взаимодействие с Fc рецепторами (FcR) на поверхности клеток, что приводит к изменению способности индуцировать выработку интерферона (ИФН). Эти изменения оказываются металлоспецифическими, а пул индуцируемого ИФН, по результатам биологического тестирования, характеризуется преимущественным содержанием ИФН- [Чекнёв С.Б. и др., 2008].

Поскольку выработка ИФН связана с индукцией каскада ассоциированных с ней иммуноактивных цитокинов, определяющих Th1/Th2 направленность иммунного ответа, изучение механизмов и оценка возможностей регуляции цитокинового каскада на уровне физиологических реакций, определяемых вектором транспорта и обмена катионов металлов в микроокружении лимфоцита, представляют не только теоретический, но и практический интерес.

С таких позиций эффекторные свойства белков -глобулиновой фракции плазмы крови, хелатирующих металлы из периглобулярного пространства, до сих пор не исследовались; закономерности выработки ИФН и ассоциированных цитокинов в условиях индукции -глобулинами, конформационно измененными связыванием катионов металлов, остаются не изученными.

Целью работы явилось: изучение конформационных преобразований белков -глобулиновой фракции плазмы крови при взаимодействии с катионами меди и цинка, получение образцов модифицированного металлом белка и оценка эффекторных функций трансформированных связыванием меди и цинка -глобулинов в индукции выработки основных иммуноактивных цитокинов.

Решались следующие задачи:

1. Изучить взаимодействие человеческого сывороточного -глобулина с катионами меди и цинка в растворе; оценить оптические эффекты связывания металлов с белками; определить параметры связывания.

2. Получить образцы человеческого сывороточного -глобулина, модифицированного связыванием катионов меди и цинка; оценить конформационное состояние белка.

3. Оценить антигенные характеристики металлокомплексов -глобулина в реакциях иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием низких концентраций образцов.

4. Оценить эффекторные свойства трансформированных металлами белков в отношении клеток периферической крови (КПК) человека, вырабатывающих ИФН-, ИФН-, интерлейкин-1 (ИЛ-1) и ИЛ-2.

Научная новизна исследования.

В работе впервые описаны конформационные преобразования человеческого сывороточного -глобулина, вызываемые связыванием катионов меди и цинка в умеренном молярном избытке металла по отношению к белку, оценены оптические эффекты взаимодействия -глобулина с катионами металлов в растворе, определены параметры связывания.

Получены оригинальные образцы человеческого сывороточного -глобулина, трансформированного связыванием катионов меди и цинка (в автореферате – БМКМ и БМКЦ). Оценено конформационное состояние полученных металлокомплексов.

В целях комплексного исследования конформационных преобразований и антигенных характеристик трансформированных связыванием катионов меди и цинка -глобулинов, в работе впервые использован метод ИФА на низких концентрациях образцов, позволяющий оценить динамику формирования монослоя белком, сорбирующимся на твердой фазе.

В клеточных системах обнаружено, что в пуле иммуноактивных цитокинов, вырабатываемых КПК человека в присутствии металлокомплексов -глобулина с цинком и медью, содержатся ИФН-,  ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-2. Катионы меди и цинка, связанные белками -глобулиновой фракции, определяют оппозитные свойства БМКМ и БМКЦ в индукции выработки КПК человека ИФН-, ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-2.

В работе впервые описана выработка КПК человека, индуцированными в режимах, близких к физиологическим, ранних (24 час инкубации клеток) ИФН- и ИЛ-2.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Процессы комплексообразования с катионами металлов могут служить важным фактором, определяющим и поддерживающим конформацию белков -глобулиновой фракции плазмы крови.

2. В результате хелатирования катионов меди и цинка -глобулины претерпевают металлоспецифические конформационные преобразования, которые преимущественно затрагивают Fc регионы молекул антител.

3. Модификация катионами металлов приводит к изменению эффекторных функций антител, реализующихся в индукции выработки основных иммуноактивных цитокинов.

4. Трансформированные связыванием катионов меди и цинка -глобулины оппозитно регулируют активность клеток; при этом белковый комплекс с медью смещает иммуногенез в направлении Th1.

Теоретическая значимость работы определяется получением данных о возможной локализации сайтов связывания металла в молекулах белков -глобулиновой фракции, об изменениях конформации и антигенных характеристик молекул антител, происходящих в результате хелатирования -глобулинами катионов металлов, которое может осуществляться в ходе нормального, физиологического обмена металлом между биомакромолекулами плазмы крови.

