WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

СОБОЛЕВА ЛИЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ЛАМОТРИДЖИНА

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пятигорск - 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор фармацевтических наук, профессор,

Лазарян Джон Седракович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Коновалов Дмитрий Алексеевич,

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России,

профессор кафедры фармакогнозии

Козлова Виктория Вячеславовна,

кандидат фармацевтических наук,

ФГБУ Пятигорский ГНИИ

курортологии ФМБА России,

старший научный сотрудник отдела изучения механизмов действия физических факторов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГБОУ ВПО Пермская ГФА

Минздравсоцразвития России

Защита состоится «29» мая 2012г. в 1100 часов на заседании диссертационного совета Д.208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России» (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан         «_27_»  апреля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                                                 Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время эпилепсия является одной из наиболее актуальных проблем неврологии. Особенность лечения заключается в необходимости длительного (иногда многолетнего или пожизненного) ежедневного приема противоэпилептических препаратов. Как и все эффективные лекарственные средства, эти  препараты не лишены побочных эффектов: возможно негативное влияние как на нервную систему и психическую сферу, так и на внутренние органы. Следует иметь в виду, что все препараты, применяемые для лечения эпилепсии, в той или иной степени токсичны. Одним из широко применяемых препаратов этой группы считается ламотриджин. Данный препарат относится к новому поколению противоэпилептических средств. Ламотриджин применяют как в монотерапии, так и в комбинациях с другими противоэпилептическими средствами (фенитоин, фенобарбитал и др.). Наряду с положительным терапевтическим эффектом, ламотриджин в определенных условиях (при передозировке, злоупотреблении, повышенной чувствительности организма) оказывает токсическое действие на организм человека, в том числе с летальным исходом.

Анализ данных литературы свидетельствует о том, что не было проведено систематических исследований по изолированию, идентификации и количественному определению ламотриджина в биологических объектах; отсутствует схема химико-токсикологического анализа ламотриджина, позволяющая надежно идентифицировать отравления ламотриджином.

В связи с этим комплексное исследование по разработке методик изолирования, идентификации и количественного определения ламотриджина в биологических объектах является актуальной задачей.

Целью исследования является разработка схемы химико-токсикологического исследования ламотриджина в биологических объектах (кровь, моча, печень, почки) с помощью современных физико-химических методов.

Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

  • Разработать методику изолирования ламотриджина из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки);
  • Разработать методики идентификации ламотриджина в извлечениях из биологических объектов;
  • Разработать методики количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов;
  • Предложить схему химико-токсикологического анализа ламотриджина при отравлениях;
  • Апробировать разработанные методики изолирования, идентификации и количественного определения на лабораторных животных (крысах).

Научная новизна работы. Определены оптимальные условия экстракции ламотриджина из водных растворов. С помощью метода математического планирования эксперимента – «латинский квадрат» изучали одновременное влияние на процесс жидкость-жидкостной экстракции ламотриджина четырёх факторов (природы органического растворителя, значения рН среды, наличия электролитов и продолжительности экстракции). Установлено, что на процесс изолирования ламотриджина методом жидкость-жидкостной экстракции влияют значение рН среды, природа органического растворителя и наличие электролита.

Найдены оптимальные условия для изолирования ламотриджина из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки). Разработаны методики идентификации ламотриджина в извлечениях из биологических объектов с помощью современных физико-химических методов (ТСХ, ВЭЖХ и ГХ/МС) и химических реакций (хромогенные и микрокристаллоскопические). Разработаны методики количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических жидкостей  и внутренних органов трупа с помощью методов ВЭЖХ и ГХ, позволяющие обнаружить изучаемое лекарственное вещество с относительным стандартным отклонением для всех исследуемых биологических объектов не превышающим 10,2%.

Предложенные методики изолирования, идентификации и количественного определения ламотриджина были апробированы на лабораторных животных (крысах) при введении им терапевтических и токсических доз лекарственного препарата, тем самым показано определение ламотриджина в биологических жидкостях и органах животных при отравлении.

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования

Разработаны методики химико-токсикологического анализа ламотриджина. Обосновано применение этих методик в практике химико-токсикологических лабораторий, что позволит достоверно диагностировать факт отравления ламотриджином и оценить его степень.

