WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Глебездина Наталья Сергеевна

Исследование возможности индукции экстратимической дифференцировки   Т-лимфоцитов при беременности

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология 

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Екатеринбург - 2012

Работа выполнена в лаборатории иммунорегуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, г. Пермь

Научный руководитель:

Доктор биологических наук 

Куклина Елена Михайловна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, доцент, руководитель отделения иммунологии и микробиологии Екатеринбургского НИИ охраны материнства и младенчества

Чистякова Гузель Нуховна

Доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии, клинической фармакологии, с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Пермской государственной фармацевтической академии

Юшков Владимир Викторович

Ведущая организация:        ФГБУ "Главный научный центр Институт иммунологии" ФМБА России, г. Москва

Защита состоится «09»  ноября 2012 г. в 11-30 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 004.027.01 при ФГБУН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С.Ковалевской, д. 22/20).

Автореферат разослан «___» ____________ 2012 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских

и кандидатских диссертации при ФГБУН Институте

иммунологии и физиологии УрО РАН,

д.м.н., проф.                               И.А. Тузанкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Согласно традиционным представлениям, основные этапы созревания и дифференцировки αβТ-лимфоцитов осуществляются в тимусе. В процессе тимического развития Т-клеточные предшественники формируют антигенспецифичный рецептор (T Cell Receptor, TCR) и проходят процессы клональной селекции, обеспечивающие элиминацию аутореактивных клонов (Ярилин А.А. и др., 1991; Fehling H. J., von Boehmer H., 1997). В результате зрелые Т-лимфоциты, выходящие на периферию, способны эффективно выполнять функции иммунного надзора, а именно – распознавать и обеспечивать уничтожение чужеродных антигенов, не повреждая при этом собственных тканей.

Известно, что при некоторых физиологических и патологических состояниях, сопровождаемых атрофией тимуса, в организме активируется альтернативный путь дифференцировки – экстратимический, который затрагивает не только  γδТ-лимфоциты, традиционно созревающие вне тимуса (Robey E.A., Fowlkes B.J., 1998; Mincheva-Nilsson L. et al., 1997), но и Т-клетки (Rocha B. et al., 1995; Ibraghimov et al., 1995). Такой компенсаторный механизм имеет место при стрессе (Shimizu T. et al., 2000), аутоиммунных (Seki S. et al., 1991; Abo T., 2001) и некоторых инфекционных заболеваниях (Kadena T. et al., 1997; Lamontagne L. et al., 1997), а также в случае возрастных изменений (Ohteki T. et al., 1992). Логично предположить, что аналогичный механизм включается и при беременности, которая сопровождается существенной атрофией тимуса, выраженной в снижении его массы (Rijhsinghani A.G. et al., 1996) и клеточности (Rijhsinghani A.G., 1996; Shinomiya N. et al., 1991), главным образом за счет атрофии коркового слоя и истощения популяции кортикальных тимоцитов (Shinomiya N. et al., 1991). На возможность активации экстратимического развития Т-клеток в этот период указывает и тот факт, что отдельные факторы, ассоциированные с беременностью, в частности, онкостатин М (Boileau C. et al., 2000) или эстрогены в высокой дозе (Okuyama R., 1992), при экзогенном введении вызывают появление на периферии αβТ-клеток с незрелым фенотипом (CD4+CD8+) (Boileau C. et al., 2000) или с промежуточным уровнем экспрессии TCR, указывающим на их экстратимическое происхождение (Okuyama R., 1992).

Поскольку беременность, будучи феноменом естественной аллотрансплантации, требует наличия эффективных регуляторных механизмов для предупреждения возможных антифетальных иммунных реакций, и основная роль в этом процессе отводится локальному иммунитету, при исследовании экстратимического развития Т-лимфоцитов особый интерес представляла дифференцированная оценка этих процессов в зависимости от Т-клеточной локализации: в селезенке, периферической крови, лимфатических узлах, причем отдельно – в дренирующих матку и не дренирующих.

Цель работы: исследовать наличие процессов экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов при беременности у мышей, а также возможные механизмы их активации.

В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:

  1. Оценить возможность активации процессов дифференцировки Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах и тканях при беременности у мышей.
  2. Определить роль молекулы CD40 в индукции экспрессии ключевого маркера дифференцировки Т-лимфоцитов, рекомбиназы RAG-1.
  3. Сопоставить реактивность периферических Т-лимфоцитов различной локализации беременных мышей в отношении антигенов самца.

Научная новизна. Вопрос об активации экстратимического пути дифференцировки Т-лимфоцитов при беременности до сих пор никем не рассматривался, поэтому все полученные результаты являются новыми. В частности, впервые на основе экспрессии ключевого фактора реаранжировки, рекомбиназы RAG-1, а также маркера незрелых Т-клеточных предшественников, суррогатной -цепи TCR, показана возможность активации процессов дифференцировки в периферических Т-клетках беременных мышей, причем, данный процесс прослежен в динамике беременности и при разных вариантах скрещивания. Впервые выявлено появление при беременности у мышей нетипичной популяции CD40+Т-лимфоцитов. Впервые свойства и функции периферических Т-лимфоцитов беременных самок, в том числе их реактивность в отношении аллоантигенов самца, исследованы дифференцированно для Т-клеток различной локализации – спленоцитов, лейкоцитов, клеток разных типов лимфатических узлов.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе выявлен принципиально новый механизм регуляции иммунной системы при беременности у мышей, связанный с возможной индукцией альтернативного, экстратимического, пути дифференцировки Т-лимфоцитов. С одной стороны, данный феномен может вносить вклад в формирование толерантности материнского организма к чужеродному для нее (полуаллогенному) плоду – в том случае, если речь идет о развитии регуляторных Т-клеток. С другой стороны, учитывая отсутствие на периферии условий для эффективной клональной селекции, экстратимическая дифференцировка может быть причиной развития аутоиммунных патологий, которые часто провоцируются беременностью. Кроме того, согласно полученным данным, Т-лимфоциты лимфатических узлов, дренирующих матку, существенно отличаются по своим свойствам и функциям от Т-клеток других лимфатических узлов или селезенки, что указывает на необходимость новых, дифференцированных подходов к исследованию Т-клеточного звена при беременности.