С использованием оригинальной технологии постановки реакций ИФА в работе доказано первичное изменение при связывании металла структуры Fc регионов молекул антител, что формирует основу проявления новых эффекторных свойств белков -глобулиновой фракции, реализующихся через семейство FcR в отношении экспрессирующих FcR клеток иммунной системы.

Реализация новых эффекторных свойств -глобулинов, трансформированных связыванием катионов металлов, металлоспецифически меняет содержание в пуле иммуноактивных цитокинов, индуцированных в присутствии металлокомплексов -глобулина, ИФН-, ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-2.

БМКМ и БМКЦ реципрокно регулируют выработку КПК человека ИФН-, ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-2.

В работе получены первые убедительные свидетельства возможности индукции в режимах, близких к физиологическим, выработки КПК человека ранних (24 час инкубации клеток) ИФН- и ИЛ-2.

Практическая значимость результатов состоит в экспериментальном подтверждении принципиальной возможности разработки алгоритмов для получения (путем модификации катионами металлов) иммуноглобулинов с заданными эффекторными функциями, реализующимися на базальных уровнях регуляции активности КПК человека и связанными с индукцией выработки в режимах, близких к физиологическим, цитокинов раннего ответа, значимых в последующей Th1/Th2 поляризации иммуногенеза.

В работе предложена и впервые применена для оценки конформационных преобразований Fc фрагментов молекул антител технология постановки реакций ИФА (прямой и «сэндвич» варианты) с использованием низких концентраций исследуемых образцов белка.

Внедрение полученных результатов.

По материалам исследования подготовлены методические рекомендации «Использование иммуноферментного анализа для оценки конформационных преобразований Fc фрагментов молекул антител». Утверждены на основании решения Совета по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России от 15 ноября 2011 г. (протокол №18).

Апробация работы.

Результаты исследования доложены на Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2009), VII конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии и интерферонов ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России 29 мая 2012 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 139 страницах, иллюстрирована  20 рисунками и таблицей, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (191 источник, из которых 62 отечественных и 129 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ  РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Для получения образцов -глобулина, трансформированного связыванием катионов меди и цинка (БМКМ и БМКЦ), использовали препарат человеческого сывороточного -глобулина (ICN) в 0.15 М растворе NaCl (рН 7.12-7.19) с концентрацией белка по навеске 100 мкг/мл. Освобожденные от крупных ассоциатов белка пропусканием через мембранные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм (Millipore) образцы инкубировали в течение 1 час при 37°С с осветленными (мембраны 0.22 мкм, Millipore) хлоридом цинка или водным сульфатом меди (Merc); концентрация металла составляла 0.25, 0.5 или 2.5 мкг/мл. В качестве контроля использовали образцы -глобулина, инкубированные в тех же условиях, но без солей указанных металлов.

По истечении срока инкубации образцы белков в объеме 7.0 или 10.0 мл двукратно (с промежуточным восстановлением в исходном объеме 0.15 М раствора NaCl) подвергали молекулярной ультрафильтрации на конусах CF-25 (Amicon) в режиме 300 g, 10-15 мин или в ячейках “Ultracel-30k” (Millipore) в режиме 1700 g, 5 мин, с умеренным охлаждением.

По окончании фракционирования супернатанты поднимали из конусов или ячеек, доводили до исходного объема 0.15 М раствором NaCl и (как на всех этапах исследования) анализировали спектрофотометрически в ультрафиолете (УФ) в диапазоне длин волн от 190 до 320 нм с шагом 10 нм, в полуавтоматическом режиме с использованием дифференцирующего спектрофотометра PU 8730 UV/VIS (Philips).

Определение концентрации белка и расчет молярных отношений в растворе осуществляли на основании результатов спектрофотометрического исследования при длине волны 280 нм (коэффициент экстинкции 0.7).

Кислотность растворов контролировали с помощью электронного рН-метра-иономера Эксперт-001 (Эконикс-Эксперт).

Количество связавшегося с -глобулином металла определяли, исходя из содержания свободных катионов в фильтрате, полученном при ультрацентрифугировании связавших металл белков.

Содержание свободного цинка оценивали реакцией комплексообразования с о-фенантролином (от 5.5х10-5 до 7.5х10-5 М) в 0.15 М растворе NaCl при нейтральном рН, с использованием спектрофотометрии при длине волны 226 нм. Содержание свободной меди оценивали реакцией комплексообразования с диэтилдитиокарбаматом натрия (10-3 М) в 0.15 М растворе NaCl при рН 9.0-9.2 с использованием спектрофотометрии при длине волны 440 нм.

Иммунохимическое исследование БМКМ и БМКЦ включало постановку прямого и «сэндвич» вариантов ИФА.

