WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Теплова Надежда Владимировна

Иммуномодулирующее действие клеточной аутотерапии при туберкулезе легких

14.03.03 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Томск – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук,                        Уразова

профессор                        Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, профессор

кафедры морфологии и общей патологии                        Хлусов

ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России        Игорь Альбертович

доктор медицинских наук, профессор,

заведующий лабораторией иммунофармакологии                Шерстобоев

ФГБУ НИИ фармакологии СО РАМН, г. Томска                Евгений Юрьевич

Ведущая организация: ФГБУ Новосибирский НИИ туберкулеза Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «____» __________2012 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «____» __________  2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета                                       И.В.Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. В настоящее время отмечается выраженная тенденция к росту числа распространенных деструктивных форм туберкулезной инфекции, характеризующихся тяжелым течением, склонностью к формированию множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) микобактерий туберкулеза к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП) и высоким процентом летальных исходов [Филинюк О. В., 2011; Jeon D. S. et al., 2011; Wells C. D., 2010].

Развитие и прогрессирующее течение туберкулеза во многом связывают с дефектом антигенспецифического иммунного Th1-ответа [Orme I. M., 2011; Jacobsen M. et al., 2010; Гунтупова Л. Д. и соавт., 2007]. В последние годы существенную роль в иммунопатогенезе туберкулеза легких (ТБЛ) отводят нарушению функциональной активности популяции антигенпрезентирующих клеток (АПК), основными представителями которой являются макрофаги и дендритные клетки (ДК). По современным представлениям, функция АПК заключается в распознавании и презентации антигена, а также поляризации специфического иммунного ответа и поддержании толерантности к аутоантигенам [Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., 2008; Steiman R. M., Banchereau J., 2007; Scott K. et al., 2005]. Изменение функциональных свойств макрофагов и ДК при туберкулёзной инфекции обусловлено прямым влиянием антигенов микобактерий и нарушениями цитокинового баланса в результате гиперпродукции Th2-ассоциированных и иммуносупрессорных цитокинов (IL-10, трансформирующего фактора роста (TGF) ) [Сахно Л. В., Черных Е. Р., 2012; Remoli M. E. et al., 2011; Горлова Е. Е., 2010; Щебляков Д. В. и соавт., 2010; Tourret M. et al., 2010; Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., 2008]. Следствием этого становится запуск каскада реакций, направленных на угнетение активности клеточного звена иммунного ответа, что приводит к формированию вторичной иммунологической недостаточности (ВИН) [He X. Y. et al., 2010; Darrasse-Jze G. et al., 2009; Verreck F. A. et al., 2004]. Признаки ВИН при ТБЛ выявляются как на ранних этапах развития заболевания, так и на фоне применения ПТП, что, несомненно, диктует необходимость включения мероприятий по иммунокоррекции в стандартную программу лечения больных ТБЛ [Васильева О. А. и соавт., 2010; Кононова Т. Е. и соавт., 2010; Пальцев М. А., 2004; Казимирский А. Н., 2003]. Однако практикуемое во фтизиатрии индивидуально необоснованное назначение иммуномодулирующих препаратов может оказывать не только позитивный иммуностимулирующий эффект, но и в ряде случаев прямо противоположное негативное действие. В связи с этим все чаще речь идет о назначении иммунотропных препаратов с учетом индивидуальной иммунореактивности пациента и курса ПТП, или, иными словами, – внедрении персонифицированных подходов к лечению [Новицкий В. В. и соавт., 2009; Vogiatzi P. et al., 2006].

Наиболее перспективным вариантом персонифицированного лечения ряда заболеваний (в том числе инфекционных) являются методы адоптивной терапии, которые основываются на стимуляции функциональных свойств иммунокомпетентных клеток путем устранения дефекта антигенпрезентирующей функции АПК и дефицита иммунорегуляторных цитокинов. Принцип этого вида иммуномодулирующей терапии заключается в переносе клеточно-опосредованного иммунного ответа на антиген при помощи живых иммунокомпетентных клеток или их субпопуляций, активированных in vitro [Guan H. et al., 2012; Mesiano G. et al., 2012; Alenzi F. G. et al., 2011; Shin J. H. et al., 2011; Banchereau A. K. et al, 2005; Розенберг С. А., 2002]. Данный подход оказался перспективным для индукции противоопухолевого иммунного ответа [RU №2392946; RU №2309753; RU №2262941; US №2348418; US №2634625].

Показано, что разрешенная к применению в клинической практике на территории Российской Федерации [разрешение ФС №2011/346 от 28.10.2011 г.; патент RU №2372936] медицинская технология «Аутогемотерапия на основе антиген-активированных дендритных клеток в лечении больных туберкулезом легких», основанная на реинфузии собственных (аутологичных) изолированных из крови мононуклеарных лейкоцитов после их «обучения» в присутствии антиген-активированных ДК и активации рекомбинантным IL-2 in vitro, оптимизирует лечение больных ТБЛ. Однако закономерно возникает вопрос о том, каковы же конкретные механизмы иммуномодулирующего действия клеточной аутотерапии при ТБЛ.

Цель исследования: выявить особенности и патогенетические факторы иммуномодулирующего эффекта реинфузии индуцированных in vitro аутологичных мононуклеарных лейкоцитов крови у больных туберкулезом легких.

Задачи исследования:

  1. Оценить CD-субпопуляционный состав, активность пролиферации и апоптоза лимфоцитов периферической крови и секреции цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IFN-) in vitro у больных с впервые выявленным инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких до и на фоне лечения.
  2. Выявить общие закономерности и особенности изменений CD-субпопуляционного состава, показателей пролиферации и апоптоза лимфоцитов крови и цитокиновой секреции in vitro у больных туберкулезом легких через 1,5 месяца после базовой химиотерапии и комплексного лечения с использованием клеточной аутотерапии.
  3. Охарактеризовать патогенетические факторы иммуномодулирующего эффекта курсовой реинфузии индуцированных in vitro аутологичных мононуклеарных лейкоцитов у больных туберкулезом легких.

Научная новизна исследования. Впервые у больных с различными клиническими формами (инфильтративный, диссеминированный) туберкулеза легких (ТБЛ) в зависимости от лекарственной чувствительности M. tuberculosis проведена оценка CD-субпопуляционного состава (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+/CD56+, CD19+), пролиферации и апоптоза лимфоцитов периферической крови и секреции цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IFN-) через 1,5 месяца лечения противотуберкулезными препаратами (ПТП) в комплексе с клеточной терапией изолированными из крови аутологичными мононуклеарными лейкоцитами после их «обучения» в присутствии антиген-активированных дендритных клеток (ДК) и активации рекомбинантным IL-2 in vitro.