Результаты работы изменяют существующие представления как о тимической дифференцировке, так и о механизмах формирования толерантности, в том числе при беременности, и найдут применение в биологии, а также в экспериментальной и практической медицине.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Физиологическая беременность сопровождается активацией экстратимической реаранжировки генов антигенного рецептора Т-лимфоцитов – ключевого события Т-клеточной дифференцировки, а также появлением на периферии незрелых Т-лимфоцитов, несущих суррогатную -цепь TCR. Данный процесс характерен, главным образом, для лимфатических узлов, дренирующих матку. Он выявляется, начиная с середины беременности, причем, как у нелинейных животных, так и у мышей линии CBA/J при разных вариантах скрещивания, моделирующих нормальную аллогенную и нормальную сингенную беременности, а также в склонной к аборту комбинации.
  2. Беременность у мышей ассоциирована с появлением в периферических лимфоидных органах Т-лимфоцитов, несущих на мембране нетипичную для них молекулу CD40. Локализация CD40-позитивной Т-клеточной субпопуляции аналогична локализации ключевого фактора и маркера реаранжировки генов TCR, рекомбиназы RAG-1, т.е. ограничена в основном лимфатическими узлами, дренирующими матку, однако непосредственного участия CD40 в активации экспрессии рекомбиназы не выявлено.
  3. Реактивность периферических Т-лимфоцитов беременных самок мышей  в отношении аллоантигенов самца также зависит от их локализации: Т-лимфоциты лимфатических узлов, дренирующих матку, отвечают на спленоциты самца достоверно эффективнее Т-клеток лимфоузлов других типов.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены, обсуждены на Региональной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии» (Пермь, 2006, 2007); 16 Европейском конгрессе по иммунологии (Париж, Франция, 2006); 2 Европейском конгрессе по иммунологии (Берлин, Германия, 2009); 12 Европейском конгрессе по иммунологии (Кобе, Япония, 2010);  IV Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010);  I Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011).

Основные результаты проведенных исследований представлены в 14 печатных работах, включая 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 13 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 207 наименований, среди которых 12 отечественных и 195 зарубежных источников.


содержание работы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на нелинейных и линейных мышах. Первый этап исследования проводился на самках мышей породы Swiss в разных стадиях беременности: на 4-5, 10-12 и 17-18 сутки (50 животных). Второй этап - на самках мышей линии CBA/J, которых скрещивали с самцами линий BALB/c, моделируя нормальную аллогенную беременность, с CBA/J - нормальную сингенную беременность, с  DBA/2 - комбинацию с повышенной частотой спонтанных абортов (Chaouat et al., 1983; Lin et al., 2004) (70 животных). Срок беременности у линейных животных составлял 9-10 суток. Первый гестационный день фиксировали по появлению вагинальной пробки. Из эксперимента животных выводили методом цервикальной дислокации.

Наряду с этим, исследовалась периферическая кровь (лейкоциты) женщин, имеющих разные сроки беременности – I, II или III триместр (35 женщин, средний возраст – 25,2 года). Контрольную группу составляли небеременные женщины репродуктивного возраста (10 женщин).

Объекты исследования. В работе использовали лимфоциты периферической крови, селезенки, тимуса и лимфатических узлов (отдельно дренирующих матку – парааортальных, и не дренирующих – подмышечных, мезентериальных и паховых (Chaouat et al., 1983; Lin et al., 2004)). Клетки лимфоидных органов выделяли гомогенизацией с последующим фильтрованием гомогената через капроновые сетки, лейкоциты – из гепаринизированной периферической крови (25 ед/мл) центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина («Биолот») (плотность - 1,077 г/см3). Для цитометрического анализа использовали нефракционированную клеточную суспензию, для оценки экспрессии мРНК – фракционированную: а именно, суспензию клеток, из которой удаляли В-лимфоциты, способные в норме реаранжировать цепи антигенного рецептора на периферии (Hikida M. et al., 1996). При этом клетки разделяли на поверхности пластика, нагруженной антителами к иммуноглобулинам мыши («Медгамал») или к В-клеточному маркеру CD19 («Caltag»). Далее в работе такая суспензия обозначена как «Т-лимфоциты». В дополнительной серии экспериментов проводилось непосредственное выделение αβТ-лимфоцитов из исходной (нефракционированной) суспензии с помощью иммуномагнитных бус («Invitrogen») в комплексе с биотинилированными моноклональными антителами хомяка HМ3600 или H57-597 («Caltag») к β-цепи αβТСR мыши, 62,5 мкг/мл, (далее - «αβТ-лимфоциты»). В этом случае из исследования наряду с В-клетками исключалась минорная популяция  Т-лимфоцитов, традиционно дифференцирующихся вне тимуса и также способных экспрессировать маркеры реаранжировки на периферии (Mincheva-Nilsson L. et al., 1997; Robey E.A., Fowlkes B.J., 1998).





Оценка наличия процессов экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов. Процессы дифференцировки в периферических лимфоидных органах выявляли по экспрессии в Т-клетках двух факторов – рекомбиназы RAG-1 (Recombination Activating Gene 1) и суррогатной α-цепи TCR (α-цепи пре-Т-клеточного рецептора, pre-TCRα).