Анализ проводили с использованием меченных пероксидазой кроличьих анти-IgG (H+L) человека антител (Медгамал). В качестве субстрата применяли ортофенилендиамин (Sigma) – 0.05% раствор в 30 мМ цитратном буфере (pH-5.0), с перекисью водорода (4.0 мкл 30%-ной перекиси на 10 мл раствора). Учет результатов производили с использованием ELISA Processor II (Behring) при длине волны 450 нм.

В прямом варианте ИФА планшеты сенсибилизировали исследуемыми и контрольными образцами -глобулина в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 18 час при комнатной температуре. Места возможного неспецифического связывания антител блокировали раствором, содержавшим бычий сывороточный альбумин (Диа М) и 10%-ные тритон Х-100 или твин 80 (оба Serva) в PBS. Меченные пероксидазой анти-IgG (H+L) человека антитела применяли в разведении коммерческого препарата 1:1000.

В «сэндвич» варианте ИФА планшеты сенсибилизировали козьими анти-IgG (H+L) человека антителами (Медгамал), примененными в конечном разведении 1:500. Сорбцию антител на твердой фазе проводили в условиях, аналогичных прямому варианту ИФА. Исследуемые и контрольные образцы -глобулина наносили на содержавшую анти-IgG (H+L) человека антитела твердую фазу и инкубировали в принятом режиме. Разведение конъюгата составляло 1:250.

С учетом возможности изменения в растворах БМКМ и БМКЦ коэффициента экстинкции, разведения экспериментальных образцов для реакций ИФА, как и для всех последующих экспериментов, готовили на основании концентраций, определенных спектрофотометрическим исследованием контрольных белков. Концентрацию БМКМ и БМКЦ принимали как соответствующую таковой контрольного белка.

Правомерность использованного подхода определялась результатами предшествующих спектрофотометрических исследований контрольных и опытных образцов, в которых полученные данные уточняли применением методики определения белка по Брэдфорду [Чекнёв С.Б. и др., 2007].

Полученные препараты применяли в диапазоне низких концентраций белка – от 0.125 до 1.0 мкг/мл.

При использовании прямого варианта ИФА опыты сопровождали исследованием образцов нативного -глобулина. Их приготовление ограничивалось получением необходимой концентрации в 0.15 М растворе NaCl и последующим осветлением через мембранные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм (Millipore).

Индукцию ИФН и ассоциированных цитокинов проводили в суспензиях клеток лейкомассы или цельной периферической венозной крови (в работе применена общая аббревиатура – КПК), полученных от 16 здоровых доноров. Суспензии содержали 106 клеток в 1 мл полной питательной среды, приготовленной на основе среды Игла с двойным набором аминокислот и витаминов (ФГУП Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН), дополненной 2% плазмы донорской крови, L-глутамином, гентамицином и гепарином.

         Исследуемые образцы модифицированных и контрольных белков вносили в суспензию КПК до получения конечных концентраций 5.0; 0.5 и 0.05 мкг/мл или только 0.5 мкг/мл с последующим совместным инкубированием в течение 24 и 48 час или 24, 48 и 72 час при 37°С во влажной атмосфере, содержавшей 5% СО2.

Параллельно оценивали действие солевых растворов цинка (хлорид) и меди (водный сульфат, Merc) в 0.15 М NaCl, содержание катионов в которых соответствовало количеству металла, связавшегося с белком на стадии получения БМКМ и БМКЦ.

         В качестве стандартных индукторов выработки ИФН и ассоциированных цитокинов применяли вирус болезни Ньюкасла (ВБН, 10 ЦПД на клетку) и фитогемагглютинин Р (ФГА, Difco, 1.0 мкг/мл).

Титрование ИФН проводили на монослойной культуре диплоидных фибробластов эмбриона человека (получена из лаборатории клеточных культур Медико-генетического научного центра РАМН) против 1-10 ЦПД50 вируса энцефаломиокардита (ВЭМК) мышей. Исходная концентрация клеток составляла 2 х 105 в 1 мл суспензии.

За титр ИФН принимали последнее (максимальное) разведение содержащего ИФН супернатанта, обеспечивающее защиту 50% клеток от цитопатического действия ВЭМК.

В независимых экспериментах проводили оценку возможного прямого противовирусного действия исследуемых образцов.

Для определения кислотолабильности или стабильности ИФН содержащие ИФН супернатанты клеток, отобранные после 24 или 48 час инкубации КПК с исследуемыми образцами, подвергали обработке 20% HCl до получения рН-2.0 с последующей экспозицией в течение 24 час при 4°С и восстановлением рН до 7.2-7.4 добавлением 40% раствора NaOH. Далее проводили титрование ИФН. Контролем служила вторая часть отобранных супернатантов, не подвергавшаяся обработке кислотой и поддерживавшаяся в тех же экспериментальных условиях, что и опытная.