По результатам исследования утверждено РИО ФГУ «РЦСМЭ» Минздравсоцразвития России информационное письмо «Определение ламотриджина в биологических объектах при проведении химико-токсикологического и судебно-химического анализа» и рекомендовано к использованию в химико-токсикологических лабораториях.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 62-й, 64-й, 65-й и 66-й конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» г. Пятигорск (2007-2011 гг).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту:

  • Результаты поиска оптимальных условий изолирования ламотриджина из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки).
  • Результаты применения разработанных методик на модельных смесях для идентификации и количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических жидкостей (крови, мочи) и внутренних органов трупа (печень, почки) с помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, ГХ/МС) и химических реакций (хромогенные и микрокристаллоскопические).
  • Схема химико-токсикологического исследования ламотриджина в биологических объектах и результаты апробации разработанных методик на лабораторных животных (крысах).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 99 страницах и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы. В тексте содержится 33 таблицы и 24 рисунка. Список цитируемой литературы включает 109 источников, из них 41 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

  1. Разработка методик изолирования ламотриджина из биологических объектов

Изучение оптимальных условий экстракции ламотриджина из водных растворов

Одним из основных этапов в разработке методик изолирования лекарственных веществ из биологических объектов является моделирование этих процессов на водных растворах. С помощью метода математического планирования эксперимента – «латинский квадрат» изучали одновременное влияние на процесс жидкость-жидкостной экстракции ламотриджина четырёх факторов: природы органического растворителя (А), значения рН буферного раствора (В), наличия электролитов (С) и продолжительности экстракции в минутах (Д). Каждый из этих факторов имел по 5 вариантов.

В качестве экстрагентов использовали несмешивающиеся с водой свежеперегнанные растворители: хлороформ, этилацетат, диэтиловый эфир, гексан, гептан–дихлорэтан-изопропанол-хлороформ в соотношении 32:23:10:35; в качестве электролитов применяли натрия сульфат и натрия хлорид; значение рН среды в интервале 2,0-11,0 создавали с помощью универсальной буферной смеси (УБС) Бриттона-Робинсона; экстрагирование проводили в течение 3, 5, 7, 9, 11 минут.

Контроль степени экстракции ламотриджина в процессе эксперимента проводили с помощью УФ-спектрофотомерии при длине волны 270 нм. Всего проведено 100 опытов (25 вариантов по 3 основных и одному контрольному). 

В результате эксперимента установлено, что процент изолирования ламотриджина оказался наибольшим при использовании в качестве экстрагента хлороформа, значении рН среды 9 и электролита – аммония сульфата до насыщения и составил 96,0±2%. Продолжительность экстракции особого влияния на процент изолирования ламотриджина не оказывает.

На основании проведенных исследований нами разработаны методики изолирования ламотриджина из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки). Исследование проводилось на модельных смесях.

Для разработки оптимальной методики изолирования ламотриджина готовили модельные пробы крови(10 мл), мочи(10 мл), печени(10 г), почек(10 г) с содержанием изучаемого лекарственного вещества  4,0; 6,0 и 8,0 мг в пробе.

Изолирование ламотриджина из биологических жидкостей (кровь, моча)

Методика: модельные смеси крови (мочи) объемом 10 мл оставляли на 24 часа при температуре окружающей среды 18С. Через сутки прибавляли 30% раствор натрия гидроксида до значения рН среды 9 по универсальному индикатору. Полученную смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут с воздушным холодильником, охлаждали до комнатной температуры, добавляли аммония сульфат до насыщения и экстрагировали трехкратно хлороформом (по 20 мл) в течение 5 мин. Полученные органические извлечения объединяли, фильтровали через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривали в потоке теплого воздуха до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в 10 мл этанола 96% и исследовали.

Изолирование ламотриджина из биологических органов (печень, почки)

Модельную пробу биологического объекта (печень, почки) массой 10 г измельчали и прибавляли этанол 96% до зеркала и доводили 10% щавелевой кислотой до рН 2-3 по универсальному индикатору. Затем настаивали 3 раза по 2 часа, каждый раз сливая надосадочную жидкость.  Полученные извлечения объединяли и  упаривали при температуре 400С до густоты сиропа. Далее добавляли по каплям этанол 96% до прекращения выпадения осадка. Надосадочную жидкость упаривали досуха. Остаток растворяли в 25 мл горячей воды (600С) и охлаждали до комнатной температуры. Затем добавляли 30% раствор натрия гидроксида до рН 9 по универсальному индикатору, затем добавляли аммония сульфат до насыщения. Экстрагирование проводили трехкратно хлороформом по 20 мл в течение 5 минут. Хлороформные извлечения объединяли и центрифугировали при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали и фильтровали через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом и выпаривали до сухого остатка в потоке теплого воздуха. Далее  сухой остаток растворяли в 10 мл этанола 96% и исследовали.