Первый фактор, RAG-1, – маркер реаранжировки генов TCR, ключевого события Т-клеточной дифференцировки. Он участвует во всех основных этапах реаранжировки и регистрируется только в лимфоцитах и только в момент реаранжировки генов каждой из цепей антигенного рецептора (Turka L. et al., 1991). Второй фактор, суррогатная α-цепь TCR, – маркер незрелых αβТ-клеток. В норме pre-TCRα экспрессируется субпопуляцией ранних тимических предшественников до реаранжировки α-цепи и появления на мембране полноценного TCR (Bruno L. et al., 1995). Экспрессия обоих факторов оценивалась на уровне мРНК, а для RAG-1 – и на уровне белка.

Определение экспрессии мРНК. Анализ проводили методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции. В клетке оценивали наличие трех продуктов – мРНК RAG-1, pre-TCRα и β-актина (положительный контроль на наличие мРНК в пробе). Для анализа использовали фракционированные  Т-/αβТ-лимфоциты периферических лимфоидных органов, а также тимоциты (положительный контроль на наличие мРНК для RAG-1 и pre-TCRα).

Выделение РНК, обратную транскрипцию и амплификацию проводили с помощью соответствующих наборов («Лаборатория Изоген»): для выделения тотальной РНК (Trizol RNA Prep 100), для обратной транскрипции (GenePak RT Core) и для амплификации (GenePak PCR Core).

  В работе использовались следующие специфические праймеры и соответствующие режимы амплификации: для RAG-1 (431 bp) – 5’-CATCGAGACAGTCCCTTCC-3’ и 5’-CGATAGAGCCATCCCTTTC-3’ (Vaitatis G.M. et al., 2003; уточнение праймеров с помощью базы данных нуклеотидных последовательностей GENBANK и программы Primer3: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi), 92С30 с, 60С30 с, 72С60 с, 35 циклов; для pre-TCRα (750 bp) – 5’-ACACTGCTGGTAGATGGAAGG-3’ и 5’-CGAGCAGAAGCAGTTTGAAGAG-3’ (Corcoran L. et al., 2003), 92С30 с, 52С30 с, 72С60 с, 38 циклов; для β-актина (415 bp) –  5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3’ и 5’-TTTGATGTCACGCACGATTT-3’ (GENBANK и программа Primer3), 92С30 с, 60С30 с, 72С60 с, 30 циклов.

Электрофорез мРНК проводили стандартным методом в 1,5% геле агарозы («Serva») при напряжении 80 В. Для электрофореза использовался стандартный ТВЕ-буфер (буфер Трис (0,089 М), борная кислота (0,089 М), EDTA (0,0025 М)). Гель окрашивали бромистым этидием (концентрация – 10 мкг/мл). Документирование электрофореза осуществляли с помощью соответствующего пакета программ.

Определение экспрессии рекомбиназы RAG-1 на уровне белка. Экспрессию белка RAG-1 в Т-лимфоцитах оценивали проточной цитометрией по коэкспрессии RAG-1 и TCR в нефракционированной клеточной суспензии с помощью соответствующих моноклональных антител к TCR (ТСR·FITC («Invitrogen»)) и RAG-1 (anti-RAG-1 (H 300) («Santa Cruz Biotechnology»)) + anti-rabbit IgG·PE-Cy5.5 («Invitrogen»). Внутриклеточное окрашивание RAG-1 проводили с использованием набора фиксирующего/пермеабилизирующего буферов («Biolegend») в соответствии с рекомендациями производителя. Пробы анализировали на цитометре Becton Dickinson FACS-calibur, для обработки результатов использовали программу CellQuest («Becton Dickinson»).

Оценка роли молекулы CD40 в индукции экспрессии RAG-1 в периферических Т-лимфоцитах. Экспрессия мембранной молекулы CD40 на периферических Т-лимфоцитах оценивалась в нефракционированной клеточной суспензии проточной цитометрией с использованием моноклональных антител: анти-TCR·FITC («Invitrogen») и анти-CD40·PE («Caltag»). Одновременно оценивалась экспрессия внутриклеточного белка RAG-1 - с использованием указанных выше моноклональных антител. В ряде экспериментов для разделения клеточных конгломератов выделенные клетки перед проведением цитометрического анализа инкубировали в 0,5 мМ EDTA.

Наряду с этим, в ряде экспериментов фракционированные αβТ-лимфоциты инкубировали in vitro в течение 18 часов в присутствии моноклональных антител к CD40, меченых биотином («Caltag»), обеспечивая перекрестное связывание CD40 на мембране внесением в культуру стрептавидина («Caltag»). По окончании культивирования оценивали экспрессию RAG-1 в клетках.

Определение реактивности периферических Т-лимфоцитов беременных мышей в отношении антигенов самца. Оценка реактивности проводилась по пролиферативному ответу фракционированных αβТ-лимфоцитов лимфатических узлов беременных самок СBA/J (2х105 на пробу) на антигены самцов соответствующих линий – СBA/J, BALB/c, DBA/2, а также небеременных самок СBA/J, в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов. При этом стимулирующие клетки (2 х 104 на пробу) предварительно обрабатывали митомицином С (25 мкг/мл). Культивирование длилось 72 часа. Результаты оценивали в тесте с МТТ (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5)-diphenyltetrazolium bromide («Sigma»)), основанном на определении количества жизнеспособных клеток в пробе (Xi et al., 2005). Индекс стимуляции определялся как отношение соответствующих показателей оптической плотности для стимулированной  (Т-клетками самца) и не стимулированной проб.

Статистическая обработка. Анализ результатов проводили с помощью программ MS Excel и Statistica 5.0. Достоверность различий оценивали с помощью  t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ наличия процессов дифференцировки Т-клеток в центральных и периферических лимфоидных органах нелинейных животных. Показано, что у небеременных самок мышей породы Swiss экспрессия мРНК RAG-1 выявляется в тимоцитах, но отсутствует в Т-лимфоцитах, выделенных из лимфатических узлов как дренирующих матку, так и не дренирующих (рисунок 1).