Постановку реакции нейтрализации ИФН проводили с использованием анти-ИФН- IgG антител (НПФ Интекор или ГИСК им.Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора).

К исследуемым пробам, содержавшим по 10 ЕД/мл активности ИФН, добавляли равный объем нейтрализующих антител в разведении от 1:800 до 1:3200 с последующей инкубацией в течение 2 час при 37°С. Затем проводили титрование ИФН.

В качестве контролей использовали: референс-препарат ИФН-  (НПФ Интекор) в дозе 10 ЕД/мл и исследуемые супернатанты с активностью ИФН 10 ЕД/мл, которые не подвергали обработке анти-ИФН- антителами.

Иммуноферментный анализ цитокинов.

Содержание ИФН-, ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-2 в супернатантах индуцированных КПК определяли методом ИФА с использованием ELISA Processor II (Behring). Наборы для ИФА (Протеиновый контур или ЗАО Вектор-Бест) применяли согласно инструкции фирмы-производителя, с дополнительными технологическими контролями.

Для того, чтобы убедиться в чувствительности и специфичности тест-систем (Протеиновый контур) при работе с предположительно низкими концентрациями ИФН- и ИФН-, наборы предварительно «калибровали» сериями двукратных последовательных разведений коммерческих препаратов (все – НПО Фермент) рекомбинантных человеческих ИФН-2b (реаферон), ИФН- (гаммаферон) и ИФН- (бетаферон, контроль специфичности), оттитрованных по биологической активности в стандартных условиях.

Содержание ИФН в коммерческих образцах доводили разведением исходного материала с определенной активностью до уровня реакции ИФА, соответствовавшего концентрации 15 пг/мл. Линейность полученной зависимости свидетельствовала о возможности использования наборов (Протеиновый контур) для определения ИФН в диапазоне концентраций, выходящих за пределы стандартной калибровки – меньших, чем 50 пг/мл.

В ходе основных экспериментов каждый образец полученных супернатантов тестировали в исходном состоянии и в разведении 1/10 или 1/20 питательной средой RPMI-1640 (Gibco). Каждое разведение каждого образца и всех использованных контролей экспериментальной системы (ВБН, ФГА, нативный -глобулин, спонтанная продукция) тестировали в 2-х или 3-х параллельных лунках микропланшетов.

Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием общепринятых методов вариационной статистики. Достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стъюдента.

Результаты исследования и их обсуждение.

Взаимодействие человеческого сывороточного -глобулина с катионами меди и цинка в растворе.

Особенности взаимодействия -глобулина с катионами меди и цинка в растворе и конформационное состояние модифицированного белка оценивали с использованием дифференциальной спектрофотометрии в УФ-свете (рис.1).

Как видно на рис.1, связывание белком катионов цинка вызывает изменения спектра поглощения -глобулина, проявляющиеся выраженной гипохромией на всем диапазоне измерения. Модификация -глобулина катионами меди вызывает гипохромию в коротковолновой (210-230 нм) и гиперхромию в длинноволновой (240-320 нм) области спектра поглощения (рис.1).

Анализ дифференциальных спектров, полученных отнесением показателей поглощения БМКЦ к оптической плотности раствора контрольного белка, позволяет установить, что наиболее выраженная гипохромия регистрируется в диапазоне длин волн 250-270 нм.

Дифференциальные спектры БМКМ и контрольного белка обнаруживают выраженную гиперхромию с пиком при 260 нм. При этом для БМКМ характерна гипсохромия спектра (сдвиг длинноволновой полосы поглощения с 280 нм в область более коротких волн – на 260 нм), которую рассматривают как следствие перемещения гидрофобных хромофоров из гидрофобной среды в белковой матрице в водную или солевую среду раствора [Мартин Р., 1966; Чанг Р., 1980].

Следовательно, трансформация -глобулина металлом способствует повышению степени упорядоченности внутриглобулярных структур молекулы белка. Вместе с тем, БМКЦ характеризуется компактизацией части внешних структур белковой глобулы, а БМКМ – развертыванием (экспонированием) во внемолекулярное пространство части скрытых в нативной конформации аминокислотных радикалов и углеводов.

Оценка параметров связывания катионов металлов -глобулином с использованием молекулярной ультрафильтрации позволила определить, что полученные белковые металлокомплексы содержали от 14 до 17 катионов цинка и от 6 до 8 катионов меди на молекулу белка. Константы связывания (порядка 105 М-1) описывают такое взаимодействие как неспецифическое.