Показано, что изменения CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови при диссеминированном и лекарственно-устойчивом ТБЛ сочетаются с активацией их апоптоза и проявляются дефицитом CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов и CD16+/CD56+ NK-клеток. Вместе с этим, при лекарственно-чувствительном ТБЛ дефицит CD8+ Т- и NK-клеток в крови формируется при сохранении равновесия апоптоза и пролиферации лимфоцитов. Выявлено, что дисбаланс секреции цитокинов in vitro у больных ТБЛ определяется спонтанной и индуцированной гиперпродукцией IL-6, IL-10, TNF- в условиях дефицита индуцированной секреции Th1-ассоциированных цитокинов – IL-2 и IFN-. На фоне базовой терапии, как без, так и в сочетании с клеточной аутотерапией, динамика показателей апоптоза лимфоцитов крови, секреции IL-6 и TNF- in vitro у больных ТБЛ носит сходный (отрицательный) характер. Между тем, снижение показателей апоптоза лимфоцитов крови у больных ТБЛ на фоне базовой химиотерапии сопряжено с уменьшением, а на фоне комплексной терапии – с увеличением абсолютного количества клеток в состоянии пролиферации. Кроме того, применение в течение 1,5 месяцев только базовой терапии ПТП при всех вариантах течения заболевания усугубляет дефицит индуцированной секреции in vitro IFN- при повышении спонтанной продукции противовоспалительных цитокинов с Th1-супрессорной активностью (IL-4 и IL-10). Применение же клеточной аутотерапии в комплексе с базовыми ПТП сопровождается восстановлением субпопуляционного состава Т-лимфоцитов крови (у больных диссеминированным и лекарственно-чувствительным ТБЛ) и показателей секреции in vitro IL-2, IL-10, IFN-, TNF- и IL-6. При этом у больных инфильтративным и лекарственно-устойчивым ТБЛ отмечается снижение (относительно нормальных значений) числа CD16+/CD56+ NK-клеток и (при инфильтративной и диссеминированной формах заболевания) CD19+ В-лимфоцитов.

В целом полученные данные свидетельствуют о том, что иммуномодулирующий эффект курсовой реинфузии аутологичных мононуклеарных лейкоцитов, индуцированных in vitro антиген-активированными ДК и рекомбинантным IL-2, у больных ТБЛ связан с восстановлением баланса секреции про- и противовоспалительных цитокинов, подавлением апоптоза и активацией пролиферации лимфоцитов крови, а также перераспределением их популяционного состава в направлении увеличения числа основных CD-субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+).

Практическое и теоретическое значение работы. В ходе исследования получены новые данные об особенностях и патогенетических факторах иммуномодулирующего действия реинфузий изолированных из крови больных ТБЛ аутологичных мононуклеарных лейкоцитов после их активации in vitro. Разработана схема комплексного лечения больных ТБЛ базовыми ПТП в сочетании с клеточной аутотерапией мононуклеарными лейкоцитами, индуцированными in vitro антиген-активированными ДК и рекомбинантным IL-2. Получен патент Российской Федерации на изобретение «Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза» (№2372936 от 20 ноября 2009 г.). Результаты оценки CD-популяционного состава, пролиферации и апоптоза лимфоцитов периферической крови и секреции про- и противовоспалительных цитокинов in vitro обосновывают иммуностимулирующий эффект клеточной аутотерапии на клеточное звено иммунного ответа у больных с различными клиническими формами ТБЛ (инфильтративный и диссеминированный) с лекарственной чувствительностью и устойчивостью возбудителя к ПТП и возможность ее использования в комплексе со специфической химиотерапией для оптимизации лечения больных ТБЛ.

Положения, выносимые на защиту:

  1. У больных туберкулезом легких (ТБЛ) гиперпродукция TNF-, IL-6, IL-10 и индуцированная гипосекреция IL-2 и IFN- мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro сочетаются с дефицитом Т-лимфоцитов (при диссеминированном и лекарственно-чувствительном ТБЛ) и NK-клеток в крови и увеличением числа лимфоцитов в состоянии апоптоза (при диссеминированном и лекарственно-резистентном ТБЛ). После 1,5 месяцев базовой химиотерапии без и в комплексе с клеточной аутотерапией у больных ТБЛ активность апоптоза лимфоцитов и секреции провоспалительного цитокина IL-6 in vitro снижается относительно исходного уровня, при этом в большей степени – при комплексном лечении.
  2. Применение на фоне стандартного лечения клеточной аутотерапии у больных ТБЛ обеспечивает восстановление секреции IL-2, IL-6, IL-10, TNF-, IFN-, субпопуляционного состава Т-клеток крови и повышение активности пролиферации лимфоцитов. Напротив, через 1,5 месяца только базовой химиотерапии у больных ТБЛ вне зависимости от клинической формы и лекарственной чувствительности возбудителя дефицит индуцированной секреции IFN- мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro усугубляется, подавляется спонтанная продукция TNF- при повышении базальной секреции цитокинов с Th1-супрессорной активностью (IL-4, IL-10) и уменьшении абсолютного количества лимфоцитов в состоянии пролиферации.
  3. В основе иммуномодулирующего эффекта реинфузии индуцированных in vitro аутологичных мононуклеарных лейкоцитов у больных ТБЛ лежит восстановление баланса секреции про- и противовоспалительных цитокинов с нормализацией продукции основных Th1-регуляторов – IL-2 и IFN-, подавление апоптоза и активация пролиферации лимфоцитов крови с перераспределением их популяционного состава в направлении увеличения численности Т-лимфоцитов.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на конференциях молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии – 2009» (Санкт-Петербург, 2009) и «II Архангельская международная медицинская научная конференция студентов и молодых учёных – 2009» (Архангельск, 2009), Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010), Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине – 2009» (Курск, 2009).

Исследования проведены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2013 годы» (ГК №16.512.11.2046 «Разработка комплекса молекулярно-генетических маркеров дизрегуляции иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis для оптимизации диагностики и коррекции вторичной иммунологической недостаточности при туберкулезе легких», руководитель – профессор О.И. Уразова) и РФФИ (11-04-98057-р «Разработка комплекса иммунодиагностических биомаркеров для оптимизации лечения больных туберкулезом легких», руководитель – профессор О.И. Уразова).

Внедрение. Результаты работы применяются в учебном процессе кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии, иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России для студентов лечебного, педиатрического и медико-биологического факультетов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1 патент.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 8 таблицами. Библиографический указатель включает 267 источников, из которых 128 отечественных и 139 зарубежных авторов.





Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в разработке идеи, дизайна и планировании исследования. Результаты достигнуты, проанализированы и обобщены в выводах и положениях лично автором.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика клинического материала

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 65 больных с впервые выявленным туберкулезом легких (ТБЛ) (54 мужчин и 11 женщин в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст – 42 года). Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной клинической туберкулёзной больнице (гл. врач – канд. мед. наук Г. В. Янова) во фтизиотерапевтических отделениях №1 (зав. отд. – О. И. Новосельцева), №2 (зав. отд. – Т. З. Малиновская).

Диагноз ТБЛ устанавливали на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты.

Инфильтративный туберкулез легких (ИТБЛ) был диагностирован у 53 (81,54%) пациентов и характеризовался на рентгенограмме наличием одной или нескольких неоднородных теней туберкулезного инфильтрата диаметром не более 4 см. Диссеминированный туберкулез (ДТБЛ) был выявлен у 12 (18,46%) больных, рентгенологическим признаком которого являлось наличие в легких мелких и среднеочаговых изменений неоднородной структуры ограниченной протяженности в пределах двух верхних долей легких.

Возбудитель туберкулеза выявлялся методом прямой световой микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю-Нильсену, а также методом люминесцентной микроскопии с использованием флуорохромов (аурамина). Бактериовыделение у больных ТБЛ регистрировалось в 100% случаев. Для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным химиопрепаратам (методом абсолютных концентраций) производили посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Исследования проводились в бактериологических лабораториях Томской областной туберкулезной клинической больницы (гл. врач – канд. мед. наук Г.В. Янова) и Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач – С. П. Мишустин).

Лекарственно-устойчивый ТБЛ был диагностирован у 20 (30,77%) пациентов, лекарственно-чувствительный – у 45 (69,23%).

Критериями исключения пациентов из исследования являлись: возраст менее 18 или более 55 лет; выраженный интоксикационный синдром; дефицит массы тела пациента более 30%; выраженная хроническая декомпенсированная сердечно-сосудистая, дыхательная, печеночная, почечная недостаточности; терминальное состояние больного; декомпенсированный сахарный диабет; злокачественные новообразования и заболевания крови; анемический синдром; психические расстройства; беременность; системные аутоиммунные заболевания; индивидуальная непереносимость компонентов клеточной аутогемотерапии, выявленная в процессе её проведения; отсутствие информированного согласия пациента и его отказ от участия в исследовании.

Согласно целям исследования все пациенты с ТБЛ были разделены на две группы (табл. 1).

Группы сравнивали между собой с учетом клинической формы ТБЛ и варианта чувствительности возбудителя к препаратам базовой терапии. Достоверных внутригрупповых различий исследуемых параметров у пациентов мужского и женского пола выявлено не было. Кроме того, сравнение проводили с группой здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту, не имеющих в анамнезе хронических инфекционных заболеваний, аллергических реакций, с частотой заболеваемости острыми респираторными вирусными и бактериальными инфекциями не чаще 2-3 раз в год.

Все пациенты с ТБЛ были обследованы до назначения терапии при поступлении на стационарное лечение, а также через 1,5 месяца с момента начала противотуберкулезной терапии, что соответствовало 2 неделям с момента окончания курса клеточной аутотерапии.

В течение 1,5 месяцев все пациенты получали стандартный курс терапии ПТП, заключающийся в однократном ежедневном приеме изониозида (300 мг/сутки), рифампицина (600 мг/сутки), пиразинамида (2000 мг/сутки), этамбурола (1200 мг/сутки) и стрептомицина (1000 мг/сутки).

Таблица 1

Распределение больных туберкулезом легких по группам исследования

Клинические формы туберкулеза легких (ТБЛ)

Больные ТБЛ, пролеченные по стандартной схеме химиотерапии

Больные ТБЛ, пролеченные по стандартной схеме химиотерапии с применением клеточной аутотерапии

Инфильтративный ТБЛ

24

29

Диссеминированный ТБЛ

5

7

По чувствительности возбудителя к ПТП

Лекарственно-чувствительный ТБЛ

21

24

Лекарственно-устойчивый ТБЛ

8

12

Через 1,5 месяца с момента начала лечения ПТП (группа сравнения) и сочетанного применения ПТП и клеточной аутотерапии (группа исследования) у всех обследованных пациентов с ТБЛ отмечалось уменьшение клинических проявлений болезни, более выраженное в случае комплексной терапии. Кашель сохранялся у 10 из 65 пациентов (15,38%) (у 7 в группе сравнения (24,14%) и у 3 в группе исследования (8,33%)), у 2 больных (3,08%) отмечалось выделение мокроты слизистого характера (у 1 в группе сравнения (3,44%) и у 1 в группе исследования (2,77%)). У всех пациентов наблюдалось купирование симптомов интоксикации, что проявлялось нормализацией температуры тела в 59 случаях (90,77%) (у 23 (79,31%) пациентов в группе сравнения и у 36 (100%) в группе исследования). Негативация мокроты (абациллирование) выявлялась у 25 из 65 человек (38,46%) (9 в группе сравнения (31,03%) и 16 в группе исследования (44,44%)). Умеренное бактериовыделение отмечалось в 32 случаях (49,23%) (15 в группе сравнения (51,72%) и 17 в группе исследования (47,22%)), обильное сохранялось у 8 больных (12,31%) (5 в группе сравнения (17,24%) и 3 в группе исследования (8,33%)). Данные рентгенологического обследования показали полное или почти полное закрытие полостей распада в 13 случаях (20,00%) (5 в группе сравнения (17,24%) и 8 в группе исследования (22,22%)), значительное уменьшение размеров полостных образований у 7 пациентов (10,77%) (1 в группе сравнения (3,45%) и 6 в группе исследования (16,67%)).

К осложнениям комплексной терапии можно отнести выявленное в ходе исследования повышение до фебрильных значений температуры тела в день реинфузии у 2 из 36 больных (5,56%). Прочих нежелательных эффектов на введение клеточной суспензии, которые могли бы повлечь за собой прекращение клинических испытаний, не было выявлено.

Исследования проведены в рамках договора о совместной деятельности №28 от 05.07.2008 г. между ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (на базе кафедр патофизиологии, пульмунологии и фтизиатрии и Центральной научно-исследовательской лаборатории),  ЗАО «Томские клеточные технологии» и ОГУЗ «Областная туберкулезная клиническая больница» г. Томска, согласно протоколу клинического исследования (дата утверждения – 15.04.2008 г.) и рекомендациям по проведению курса клеточной аутотерапии, изложенным в медицинской технологии «Аутогемотерапия на основе антиген-активированных дендритных клеток в лечении больных туберкулезом легких», разрешенной к практическому применению (ФС №2011/346 от 28.10.2011 г.). На проведение исследований получено положительное заключение локального комитета по этике №768 от 18.02.2008 г.

Материал исследования

Материалом исследования была периферическая венозная кровь и супернатанты культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов крови.

