WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

ШИМАНСКАЯ Анна Геннадьевна

ГИСТОПАТОЛОГИЧЕСКИЙ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ И ЭКСПЕРТНЫЙ МЕТОДЫ ВЕРИФИКАЦИИ АТРОФИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА В БИОПСИЙНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ХРОНИЧЕСКОГО ГАСТРИТА

14.03.02 – патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Омск – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Кононов Алексей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мишнев Олеко Дмитриевич, Российский национальный исследовательский медицинский университет им.

Н.И. Пирогова, заведующий кафедрой патологической анатомии лечебного факультета доктор медицинских наук, профессор Казачков Евгений Леонидович, Челябинская государственная медицинская академия, заведующий кафедрой патологической анатомии

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Защита диссертации состоится «____»__________2012 г. в_____часов на заседании диссертационного совета Д208.065.04 при Омской государственной медицинской академии по адресу: 644043, г. Омск, ул. Ленина, д. 12; тел.: (381-2) 23-32-89.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «___» ______________2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.А. Потрохова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Атрофия слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите является стартовой площадкой в многокаскадном процессе канцерогенеза (Correa P., 1997). Интегральная морфологическая оценка степени выраженности атрофических процессов рассматривается в качестве ведущего прогностического фактора риска рака желудка кишечного типа (Graham D.Y., 2010, Rugge M. et al., 2010).

Группа европейских и американских патологов и гастроэнтерологов, объединившихся в ассоциации Atrophy Club и OLGA (Operative Link on Gastritis Assessment), предложила в качестве персонифицированного риска канцерогенеза оценивать интегральный показатель атрофических изменений слизистой оболочки желудка, обозначив этот показатель стадией хронического гастрита. Стадия атрофического гастрита (0-IV) стала ключевой характеристикой новой его классификации – OLGA-system (Rugge M. et al., 2008).

Однако внедрению Международной классификации OLGA-system препятствует громоздкая система количественного анализа морфологических изменений и отсутствие визуального аналога градации атрофии.

Коллективом кафедры патологической анатомии Омской государственной медицинской академии была предложена модификация OLGA-system, утвержденная III съездом Российского общества патологоанатомов и получившая название Российского пересмотра OLGA-system (Аруин Л.И., Кононов А.В., Мозговой С.И., 2009).

В повседневной практике врача-патологоанатома идентификация атрофии осложнена неоднозначной интерпретацией морфологических признаков (Кононов А.В. с соавт., 2011). Далеко не всегда исследуемый фрагмент слизистой оболочки желудка является репрезентативным (информативным) в связи с ограничениями технического характера, обусловленными существующей в отечественном здравоохранении практикой забора материала при фиброгастроскопии. Актуальным является и поиск дополнительных фенотипических критериев атрофии – разработка молекулярных и клеточных мишеней.

Цель исследования. Оценка возможностей и ограничений методов верификации атрофии слизистой оболочки желудка для улучшения качества биопсийной диагностики хронического атрофического гастрита.

Задачи исследования:

1. Оценить пригодность текущего биопсийного материала в рутинной практике анализа материалов гастробиопсии для внедрения в диагностику принципов Российского пересмотра Международной классификации OLGA-system.

2. Проанализировать применение Российского пересмотра Международной классификации OLGA-system в практике методом оценки согласия экспертов (каппа Коэна).

3. Оценить параметры валидности признаков метапластической и абсолютной атрофии слизистой оболочки желудка (молекулярных и клеточных мишеней) для разработки маркерного принципа детекции атрофии при хроническом гастрите.

Научная новизна. Обозначены причины ограничения применения современной классификации хронического гастрита для патоморфологической верификации атрофии слизистой оболочки желудка, установлены и рубрифицированы причины неинформативности гастробиоптатов. Выявлены причины недостаточной эффективности обучения практикующих врачей-патологоанатомов современным гистологическим классификациям хронического гастрита и разработан многоуровневый учебнометодический комплекс, облегчающий получение врачом умений и навыков для внедрения системы Российского пересмотра классификации OLGA-system. Определены высоко валидные (чувствительность, специфичность, прогностическая ценность, отношения правдоподобия результата) гистологические и гистохимические критерии – молекулярные и клеточные мишени для диагностики хронического атрофического гастрита.

Практическая значимость. Учебно-методический комплекс «Многоуровневый визуальный тренажер диагностики/распознавания атрофии слизистой оболочки желудка» с использованием созданной компьютерной базы данных существенно оптимизировал обучение патологоанатомов современным подходам морфологической диагностики хронического атрофического гастрита.

Внедрение результатов исследования. Учебно-методический комплекс «Многоуровневый визуальный тренажер диагностики/распознавания атрофии слизистой оболочки желудка» и собранная база данных (коллекция изображений и гистологических препаратов) для обучения врачей-патологоанатомов методам оценки атрофии слизистой оболочки желудка внедрена в практику дополнительного профессионального образования по специальности патологическая анатомия (тематическое усовершенствование 72 часа). Работа поддержана грантом УМНИК Федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия развитию малых форм предприятия в научно-технической сфере» №141«Разработка и апробация модуля для мониторинга риска развития рака желудка» (в соавторстве с Мозговым С.И., Новиковым Д.Г. и Маркеловой М.В.).