Рисунок 1 – Экспрессия мРНК RAG-1 и pre-TCR Т-клетками тимуса и лимфатических узлов небеременных самок мышей Swiss

Примечание: ПА – парааортальные лимфатические узлы (дренирующие матку), ПМ – подмышечные, М – мезентериальные, П – паховые; β-актин – положительный контроль на наличие мРНК в пробе.

Эти данные закономерны и свидетельствуют о том, что в отсутствие беременности дифференцировка αβТ-лимфоцитов осуществляется только в центральных (тимус), но не в периферических лимфоидных органах.

Исследования, проведенные на мышах на ранней стадии беременности  (5-е сутки), показали, что у самок экспрессия мРНК RAG-1 выявляется в тимоцитах, но отсутствует в Т-клетках лимфатических узлов (рисунок 2). В середине беременности, на 11-е сутки, экспрессия мРНК RAG-1, наряду с тимусом, регистрировалась в парааортальных лимфатических узлах (в 70% случаев), а на 17-е сутки она выявлялась уже не только в дренирующих матку (в 60% случаев), но и в не дренирующих лимфатических узлах, в основном, подмышечных (в 60% случаев) (рисунок 2). Анализ экспрессии мРНК pre-TCRα выявил сходные закономерности (рисунок 3): отсутствие данного транскрипта в периферических Т-лимфоцитах на ранних этапах беременности и его появление, хотя и менее выраженное по сравнению с RAG-1, начиная с середины беременности – на 11-е сутки только в парааортальных лимфатических узлах (в 40% случаев), а на 17-е сутки – как в парааортальных (в 40% случаев), так и в подмышечных (в 20% случаев).

Беременные самки

5-е сутки беременности

11-е сутки

беременности

17-е сутки беременности

Тимус

ПМ

М

П

ПА

Тимус

ПМ

М

П

ПА

Тимус

ПМ

М

П

ПА

Рисунок 2 – Экспрессия мРНК RAG-1 Т-клетками тимуса и лимфатических узлов мышей Swiss на разных стадиях беременности

Примечание: обозначения те же, что и на рисунке 1.

Беременные самки

5-е сутки беременности

11-е сутки

беременности

17-е сутки беременности

Тимус

ПМ

М

П

ПА

Тимус

ПМ

М

ПА

Тимус

ПМ

П

ПА

Рисунок 3 – Экспрессия мРНК pre-TCR Т-клетками тимуса и лимфатических узлов мышей Swiss на разных стадиях беременности

Примечание: обозначения те же, что и на рисунке 1.

Согласно приведенным выше данным, начиная с середины беременности в периферических лимфоидных органах мышей могут активироваться процессы реаранжировки генов TCR, ключевого этапа Т-клеточной дифференцировки, а появление на периферии мРНК суррогатной -цепи TCR свидетельствует о том, что данный процесс, по крайней мере частично, связан с миграцией в лимфатические узлы тимоцитов, поскольку ни в зрелых Т-клетках, ни в костномозговых предшественниках этот маркер не экспрессируется (Bruno L. et al., 1995).

Экспрессия маркера реаранжировки генов TCR в Т-клетках центральных и периферических лимфоидных органов линейных животных.  Установлено, что в отличие от небеременных самок CBA/J, у которых экспрессия мРНК RAG-1 выявляется только в тимусе (рисунок 4), у беременных мышей уже на 9-е сутки гестации данный транскрипт определяется и в периферических Т-лимфоцитах – причем это характерно как для нормальной беременности (CBA/J x BALB/c, CBA/J x CBA/J), так и для склонной к аборту комбинации (CBA/J x DBA/2). Принципиальных различий между группами не выявлено: при всех вариантах скрещивания наиболее устойчиво экспрессия мРНК RAG-1 выявлялась в парааортальных лимфатических узлах (в 60-100% случаев) и, в гораздо меньшей степени, в подмышечных (~40%) и мезентериальных (~10%) (рисунок 5).

Аналогичные данные были получены и для популяции αβТ-лимфоцитов, выделенных из соответствующих лимфоузлов (рисунки 4, 5), так что возможность влияния на конечный результат В-лимфоцитов или γδТ-лимфоцитов, присутствующих в лимфатических узлах и в норме экспрессирующих белки RAG (Mincheva-Nilsson L. et al., 1997; Hikida M. et al., 1996), исключена.

Рисунок 4 – Экспрессия мРНК RAG-1 Т-/αβТ-клетками тимуса и лимфатических узлов небеременных самок СВА/J

Примечание: ПА – парааортальные лимфатические узлы (дренирующие матку), ПМ – подмышечные, М – мезентериальные.

Возвращаясь к результатам, полученные на мышах породы Swiss, можно сказать, что выявленные закономерности подтвердились и на линейных животных, причем, характер экспрессии мРНК RAG-1 не зависел от вариантов скрещивания. Последнее обстоятельство позволяет говорить о том, что данный процесс, несмотря на свою ограниченность, по-видимому, универсален, а также о том, что высокая частота спонтанных абортов в комбинации CBA/J x DBA/2 никак с ним не связана и имеет другие причины.

Рисунок 5 – Экспрессия мРНК RAG-1 Т-/αβТ-клетками тимуса и лимфатических узлов беременных мышей СВА/J 

Примечание: обозначения те же, что и на рисунке 4.

Роль молекулы CD40 в активации экспрессии рекомбиназы RAG-1 периферическими Т-лимфоцитами беременных мышей. Данные об активации экстратимической реаранжировки генов TCR при беременности подняли вопрос о том, какие факторы и механизмы участвуют в ее индукции. Наиболее вероятный кандидат на эту роль – мембранная молекула CD40: во-первых, в периферических В-лимфоцитах именно сигнал с молекулы CD40 запускает экспрессию рекомбиназ (Grewal I.S., Flavell R.A., 1998); во-вторых, у мышей линии NOD (Non Obese Diabetic), для которых характерно наличие процессов реаранжировки генов в периферических Т-лимфоцитах, до 60% периферических Т-клеток несут на мембране эту нетипичную для них молекулу (Waid D.M. et al., 2004). Поэтому следующим этапом работы было изучение экспрессии молекулы CD40 на Т-лимфоцитах периферических лимфоидных органов беременных мышей, а также возможного вклада данной молекулы в индукцию реаранжировки генов TCR.