Забор крови для получения аутологичных мононуклеарных лейкоцитов крови, «обученных» и стимулированных в присутствии антиген-активированных дендритных клеток и рекомбинантного IL-2, а также для получения супернатантов культуры мононуклеарных лейкоцитов проводили в присутствии врача анестизиолога-реаниматолога до начала курса специфической противотуберкулезной терапии, утром натощак из локтевой вены в количестве 50 мл. Кровь стабилизировали гепарином 25 ЕД/мл. Для оценки субпопуляционного состава, пролиферации и апоптоза лимфоцитов, кровь забирали из локтевой вены в количестве 5 мл утром натощак и стабилизировали К2ЭДТА (1,5 мг/мл).

Методы исследования

  1. Культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с туберкулином и рекомбинантным IL-2 [RU № 2372936].
    • Выделение мононуклеарных лейкоцитов из цельной гепаринизированной венозной крови методом градиентного центрифугирования [Натвиг Дж. и соавт., 1980].
  • Подсчет и оценка жизнеспособности клеток [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].
  • Криоконсервация и хранение индуцированных аутологичных мононуклеарных лейкоцитов периферической крови [RU №2372936].

Протокол получения и хранения суспензии мононуклеарных лейкоцитов для проведения курса клеточной аутотерапии у больных ТБЛ является результатом совместной работы ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН (ГУ НИИКИ СО РАМН) г. Новосибирска и ЗАО «Томские клеточные технологии» на основании договора на создание научно-технической продукции №45 от 22.11.2007 г. (протокол утвержден на заседании ученого совета ГУ НИИКИ СО РАМН 25.12.2007 г.).

  1. Подготовка и обратное введение аутологичных мононуклеарных лейкоцитов [RU №2372936].
  2. Исследование количественного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови:
  • Определение общего количества лейкоцитов и подсчет лейкоцитарной формулы.
  • Определение количества CD3+, CD4+, CD8+, CD16+/CD56+, CD19+-лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии с использованием набора меченых моноклональных антител TriTEST («Becton Dickinson (BD)», США).
  1. Исследование цитокинсекреторной активности мононуклеарных  лейкоцитов периферической крови in vitro:
  • Культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro для получения супернатантов [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992; Хаитов Р. М. и соавт., 1995]. Для стимуляции клеток в пробы вносили туберкулин в дозе 500 ТЕ и фитогемагглютинин (ФГА, PHA) в дозе 30 мкг/мл (ООО ПанЭко, Москва).
  • Определение концентрации цитокинов в культуральных супернатантах методом проточной цитометрии с использованием системы CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit (BD Biosciense, США).
  1. Определение количества апоптотических и пролиферирующих лимфоцитов крови методом проточной цитометрии с использованием набора APO-BRDU Flow Kit (BD Biosciense, США).

Измерения производили на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), оборудованном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Анализ полученных данных осуществляли при помощи программого приложения: Multiset for Mac OS® X BD, CellQuest for Mac OS® X, Excel CBA 6- Beats Facs Array for Mac OS® X (BD Biosciense).

Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез. При анализе имеющихся выборок данных проверяли гипотезу о нормальности распределения (критерий Шапиро- Уилкса). Поскольку распределение выборочных данных отличалось от нормального, рассчитывали медиану М, первый и третий квартили Q1 и Q3. С целью попарного сравнения показателей в исследуемых группах применяли критерий Манна-Уитни для независимых групп. W-критерий Вилкоксона применяли для сравнения попарно связанных групп данных (например, для оценки разницы показателей одной и той же выборки в динамике). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05 [Harris M., Taylor G., 2004; Боровиков В. П., 2003; Лакин Г. Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Показатели CD-субпопуляционного состава, апоптоза и пролиферации лимфоцитов крови, секреции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro у больных с впервые выявленным туберкулезом легких до лечения

До лечения у больных с впервые выявленным диссеминированным туберкулезом легких (ДТБЛ) имело место снижение сравнительно с группой здоровых доноров относительного содержания CD3+ и CD8+ Т-лимфоцитов, абсолютного и относительного числа CD4+ Т-клеток. У пациентов с лекарственно-чувствительным туберкулезом легких (ЛЧТБЛ), наряду со снижением относительного содержания CD8+ Т-лимфоцитов в крови, обнаруживалось также понижение (равно как и при лекарственно-устойчивом туберкулезе легких (ЛУТБЛ)) абсолютного количества CD16+/CD56+ NK-клеток.

Одной из причин лимфоцитопении при ТБЛ является активация программы апоптоза вследствие прямого влияния M. tuberculosis на клетки иммунной системы, гиперактивации супрессорных (толерогенных) антигенпрезентирующих клеток, регуляторных Т-клеток (Treg) и цитотоксических лимфоцитов, а также воздействия цитокинового окружения, в частности сочетанного повышения концентрации во внеклеточной среде TNF- и IL-10 [Remoli M. E. et al., 2011; Wu K. et al., 2009; Тюлькова Т. Е. и соавт., 2008; Воронкова О. В. и соавт., 2007; Barrera S. et al., 2004].

Согласно результатам проведенного исследования, до лечения увеличение (по сравнению с нормой) абсолютного и относительного содержания апоптотических лимфоцитов в крови обнаруживалось у больных ДТБЛ. Аналогичные изменения выявлялись у пациентов с ЛУТБЛ (табл. 2). Однако при ЛЧТБЛ дефицит CD8+ Т- и NK-клеток в крови обнаруживался в условиях сбалансированности показателей апоптоза и пролиферации лимфоцитов.

При оценке цитокинопродукции in vitro у больных ТБЛ выявлялось повышение спонтанной и индуцированной секреции иммуносупрессорного IL-10 и (за исключением группы больных с инфильтративным туберкулезом легких (ИТБЛ) и ЛЧТБЛ в случае ФГА-индукции клеток) TNF-. Кроме того, при всех вариантах клинического течения ТБЛ независимо от чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (ПТП) значительно (в десятки раз) возрастала продукция in vitro IL-6 (табл. 3).

Таблица 2

Показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких до начала терапии, Mе (Q1-Q3)

Показатели

Здоровые доноры

Больные до лечения

Больные до лечения

ИТБЛ

ДТБЛ

ЛЧТБЛ

ЛУТБЛ

Количество апоптотических клеток, 103/л

228,00

(162,00-257,00)

247,00

(109,00-782,00)

680,50

(393,00-1056,50)

P1<0.05

246,00

(189,00-793,00)

341,00

(189,00-1082,00)

P1<0.05

Количество апоптотических клеток, %

17,23

(14,22-21,75)

21,92

(11,50-32,75)

44,45

(29,31-51,19) P1<0.05

18,28

(11,50-32,75)

27,66

(18,51-53,44)

P1<0.05

Примечание. Здесь и далее в табл.: Р1 – уровень статистической значимости различий по сравнению со здоровыми донорами; ИТБЛ – инфильтративный туберкулез легких, ДТБЛ – диссеминированный туберкулез легких, ЛЧТБЛ – лекарственно-чувствительный туберкулез легких, ЛУТБЛ – лекарственно-устойчивый туберкулез легких.