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и представлены на Всероссийской научно-практической патологоанатомической конференции «Актуальные проблемы патологоанатомической службы муниципальных учреждений здравоохранения. Вопросы экологической патологии. Современные методы морфологической диагностики в патологоанатомической практике», Миасс, 28-31 мая 2008 года; Юбилейной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, 22 апреля 2010 года;

заседаниях Омской областной общественной организации «Ассоциация патологоанатомов», Омск, 20 октября 2010 года, 26 января 2012 года; ежегодной научной конференции молодых ученых и студентов, посвященной памяти заслуженного деятеля науки, члена-корреспондента РАМН, профессора А.С. Зиновьева «Зиновьевские чтения», Омск, 29 октября 20года; III научной конференции молодых ученых Омской государственной медицинской академии, Омск, 7-8 февраля 2011 года; Всероссийской научной школе «Превентивная медицина: вызовы XXI века», Омск, 14-ноября 2011 года; Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы детской гастроэнтерологии и нутрициологии», Омск, 16 марта 2012 года.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Повседневная практика гастробиопсии, а также морфологического исследования гастробиоптатов в 95,97% диагностических случаев не соответствует требованиям Российского пересмотра Международной классификации хронического гастрита OLGA-system. Это не позволяет достичь целевого показателя системы детекции и персонифицированной оценки выраженности атрофии слизистой оболочки желудка как стартовой площадки опухолевого роста при хроническом гастрите.

2. Традиционные дидактические приемы, использованные для внедрения принципов Российского пересмотра OLGA-system в практику патологоанатомических исследований гастробиоптатов, продемонстрировали низкие уровни согласия экспертов-патологоанатомов (обучающихся), быструю утрату созданных компетенций, обусловленную низкой выживаемостью знаний и, как следствие, низкий уровень воспроизводимости диагностической системы. Эффективность внедрения может быть обеспечена созданием современных обучающих систем с использованием референтной базы данных и модульного принципа обучения.

3. Альтернативным подходом к определению наличия атрофии слизистой оболочки и ее выраженности (стадия хронического гастрита) является разработка маркерного принципа (признак/маркер) с расчетом чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного результата, отношения правдоподобия положительного результата (параметры валидности), который может быть положен в основу создания панели диагностических белков клеточной дифференцировки, маркерных признаков кишечной метаплазии и др. Предпочтительность такого подхода основывается на высоких показателях критерия согласия (1,0) патологоанатомов-экспертов, оценивавших не гистологическую структуру, а маркерный признак.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 в журналах по перечню ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 1страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 50 рисунками. Список цитированной литературы включает 157 источников, в том числе 38 отечественных и 119 зарубежных.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведены анализ литературных источников, набор биопсийного материала, патоморфологическая его оценка, гистохимические и иммуногистохимические исследования, руководство экспертными группами, статистический анализ результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Формирование массива выборки диагностических случаев для оценки пригодности материала гастробиопсии для внедрения в диагностику принципов Российского пересмотра Международной классификации OLGA-system Ретроспективное исследование выполнено методом одномоментного поперечного среза путем анализа материала патологоанатомических отделений нескольких медицинских организаций города Омска, специализирующихся в области гастроэнтерологии, за период август 2008 - сентябрь 2011 годы.

В рамках пилотного исследования отобрано 200 диагностических случаев с морфологическим заключением «Хронический гастрит». Из исследования исключены случаи неопределенной атрофии, очаговой фовеолярной гиперплазии, полипов, интраэпителиальной дисплазии/неоплазии, аденомы, инвазивной карциномы, эрозивно-язвенного дефекта. Единственным условием для возможности проведения оценки уровня атрофии слизистой оболочки желудка являлось наличие достаточного количества исследуемого материала при эндоскопическом заборе (не менее 4-5 фрагментов слизистой оболочки желудка).

Из 200 набранных диагностических случаев пригодными для оценки по заданному условию составили 72 случая (36%).

Объем представительной необходимой выборки (n) устанавливали по формуле (Автандилов Г.Г., 2002):

n = tpq/ = (t / ) pq = kpq, где p – относительный показатель частоты наблюдений случайного признака; q – относительный показатель частоты его отсутствия; – предельная ошибка измерений (счета), принятая за 0,01; t – критерий Стюдента (критерий надежности), принимаемый за 2 (доверительная вероятность 0,95); k – коэффициент точности, равный произведению допустимой ошибки ( ) на критерий надежности (t).

Таким образом, объем необходимой репрезентативной выборки для оценки пригодности текущего биопсийного материала в рутинной практике анализа материалов гастробиопсии для внедрения в диагностику принципов Российского пересмотра Международной классификации OLGAsystem составил 9216 диагностических случаев. При наборе материала за указанный период объем выборки составил 9312 диагностических случаев, представленных 21156 биоптатами.

2. Экспертный метод верификации атрофии слизистой оболочки желудка в биопсийной диагностике хронического гастрита Оценка воспроизводимости Российского пересмотра классификации хронического гастрита OLGA-system выполнена методом расчета критерия согласия экспертов – каппа Коэна (Landis J.R., Koch G.G., 1977).

В состав созданной группы входили 24 врача-патологоанатома – «эксперты». Условно в качестве квалификационной характеристики «опытные» - «неопытные» был принят стаж работы по специальности:

выделены группы со стажем менее 2 лет («неопытные») и свыше 5 лет («опытные»). 12 «молодых» патологов с опытом работы 1-3 года и «опытных» патологов с опытом работы более 5 лет, для которых диагностика хронического гастрита является одним из компонентов рутинной морфологической диагностики. Все эксперты были патологоанатомами «общего профиля», то есть среди них не было лиц, специализирующихся исключительно в патологии желудка.

Дизайн исследования предусматривал четырехэтапный просмотр материала с оценкой уровня согласия между экспертами. Группы экспертов работали в очной форме в различных режимах: первый этап - без предварительного обучения. Спустя 1-2 недели - второй этап (после устного индивидуального обучения). Третий этап спустя 2-3 недели - после обучения с целью оценки воспроизводимости и повторяемости результатов, и через 3-4 недели после обучения с использованием учебно-методического комплекса - четвертый этап работы экспертов. На всех этапах экспертам были предложены референтные микропрепараты для выполнения оценки интегрального показателя атрофии слизистой оболочки желудка – стадии хронического гастрита.