Установлено, что у мышей Swiss, начиная со второй половины беременности в парааортальных лимфатических узлах, дренирующих матку, а также, в меньшей степени, в подмышечных лимфоузлах, регистрируется нетипичная популяция  Т-лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD40 (таблица 1). Размер данной популяции небольшой, однако, отличие принципиальное: у небеременных мышей она практически не выявляется.

Таблица 1 - Экспрессия молекулы CD40 αβТ-лимфоцитами периферических лимфоидных органов и тканей беременных мышей

Периферические органы/ ткани

Процент CD40+-клеток в популяции αβT-лимфоцитов

Небеременные мыши (n = 16)

Беременные мыши (n = 13)

Периферическая кровь

0,42 ± 0,08

0,47 ± 0,15

Селезенка

1,51 ± 0,23

3,05 ± 0,42

ПА

0,87 ± 0,15

5,33 ± 0,59*

ПМ

0,87 ± 0,08

3,55 ±0,46*

П

0,51 ± 0,06

0,76 ± 0,08

Примечание: обозначения те же, что и на рисунке 1.

* - p < 0,05 (в сопоставлении с соответствующим показателем для небеременных мышей).

Приведенные в таблице 1 данные получены для классического пула лимфоцитов (рисунок 6А, гейт R1). Однако, для парааортальных и подмышечных лимфатических узлов, а также для селезенки беременных мышей справа от классической популяции лимфоцитов регистрировалось дополнительное клеточное облако (рисунок 6А, гейт R2), размер которого составлял в среднем 16,4 ± 2,09 % от общего количества лимфоцитов для селезенки и 11,2 ± 1,60 % для лимфатических узлов. Анализ коэкспрессии СD40 и ТСR в этом неклассическом лимфоцитарном пуле (гейт R2) показал, что значительная часть Т-клеток несет молекулу CD40 (рисунок 6С).

Наиболее выражен данный показатель был в парааортальных лимфатических узлах – 35,80 ± 3,31 % ТСR+CD40+-клеток от общего числа Т-лимфоцитов, и несколько ниже – в селезенке (11,90 ± 2,23%) и подмышечных лимфатических узлах (23,60 ± 3,30%).

Учитывая, что наличие TCR+СD40+-объектов вне классического лимфоцитарного пула может быть связано с образованием конгломератов Т- и В-лимфоцитов, ряд экспериментов по оценке коэкспрессии на клетках СD40 и ТСR проводили в хелатирующих условиях (EDTA) и показали, что неклассическое лимфоцитарное облако при этом существенно не изменяется и процент CD40-позитивных Т-клеток в нем сохраняется на том же уровне: для парааортальных лимфоузлов размер популяции TCR+СD40+-клеток составлял 29,00 ± 3,92%, для подмышечных – 21,90 ± 4,64%.

Рисунок 6 - Коэкспрессия ТCR и CD40 различными субпопуляциями Т-клеток лимфатических узлов беременных мышей

Примечание: А – диаграмма распределения клеток лимфатических узлов по параметрам переднего и бокового светорассеяния, гейтом R1 выделен классический пул лимфоцитов, гейтом R2 – неклассическое облако лимфоцитов;

B – двухпараметрический график распределения клеток из классического лимфоцитарного пула (гейт R1) по уровню  экспрессии ТCR и CD40;

С – двухпараметрический график распределения клеток из неклассического облака лимфоцитов (гейт R2) по уровню  экспрессии ТCR и CD40.

Важно отметить, что экспрессия молекулы CD40 Т-лимфоцитами беременных мышей имела те же закономерности распределения, что и экспрессия рекомбиназы RAG-1 в этих клетках, как на уровне мРНК, показанное ранее, так и на уровне белка (рисунок 7): наиболее четко и воспроизводимо она выявлялась в парааортальных лимфатических узлах, дренирующих матку.

Рисунок 7 - Экспрессия белка RAG-1 αβТ-лимфоцитами периферических лимфоидных органов и тканей мышей при беременности

Примечание: незаштрихованные столбцы – небеременные животные, заштрихованные столбцы – беременные (10-11 сутки);

* - p < 0,05 (в сопоставлении с соответствующим показателем для небеременных мышей).

Анализ экспрессии рекомбиназы RAG-1 в периферических αβТ-лимфоцитах парааортальных лимфатических узлов в зависимости от наличия или отсутствия на мембране CD40 не выявил четких закономерностей: рекомбиназа выявлялась как в TCR+СD40+-клетках (5,40 ± 0,81 % RAG-1+-лимфоцитов от общего числа ТСR+CD40+-клеток), так и в классической, CD40-негативной популяции Т-лимфоцитов (3,90 ± 0,76 % RAG-1+-лимфоцитов от общего числа ТСR+CD40--клеток). Кроме того, перекрестное связывание CD40 на мембране T-клеток парааортальных лимфатических узлов in vitro не изменяло уровня RAG-1-позитивных клеток в культуре (таблица 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что CD40,  по-видимому, не играет ключевой роли в индукции экспрессии рекомбиназы в периферических Т-лимфоцитах.