2. Разработка методик идентификация ламотриджина в извлечениях из биологических объектов

Предварительное исследование

Обнаружение ламотриджина методом хроматографии в тонком слое сорбента

В качестве хроматографических пластин были использованы пластины с закреплённым слоем силикагеля отечественного производства - “Сорбфил”. С помощью микрошприца на линию старта хроматографических пластин наносили по 1 мкл 0,1% спиртового раствора ламотриджина (1 мкг). После удаления органического растворителя пластины хроматографировали в различных системах растворителей, используемых в химико-токсикологическом анализе.

Для подтверждения специфичности методики в тех же условиях исследовали применяемые совместно с ламотриджином препараты: фенитоин, фенобарбитал

Проведенные исследования позволили нам выбрать оптимальные системы растворителей для разработки методики обнаружения и разделения ламотриджина от применяемых вместе с ним противоэпилептических средств:

  • S1: Толуол–ацетон-этанол –25% раствор аммиака (22,5:22,5:4:1);
  • S2: Бензол - диоксан––25% раствор аммиака (30:17,5:2,5);
  • S3: Хлороформ–н-бутанол–25% раствор аммиака (14:8:5).

Значения Rf исследуемых лекарственных веществ в предложенных системах растворителей представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Величины Rf исследуемых лекарственных веществ в общих системах растворителей

Значение Rf изучаемых лекарственных веществ(n=6)

ламотриджин

фенитоин

фенобарбитал

0,35 ±0,01

0,61 ±0,02

0,46 ±0,01

0,56 ±0,02

0,68 ±0,01

0,79 ±0,02

0,71 ±0,02

0,51 ±0,02

0,25 ±0,01

В предложенных системах растворителей определяли пределы обнаружения исследуемых веществ на хроматографических пластинах путем нанесения их растворов рабочих стандартных образцов на линию старта в количестве от 0,05 до 50 мкг. После хроматографирования зоны локализации исследуемых лекарственных веществ детектировали различными реагентами.

Детектирование осуществляли путем обработки хроматографических пластин раствором дифенилкарбазона в хлороформе, с последующей обработкой 5% раствором ртути (II) сульфата, а также реактивом Драгендорфа. В отличие от первого проявителя, реактив Драгендорфа детектирует только ламотриджин (таблица 2).

Таблица 2 – Результаты детектирования исследуемых лекарственных веществ

Реагент

Окрашивание и пределы обнаружения

(мг в пробе)

ламотриджин

фенитоин

фенобарбитал

реактив Драгендорфа

оранжевый

(1 мг/в пробе)

-

-

раствор дифенилкарбазона в хлороформе, высушивание, 5% раствор ртути(II) сульфата

фиолетовый

(1 мг/в пробе)

голубой

(2мг/в пробе)

фиолетовый

(1 мг/в пробе)

Для идентификации и разделения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча ,печень, почки) от соэкстрактивных веществ (эндогенные вещества и метаболиты), хроматографирование проводили в системах растворителей представленных в таблице 1. На линию старта хроматографической пластины наносили 20 мкл извлечения. Значения Rf ламотриджина, в извлечениях из биологических объектов совпадали с их значениями при хроматографировании раствора стандартного образца.

На основании вышеописанных исследований, можно сделать вывод, что разработанная методика позволяет обнаруживать ламотриджин на предварительном этапе исследования в биологических жидкостях (кровь, моча, печень, почки) как индивидуально, так и при сочетанном применении. Соэкстрактивные компоненты крови, мочи, печени и почек не мешают определению.

Подтверждающее исследование ламотриджина с помощью химических и физико-химических методов

Хромогенные реакции

Реакции окрашивания ламотриджин дает с раствором калия гексацианоферрата(II) в присутствии кислоты хлористоводородной при нагревании (чувствительность реакции 700 мкг в 10 мл мочи); с 1% раствором калия перманганата в щелочной среде (чувствительность реакции 900 мкг в 10 мл мочи).

В химико-токсикологическом анализе используются хромогенные и микрокристаллоскопические реакции, в случае, если объектом исследования является вещественное доказательство в виде лекарственного препарата. Пределы обнаружения в водных растворах представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Пределы обнаружения ламотриджина, фенитоина и фенобарбитала при проведении хромогенных реакций (объем пробы 50 мкл)

Реактив

Окрашивание и чувствительность реакций (мкг/в пробе)

Ламотриджин

Фенитоин

Фенобарбитал

с раствором калия гексацианоферрата(II) в присутствии кислоты хлористоводородной при нагревании

зеленое

(3,5мкг)

нет

нет

с 1% раствором  калия перманганата в щелочной среде

темно-зеленое (4,5мкг)

нет

нет

Микрокристаллоскопические реакции

Характерные кристаллы ламотриджин образует с реактивами Рахматова, Бушарда, Реактивом 1(0,02 г ализаринового красного, 1 мл уксусной кислоты ледяной, 4 мл воды). Также, можно наблюдать образование кристаллов с кислотой пикриновой 0,5% и с хлорцинкйодом после добавления 0,1 М кислоты хлористоводородной. Пределы обнаружения ламотриджина в водных растворах (объем пробы 50 мкл) и в извлечениях из мочи представлены в таблице 4.