3. Обоснование использования методов каппа-статистики при анализе результатов работы групп экспертов при оценке атрофии Расчет коэффициента – каппа Коэна производился линейным и квадратическим взвешенным методами (Cicchetti D.V., Feinstein A.R., 1990;

Jang B.I. et al., 2010).

В случаях расчета бинарных данных, когда учитывались два показателя – наличие атрофии принималось за единицу, а её отсутствие – за ноль, была рассчитана линейная каппа, что обосновано достаточной чувствительностью метода. При заполнении таблицы с индивидуальными показателями экспертов нами искусственно вводились контрольные показатели для оптимизации расчетов. Дополнительные значения «1» и «0» у каждого эксперта демонстрировали, что может быть коэффициент полного согласия или несогласия.

Для обработки результатов работы экспертов с определением градации атрофии и стадии гастрита использовали расчет каппы Коэна методом квадратического взвешивания. Производилось парное сравнение результатов оценки («каждый с каждым») с расчетом взвешенной каппы. Оценивали медиану от всех значений каппы для каждого исследователя – индивидуальный показатель согласия, и медиану от полученных индивидуальных показателей – генеральная взвешенная каппа. Разброс между генеральным значением и индивидуальными показателями характеризовал уровень диагностической вариабельности. Оценку каппа-коэффициента проводили согласно рекомендуемым критериям (Landis J.R., Koch G.G., 1977; Morris J.A., 1994; Talebkhan Y. et al., 2009): менее 0,2 – плохое согласие, плохая степень согласованности; от 0,21 до 0,4 – удовлетворительное согласие (сносное), удовлетворительная степень согласованности; от 0,до 0,6 – умеренное согласие (среднее), умеренная степень согласованности; от 0,61 до 0,8 – хорошее согласие, хорошая степень согласованности;

более 0,81 – очень хорошее (превосходное) согласие, очень хорошая степень согласованности.

Расчеты выполнены с использованием статистической программы MedСalc 10.4.0.0. Вычисления и построение диаграмм проводились с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2007.

4. Оценка параметров валидности признаков атрофии слизистой оболочки желудка (молекулярных и клеточных мишеней) путем расчета чувствительности/специфичности гистохимических и иммуногистохимических маркеров атрофии. Терминология Валидность определяют как характеристику способности теста (признака/маркера) служить поставленной цели измерения, в нашей работе это характеристика признака/маркера, отражающая его способность соответствовать поставленной цели детекции атрофии слизистой оболочки желудка (Marchevsky А.М., Мark R.W., 2011). Оценка валидности признаков атрофии слизистой оболочки желудка проведена путем расчета чувствительности и специфичности гистохимических и иммуногистохимических признаков/маркеров атрофии, а также связанных с ними показателей (прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов, отношения правдоподобия для положительного и отрицательного результатов).

Чувствительность – доля (%) гистологических препаратов, в которых гистохимически/иммуногистохимически обнаружен искомый признак/маркер атрофии среди всех гистологических препаратов выборки с атрофией слизистой оболочки желудка.

Специфичность – доля (%) гистологических препаратов, в которых не обнаружен (гистохимически/иммуногистохимически) признак/маркер атрофии среди всех гистологических препаратов выборки без атрофии слизистой оболочки желудка.

Прогностическая ценность положительного результата – для гистологических препаратов с наличием атрофии слизистой оболочки желудка среди всех гистологических препаратов с положительным результатом определения (гистохимически/иммуногистохимически) признака/маркера атрофии.

Прогностическая ценность отрицательного результата – доля гистологических препаратов с отсутствием атрофии слизистой оболочки желудка среди всех гистологических препаратов с отрицательным результатом определения гистохимически/иммуногистохимически признака/маркера атрофии.

Отношение правдоподобия для положительного результата указывает на значимость признака/маркера атрофии слизистой оболочки желудка для повышения уверенности относительно выявления атрофии:

Чувствительность (в долях единицы) 1- специфичность (в долях единицы).

Отношение правдоподобия для отрицательного результата указывает на значимость признака/маркера атрофии для повышения уверенности относительно отсутствия атрофии:

1 – чувствительность (в долях единицы) Специфичность.

Для каждой характеристики признака (чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результата, отношение правдоподобия для положительного и отрицательного результата) рассчитывали доверительный интервал (ДИ).

5. Дизайн исследования оценки чувствительности и специфичности гистологических, гистохимических и иммуногистохимических маркеров метапластической атрофии Использованы принципы текущей критериальной валидности, которая характеризует способность маркерного признака измерять некоторые качества объекта и коррелировать с некоторым референтным внешним критерием, являвшимся в нашем исследовании гистологической характеристикой атрофии. В качестве такого референтного внешнего критерия составлена коллекция биоптатов 250 гистологических препаратов. Набор материала проводился в ФГУ «Западно-Сибирский медицинский центр» Федерального медико-биологического агентства за период 2010-2011 годы.

При оценке наличия атрофии слизистой оболочки желудка по бинарной схеме: «есть атрофия нет атрофии» критерий согласия (каппа Коэна) экспертов равнялся 1,0. Достигалось это достаточно искусственно заданными условиями отбора: выбраковывался любой гистологический препарат, по поводу которого хотя бы у одного эксперта было сомнение о наличии в нем атрофии слизистой оболочки желудка. Затем из оставшихся 1образцов (гистологический препарат парафиновый блок) методом рандомизации были выбраны 50 блоков. Из этих блоков приготовили серийные срезы, в которых и была проведена детекция маркерных признаков.

Аналогичным методом были отобраны 50 образцов слизистой оболочки желудка, залитых в парафин, в которых отсутствовала атрофия слизистой оболочки.