Таблица 2 - Экспрессия белка RAG-1 фракционированными αβТ-лимфоцитами парааортальных лимфатических узлов беременных самок СВА/J (CBA/J х BALB/c) в 18-часовой культуре в ответ на перекрестное связывание CD40 на мембране

Экспериментальные условия

Процент RAG-1+- клеток (M ± m)

До культиви-рования (n = 8)

После культивирования

Без CD40-зависимой активации (n = 5)

На фоне CD40-зависимой активации (n = 5)

Интактная культура T-лимфоцитов

4,11 ± 0,68

3,63 ± 0,523

3,75 ± 0,538

В целом, мы показали присутствие при беременности в периферических лимфоидных органах мышей необычной популяции CD40-позитивных Т-лимфоцитов, которая по своей преимущественной локализации (в парааортальных лимфатических узлах, дренирующих матку) совпадает с экспрессией рекомбиназы RAG-1. Тем не менее, отсутствие прямой связи между экспрессией белка RAG-1 и наличием на мембране CD40 при их оценке на уровне одной клеточной системы свидетельствует о том, что CD40-зависимый сигнал, по-видимому, не играет ключевой роли в индукции рекомбиназы.

Экспрессия RAG-1 и CD40 Т-лимфоцитами периферической крови человека при беременности. Проведен анализ экспрессии RAG-1 и CD40 в отношении Т-клеток периферической крови беременных женщин, находящихся на разных сроках гестации. Исследования не выявили значимой экспрессии молекулы CD40 Т-лимфоцитами женщин, независимо от срока беременности (I, II или III триместры) – во всех случаях популяция CD40-позитивных клеток не превышала 1% от общего количества Т-лимфоцитов, как и у небеременных (таблица 3).

Таблица 3 - Экспрессия CD40  и RAG-1 αβТ-лимфоцитами периферической крови беременных женщин

Показатели

Небеременные

женщины

Беременные женщины, срок беременности

I триместр

II триместр

III триместр

Процент αβТCR+ CD40+- клеток от общего количества

αβТ-лимфоцитов,

M ± m

0,47 ± 0,061

(n = 10)

0,48 ± 0,036

(n = 8)

0,33 ± 0,048

(n = 5)

0,19 ± 0,011

(n = 12)

Процент αβТCR+ RAG-1+- клеток от общего количества

αβТ-лимфоцитов,

M ± m

0,65 ± 0,13

(n = 10)

-

0,56 ± 0,17

(n = 4)

1,42 ± 0,358

(n = 9)

Одновременная оценка экспрессии Т-лимфоцитами рекомбиназы RAG-1 показала аналогичные результаты: размер ТCR+RAG-1+-популяции даже в III триместре не превышал 1,5% (таблица 3).

Эти результаты согласуются с приведенными выше данными для мышей, у которых, несмотря на появление CD40+Т-лимфоцитов в лимфатических узлах и селезенке на поздних сроках беременности, в периферической крови заметных изменений не регистрировалось, что свидетельствует о локальном характере данного процесса.

Оценка реактивности периферических αβТ-лимфоцитов беременных самок в отношении антигенов самца. Процесс реаранжировки генов TCR на периферии теоретически должен сопровождаться формированием нового антигенного рецептора или изменением специфичности уже существующего (Куклина Е.М., 2006). В связи с этим, следующим этапом работы было сопоставление антигенраспознающей активности αβТ-лимфоцитов беременных мышей с таковой для небеременных при разных вариантах скрещивания – нормальном аллогенном, нормальном сингенном и в склонной к аборту комбинации.

Анализ пролиферативного ответа αβТ-лимфоцитов беременных самок СВА/J на антигены самцов соответствующих линий показал, что при нормальной беременности (и сингенной, и аллогенной) индекс пролиферации Т-клеток, определяемый как отношение показателей пролиферативной активности в стимулированной и нестимулированной пробах, выше, чем у небеременных животных (таблица 4), но зависит от происхождения Т-клеток – конкретно, от типа лимфоузлов, из которых они получены. Наиболее выраженным этот эффект был при нормальной аллогенной беременности (СВА/J × BALB/c) для Т-лимфоцитов парааортальных лимфатических узлов (дренирующих матку), существенно меньшим, но статистически значимым – для подмышечных, тогда как для Т-клеток мезентериальных лимфоузлов ответ на антигены самца не отличался от такового для небеременных самок СВА/J. Более того, достоверные различия в индексах пролиферации были выявлены и в пределах одной группы животных: ответ  Т-клеток у беременных самок СВА/J × BALB/c был выше в парааортальных лимфоузлах по сравнению с мезентериальными (таблица 4). В отличие от нормальной беременности, в комбинации СВА/J x DBA/2, характеризующейся высоким уровнем спонтанных абортов, ответа периферических Т-клеток на антигены самцов DBA/2 не выявлено (таблица 4).

В комбинации СВА x DBA/2, характеризующейся высоким уровнем спонтанных абортов, ответа периферических Т-клеток на антигены самцов DBA/2 не выявлено. Возможно, отсутствие ответа в данной модели и является одной из причин предрасположенности к абортам, поскольку, согласно современным представлениям, для успешной имплантации и плацентации необходим достаточный уровень иммунореактивности материнского организма в отношении отцовских и фетальных антигенов – цитокины, секретируемые в ходе иммунного ответа, оказывают трофическое действие на плаценту и плод (Wegmann et al., 1993).

Возвращаясь к данным, полученным на модели нормальной аллогенной беременности, важно отметить, что более активный ответ Т-лимфоцитов  парааортальных лимфоузлов, дренирующих матку, может быть связан не только с изменением специфичности Т-лимфоцитов, но и с примированием этих клеток антигенами плода в ходе беременности.

Таблица 4 - Пролиферативный ответ периферических αβТ-лимфоцитов самок СВА/J на антигены самца в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов

Отвечающие клетки

(αβТ-лимфоциты самки)

Индекс стимуляции (M ± m)

Стимулирующие клетки (спленоциты самца)

BALB/c

СВА/J

DBA/2

Небеременные самки СВА/J

ПА

1,47 ± 0,081

1,39 ± 0,089

1,37 ± 0,109

н.д.