На основании проведенных исследований можно предложить использовать хромогенные и микрокристаллоскопические реакции при анализе как биологической жидкости (мочи) при остром отравлении ламотриджином, так и вещественных доказательств в виде лекарственных препаратов.

Таблица 4 – Пределы обнаружения ламотриджина с помощью микрокристаллоскопических реакций

Реактив

Предел обнаружения, мкг в пробе

Предел обнаружения, мкг в 10 мл мочи

Рахматова

2,0

400

Бушарда

1,5

300

Реактив 1

3,5

450

раствор хлорцинкйода (дихлоротрийодо-

цинката калия)

2,8

550

0,5% пикриновая кислота

1,8

350

Идентификация ламотриджина методом ВЭЖХ

Полученные извлечения хроматографировали на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» производства ЗАО «ЭкоНова» г.Новосибирск. Исследование пробы осуществляли на хроматографической колонке размером 2х75 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом “Силасорб С18”. В качестве элюента А применяли 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент Б – ацетонитрил. Хроматографирование проводили в градиентном режиме от 0% элюента Б до 100% за 25 мин. Скорость подачи подвижной фазы составляло 100 мкл/мин, время измерения – 0,18 сек, температура термостата колонки - 35С, объем вводимой пробы 2 мкл. Измерение осуществляли при длине волны =270 нм. Идентификацию осуществляли по времени удерживания. Время удерживания для ламотриджина составляет 11,97±0,02 мин.

Данная методика была подвергнута валидационной оценке по следующим характеристикам: воспроизводимость, специфичность, предел обнаружения.

Воспроизводимость методики определяли по времени удерживания хроматографического пика ламотриджина (таблица 5).

Исходя из данных таблицы, относительное стандартное отклонение не превышает 0,17%.

Таблица 5- Результаты хроматографирования ламотриджина методом ВЭЖХ

Исследуемое вещество

Время удерживания

Метрологические характеристики

Ламотриджин

11,99;11,94;11,97;

11,96;12,00;11,95

=11,97;

SD=0,02;

RSD=0,17%

Специфичность разработанной методики определяли по величине коэффициента разделения пиков ламотриджина, фенобарбитала и фенитоина (лекарственных препаратов, применяемых с ним совместно); а также набором хроматограмм стандартных образцов ламотриджина и извлечений из модельных проб мочи, крови, печени, почек и извлечений из контрольных проб исследуемых биологических объектов. При этом времена удерживания ламотриджина, фенобарбитала и фенитоина соответственно равны 11,97, 13,3 и 15 мин. Коэффициент разделения пиков для пиков ламотриджина и фенобарбитала составил 5,22, а для фенобарбитала и фенитоина 8,2, что говорит о том, что они хорошо разделимы.

Величины коэффициента разделения, а также результаты сравнения полученных хроматограмм, позволяют сделать вывод о достоверности и высокой специфичности разработанной методики ВЭЖХ. Соэкстрактивные компоненты крови, мочи, печени и почек не мешают определению.

Предел обнаружения для ламотриджина составляет 1,80 мкг/мл. Предел обнаружения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов представлен в таблице 6.

Таблица 6 - Пределы обнаружения ламотриджина методом ВЭЖХ

Биологические объекты

Предел обнаружения ламотриджина

Кровь

23мкг в 10 мл

Моча

20 мкг в 10мл

Печень

24мкг в 10 г

Почки

25мкг в 10г

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности использования метода ВЭЖХ для идентификации ламотриджина в извлечениях из биологических объектов при отравлениях ламотриджином как индивидуально, так и при сочетанном применении с фенитоином и фенобарбиталом.

Идентификация ламотриджина методом ГХ/МС

Исследование проводили на газовом хроматографе №5860, фирмы «Agilent Technologi», оснащенном пламенно-ионизационным детектором (ПИД) и капиллярной колонкой НР-1 размерами 30 м - 0,32мм (внутренний диаметр) - 0,25 мкм (толщина неподвижной фазы). Температуру колонки программировали  от 70 до 2900С, температура детектора составляла 2700С.  Ввод автоматический. Объем пробы 1мкл, режим Splitless. Идентификацию осуществляли по времени удерживания полученного хроматографического пика. Время удерживания для ламотриджина составляет 19,57±0,03мин.