В качестве маркеров атрофии были выбраны гистохимические и иммуногистохимические признаки/маркеры, отражающие дефицит желез (гиперплазия гладкомышечных, ретикулярных аргирофильных и эластических волокон), а также изменение клеточного фенотипа (метаплазия кишечная и пилорическая): продукция белка CDX-2 белка мукоцита, вставшего на путь кишечной дифференцировки, продукция белка Shh условный признак желудочной дифференцировки эпителия, выработка клетками виллина и CD10 белки, ассоциированные со щеточной каемкой, а также ШИК-реакция или диамин железа в сочетании с альциановым синим, продукция слизи, содержащей MUC2 и MUC5AC.

6. Гистохимические методы Полученные при биопсии фрагменты слизистой оболочки (2 – из тела, 2 - из антрального отдела желудка, 1 – из угла желудка) фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине (рН 7,2 – 7,4) в течение 12 - 24 часов, заливали в парафин по общепринятой методике. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Пирс Э., 1962; Лилли Р., 1969).

Для определения профиля муцинов и типирования очагов кишечной метаплазии в клетках слизистой оболочки желудка использовались реакции с 1%-ным альциановым синим при рН 2,5 (кислые сиаломуцины), ШИК реакция на основе стандартной методики с основным фуксином, а также комбинация методов: альциановый синий (рН 2,5) + ШИК. Детекцию сульфомуцинов с помощью диамина железа дополняли окраской альциановым синим при рН 2,5 (Сапожников А.Г., 2000; Мозговой С.И., 2009).

7. Иммуногистохимические методы Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах. Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере (рН 6,0) при кипячении на водяной бане в течение 1 часа.

В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела (табл. 1). Биотилинированные антитела второго слоя и стрептавидин, меченный пероксидазой, входили в систему визуализации KP-500 (“Diagnostic Biosystems”, США). В качестве хромогена использовался 3,3-диаминобензидина тетрахлорид, входящий в указанный выше коммерческий набор детекции. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера в течении 30 секунд – 2 минут.

Таблица Панель антител, использованных в работе Природа, биологическая роль, функции белка, Рабочее Антитела Клон интерпретация разведение MUC5AC1 CLH2 нейтральный муцин поверхностных отделов 1:1слизистой оболочки желудка, протективная роль MUC61 CLH5 кислый муцин глубоких отделов слизистой 1:1оболочки желудка, протективная роль MUC21 Ccp58 кислый муцин кишечного типа 1:1CDX24 IS080 фактор транскрипции кишечного эпителия RTU Shh3 Поликло- фактор, обеспечивающий желудочную диффе- 1:1нальные ренцировку клеток villin4 CL1D2C3 актин-связывающий белок в ворсинках щеточ- 1:ных каемок кишечного эпителия CD101 56С6 мембрано-ассоциированная пептидаза, маркер RTU щеточной каемки кишечного типа 1 2 Примечания: - “Novocastra”, Великобритания, – “Cell Mark”, США, – “Spring”, США, 4 - “DAKO”, Дания.

Оценку валидности гистохимического/иммуногистохимического маркера проводили по принципу детекции его отсутствия или наличия в исследуемом материале (есть маркер/нет маркера). Для оценки фактора желудочной дифференцировки Shh рассчитывали показатель интенсивности окрашивания цитоплазмы: 1 – слабая, 2 – умеренная, 3 – выраженная, а также вычисляли процент позитивно окрашенных клеток от общего числа эпителиоцитов (1000 клеток) с подразделением на 5 градаций (0 – до 5%, 1 – 5-25%, 2 – 26-50%, 3 – 51-75%, 4 – 75% и более) позитивно меченых клеток. Оценку индекса экспрессии Shh вычисляли путем умножения показателя интенсивности окрашивания (1-3) на полуколичественно оцененную градацию (0-4).

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе Axioskop 40 c использованием камеры AxioCam MRc5 и программного обеспечения AxioVision Rel. 4.7.2 (Carl Zeiss, Германия).

Расчет критерия согласия и параметров валидности методов детекции атрофии выполнен с использованием программы MedCalc 10.4.0.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Репрезентативность материала гастробиопсий для использования определения стадии хронического гастрита по Российскому пересмотру классификации хронического гастрита OLGA-system Из всей выборки только в 375 диагностических случаях (4,03%) были взяты биоптаты из 5 точек, приблизительно соответствующих требованиям Российского пересмотра OLGA-system.

После оценки морфологических изменений слизистой оболочки желудка материал был распределен на группы: 1 биоптат на 1 диагностический случай – 1426 (1426 пациентов), 2 фрагмента слизистой оболочки – 10122 биоптата (5061 пациент), 3 фрагмента – 2481 биоптат (827 пациентов), 4 фрагмента – 3952 биоптата (988 пациентов), 5 фрагментов – 31биоптатов (635 пациентов).

Диагноз атрофического гастрита был обозначен в 1150 наблюдениях (3156 биоптатов), но мог соответствовать при этом стандарту, заданному Российским пересмотром OLGA-system только в 36 случаях, представленных 162 биоптатами (3,1%).

Таким образом, диагноз атрофического гастрита по стандарту, заданному Российским пересмотром OLGA-system, мог быть установлен только в 36 случаях (0,39% от общей выборки). Но это не значит, что остальные 99,61% выборки составляют пациенты без атрофических изменений слизистой оболочки желудка. И дело даже не в том, отмечена атрофия слизистой оболочки в каком-то фрагменте или нет, а в том, что в 95,97% диагностических случаев пациенты не получили персонифицированного прогноза развития хронического гастрита, то есть оценки риска развития рака желудка кишечного типа.