1,19 ± 0,074

1,18 ± 0,062

1,21 ± 0,048

М

ПМ

Беременные самки

СВА/J × BALB/c

ПА

2,09 ± 0,222*

1,49 ± 0,124

1,69 ± 0,196*

М

ПМ

Беременные самки

СВА/J × CВА/J

ПА

1,72 ± 0,183

1,66 ± 0,178

1,46 ± 0,138

М

ПМ

Беременные самки

СВА/J × DBA/2

ПА

1,083 ± 0,042a b

1,11 ± 0,045 b

1,01 ± 0,035* ab

М

ПМ

Примечания: в каждой группе 8-10 животных; ПА – парааортальные лимфатические узлы (дренирующие матку), ПМ – подмышечные, М – мезентериальные; н.д. – нет данных;  индекс пролиферации определялся как отношение соответствующих показателей оптической плотности для стимулированной  (спленоцитами самца) и не стимулированной проб.

* - p < 0,05 (сопоставление с ответом Т-клеток соответствующих лимфатических узлов небеременных самок),

a - p < 0,05 (сопоставление с соответствующим показателем для беременности СВА/J x BALB/c),

b - p < 0,05 (сопоставление с соответствующим показателем для беременности СВА/J x СВА/J).

Чтобы нивелировать эффект примирования, был определен ответ  Т-лимфоцитов беременных самок СВА × BALB/c на спленоциты небеременных самок СВА. В результате выявлены следующие закономерности: индекс стимуляции Т-клеток парааортальных лимфатических узлов у этих животных был достоверно выше такового для Т-лимфоцитов мезентериальных лимфатических узлов, а также Т-лимфоцитов парааортальных лимфоузлов небеременных самок. Поскольку в данной модели возможность предварительного примирования Т-клеток существенно снижена, появление реактивности Т-лимфоцитов парааортальных лимфатических узлов в отношении собственных клеток связано, вероятнее всего, именно с изменением антигенраспознающего репертуара, в частности, с появлением новых аутореактивных Т-клеточных клонов.

В целом, на основе экспрессии маркера незрелых Т-клеточных предшественников, а также фактора реаранжировки генов TCR, мы показали наличие при беременности процессов экстратимической дифференцировки αβТ-лимфоцитов. Выявление этих процессов в лимфатических узлах имеет как минимум два логичных объяснения. Первое заключается в том, что незрелые тимоциты под действием тех или иных факторов, ассоциированных с беременностью, мигрируют в периферические лимфоидные органы и там завершают свое развитие. В пользу этого механизма говорит экспрессия в периферических Т-клетках pre-TCRα, которая в норме выявляется только в ранних тимических предшественниках (Bruno et al., 1995). Второй механизм предполагает активацию недавно открытого процесса, известного как «ревизия антигенного рецептора», при котором в зрелых периферических Т-лимфоцитах повторно индуцируются процессы реаранжировки цепей антигенного рецептора, сопровождающиеся формированием TCR с новой специфичностью (Куклина, 2006). Не исключено, что оба механизма вносят вклад в этот процесс. Что касается факторов, индуцирующих его, то эту роль могут играть уже упоминавшиеся ранее члены семейства интерлейкина 6 – ОМ (Boileau et al., 2000) и/или фактор, ингибирующий лейкемию (Leukemia Inhibitory Factor, LIF) (Shen et al., 1994), а также эстрогены (Okuyama et al., 1992), способные при экзогенном введении (Boileau et al., 2000; Okuyama et al., 1992) или в случае трансгенной экспрессии (Shen et al., 1994) активировать процессы экстратимической дифференцировки αβТ-клеток у мышей.

Обсуждая биологическое значение выявленного феномена, важно учитывать, что речь идет о беременности, которая, в силу экспрессии плодом чужеродных (отцовских) антигенов, предполагает включение сложных механизмов регуляции иммунной системы матери, предупреждающих реакции отторжения. Расшифровка этих механизмов на сегодняшний день не завершена. В этой связи особый интерес представляет выявленная в работе преимущественная активация процессов реаранжировки именно в лимфоузлах, дренирующих матку. Вероятнее всего, смысл такой активации заключается не просто в компенсации атрофических процессов, происходящих в этот период в тимусе, а в локальной коррекции антигенраспознающего репертуара Т-лимфоцитов, с учетом появления в организме новых антигенов – фетальных и плацентарных. Это предположение отчасти подтверждается данными по реактивности периферических Т-лимфоцитов беременных самок в отношении антигенов самца: пролиферативный ответ Т-клеток парааортальных лимфатических узлов, в которых как раз и регистрируется преимущественно экспрессия RAG-1 и pre-TCRα, в наших экспериментах был заметно выше, чем у Т-лимфоцитов лимфатических узлов других типов.

С одной стороны, активация процессов экстратимической дифференцировки αβТ-лимфоцитов при беременности может представлять собой новый, ранее неизвестный механизм формирования иммунной толерантности матери к плоду – в том случае, если такой реаранжировке подвергаются регуляторные клетки, реализующие в дальнейшем иммуносупрессивную активность, или же эффекторные Т-лимфоциты, которые под действием репродуктивных гормонов дифференцируются преимущественно в Th2 и продуцируют цитокины, оказывающие трофическое действие на плаценту.

С другой стороны, учитывая отсутствие на периферии условий для эффективной клональной селекции, дифференцировка αβТ-клеток вне тимуса может быть причиной развития аутоиммунных процессов в организме, которые часто провоцируются беременностью (Куклина, 2010).