Методика была подвергнута валидационной оценке по следующим характеристикам: воспроизводимость, специфичность, предел обнаружения.

Воспроизводимость методики определяли по времени удерживания хроматографического пика ламотриджина (таблица 7).

Таблица 7 - Результаты хроматографирования ламотриджина методом ГХ

Исследуемое вещество

Время удерживания

Метрологические характеристики

Ламотриджин

19,57; 19,59, 19,55; 19,56; 19,52, 19,61

=19,57;

SD=0,032

RSD=0,16

Исходя из таблицы, относительное стандартное отклонение не превышает 0,16%.

Специфичность методики идентификации ламотриджина в извлечениях из биологических объектов подтверждали набором хроматограмм стандартных образцов ламотриджина и извлечений из модельных проб мочи, крови, печени, почек и извлечений из контрольных проб исследуемых биологических объектов.

Соэкстрактивные компоненты крови, мочи, печени и почек не мешают определению.

Предел обнаружения ламотриджина составляет 1,5 мкг/мл.

Предел обнаружения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов представлен в таблице 8.

Таблица 8 - Предел обнаружения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов с помощью метода ГХ

       Биологические объекты

Предел обнаружения ламотриджина

Кровь

19мкг в 10мл

Моча

17мкг в 10мл

Печень

20 мкг в 10г

Почки

21мкг в 10г

Также идентификацию ламотриджина в извлечениях из биологических жидкостей (кровь, моча) и органов трупа (печень, почки) осуществляли по сравнению масс-спектра анализируемого вещества со стандартными спектрами библиотеки NIST 2.0.

Полученные характерные пики с числом m/z- 255, 185, 123  в извлечениях из биологических объектов (крови, мочи, печени и почек) соответствуют пикам с числом m/z стандартного раствора ламотриджина.

Таким образом, нами была разработана методика идентификации ламотриджина с помощью ГХ/МС метода, которая может быть использована в химико-токсикологическом анализе при диагностике как острых, так и смертельных отравлений изучаемым лекарственным веществом.

3. Разработка методик количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов

Количественное определение ламотриджина в извлечениях из биологических объектов проводили методами ВЭЖХ и ГХ по разработанным методикам, описанным в разделах идентификации. Исследования проводили на модельных пробах крови(10 мл), мочи(10 мл), печени(10 г), почек(10 г) с содержанием изучаемого лекарственного вещества  4,0; 6,0 и 8,0 мг в пробе.

Количественное содержание ламотриджина определяли методом внешнего стандарта и рассчитывали по площади пика.

Определение ламотриджина с помощью метода ВЭЖХ

Данная методика количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов была подвергнута валидационной оценке по следующим параметрам: линейность, воспроизводимость, предел количественного определения.

При оценке разработанной методики проводили проверку линейной зависимости величины отклика от количества определяемого вещества. Хроматографирование осуществляли в шести повторностях. В интервале концентраций 0,005-1,0 мг/мл наблюдается линейная зависимость. Показатели калибровочного графика были математически обработаны, в результате получили линейное уравнение y=62,63х-0,288. Коэффициент корреляции составил 0,999, что подтверждает линейность методики. Предел количественного определения ламотриджина равен 5,9 мкг/мл. Пределы количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов  методом ВЭЖХ представлены в таблице 9.

Таблица 9 - Пределы количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов  методом ВЭЖХ

Биологические объекты

Предел количественного определения ламотриджина

Кровь

74мкг в 10мл

Моча

68мкг в 10мл

Печень

79 мкг в 10г

Почки

81мкг в 10г

Для установления воспроизводимости методики полученные растворы хроматографировали не менее шести раз в предложенных условиях (таблице 10).

Выход ламотриджина из крови составил 80%, из мочи – 89%, из печени – 76%, из почек – 75%. Разработанная методика позволяет количественно определить ламотриджин с относительным стандартным отклонением для всех исследуемых биологических объектов не превышающим 9,8%.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности использования метода ВЭЖХ для количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки).