Но даже в условиях такого относительно непрочного связывания, вследствие участия в хелатировании катионов частично экспонированных на поверхности глобулы олигосахаридов талии молекулы белка, значительное количество металла оказывается погруженным во внутриглобулярные компартменты шарнирной области [Чекнёв С.Б. и др., 2006]. 

Следовательно, в результате связывания катионов металлов белки  -глобулиновой фракции плазмы крови переходят в новое, динамично меняющееся конформационное состояние. Если при этом оказываются задействованными Fab фрагменты молекул антител, возможны изменения в протекании реакций антиген–антитело, а если структуры Fc региона – следует ожидать изменений в клеточных реакциях, замкнутых на активацию FcR.

Иммуноферментный анализ модифицированного катионами металлов  -глобулина на низких концентрациях образцов.

Для проверки предположения о преимущественном вовлечении в трансформацию металлом Fc регионов молекул антител в работе произведена постановка реакций ИФА с использованием низких концентраций БМКМ и БМКЦ. Мы полагали, что использование в ИФА низких концентраций образцов позволит описать динамику формирования монослоя на «чистой» и покрытой специфическими антителами твердой фазе, которая могла бы способствовать локализации первичных преобразований белковой глобулы, происходящих в результате трансформации молекулы связыванием катионов металлов.

Как видно на рис.2, в прямом варианте ИФА тенденция к насыщению твердофазного монослоя для всех контрольных образцов (точка перехода) отмечается при использовании -глобулина в дозе 0.5 мкг/мл.

У БМКЦ эта тенденция проявляется в динамике формирования монослоя раньше – при концентрации белка 0.25 мкг/мл (рис.2). БМКМ в использованном диапазоне концентраций заполняет, но не насыщает твердую фазу: зависимость интенсивности реакции со специфическими антителами на всем диапазоне остается практически линейной (рис.2).

В «сэндвич» варианте ИФА, как и в ходе прямой постановки, контрольные -глобулины обнаруживают тенденцию к насыщению активных центров сорбированных на твердой фазе антител при концентрации 0.5 мкг/мл; у БМКЦ эта тенденция проявляется раньше  –  в дозе 0.25 мкг/мл;


БМКМ в использованном диапазоне концентраций заполняет, но не насыщает сорбированный на твердой фазе монослой специфических антител.

Таким образом, динамика заполнения исследуемыми образцами белка монослоя сорбированных на твердой фазе антител против IgG (H+L) человека в «сэндвич» постановке практически полностью воспроизводит результаты прямого варианта ИФА (см. рис.2 и 3).

Полученные данные согласуются с результатами предшествующих исследований. Действительно, если цинк, как стабилизатор биомакромолекул и биомембран, стабилизирует молекулу белка в новом конформационном состоянии [Чекнёв С.Б., 2006; Чекнёв С.Б. и др., 2006, 2007], то такие белки, с конформационно более «жесткими» Fc и Fab фрагментами, должны испытывать стерические затруднения при формировании монослоя. И тогда насыщающей окажется меньшая концентрация -глобулина (см. рис.2 и 3). Медь, наоборот, может дестабилизировать Fc регион [Чекнёв С.Б. и др., 2006]; модифицированный ею -глобулин, с отчасти деструктурированным и измененным по степени поляризации Fc фрагментом, будет сорбироваться хуже, а для насыщения монослоя потребуется его значимо большая концентрация (см. рис.2 и 3).

Полученное полное «динамическое» соответствие результатов прямой и «сэндвич» постановок может возникать только на основе первичных преобразований, происходящих в Fc регионе.

Таким образом, правомерно ожидать, что в ходе физиологического хелатирования катионов меди или цинка и выраженной трансформации Fc регионов входящих в состав -глобулиновой фракции молекул антител, последние будут иначе распознаваться FcR клеток и запускать внутриклеточные сигнальные пути, не реализуемые в случае активации рецептора Fc фрагментом в его нативной конформации.

Обнаружение ИФН-, вырабатываемого в присутствии модифицированных медью и цинком -глобулинов.

Индукция и характеристика пула ИФН, вырабатываемого КПК в присутствии трансформированного связыванием катионов металлов -глобулина, показывают, что на ранние (24 час) сроки индукции в культуральной жидкости стимулированных КПК определяется, в среднем,  16-32 ЕД/мл ИФН.

Модификация -глобулина цинком приводит к снижению ИФН-индуцирующей активности белка по сравнению с катионами цинка и с контрольным -глобулином. Комплекс -глобулина с медью, наоборот, реализует более высокий потенциал: титры вырабатываемого в его присутствии ИФН  превышают показатели меди и контрольного белка. При этом БМКМ оказывается более активным, чем БМКЦ.