Столь низкие показатели возможности прогноза использовать рутинный материал для оценки риска рака желудка объясняются погрешностями эндоскопического забора материала, а также нарушениями технологии обработки биоптатов в патологоанатомическом отделении (табл. 2).

Дефекты протокола забора биопсийного материала. В силу разных обстоятельств (недостаток времени, неадекватное поведение пациента, неумелые действия среднего медицинского персонала, отсутствие достаточного количества форцептов) врач эндоскопической диагностики производит биопсию не в тех участках, которые указаны в протоколе OLGAsystem, либо уменьшает количество биоптатов, либо вообще производит забор произвольно из зон, которые кажутся ему «подозрительными». Данные получены не путем анкетирования, но при личной беседе с врачами эндоскопической диагностики, материал которых пересматривался как объект патологоанатомического исследования.

К артефактам, возникшим в эндоскопическом кабинете при заборе материала, следует отнести высыхание материала, когда фиксация не следует немедленно.

Обычно в протоколах эндоскопического исследования указывается зона, откуда взят биоптат, однако, нет практики отметки этих данных на флаконе с фиксирующей жидкостью, куда помещен фрагмент слизистой оболочки. Кроме того, зачастую несколько фрагментов помещают в один флакон без маркировки. Патологоанатом лишен возможности надежно интерпретировать гистопатологическую картину, поскольку отдел желудка, из которого взят материал, ему неизвестен: это антральный отдел или тело желудка с выраженной пилорической метаплазией слизистой оболочки. Использование биопсийных щипцов с тупыми браншами обусловливает эффект «скольжения» и получение недостаточного по объему материала, в котором, как правило, отсутствует мышечная пластинка слизистой оболочки.

Дискуссионным является вопрос применения форцептов с наличием фиксирующей иглы. С одной стороны, надежное положение (фиксация) щипцов в момент забора материала создает возможность взятия кусочка с четким визуальным контролем (соблюдение протокола). Вместе с тем, наличие иглы увеличивает артифициальную деформацию материала.

Несоответствия гистологических препаратов стандартам Российского пересмотра OLGA-system в результате нарушения технологии обработки биопсийного материала. Артифициальная фрагментация кусочка слизистой оболочки возникает в результате использования нестандартных расходных материалов при проводке и заливке материала: марлевые мешочки вместо гистологических (биопсийных) кассет, перенос кусочков в парафин обычным пинцетом вместо ланцетовидной иглы или лопатки.

Неправильная ориентировка кусочка при заливке в парафин не позволяет сделать срезы строго перпендикулярные поверхности слизистой оболочки. Идеальной ориентировки можно добиться, применяя специальный адгезивный материал, к которому приклеивают биоптат после извлечения из браншей биопсийных щипцов и одновременно ориентируют его (например, система Endokit, Bio-Optica, Италия). Однако использование такого подхода вряд ли найдет широкое распространение в практике в силу громоздкости самой процедуры, а также отсутствия мануальных навыков для ее выполнения у персонала эндоскопических кабинетов. Вполне понятно, что их мануальные навыки и ментальность, определяющая отношение к биопсийному материалу, принципиально отличаются от таковых у медицинских лабораторных техников.

Остальные причины (табл. 2) особых комментариев не требуют.

Таблица Основные причины непригодности валового биопсийного материала, полученного при традиционной практике гастроскопии, для выполнения патологоанатомического заключения в соответствии с требованиями Российского пересмотра OLGA-system Общее число наблюдений в выборке 9312 (100%) Материал не пригодный для оценки по требованиям Российского пере- 8937 (95,97%) смотра OLGA-system по причине:

недостаточного количества биоптатов (менее 4 фрагментов): 7314(78,53%) • 1 фрагмент 1426 (15,31%) • 2 фрагмента 5061 (54,34%) • 3 фрагмента 827 (8,88%) Недостаточный объем фрагмента слизистой оболочки (объем биоптата) 1623(17,42%) • представлена только фовеолярная зона 766 (8,22%) • представлены только донные отделы желез 857 (9,20%) • отсутствует мышечная пластинка 4257 (45,7%) • менее 10 правильно ориентированных желез в биоптате (в пересчете 3486 (37,43) на все имеющиеся срезы) Отсутствие немедленной фиксации в эндоскопическом кабинете после 482,4 (5,39%) выделения из браншей биопсийных щипцов (кусочек помещен в фикса- тор позже 2 минут) Отсутствие маркировки на флаконах с фиксатором, в которые помеще- 2674 (29,92%) ны биоптаты (отсутствует маркировка и на парафиновых блоках) Артифициальная фрагментация и деформация кусочка 4683 (52,4%) Неправильная ориентировка кусочка при заливке 2995 (33,51%) Несоблюдение технологии обезвоживания и парафиновой пропитки при 2412 (26,98%) ручном способе проводки Высыхание материала при ручном способе заливки 1675 (18,74%) Нарушение технологии микротомирования гистологических блоков 2967 (33,19%) • срезы толще 4 мкм 1504 (16,82%) • складки, полосы от ножа, «четтер» и разрывы, уничтожающие диаг- 1463 (16,37%) ностически значимые поля зрения (структурные признаки) Экспертный метод оценки воспроизводимости атрофии слизистой оболочки желудка (стадии хронического гастрита) по критериям Российского пересмотра OLGA-system Результаты работы группы патологов-экспертов по пересмотру референтной коллекции микропрепаратов на четырех этапах работы представлены в таблице 3.