Таблица 10 – Результаты количественного определения ламотриджина в модельных пробах биологических объектов методом ВЭЖХ

Объект

Внесено, мг в пробе

Найдено

Метрологические характеристики

мг в пробе

%

Кровь

(10мл)

4,0

2,9116;3,2508; 2,968

72,8;81,3; 74,2

= 79,1%; SD=7,66; RSD=8,04%

6,0

4,3164;5,2374; 4,9224

78,0;87,2;82,0

8,0

5,7984;6,5432; 7,0272

72,5;81,8; 87,9

Моча

(10мл)

4,0

3,2884;3,7416;3,3464

82,2; 93,5; 83,7

= 89,2%; SD=5,99; RSD=6,20%

6,0

4,9884;5,5662;5,6706

83,1; 92,84 94,5

8,0

7,6624; ,3736;6,8120

95,84 92,1; 85,2

Печень

(10г)

4,0

2,6748; ,1756;3,3484

66,94 79,4, 83,7

= 74,7%; SD=9,49; RSD=9,98%

6,0

3,9552;4,9044; 4,5168

65,9; 81,7; 75,3

8,0

5,4328;6,6432;5,4840

67,9; 83,0; 68,6

Почки

(10г)

4,0

3,1124; ,1536;2,5220

77,8; 78,8; 63,1

= 73,4%; SD=9,68; RSD=10,16%

6,0

4,9152;3,9126; 4,8228

81,9; 65,2; 80,4

8,0

5,3496;5,4184;6,2704

66,9; 67,7; 78,4

Определение ламотриджина с помощью метода ГХ

Данная методика обладает следующими валидационными характеристиками: линейностью, воспроизводимостью и пределом количественного определения. В интервале концентраций 0,004-1,0мг/мл наблюдается линейная зависимость. Показатели калибровочного графика были математически обработаны, в результате получили линейное уравнение y=1220,5х+0,94. Коэффициент корелляции составил 0,999, что подтверждает линейность методики. Предел количественного определения ламотриджина методом ГХ равен 5 мкг/мл.

Пределы количественного определения ламотриджина методом ГХ для каждого биологического объекта представлены в таблице 11.

Таблица 11 - Предел количественного определения ламотриджина в  извлечениях из биологических объектов методом ГХ

Биологические объекты

Предел количественного определения ламотриджина

Кровь

63 мкг в 10мл

Моча

57 мкг в 10мл

Печень

67 мкг в 10г

Почки

68 мкг в 10г

Для установления воспроизводимости методики приготовленные растворы хроматографировали не менее шести раз в предложенных условиях (таблица 12).

Таблица 12 – Результаты количественного определения ламотриджина в модельных пробах биологических объектов методом ГХ

Объект

Внесено, мг в пробе

Найдено

Метрологические характеристики

мг в пробе

%

Кровь

(10мл)

4,0

3,1032;2,9836;3,3476

77,6; 74,6;83,7

= 78,8%; SD=7,46; RSD=7,69%

6,0

4,3092;4,4898;5,0556

71,8; 74,8;84,3

8,0

5,8776;6,6904;7,0408

73,5; 83,6;88,0

Моча

(10мл)

4,0

3,3468;3,7248;3,4036

83,7; 93,1;85,1

= 89,1%; SD=5,79; RSD=5,87%

6,0

5,3778;5,0730;5,6688

89,6; 84,6;94,5

8,0

7,7000;6,5960;7,4048

96,3; 82,5;92,6

Печень

(10г)

4,0

3,2192;2,8464;2,4780

80,5; 71,2;61,9

= 74,1%; SD=9,02;

RSD=9,28%

6,0

4,1088;4,7442;4,87774

68,5; 79,1;81,3

8,0

5,8624;5,5984;6,5320

73,3; 70,0;81,7

Почки

(10г)

4,0

2,4872;3,1704;3,0752

62,2; 79,3;76,9

= 73,0%; SD=9,86; RSD=10,2%

6,0

3,7158;4,8216;4,3080

61,9; 80,4;71,8

8,0

5,400;6,3376;6,2648

67,5; 79,2;78,3

Выход ламотриджина из модельных проб биологических объектов при количественном определении методом ГХ составил: из крови - 78%, из мочи – 87%, из печени – 74%, из почек – 73%. Разработанная методика позволяет количественно определить ламотриджин с относительным стандартным отклонением для всех исследуемых биологических объектов не превышающим 10,2%.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности использования метода ГХ для количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов (крови, мочи, печени, почек).

4 Разработка схемы химико-токсикологического  анализа ламотриджина

Результаты проведенных исследований были использованы для разработки схемы химико-токсикологического анализа ламотриджина в биологических объектах (кровь, моча, печень, почки) (рисунок 1).

Рисунок 1 – Схема химико - токсикологического исследования ламотриджина

Заключение о присутствии ламотриджина в исследуемых биологических объектах дают при положительном результате предварительного исследования методом ТСХ и подтверждающего исследования методами ГХ/МС и ВЭЖХ.