Оценка чувствительности ИФН к обработке кислотой обнаруживает присутствие во всех исследованных образцах кислотолабильной и стабильной составляющих. При этом пул раннего (24 час индукции) ИФН содержит до 60% кислотостабильной фракции и до 40% лабильного материала.

С целью установления типа индуцируемого ИФН проводили постановку реакции его нейтрализации с использованием антител к ИФН-. Обнаружено, что примененные антитела в разведениях от 1:800 до 1:3200 связывают и нейтрализуют ИФН, вырабатываемый в условиях индукции контрольными и опытными белками, а также  изолированно катионами меди и цинка (см.таблицу).

Определение типа ИФН, индуцированного образцами связавшего металл -глобулина,

в реакции нейтрализации анти-ИФН- антителами.

Образец ИФН

Разведение анти-ИФН- антител

1:400

1:800

1:1600

1:3200

Референс ИФН-

Референс ИФН- (стандарт антител)

После индукции: ВБН

  ФГА

После индукции: -глобулином

  -глобулином с цинком

  цинком

  -глобулином с медью

  медью

++++

+++

++++

++++

+++

++++

++++

±

±

±

+

+

++++

±

++++

++

++

++

++

++

++++

+++

+++

+++

+++

+++

Знаки в таблице – степень дегенерации клеток в инфицированной ВЭМК культуре.

Протективное действие ИФН-содержащих супернатантов в культуре клеток полностью отменяется при достижении эквивалентной концентрации нейтрализующих антител – 1:3200.

Потребность в высоких разведениях анти-ИФН- антител, позволяющих зарегистрировать эффект нейтрализации, определяется, по-видимому, относительной слабостью полученного ИФН, в сравнении с ИФН-, который содержится в коммерческих референс-препаратах.

Результат позволяет заключить, что в общем пуле ИФН, вырабатываемого в присутствии контрольных и конформационно измененных белков -глобулиновой фракции, присутствует не только ИФН-, как было показано ранее [Чекнёв С.Б. и др., 2008], но и ИФН-.

Применение ИФА подтверждает факт выработки ИФН-. Концентрация ИФН-, вырабатываемого на ранние сроки индукции, составляет до 60-90 пг/мл.

При этом результаты ИФА коррелируют с данными по биологической активности исследованного материала. БМКЦ индуцирует в 1.7 раза меньше ИФН-, чем контрольный белок, и в 2.0 раза меньше ИФН-, чем катионы цинка (рис.4). БМКМ в 1.2 раза более активен, чем контрольный белок, и в 1.3 раза – чем медь (рис.4). Корреляция с биологической активностью оценивается как сильная положительная.

Из этого следует, что наличие в пуле раннего ИФН, вырабатываемого в присутствии белков -глобулиновой фракции, ИФН- во многом определяет противовирусную активность образцов. А поскольку основные сигнальные пути, замкнутые на FcR клеток, ранее не считали связанными с механизмами индукции ИФН-, можно полагать, что в работе впервые описаны взаимодействия, обеспечивающие выработку ИФН- в присутствии белков -глобулиновой фракции плазмы крови.

Эти взаимодействия правомерно рассматривать с позиций физиологической иммунорегуляции, способствующей (за счет конформационных преобразований Fc регионов молекул антител и контроля таким образом внутриклеточной сигнализации, замкнутой на FcR) наведению и поддержанию в клетке определенного уровня антивирусного состояния.

Динамика выработки ИФН- и ИФН- в присутствии модифицированного металлом -глобулина.

Результаты исследования показывают, что на ранние (24 час) сроки индукции в общем пуле вырабатываемого ИФН, наряду с ИФН-, присутствует ИФН- (до 180 пг/мл). Как и в отношении ИФН-, модификация цинком ослабляет, а медью – усиливает реализацию ИФН-индуцирующих свойств связавшего металл -глобулина (рис.5). БМКМ в индукции  ИФН-  активнее  БМКЦ.  Эта  разница особенно заметна с учетом

различий в активности контрольных по меди и цинку белков (рис.5).

В динамике наблюдения выработка ИФН- и ИФН- КПК человека увеличивается. При этом на сроки индукции 48 час содержание ИФН- в образцах, индуцированных БМКМ, значимо не отличается от соответствующих контролей. В индукции ИФН-, а также в реализации противовирусного потенциала на 48 час пик активности БМКМ сохраняется.