Таблица Значения критериев согласия экспертов-патологов на четырех этапах оценки уровня атрофии согласно Российскому пересмотру классификации хронического гастрита OLGA Патологи- I этап II этап III этап IV этап эксперты Взве- Невзве- Взве- Невзве- Взве- Невзве- Взве- Невзвешенная шенная шенная шенная шенная шенная шенная шенная каппа каппа каппа каппа каппа каппа каппа каппа 24 эксперта 0,24 0,64 0,23 0,62 0,15 0,52 0,42 0,«Опытные» 0,34 0,43 0,22 0,39 0,22 0,33 0,31 0,эксперты, n=«Неопытные» 0,23 0,70 0,37 0,58 0,34 0,52 0,51 0,эксперты, n=24 эксперта, - 1,00 - 1,00 - 1,00 - 1,оценивающие случаи с кишечной метаплазией 24 эксперта, - 0,62 - 0,60 - 0,47 - 0,оценивающие случаи без кишечной метаплазии Первый этап. На первом этапе 24 эксперта самостоятельно оценивали уровень атрофии в коллекции референтных микропрепаратов – 14 серий по 4-5 микропрепаратов, всего 65 микропрепаратов. По этому материалу эксперты проводили интегральную оценку атрофии слизистой оболочки желудка, то есть идентифицировали стадии (0-IV) хронического гастрита в соответствии с Российским пересмотром OLGA-system.

Расчет -коэффициента методом квадратического взвешивания проводили путем парного сравнения результатов работы экспертов по детекции уровня атрофии. Таким образом, для каждого эксперта было получено 23 показателя.

Итоговый показатель – генеральная взвешенная (медиана индивидуальных показателей) составила 0,24, что укладывается в интервал удовлетворительной степени согласованности – сносное согласие.

Значимой, с нашей точки зрения, является =0,64 - интегральный показатель уровня согласия 24 экспертов, при оценке всего 2 категорий – наличие и отсутствие атрофии (1 или 0). Значение невзвешенной каппы группы экспертов сопоставимы с результатами работы Международной группы Atrophy Club (=0,73) и ведущих отечественных патологоанатомов-экспертов (=0,61), которые интерпретируются как хорошая степень согласованности (Аруин Л.И., Кононов А.В., Мозговой С.И., 2009; Rugge M. et al., 2002).

Интересным выглядит разброс показателей в группах с различным «уровнем опыта». Вполне ожидаемой была более высокая степень согласованности при оценке стадии хронического гастрита (=0,34) «опытными» экспертами по сравнению с «неопытными» (=0,23) при расчете критерия согласия методом квадратического взвешивания. Однако, при анализе референтной коллекции микропрепаратов по бинарной схеме – наличие или отсутствие атрофии слизистой оболочки желудка, «неопытные» эксперты демонстрировали уровень согласия значительно выше (=0,70), чем «опытные» (=0,43). Данное различие указывает на значительно более высокую согласованность в случаях бинарной оценки признака, однако демонстрирует неоднозначную трактовку гистологических маркеров атрофии слизистой оболочки желудка, что, соответственно, влечет за собой отнесение конкретного клинического случая в разные категории – стадии хронического гастрита.

Второй этап. С целью повышения критерий согласия в обеих группах экспертов был проведен слайд-семинар и индивидуальный тренинг по референтным микропрепаратам. Спустя две недели после завершения образовательной программы всем экспертам была предоставлена для оценки прежняя референтная коллекция микропрепаратов. Расчет критерия согласия продемонстрировал неожиданный и парадоксальный результат: в группе «неопытных» экспертов итоговый показатель хотя и вырос до =0,37, но все равно укладывался в интервал удовлетворительного (сносного) согласия; а вот в группе стажированных патологоанатомов – «опытных экспертов», критерий согласия, наоборот, уменьшился (=0,22) и поменял, соответственно, категорию – вместо бывшего умеренного согласия стал удовлетворительным (сносным).

Полученный методом квадратического взвешивания коэффициент согласия, представлен так же низким значением. Подобная степень согласованности объясняется как довольно неоднородной группой исследователей при огромном с позиции применения каппа-статистики количестве экспертов - 24, так и поставленной нами задачей сразу оценить 5 категорий (от 0 до IV) - стадий гастрита.

Парадоксальный результат – существенное снижение уровня согласованности «опытных» экспертов, спустя полтора месяца после обучения (табл. 3), что в подобного рода исследованиях принято объяснять проявлением неоднородности группы экспертов (Sim J., 2005; Khalid O. et al., 2009). Для обеспечения адекватного результата при этом необходимо прибегать к разбивке групп (перегруппировке) экспертов, к изменению количества участников исследования. Причем вполне реально предположить ситуацию, при которой, чем выше стаж и больше опыт работы патологоанатома, тем больше у него шансов оказаться в плену неких собственных представлений, умозрительных концепций, не всегда верных. Но чем больше опыт работы, тем выше может оказаться приверженность этим концепциям и образу действий.

Третий этап. При пересмотре той же коллекции микропрепаратов на третьем этапе спустя 2-3 недели после обучения с целью оценки в первую очередь повторяемости результатов, эксперты продемонстрировали ещё более низкие значения критерия согласия. Данный факт свидетельствует о низкой воспроизводимости экспертами своих же результатов спустя время в идентичных условиях.

Четвертый этап. Нам представляется важным обсудить еще одну существенную подробность: отечественные патологи не имеют навыков работы «по протоколу», как правило, пренебрегают выполнением жесткого алгоритма последовательности действий над объектом. В связи с изложенным, нами разработан учебно-методический комплекс «Многоуровневый визуальный тренажер диагностики/распознавания атрофии слизистой оболочки желудка» с использованием когнитивной графики и тестового курса, формирующий у обучающегося компетентный целостный подход – постановка стандартизированного патологоанатомического диагноза хронического атрофического гастрита (рис.1).

Оценка эффективности разработанного учебно-методического комплекса проведена на четвертом этапе путем расчета коэффициента согласия спустя 3-4 недели после обучения 24 экспертов. Удалось существенно повысить критерий согласия: увеличение взвешенной каппы Коэна от 0,до 0,44, что соответствует умеренному уровню согласованности.