Таким образом, химико-токсикологический анализ биологических жидкостей (крови, мочи) и внутренних органов трупа (печени, почек) позволяет достоверно диагностировать факт отравления ламотриджином.

5. Апробация разработанной схемы химико-токсикологического анализа на лабораторных животных (крысах)

Разработанная схема анализа ламотриджина в биологических объектах была апробирована на лабораторных животных (крысах).

Экспериментальные исследования выполнялись в соответствии с правилами европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в эксперименте для научных целей.

Исследования проводили на белых взрослых крысах в возрасте 2,0–2,5 месяца массой 180-220 г. Группе животных (по 6 на каждую концентрацию) вводились перорально максимальная терапевтическая(700мг), токсическая(4000мг) и смертельная(6000мг) дозы ламотриджина с водной нагрузкой в пересчете на массу животных (соответственно 12 мг, 67 мг и 101 мг). Через 2,5 часа (время максимальной концентрации в плазме) крысам делался общий наркоз и производился забор биологических жидкостей (кровь, моча) и органов (печень, почки). В качестве контроля использовали биологические объекты (кровь, моча, печень, почки) интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы. Далее производили изолирование по вышеописанным методикам.

Идентификацию ламотриджина осуществляли с помощью предварительного (метод ТСХ) и подтверждающего исследований (методы ГХ/МС, ВЭЖХ) Полученное значение Rf, масс-спектры и времена удерживания соответствуют значению Rf, масс-спектрам и временам удерживания стандартного образца ламотриджина. Эндогенные соединения не мешают определению ламотриджина. Количественное содержание ламотриджина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) лабораторных животных определяли методами ВЭЖХ и ГХ. Полученные результаты представлены в таблице 14. Исходя из данных таблицы, относительная погрешность не превышает 11,4%.

Разработанные методики изолирования, идентификации и количественного определения позволяют достоверно идентифицировать и количественно определить ламотриджин в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) лабораторных животных (крыс), что подтверждает возможность использования представленной схемы химико-токсикологического исследования ламотриджина в химико-токсикологических лабораториях.

Таблица 14– Результаты количественного определения ламотриджина в крови, моче, печени, почках крыс методами ВЭЖХ и ГХ (n=6)

Биологический объект

Введено (перорально) субстанции ламотриджина крысе, мг

12

67

101

Метод ВЭЖХ

кровь

=21,3%;=1,95;

S=0,76;=9,18%

=22,0%;=1,92;

S=0,75;=8,73%

=22,5%; =1,9;

S=0,74;=8,45%

моча

=11,5%;=0,97;

S=0,38; =8,4%

=12,0%;=0,94;

S=0,37;=7,83%

=12,3%;=0,92;

S=0,36;=7,47%

печень

=20,5%;=2,23;

S=0,87;=10,89%

=21,1%;=2,21;

S=0,86;=10,46%

=21,5%;=2,12;

S=0,85;=10,19%

почки

=11,1%;=1,25;

Sх=0,49;=11,30%

=11,6%;=1,25;

Sх=0,49;=10,78%

=12,0%;=1,25;

S=0,49;=10,46%

Метод ГХ

кровь

=20,6%;=1,91;

S=0,75;=9,28%

=21,5%;=1,88;

S=0,73;=8,75%

=22,0%;=1,86;

S=0,72;=8,42%

моча

=11,1%;=0,94;

Sх=0,36;=8,44%

=11,6%;=0,92;

Sх=0,36;=7,88%

=12,0%;=0,91;

S=0,35;=7,55%

печень

=20,2%;=2,21;

S=0,86;=10,91%

=20,7%;=2,18;

S=0,85;=10,5%

=20,9%;=2,14;

S=0,83;=10,25%

почки

=10,6%;=1,21;

S=0,47;=11,39%

=11,1%;=1,2;

S=0,47;=10,87%

=11,4%; =1,2;