Следовательно, несмотря на преимущественное содержание в общем пуле ИФН, вырабатываемого в условиях индукции металлокомплексами -глобулина, ИФН-, противовирусная активность материала определяется присутствующим в культуральной жидкости клеток ИФН-.

Оценка выработки цитокинов раннего ответа.

Полученные данные обнаруживают, что в общем пуле ранних цитокинов, ассоциированных с выработкой ИФН и вырабатываемых в примененной экспериментальной системе, содержится от 428.25±37.07 до 807.0±7.56 пг/мл ИЛ-1 (рис.6). БМКЦ индуцирует в 1.2 раза (р<0.01) больше ИЛ-1, чем контрольный -глобулин, и в 1.4 раза (р<0.001) больше ИЛ-1, чем примененные изолированно катионы цинка (рис.6). БМКМ в индукции раннего ИЛ-1 оказывается в 1.4 раза (р<0.1) слабее контрольного -глобулина и в 1.6 раза (р<0.01) слабее катионов меди, примененных изолированно (рис.6).

В отличие от описанных нами закономерностей индукции ИФН, металлокомплекс -глобулина с медью оказывается в 1.6 раза (р<0.001) менее активным, чем белок, трансформированный связыванием катионов цинка (рис.6). Далее, в условиях пролонгирования инкубации КПК до 72 час, и цинк, и медь снижают активность связывающего их -глобулина в индукции выработки ИЛ-1. Следовательно, в сопоставлении с контрольными белками, БМКМ и БМКЦ действуют на ранних сроках индукции оппозитно, а на поздних – сонаправленно.

Результаты исследования показывают, что в раннем (24 час индукции) пуле цитокинов, вырабатываемых в присутствии полученных образцов -глобулина, их белковых контролей, а также свободных катионов металлов, содержится от 1.3±0.05 до 2.9±0.33 пг/мл ИЛ-2 (рис.7). При этом спонтанная продукция цитокина КПК отсутствовала.

БМКЦ индуцирует в 1.4 раза (р<0.01) меньше ИЛ-2, чем контрольный -глобулин, и в 2.0 раза (р<0.01) меньше цитокина, чем катионы цинка, примененные изолированно (рис.7).

БМКМ в индукции раннего ИЛ-2 оказывается в 1.2 раза активнее контрольного -глобулина и в 1.3 раза (р<0.01) более активным, чем свободные катионы меди (рис.7). Одновременно, БМКМ индуцирует в  1.2 раза (р>0.1) больше ИЛ-2, чем БМКЦ (рис.7).

Именно такие закономерности регуляции характеризуют действие металлокомплексов -глобулина с цинком и медью в индукции выработки ранних ИФН- и ИФН-. Следовательно, выработка раннего ИЛ-2 регулируется механизмами, общими для него, ИФН- и ИФН-.

В целом, полученные в работе данные позволяют обоснованно предполагать, что физиологические процессы обмена катионов металлов, протекающие в примембранном пространстве лимфоцита с участием белков -глобулиновой фракции плазмы крови, поддерживают на базальном уровне совокупность регуляторных воздействий, замкнутых на активацию FcR, и одновременно – способны рационально ограничивать реализацию механизмов индукции.

ВЫВОДЫ

1. В работе получены образцы человеческого сывороточного -глобулина, модифицированного связыванием катионов меди и цинка в умеренном молярном избытке металла по отношению к белку. Связывание -глобулином цинка приводит к компактизации белковой глобулы; связывание меди – к повышению степени упорядоченности внутриглобулярных структур с одновременным развертыванием внешних участков глобулы во внемолекулярное пространство.

2.  Показано, что возникающее в результате связывания катионов металлов новое конформационное состояние -глобулина преимущественно затрагивает пространственную организацию Fc фрагментов молекул антител.

3. Установлено, что связывание катионов меди и цинка приводит к металлоспецифическому изменению индукции -глобулином выработки ИФН КПК человека. Модифицированный цинком белок обладает менее выраженной, а модифицированный медью – более выраженной ИФН-индуцирующей активностью, чем контрольный -глобулин.

4. Впервые показано, что пул ИФН, вырабатываемого в присутствии конформационно измененных белков -глобулиновой фракции, характеризуется содержанием значительных количеств ИФН-.

5. Определено, что присутствующий в индуцированном пуле цитокинов ИФН- появляется в культуральной жидкости КПК уже на ранние (24 час) сроки индукции. Трансформированный медью -глобулин оказывается при этом активнее белка, связавшего катионы цинка.

6. В присутствии металлокомплексов -глобулина обнаружена выработка КПК человека ИЛ-1 и ИЛ-2. Содержание ИЛ-1 в общем пуле вырабатываемых цитокинов достигает 840 пг/мл, содержание ИЛ-2 составляет до 5 пг/мл. 