По данным литературы, негативный эффект сочетанного влияния IL-6, IL-10 и TNF- на АПК и Т-лимфоциты обусловлен их способностью ингибировать экспрессию молекул костимуляции и HLA на клетках, снижать продукцию ими IL-12, IL-2 и INF- и, как следствие, развитие иммунного Th1-ответа [Redford P. S. et al., 2011; Remoli M. E. et al., 2011; Barrera S. et al., 2004]. Вероятно, это и явилось одной из причин зафиксированного у больных ТБЛ до лечения дефицита индуцированной секреции Th1-ассоциированных цитокинов – IL-2 и IFN- – основных факторов роста и активации Т-лимфоцитов (табл. 3).

Таблица 3

Концентрация цитокинов в супернатантах культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов крови (пг/мл)

у больных туберкулезом легких до начала терапии, Me (Q1-Q3)

Показатели

Здоровые доноры

ИТБЛ

ДТБЛ

ЛЧТБЛ

ЛУТБЛ

INF-

ФГА

35,50 (20,10-65,60)

10,48 (6,70-15,40)

P1<0.05

10,10 (4,15-24,91)

P1<0.05

8,97 (6,49-17,60)

P1<0.05

11,93 (5,60-22,93)

P1<0.05

PPD

14,20 (10,10-18,40)

8,72 (3,00-16,85)

10,81 (3,60-21,36)

9,22 (5,10-16,83)

7,20 (4,55-15,29)

Спонтанная

13,10 (6,80-14,75)

10,70 (6,30-17,40)

11,18 (3,70-32,30)

10,70 (4,30-18,90

10,20 (5,36-17,40)

IL-2

ФГА

30,12

(19,43-43,70)

13,87 (9,60-18,20)

P1<0.05

13,90 (10,06-18,10)

P1<0.05

14,34 (10,10-20,55)

P1<0.05

16,30 (11,30-25,21)

P1<0.05

PPD

32,24

(18,50-45,10)

11,60 (9,15-16,75)

P1<0.05

16,10 (13,40-19,34)

P1<0.05

12,65 (9,80-17,00)

P1<0.05

13,15 (9,20-18,00)

P1<0.05

Спонтанная

12,02 (10,05-22,78)

15,20 (10,00-16,40)

18,50 (12,70-38,97)

15,50

(10,00-27,82)

14,02

(10,40-16,40)

TNF-

ФГА

93,11

(85,25-111,50)

75,50 (48,70-193,02)

180,53 (119,65-670,65)

P1<0.05

80,80 (31,96-87,88)

127,54 (95,92-168,50)

P1<0.05

PPD

61,25

(53,91-69,59)

76,66 (42,55-107,68)

192,75 (78,90-344,38)

P1<0.05

138,18 (64,47-199,12)

P1<0.05

90,77 (63,07-126,57)

P1<0.05

Спонтанная

40,62

(33,50-50,34)

57,00 (21,00-77,42)

171,91 (68,15-261,92)

P1<0.05

88,35 (53,95-227,77) P1<0.05

92,93 (54,85-234,30) P1<0.05

IL-6

ФГА

55,03

(32,50-120,00)

1403,70 (145,90-5000)

P1<0.05

3727,75 (331,01-5000)

P1<0.05

1147,17 (165,78-5000)

P1<0.05

4389,92 (133,10-5000)

P1<0.05

PPD

37,06

(24,50-59,03)

3330,57 (69,24-5000)

P1<0.05

3637,11 (105,73-5000)

P1<0.05

2126,65 (94,85-5000)

P1<0.05

1077,42 (82,91-2653,65)

P1<0.05

Спонтанная

27,50

(21,40-32,50)

2013,25 (42,97-5000)

P1<0.05

521,45 (130,00-5000)

P1<0.05

1363,70 (85,57-5000)

P1<0.05

1410,05 (39,39-3624,78)

P1<0.05

IL-10

ФГА

6,35

(4,60-9,71)

9,46 (5,80-15,40)

P1<0.05

12,45 (7,05-17,76)

P1<0.05

9,20 (5,75-31,15)

P1<0.05

11,38 (5,30-34,64)

P1<0.05

PPD

5,21

(3,03-7,51)

7,92 (5,00-16,77)

9,65 (6,48-12,75)

P1<0.05

9,00 (6,20-24,45)

P1<0.05

7,12 (5,60-13,11)

Спонтанная

4,00

(2,10-5,00)

7,00 (5,94-10,70)

P1<0.05

7,96 (7,49-8,52)

P1<0.05

7,89 (4,50-14,37)

P1<0.05

7,50 (5,60-19,55)

P1<0.05

Показатели CD-субпопуляционного состава, апоптоза и пролиферации лимфоцитов крови, секреции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro у больных впервые выявленным туберкулезом легких, пролеченных по стандартной схеме и с применением клеточной аутотерапии

Через 1,5 месяца лечения ПТП (группа сравнения) и ПТП в сочетании с клеточной аутотерапией (группа исследования) у больных ТБЛ обнаруживалось понижение  показателей апоптоза лимфоцитов крови и секреции in vitro IL-6 и TNF- (табл. 4, 6).

Доказано, что антигены M. tuberculosis способны оказывать прямое влияние на активацию синтеза IL-6 и TNF-, а также запускать программу гибели активированных иммунокомпетентных клеток [Сахно Л. В. и соавт., 2010; Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., 2008; Bhatt K., Salgame P., 2007]. Исходя из этого, вероятным фактором однонаправленных (в виде понижения) изменений этих показателей в обеих обследуемых группах могло быть уменьшение на фоне лечения антигенной нагрузки на организм.

Между тем, через 1,5 месяца комплексной терапии у больных инфильтративным и диссеминированным ТБЛ вне зависимости от лекарственной чувствительности возбудителя заболевания изменение соотношения лимфоцитов в состоянии апоптоза и пролиферации в направлении уменьшения количества апоптотических и увеличения доли пролиферирующих клеток (сравнительно с исходными их показателями) было более выраженным, чем у пациентов, получавших только стандартную противотуберкулезную терапию (табл. 4).