ВЫВОДЫ

  1. У беременных самок мышей Swiss, начиная со второй половины беременности, в Т-лимфоцитах лимфатических узлов выявляется маркер незрелых тимических предшественников, а также ключевой фактор реаранжировки генов TCR, что свидетельствует об активации экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов; эти процессы идут преимущественно в дренирующих матку (парааортальных) лимфоузлах, но, в меньшей степени, и в не дренирующих (главным образом, в подмышечных).
  2. Беременность у самок линии СВА/J сопровождается активацией экспрессии маркера реаранжировки генов TCR, основного события тимической дифференцировки, в αβТ-лимфоцитах периферических лимфоидных органов, главным образом парааортальных лимфатических узлов; этот феномен регистрируется при разных вариантах скрещивания: CBA/J x BALB/c (нормальная аллогенная беременность), CBA/J x CBA/J (нормальная сингенная беременность) и CBA/J x DBA/2 (склонная к аборту комбинация).
  3. У беременных самок мышей Swiss регистрируется необычная популяция CD40-позитивных Т-лимфоцитов, появление ее совпадает по времени (вторая половина беременности) и по локализации (лимфатические узлы, дренирующие матку) с активацией процессов реаранжировки в Т-клетках.
  4. Анализ наличия процессов реаранжировки в Т-лимфоцитах в зависимости от экспрессии на мембране CD40, а также их индукции при ответе на CD40-зависимую активацию, указывает на отсутствие причинно-следственной связи между этими явлениями.
  5. Пролиферативный ответ αβТ-лимфоцитов беременных самок СВА/J на спленоциты самца наиболее выражен при нормальной аллогенной беременности (CBA/J x BALB/c), в меньшей степени при сингенной беременности  (CBA/J x CBA/J), и не выявляется в склонной к аборту комбинации  (CBA/J x DBA/2); при этом клетки лимфатических узлов, дренирующих матку, отвечают на антигены самца достоверно эффективнее, чем лимфоциты других типов лимфатических узлов, что совпадает с локализацией процессов реаранжировки в Т-лимфоцитах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Ширшев С.В. Экстратимическая реаранжировка генов антигенного рецептора αβТ-лимфоцитов при беременности / С.В. Ширшев, А.Ю. Максимов, О.А. Крапивина, Е.М. Куклина, Н.С. Глебездина (Паршакова) // Биохимия. - 2007. - Т.72, № 9. - С. 1207-1213.

2. Глебездина Н.С. Роль CD40-зависимого сигнала в индукции рекомбиназной активности в периферических Т-лимфоцитах при беременности / Н.С. Глебездина, Е.М. Куклина, С.В. Ширшев // Российский иммунологический журнал. - 2011. - Т.5 (14), № 2. - С. 133-137.

3. Куклина Е.М. Анализ реактивности периферических αβт- лимфоцитов беременных самок на антигены самца / Е.М. Куклина, С.В. Ширшев, Н.С. Глебездина // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 4/1 (38). - С. 127-128.

Публикации в других изданиях

4. Ширшев С.В. Исследование экстратимической дифференцировки
αβТ-лимфоцитов при беременности / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, О.А. Крапивина, Н.С. Глебездина (Паршакова) // Региональный конкурс РФФИ-Урал: результаты науч. исслед., получ. за 2005 г.: аннотац. отчеты. - 2006. - С. 203-204.

5. Ширшев С.В. Исследование экстратимической дифференцировки
αβТ-лимфоцитов при беременности / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, А.Ю. Максимов, О.А. Крапивина, Н.С. Глебездина (Паршакова) // Региональный конкурс РФФИ-Урал: Результаты науч. исслед., получ. за 2004 г.: аннотац. отчеты. - 2007. -
С. 224-226.

6. Shirshev S.V. Studying the extrathymic differentiation of alpha/beta
Т lymphocytes during pregnancy / S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, N.S. Glebezdina (Parshakova) // European Journal of Immunology. 16TH European Congress of Immunology. - 2006. - Abstr. - P. 223.

7. Ширшев С.В. Исследование экстратимической дифференцировки
αβТ-лимфоцитов при беременности / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, Н.С. Глебездина (Паршакова) // Медицинская иммунология. - 2006. - Т.8, № 2. - С.151-152.

8. Глебездина (Паршакова) Н.С. Исследование экспрессии рекомбиназ в периферических Т-лимфоцитах при беременности // Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии: материалы регион. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых 2006 и 2007 гг. - Пермь, 2007. - С. 228.

9. Глебездина (Паршакова) Н.С. Экстратимическая дифференцировка
Т-клеток при беременности у мышей. Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии: Материалы регион. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых 2006 и 2007 гг. - Пермь, 2007. - С. 230.

10. Shirshev S.V. Rearrangement of antigen receptor Genes in Peripheral
αβТ Lumphocytes during Pregnancy / S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, N.S. Glebezdina (Parshakova) // European Journal of Immunology: 2nd European Congress of Immunology. - 2009. - Abstr. - PC19/1.

11. Shirshev S.V. The Unusual CD40+ αβТ Lumphocyte Population as a Potential Target of extrathymic Differentiation in Pregnancy / S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, N.S. Glebezdina (Parshakova) // European Journal of Immunology: 2nd European Congress of Immunology. - 2009. - Abstr. - WS C19/10.

12. Shirshev S.V. Pregnancy is associated with the activation of extrathymic
T cell development / S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, N.S. Glebezdina (Parshakova) // International Immunology: 12ndEuropean Congress of Immunology. - 2010. - Abstr. - WS/PP-110-05.

13. Куклина Е.М. Беременность у мышей ассоциирована с появлением необычной популяции CD40+Т-лимфоцитов в периферических органах иммунной системы / Е.М. Куклина, Н.С. Глебездина // Российский иммунологический
журнал. - 2010. - Вып.4 (13), № 4. - С. 382-383.

14. Глебездина Н.С. Роль CD40-зависимого сигнала в экспрессии рекомбиназ в периферических Т-лимфоцитах при беременности / Н.С. Глебездина, Е.М. Куклина // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - Т.1, № 2/1 (35). - С. 26.

  Глебездина Наталья Сергеевна

Исследование возможности индукции экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов при беременности

Специальность 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология 

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Подписано в печать 02.10.2012. Формат 60×90/16.Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 1,0

Набор компьютерный.

Отпечатано в ФГБУН ИЭГМ УрО РАН

614081, Пермь, ул. Голева, 13






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.