7. Установлено, что ИЛ-2 продуцируется КПК человека уже на ранние (24 час) сроки индукции. Закономерности индукции ИЛ-2 в присутствии металлокомплексов -глобулина соответствуют эффектам, наблюдаемым в ходе выработки ИФН-. Модификация цинком снижает, а медью – усиливает реализацию способности -глобулина индуцировать выработку раннего ИЛ-2.

8. В отличие от ИФН- и ИЛ-2, выработка раннего (24 час инкубации клеток) ИЛ-1 усиливается -глобулином, трансформированным связыванием катионов цинка, и ослабляется в присутствии белка, модифицированного катионами меди.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Денисова Е.А., Юшковец Е.Н. Иммуноферментный анализ модифицированного катионами металлов -глобулина на низких концентрациях образцов // Росс. иммунол. журнал. – 2008. – Т.2(11), №1. – С.55-62.

2. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Юшковец Е.Н., Бабаянц А.А. Противовирусная составляющая в пуле интерферона, вырабатываемого в присутствии модифицированного катионами металлов -глобулина // Росс. иммунол. журнал. –  2008. – Т.2(11), №2-3. – С.137.

3. Чекнёв С.Б., Бабаянц А.А., Ефремова И.Е., Юшковец Е.Н., Денисова Е.А. Комплексная характеристика пула интерферона, вырабатываемого в присутствии белков -глобулиновой фракции плазмы крови // Сибирский медицинский журнал. – 2008. – Т.23, №3, вып.1. – С.123.

4. Чекнёв С.Б., Бабаянц А.А., Ефремова И.Е., Юшковец Е.Н. Обнаружение ИФН-, вырабатываемого в присутствии белков -глобулиновой фракции плазмы крови // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. – 2009. – Т.147, №5. – С.544-548.

5. Юшковец Е.Н., Ефремова И.Е., Бабаянц А.А., Чекнёв С.Б. Участие катионов меди и цинка в регуляции выработки интерферона (IFN) лейкоцитами человека // Мед. иммунология. – 2009. – Т.11, №4-5. – С.344.

6. Юшковец Е.Н., Ефремова И.Е., Бабаянц А.А., Чекнёв С.Б. Выработка пула раннего и позднего интерферона в условиях индукции белками гамма-глобулиновой фракции плазмы крови и взаимодействующими с ними катионами металлов // Вестник Уральской медиц. академич. науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. – 2009. – №2/1 (24). –С.66-67.

7. Юшковец Е.Н., Ефремова И.Е., Бабаянц А.А., Чекнёв С.Б. Динамика выработки интерферона- в условиях индукции белками -глобулиновой фракции плазмы крови, трансформированными катионами металлов // Росс. иммунол. журнал. – 2010. – Т.4(13), №1. – С.41-47.

8. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Писковская Л.С., Юшковец Е.Н., Бабаянц А.А. Определение IL-1, вырабатываемого клетками крови человека в присутствии белков -глобулиновой фракции и их металлокомплексов // Мед. иммунология. – 2010. – Т.12, №6. – С.497-502.

9. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Писковская Л.С., Мездрохина А.С., Юшковец Е.Н., Бабаянц А.А. Металлокомплексы человеческого сывороточного -глобулина индуцируют выработку раннего IL-2 // Росс. иммунол. журнал. – 2012. – Т.6(15), №2. – С.147-154.

10. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Писковская Л.С., Юшковец Е.Н., Бабаянц А.А. Выработка раннего ИЛ-1, индуцированного металлокомплексами человеческого сывороточного -глобулина // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. – 2012. – Т.154, №9. – С.326-329.

Список основных использованных сокращений.

БМКМ – белок, модифицированный катионами меди.

БМКЦ – белок, модифицированный катионами цинка.

ВБН – вирус болезни Ньюкасла.

ИЛ – интерлейкин.

ИФА – иммуноферментный анализ.

ИФН – интерферон.

КПК – клетки периферической крови.

УФ – ультрафиолет.

ФГА – фитогемагглютинин.

ЦПД – цитопатическая доза (вируса).

FcR – Fc рецептор.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность кандидату медицинских наук А.А.Бабаянц за обучение современным методам исследований, помощь в планировании и выполнении работы, ценные замечания и рекомендации, высказанные в ходе обсуждения результатов.

Автор благодарит научных сотрудников И.Е.Ефремову, Л.С.Писковскую, А.С.Мездрохину и М.А.Апресову за помощь в постановке отдельных экспериментов, обработке полученных данных и оформлении работы.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.