Таблица 4

Показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких на фоне базовой терапии без и в сочетании с клеточной аутотерапией, Me (Q1-Q3)

Группа сравнения

Группа исследования

Группа сравнения

Группа исследования

ИТБЛ

ДТБЛ

ИТБЛ

ДТБЛ

ЛЧТБЛ

ЛУТБЛ

ЛЧТБЛ

ЛУТБЛ

103

108,00

(53,00-162,00)

P1<0.05

P2<0.05

440,00

(58,00-570,00) P1<0.05

P2<0.05

51,00

(30,00-168,00)

P1<0.05

P2<0.05

60,50

(40,00-201,50)

P1<0.05

P2<0.05

P3<0.05

181,00

(33,00-215,00)

P1<0.05

P2<0.05

292,00

(8,00-893,00)

143,00

(132,00-149,00)

P1<0.05

P2<0.05

112,00

(60,00-217,00)

P1<0.05

P2<0.05

P3<0.05

%

10,59

(5,83-22,00)

P2<0.05

21,13

(11,74-33,02)

P2<0.05

4,90

(1,67-

10,00)

P1<0.05

P2<0.05

P3<0.05

6,00

(4,00-

18,29)  P1<0.05

P2<0.05

P3<0.05

20,59

(5,83-

28,13)

31,34

(11,74-51,63)

P1<0.05

4,20

(1,18-16,65)

P1<0.05

P2<0.05

P3<0.05

7,42

(4,58-18,78)

P1<0.05

P2<0.05

P3<0.05

Примечание. Здесь и далее в табл.: Р2 – уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями до лечения; Р3 – по сравнению с группой больных туберкулезом легких, пролеченных по стандартной схеме химиотерапии.

Рисунок 1. Абсолютное количество пролиферирующих (активированных) клеток у больных ТБЛ на фоне терапии ПТП без и в сочетании с клеточной аутотерапией

При этом у больных ИТБЛ и ЛУТБЛ, пролеченных с использованием клеточной аутотерапии, абсолютное количество пролиферирующих лимфоцитов после лечения повышалось, в то время как в группах сравнения проявляло тенденцию к снижению в сравнении с периодом до начала лечения и нормой (рис. 1).

Кроме того, на фоне базовой противотуберкулезной терапии показатели субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови претерпевали ещё более выраженные изменения. В частности, у больных ДТБЛ отмечалось снижение абсолютного количества CD3+ Т-лимфоцитов в 1,7 раза, а у больных ЛЧТБЛ – относительного содержания CD8+ Т-лимфоцитов в 1,6 раза относительно таковых в группе здоровых доноров.

Более выраженное понижение по сравнению с периодом до начала терапии у больных инфильтративным и диссеминированным ЛЧТБЛ и ЛУТБЛ претерпевали показатели ФГА- и туберкулин (PPD)-индуцированной секреции IFN-. Индуцированная секреция IL-2 in vitro через 1,5 месяца терапии ПТП у больных ТБЛ сохранялась ниже нормы, в то время как спонтанная секреция TNF- во всех обследованных группах резко снижалась не только в сравнении с периодом до лечения, но и группой здоровых доноров.

Спонтанная секреция противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 у больных ТБЛ после курса базовой терапии ПТП по сравнению с периодом до начала лечения, наоборот, увеличивалась. При этом в случае IL-4 она становилась выше нормы. Совместное повышение секреции указанных цитокинов на фоне базовой терапии может отражать одновременную активацию гуморального иммунитета и механизмов иммуносупрессии и быть одним из проявлений потенцирования базовыми ПТП ранее сформированного дефицита продукции Th1-ассоциированных цитокинов [Redford P. S. et al., 2011; Remoli M. E. et al., 2011; Ярилин А. А., 2010; Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., 2008].

При сочетании базовой химиотерапии с клеточной аутотерапией у больных ДТБЛ (в отличие от больных, пролеченных стандартным способом) содержание Т-лимфоцитов в периферической крови полностью нормализовалось при понижении абсолютного числа В-клеток. У больных ИТБЛ отмечалось понижение абсолютного и относительного содержания CD19+ В- и CD16+/CD56+ NK-лимфоцитов (табл. 5). При анализе данных в зависимости от лекарственной чувствительности возбудителя устанавливались сходные изменения. Так, у больных ЛЧТБЛ определялась нормализация относительного количества CD8+ Т-лимфоцитов (при отсутствии таковой на фоне применения только базовых ПТП), а у больных ЛЧТБЛ и ЛУТБЛ – еще более выраженное (чем до лечения и у больных, пролеченных без применения клеточной аутотерапии) снижение по сравнению с нормой абсолютного количества CD16+/CD56+ NK-клеток (табл. 5), вероятно, за счет перераспределения популяционного состава лимфоцитов в направлении увеличения количества Т-клеток вследствие нормализации показателей секреции Т-клеточных факторов роста и активации – IL-2 и IFN-.

Показатели секреции цитокинов in vitro при применении клеточной аутотерапии (табл. 6) у больных ТБЛ вне зависимости от чувствительности возбудителя к ПТП также (в отличие от группы больных, пролеченных только базовыми ПТП) практически полностью восстанавливались, за исключением индуцированной секреции TNF- (которая снижалась ниже нормы у больных ЛЧТБЛ при действии ФГА и у больных ЛУТБЛ при действии обоих индукторов). Та же закономерность отмечалась и в случае анализа цитокиновой секреции в зависимости от клинической формы заболевания, а именно, восстановление на фоне клеточной аутотерапии показателей индуцированной и спонтанной секреции IFN-, TNF- (за исключением больных ИТБЛ, у которых она понижалась), IL-2 и IL-10 и более отчетливая, нежели в отсутствие клеточной аутотерапии, тенденция к понижению показателей индуцированной и спонтанной секреции провоспалительного цитокина IL-6 с уменьшением их ниже нормы при инфильтративной форме ТБЛ (особенно при действии ФГА).

Регистрируемое на фоне комплексной терапии при всех вариантах течения ТБЛ снижение до нормы либо ниже её секреции TNF- и IL-6 (табл. 6), по-видимому, является фактором, препятствующим прогрессированию иммунного отклонения (immune deviation). Частным подтверждением этому является повышение после курса клеточной аутотерапии митоген (ФГА)- и антиген (PPD)-индуцированной продукции IFN- и IL-2 in vitro, которое позволяет судить о восстановлении активности T-клеточного звена иммунного ответа.