Рис. 1. Пример задания второго уровня учебно-методического комплекса «Многоуровневый визуальный тренажер диагностики/распознавания атрофии слизистой оболочки желудка»: демонстрация с элементами контроля.

Маркерный принцип идентификации атрофии слизистой оболочки желудка: валидность гистохимических и иммуногистохимических признаков/маркеров Достигнутый максимально возможный уровень согласия между экспертами в диагностических случаях с наличием метапластической атрофии (=1,0) достоверно демонстрирует возможность использования кишечной метаплазии как удобного доступного хорошо воспроизводимого маркера атрофии – клеточная мишень диагностики. Параметры валидности признаков/маркеров атрофии слизистой оболочки желудка представлены в таблице 4.

CDX-2 – белок, являющийся продуктом гена, программирующим кишечную дифференцировку. Ген экспрессируется инициально при увеличении рН просвета желудка, то есть при наличии абсолютной или метапластической атрофии (Мозговой С.И., 2011; Rugge M. et al., 2008-2011) в теле желудка. Чувствительность этого белка составляет 86% (ДИ 73,2694,18%), специфичность 72% (ДИ 57,51-83,77%), что позволяет принять его в качестве маркера кишечной метаплазии, а, следовательно, и атрофии слизистой оболочки желудка.

Оценка уровня продукции белка Shh (чувствительность и специфичность) не соответствует категории маркера (табл.4). Это неудивительно, поскольку Shh не является однозначно трактуемым маркером только желудочной дифференцировки.

Таблица Параметры валидности признаков/маркеров атрофии слизистой оболочки желудка Маркер Se, % Sp, % PVP PVN LR+, % LR-, % CDX-2 86,00 72,00 3,07 0,19 75,44 83,Shh 4,00 98,00 2,00 0,98 66,67 50,градация Shh 14,00 86,00 1,00 1,00 50,00 50,градация 3-Shh градация 6 24,00 32,00 0,35 2,37 26,09 23,Shh градация 8 46,00 84,00 2,87 0,64 74,19 60,Shh градация более 8 12,00 84,00 0,75 1,05 42,86 48,Villin* 72,00 100,00 - 0,28 100,00 78,CD10* 72,00 100,00 - 0,28 100,00 78,MUC2 72,00 100,00 - 0,28 100,00 78,MUC5AC 96,00 0,00 0,96 - 48,98 0,Гиперплазия гладко- 48,00 86,00 3,43 0,60 77,42 62,мышечных волокон Гиперплазия аргиро- 68,00 92,00 8,50 0,35 89,47 74,фильных ретикулярных волокон Гиперплазия эластиче- 52,00 76,00 2,17 0,63 68,42 61,ских волокон ШИК-реакция (щеточ- 100,00 0,00 1,00 - 50,00 - ная каемка) Альциановый синий 88,00 86,00 6,29 0,14 86,27 87,(рН=2,5) ШИК-реакция и аль- 84,00 90,00 8,40 0,18 89,36 84,циановый синий (рН=2,5) Диамин железа (рН=2,5) 22,00 94,00 3,67 0,83 78,57 54,Диамин железа и аль- 90,00 84,00 5,62 0,12 84,91 89,циановый синий (рН=2,5) Примечания: Se - Чувствительность; Sp - Специфичность; PVP - Прогностическая ценность положительного результата; PVN - Прогностическая ценность отрицательного результата; LR+ - Отношения правдоподобия для положительного результата; LR– - Отношения правдоподобия для отрицательного результата; * - только для полной кишечной метаплазии.

Определение гена shh и белка Shh в качестве факторов, обеспечивающих именно желудочную дифференцировку, справедливо лишь для эмбриогенеза (Stanton B.Z. et al., 2009; Resende T.P. et al., 2010).

Продукция виллина и молекулы CD10 обладают высокими показателями чувствительности и специфичности, однако они характерны только для полной кишечной метаплазии, когда изменение желудочного дифферона включает все типы кишечных клеток, в том числе каемчатые.

Продукция MUC2 экскрет бокаловидных клеток, характерна для любого типа кишечной метаплазии, что позволяет отнести его к маркерам с высоким уровнем текущей критериальной валидности: чувствительность составляет 72% (ДИ 57,51-83,77%), специфичность 100% (ДИ 92,89-100%).

Крайне низкая специфичность маркера MUC5AC не позволяет считать его валидным суррогатным маркером атрофии.

Хотя в авторитетных руководствах по биопсийной диагностике в гастроэнтерологии замещение желез гладкомышечными клетками или волокнистыми структурами соединительной ткани, особенно аргирофильными ретикулярными волокнами, принято считать надежным (почти абсолютным!) признаком атрофии слизистой оболочки (Аруин Л.И., 1998;

Robert D. Odze, 2009), при оценке валидности этих показателей/маркеров обнаружены сравнительно низкие значения (табл. 4).

Маркеры, отражающие гистохимически определяемую муцинпродуцирующую способность клеток, показали свою валидность только в отношении метапластической атрофии. Причем детекция секрета бокаловидных клеток с помощью окраски альциановым синим при рН 2,5 характерна для любого типа кишечной метаплазии, однако специфичность этого теста существенно уступает иммуногистохимической детекции MUC2 (табл. 4).

Детекция ШИК-позитивной каемки и использование реакции с диамином железа характерны для соответственно полной (тип I) и неполной толстокишечной (тип III) метаплазии, повышение валидности этих методов происходит только при комбинировании их с альциановым синим при рН=2,5 (табл.4).