S=0,47;=10,55%


ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

  1. Определены оптимальные условия экстракции ламотриджина из водных растворов методом математического планирования эксперимента «латинский квадрат» в зависимости от четырех факторов (природы органического растворителя, значения рН среды, наличия электролитов и продолжительности экстракции): экстрагент – хлороформ, значение рН среды - 9, электролит – аммония сульфат до насыщения. Выход ламотриджина в найденных условиях составил в среднем около 96,0±2%.
  2. Разработаны методики изолирования ламотриджина из модельных проб крови мочи, печени, почек позволяющие выделить изучаемое лекарственное вещество из крови до 80%, из мочи до 89%, из печени – 76%, из почек – 75%.
  3. Разработаны методики идентификации ламотриджина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) с помощью предварительного исследования методом ТСХ. Методика специфична, воспроизводима, чувствительна. Предложены три системы растворителей для идентификации ламотриджина в извлечениях из биологических объектов как индивидуально, так и в присутствии лекарственных веществ, применяемых с ним совместно (фенитоин, фенобарбитал).
  4. Разработаны методики идентификации ламотриджина хромогенными и микрокристаллоскопическими реакциями, позволяющие надежно идентифицировать  изучаемое лекарственное вещество при анализе как биологической жидкости (мочи) при остром отравлении ламотриджином, так и вещественных доказательств в виде лекарственных препаратов.
  5. Разработаны методики идентификации ламотриджина в извлечениях из биологических объектов с помощью подтверждающего исследования физико-химическими методами: ГХ/МС (предел обнаружения для всех исследуемых биологических объектов находится в интервале от 19 до 21 мкг в пробе) и ВЭЖХ (предел обнаружения для всех исследуемых биологических объектов находится в интервале от 20 до 25 мкг в пробе). Методики специфичны, воспроизводимы и имеют достаточно высокий предел обнаружения, что говорит об их валидности.
  6. Разработаны методики количественного определения ламотриджина в извлечениях из биологических объектов (кровь, моча, печень, почки) методами ВЭЖХ (предел количественного определения для всех исследуемых биологических объектов находится в интервале от 68 до 81 мкг в пробе) и ГХ (предел количественного определения для всех исследуемых биологических объектов находится в интервале от 57 до 68 мкг в пробе). Валидационная оценка методик по параметрам: специфичность, линейность, воспроизводимость и предел количественного определения подтвердила пригодность её использования.
  7. Предложена схема химико-токсикологического исследования биологических жидкостей (кровь, моча) и внутренних органов (печень, почки) при отравлении ламотриджином.
  8. Разработанные методики изолирования, идентификации и количественного определения апробированы на биологических жидкостях и внутренних органах лабораторных животных (крысах). Исследования подтверждают возможность надежной идентификации и количественного определения ламотриджина в биологических объектах в случае отравлений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Соболева, Л.В.. Обнаружение противоэпилептического препарата ламотриджин в крови крыс методом ТСХ и ВЭЖХ / Л.В.Соболева// Токсикологический вестник. - 2010.-№6(105).-С. 44-46. (Из перечня журналов, рекомендуемых ВАК РФ).
  2. Тираспольская, С.Г. Химико-токсикологический анализ фенитоина и фенобарбитала при совместном присутствии/ С.Г. Тираспольская, Л.В.Соболева  [и др.]/ Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2007. – Вып.67.- С. 394-396.
  3. Соболева, Л.В. Идентификация ламотриджина, фенитоина и фенобарбитала методом тонкослойной хроматографии/ Л.В.Соболева // Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований: материалы Всерос. науч.-практ. конф. 31 октября-01 ноября. – М.: РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава», 2007. - С.277-279.
  4. Соболева, Л.В. Разработка методики изолирования ламотриджина из водных растворов/ Л.В.Соболева // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009. – Вып.64.- С. 210-211.
  5. Соболева, Л.В. Использование ВЭЖХ методики для идентификации и количественного определения ламотриджина / Л.В.Соболева, Д.С. Лазарян // О проблемных вопросах организации производства судебно-медицинских экспертиз: материалы. всерос. науч.-практ. конф. 5 - 6 ноября 2009г.– М.: РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава»,2009.-С.350-353.
  6. Соболева, Л.В. Идентификация ламотриджина с помощью химических реакций и методов ТСХ и ВЭЖХ/ Л.В.Соболева // Актуальные вопросы судебно - химических, химико - токсикологических исследований и фармацевтического анализа: материалы Рос. науч.- практ. конф. с междунар. участием 28 сентября - 3 октября 2009г. – Пермь, 2009. –С.62-65.
  7. Соболева, Л.В. Идентификация и количественное определение ламотриджина в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/ Л.В.Соболева // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2010. –Вып.65.- С. 398-399.
  8. Соболева, Л.В. Обнаружение ламотриджина в биологических объектах с помощью хромато-масс-спектрометрии / Л.В.Соболева, Д.С. Лазарян // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2010.- № 7. – С. 270-272.
  9. Соболева, Л.В. Обнаружение и количественное определение ламотриджина в извлечениях из почек крыс/ Л.В.Соболева, Лазарян Д.С. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.- Пятигорск, 2011.-Вып.66.- С. 462-464.

СОБОЛЕВА ЛИЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ЛАМОТРИДЖИНА

14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 26.04.2012 г. Формат бумаги 60x84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ №

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО

ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИТЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

  (357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11)







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.