Таблица 5

CD-cубпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких на фоне терапии ПТП в сочетании с клеточной аутотерапией, Mе (Q1-Q3)

Показатели

Здоровые доноры

ИТБЛ

ДТБЛ

ЛЧТБЛ

ЛУТБЛ

CD3+

106/мл

1886,00

(1370,00-2402,00)

1580,00

(1169,00-2100,00)

1743,00

(954,00-1920,00)

1427,50

(906,00-2064,00)

1314,00

(870,00-2077,00)

%

77,55

(64,10-85,00)

80,50

(75  ,00-85,00)

P2<0.05

P3<0.05

73,00

(64,00-81,00)

P2<0.05

P3<0.05

76,00

(69,00-83,00)

79,00

(75,00-83,00)

P2<0.05

P3<0.05

CD4+

106/мл

930,00

(682,00-1292,00)

836,00

(660,00-1030,00)

873,50

(712,00-1118,00)

P2<0.05

P3<0.05

831,00

(565,00-1126,00)

855,00

(540,00-918,00)

%

47,00

(35,00-59,00)

47,00

(42,50-49,00)

51,00

(40,00-61,00)

P2<0.05

P3<0.05

47,00

(45,00-49,00)

P2<0.05

P3<0.05

45,00

(43,00-51,00)

P2<0.05

P3<0.05

CD8+

106/мл

673,00

(372,00-974,00)

468,00

(322,00-570,00)

354,00

(273,00-462,00)

464,50

(318,00-570,00)

463,00

(320,00-553,00)

%

30,00

(23,00-35,00)

30,50

(23,00-35,50)

P2<0.05

P3<0.05

22,00

(19,00-29,00)

P2<0.05

27,00

(25,00-33,00)

P2<0.05

P3<0.05

29,00

(27,00-35,00)

P2<0.05

Таким образом, механизм иммуномодулирующего действия комплексной терапии аутологичными мононуклеарными лейкоцитами, индуцированными в присутствии антиген-активированных дендритных клеток и рекомбинантного IL-2, связан с восстановлением баланса секреции основных про- и противовоспалительных цитокинов, подавлением апоптоза и активацией пролиферации лимфоцитов крови и перераспределением их популяционного состава в направлении увеличения числа основных CD-субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+), вследствие чего создаются условия цитокинового и клеточного микроокружения, благоприятные и необходимые для активации антигенпрезентирующей и микробицидной функций моноцитов/макрофагов. Наблюдаемый эффект может быть обусловлен высокой IFN--продуцирующей и цитотоксической активностью индуцированных мононуклеарных лимфоцитов (рис. 2), установленной в исследованиях in vitro [Романов В. В. и соавт., 2008; RU №2372936].

Рисунок 2. Патогенетические факторы иммуномодулирующего эффекта реинфузии индуцированных in vitro аутологичных мононуклеарных лейкоцитов крови (МНК) у больных туберкулезом на основании данных литературы и  результатов собственного исследования (в выделенных рамках).

ВЫВОДЫ

  1. У больных диссеминированным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких (ТБЛ) до начала противотуберкулезной терапии активация апоптоза лимфоцитов крови сочетается с изменениями их CD-субпопуляционного состава – дефицитом CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов (при диссеминированном ТБЛ) и абсолютного числа CD16+/CD56+ NK-клеток (при лекарственно-резистентном ТБЛ). При лекарственно-чувствительном ТБЛ дефицит CD8+ Т- и NK-клеток в крови формируется при сохранении баланса апоптоза и пролиферации лимфоцитов.
  2. Дисбаланс секреции цитокинов in vitro у больных инфильтративным и диссеминированным ТБЛ до лечения определяется гиперпродукцией TNF- (за исключением группы больных с инфильтративным ТБЛ), IL-6 и IL-10 в условиях дефицита индуцированной секреции Th1-ассоциированных цитокинов – IL-2 и IFN-.

Таблица 6

Концентрация цитокинов в супернатантах культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов крови (пг/мл) у больных туберкулезом легких на фоне терапии ПТП в сочетании с клеточной аутотерапией, Me (Q1-Q3)

Показатели

Здоровые доноры

ИТБЛ

ДТБЛ

ЛЧТБЛ

ЛУТБЛ

IFN-

ФГА

35,50 (20,10-65,60)

35,10 (17,40-69,30)

47,99 (14,95-79,06)

41,72 (17,40-100,70)

35,10 (19,30-60,87)

PPD

14,20 (10,10-18,40)

17,40 (10,00-43,94)

21,23(15,70-50,47)

18,70 (10,00-37,71)

17,39 (10,00-36,40)

Спонтанная

13,10 (6,80-14,75)

15,10 (10,42-20,32)

6,50 (4,62-20,97)

19,20 (6,50-22,76)

13,24 (10,65-19,10)

IL-2

ФГА

30,12 (19,43-43,70)

29,20 (15,00-43,80)

33,03 (21,50-43,01)

20,95 (15,30-33,95)

20,30 (15,43-43,80)

PPD

32,24(18,50- 10)

20,70 (16,60-33,65)

30,00 (17,65-43,80)

18,25(13,60-35,20)

20,70(17,20-37,30)

Спонтанная

12,02 (10,05-22,78)

18,20 (12,50-27,28)

20,00(10,50-39,10)

12,22 (9,50-25,40)

10,23(8,08-20,75)

TNF-

ФГА

93,11 (85,25-111,50)

44,72 (14,20-68,40)

P1<0.05

152,30 (56,45-410,27)

65,93 (14,20-73,30) P1<0.05

34,84 (17,35-70,77)

P1<0.05

PPD

61,25 (53,91-69,59)

27,61 (10,68-63,80)

P1<0.05

90,92 (29,40-157,80)

67,56 (30,20-130,30)

22,90 (10,68-54,01)

P1<0.05

Спонтанная

40,62 (33,50-50,34)

25,61(12,80-55,47)

25,70(10,68-63,31)

55,97 (24,68-134,80)

21,92(12,80-42,50)

IL-6

ФГА

55,03(32,50-120,00)

14,85 (4,20-44,15)

P1<0.05

173,45 (66,53-579,95)

P1<0.05

24,80 (9,35-78,60)

46,30 (5,86-99,94)

PPD

37,06 (24,50-59,03)

12,50 (3,60-61,90)

87,94 (32,40-206,37)

33,77 (6,60-117,45)

28,55 (7,20-66,77)

Спонтанная

27,50 (21,40-32,50)

11,60 (4,50-41,40)

214,68 (31,90-509,50)

P1<0.05

17,25 (8,11-92,80)

47,63 (9,90-100,86)

IL-10

ФГА

6,35 (4,60-8,01)

4,45 (3,40-7,80)

7,68 (4,10-11,08)

4,60(3,40-8,90)

4,75(4,00-10,94)

PPD

5,21 (3,03-6,21)

4,30(2,80-7,10)

4,89 (2,20-7,65)

5,10(3,00-8,10)

3,80(1,55-5,20)

Спонтанная

4,00 (2,10-5,00)

4,50(3,40-6,20)

4,90(3,60-7,70)

4,95 (3,40-6,40)

4,50(3,53-5,00)

IL-4

ФГА

10,20 (6,30-14,80)