Вариантом технологического решения проблемы является применение маркерного принципа детекции стадии атрофии слизистой оболочки желудка. Как было показано, использование единственного критерия атрофии кишечной метаплазии, поднимает уровень согласия экспертов до максимально высоких значений, что и понятно: психологически проще идентифицировать один отчетливый признак, чем интерпретировать сложные образы гистоархитектоники слизистой оболочки желудка.

Воспроизводимость практикующими врачами-патологоанатомами Российского пересмотра OLGA-system для оценки стадии хронического гастрита свидетельствует о необходимости обучения врачейпатологоанатомов. Использованные традиционные технологии обучения малоэффективны. В связи с этим, разработан многоуровневый учебнометодический комплекс с использованием когнитивной графики и тестового курса, направленный на формирование у обучающегося диагностической компетентности – умение поставить диагноз «Хронический атрофический гастрит» с определением стадии 0-IV.

Возможно, альтернативным методом детекции атрофии слизистой оболочки желудка является принцип «молекулярной и клеточной мишени» – признака/маркера. Те признаки/маркеры, которые обладают высокой валидностью, могли бы составить диагностическую панель для верификации стадии хронического гастрита.

ВЫВОДЫ 1. При оценке валового патоморфологического материала гастробиопсий на предмет возможности применения стандартов, заданных Российским пересмотром Международной классификации хронического гастрита OLGA-system, из 9312 диагностических случаев (21 156 биоптатов) пригодны оказались 4,03% (375 диагностических случаев).

2. Причины, препятствующие внедрению современной классификационной системы, подразделяются на 2 группы: нарушения стандарта (протокола) эндоскопического забора биопсийного материала (до 54,34%) и нарушения технологии обработки материала гастробиопсии в патологоанатомическом отделении (до 33,19%).

3. При бинарном принципе оценки «есть атрофия/нет атрофии» практикующие патологоанатомы (эксперты) показали уровень критерия согласия, соответствующий 0,64, вполне сопоставимый с аналогичным показателем группы международных экспертов, дававших оценку классификации OLGA-system, а также показателю критерия согласия ведущих российских патологов, оценивавших Российский пересмотр OLGA-system.

Все значения коэффициентов находятся в одном интервале - от 0,61 до 0,80, что соответствует градации хорошей степени согласованности.

4. Применение традиционных приемов, используемых в дополнительном профессиональном образовании, продемонстрировало низкую эффективность: значение каппа-коэффициента после обучения снизилось.

5. Учебно-методический комплекс «Многоуровневый визуальный тренажер диагностики/распознавания атрофии слизистой оболочки желудка» с использованием референтной базы данных позволил существенно повысить критерий согласия, (увеличение взвешенной каппы Коэна с 0,24 до 0,42), что соответствует умеренному уровню согласованности и обеспечивает воспроизводимость классификационной системы.

6. Оценка маркерного признака наличие бокаловидных клеток (кишечная метаплазия с молекулярной мишенью MUC2 или без нее) выявила максимальный критерий согласия экспертов 1,0 (метод невзвешенной каппы Коэна), что служит обоснованием для использования маркерного принципа с целью детекции атрофии слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите.

7. Разработка маркерного принципа (детекция молекулярных и клеточных мишеней с оценкой их валидности) позволяет выделить молекулы-кандидаты для последующей разработки диагностической панели биомаркеров атрофии слизистой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Шиманская А.Г. «Критерий согласия» и качество патологоанатомической диагностики эпителиальной неоплазии/дисплазии в гастроэнтерологии / А.Г. Шиманская, А.В. Кононов // Материалы Всероссийской научно-практической патологоанатомической конференции «Актуальные проблемы патологоанатомической службы муниципальных учреждений здравоохранения. Вопросы экологической патологии. Современные методы морфологической диагностики в патологоанатомической практике». – Челябинск, 2008. – С.182-186.

2. Мозговой С.И. Российский пересмотр Международной классификации хронического гастрита: оценка нового диагностического подхода методами каппа-статистики / С.И. Мозговой, А.Г. Шиманская, И.Л. Осинцева и др. // Омский научный вестник. – 2010. – №1 (94). – С. 84 – 88.

3. Кононов А.В. Морфогенез атрофии слизистой оболочки желудка как основа фенотипа хронического гастрита / А.В. Кононов, С.И.

Мозговой, М.В. Маркелова, А.Г. Шиманская // Архив патологии. – 2011. - № 3. – С. 26-31.

4. Кононов А.В. Российский пересмотр классификации хронического гастрита: воспроизводимость оценки патоморфологической картины / А.В. Кононов, С.И. Мозговой, А.Г. Шиманская и др. // Архив патологии.

– 2011. - № 4. – С. 52-56.

5. Шиманская А.Г. Применение метода оценки согласия экспертов в технологии патоморфологического мониторинга рака желудка кишечного типа / Шиманская А.Г. // Материалы Всероссийской научной школы «Превентивная медицина, вызовы XXI века». – Омск, 2011. – С.

190-192.

6. Шиманская А.Г. Морфологические методы и экспертный подход при верификации атрофии слизистой оболочки желудка в биопсийной диагностике атрофического гастрита / А.Г. Шиманская // Молодой ученый. – 2012. – №4. – С. 496-505.

На правах рукописи ШИМАНСКАЯ Анна Геннадьевна ГИСТОПАТОЛОГИЧЕСКИЙ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ И ЭКСПЕРТНЫЙ МЕТОДЫ ВЕРИФИКАЦИИ АТРОФИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА В БИОПСИЙНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ХРОНИЧЕСКОГО ГАСТРИТА 14.03.02 – патологическая анатомия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Омск – 20Подписано в печать 26.04.20Формат 6084/Бумага офсетная П.л. – 1,Способ печати – оперативный Тираж 1Издательско-полиграфический центр ОмГМА 644050, г. Омск, пр. Мира, 30, тел. 60-59-







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.