8,00 (4,60-10,81)

9,43 (4,45-11,98)

7,80 (4,60-10,30)

8,55 (5,42-11,98)

PPD

8,20 (2,60-16,03)

7,30(3,50-9,30)

8,20 (3,75-13,47)

6,65(3,50-8,60)

8,30 (2,60-15,03)

Спонтанная

7,30 (4,58-8,31)

7,35(4,70-9,40)

7,48 (4,60-10,77)

7,34(4,60-9,65)

7,70(4,70-9,40)

  1. Динамика показателей апоптоза лимфоцитов крови, секреции IL-6 и TNF- in vitro у больных ТБЛ на фоне базовой терапии без и в сочетании с клеточной аутотерапией является сходной и проявляется их понижением сравнительно с периодом до лечения. В то же время, на фоне аутотерапии отмечается восстановление секреции противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10), активация пролиферации лимфоцитов крови с перераспределением их популяционного состава в направлении увеличения численности клеток, несущих CD-детерминанты Т-лимфоцитов.
  2. Через 1,5 месяца базовой терапии у больных ТБЛ вне зависимости от клинической формы и лекарственной чувствительности возбудителя дефицит индуцированной секреции in vitro IFN- усугубляется при повышении спонтанной продукции противовоспалительных цитокинов с Th1-супрессорной активностью (IL-4 и IL-10) и значительном угнетении спонтанной секреции TNF-. Продукция IL-2 in vitro при ФГА- и PPD-индукции и количество Т-лимфоцитов (при диссеминированной форме заболевания) сохраняются ниже нормы.
  3. Применение клеточной аутотерапии в комплексе с базовыми  противотуберкулезными препаратами через 1,5 месяца лечения сопровождается нормализацией субпопуляционного состава Т-лимфоцитов крови (при диссеминированном и лекарственно-чувствительном ТБЛ) при понижении относительно нормы количества CD16+/CD56+ NK-клеток (при инфильтративном и лекарственно-резистентном ТБЛ) и В-лимфоцитов (при инфильтративном и диссеминированном ТБЛ).
  4. Состояние цитокинопродукции у больных ТБЛ после курса клеточной аутотерапии характеризуется восстановлением показателей секреции in vitro IL-2, IL-10, IFN-, TNF- (спонтанной, а также индуцированной при диссеминированном ТБЛ) и IL-6 (за исключением группы больных диссеминированным ТБЛ).
  5. Снижение абсолютного и относительного числа апоптотических форм лимфоцитов крови у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым ТБЛ на фоне базовой химиотерапии сопряжено с уменьшением, а на фоне базовой химиотерапии в сочетании с клеточной аутотерапией – с увеличением абсолютного количества клеток в состоянии пролиферации.
  6. Иммуномодулирующий эффект комплексной терапии аутологичными мононуклеарными лейкоцитами, индуцированными in vitro антиген-активированными дендритными клетками, трансформированными из моноцитов крови, и рекомбинантным IL-2, связан с восстановлением баланса секреции основных про- и противовоспалительных цитокинов, подавлением апоптоза и активацией пролиферации лимфоцитов крови и перераспределением их популяционного состава в направлении увеличения числа основных CD-субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+).

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов у больных инфильтративным туберкулезом легких в зависимости от выраженности туберкулиновой реакции [текст] / А. Е. Колосова, Е. Г. Чурина, Н. В. Теплова, В. А. Серебрякова, Т. Е. Будкина // Актуальные вопросы инфекционной патологии – 2009: материалы научной конференции молодых ученых с международным участием, посвященной 90-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии СПбГМУ им. академика И.П. Павлова. – СПб., 2009. – С. 47.
  2. Модуляция противотуберкулезного иммунного ответа с помощью клеточной аутотерапии [текст] / Н. В. Теплова, Н. Л. Анкудович, Е. П. Степанова, С. А. Волгушев, И. В. Богдашин, Г. В. Янова, О. И. Уразова // Инновации в медицине 2009: материалы Второй международной дистанционной научной конференции и конкурса проектов. – Курск, 2009. – С. 179-180.
  3. Иммуномодулирующее действие клеточной аутотерапии у пациентов с лекарственно-устойчивым и лекарственно-чувствительным туберкулезом легких [текст] / Н. В. Теплова, Н. Л. Анкудович, Е. П. Степанова, С. А. Волгушев, И. В. Богдашин, Г. В. Янова, О. И. Уразова // Материалы II Архангельской международной научной медицинской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (AIMSC): Бюллетень СГМУ, Архангельск. – 2009. – С. 187-188.
  4. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у пациентов с инфильтративным и диссеминированным туберкулезом легких после курса клеточной аутотерапии [текст] / Н. В. Теплова, Е. П. Степанова., С. А. Волгушев, И. В. Богдашин, Г. В. Янова, О. И. Уразова // Российский аллергологический журнал. – 2010. – №5 ( 1). – C. 292-293. 
  5. Уровень сывороточного альфа-2-макроглобулина у больных туберкулезом легких с отрицательной реакцией Манту [текст] / Е. Г. Чурина, А. Е. Колосова, О. И. Уразова, Е. Л. Никулина, Н. В. Теплова // В мире научных открытий. – 2010. – № 4 (10), Ч. 14. – С. 97-99.
  6. Показатели апоптоза и пролиферативной активности лимфоцитов у больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью M. tuberculosis [текст] / Е. Г. Чурина, В. В. Новицкий, О. И. Уразова, О. В. Филинюк, Н. В. Теплова, И. Е. Есимова // Медицинская иммунология. – 2012. – Т. 14, №1-2. – С. 119-126.
  7. Патент на изобретение №2372936 Российской Федерации, МПК 7 A61K39/00, A61P31/06, C12N5/08. Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза / С. А. Волгушев, И. В. Богдашин, Н. В. Теплова, Н. Л. Ванчугова, Г. В. Третьяков, С. Н. Руднева; патентообладатель ЗАО «Томские клеточные технологии». – №2008119771/13; заявл. 19.05.2008; опубл. 20.11.2009, Бюл. № 32.

Список условных сокращений

АПК – антигенпрезентирующая клетка

ПТП – противотуберкулезные препараты

ВИН – вторичная иммунологическая недостаточность

ТБЛ – туберкулез легких

ДК – дендритные клетки

ТЕ – туберкулиновая единица

ДТБЛ – диссеминированный туберкулез легких

ФГА – фитогемагглютинин

ИТБЛ – инфильтративный туберкулез легких

СD – антигены кластеров дифференцировки

ЛУТБЛ – лекарственно-устойчивый туберкулез легких

IL – интерлейкин

ЛЧТБЛ – лекарственно-чувствительный туберкулез легких

PPD – туберкулин






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.