WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ПОПОНИНА АННА МИХАЙЛОВНА

ГЕМОПОЭЗСТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ НА ПОЛИЭТИЛЕНОКСИДЕ

ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В УСЛОВИЯХ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ МИЕЛОСУПРЕССИИ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

14.03.03 – патологическая физиология

       

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Томск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор,  академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ

Дыгай Александр Михайлович

доктор медицинских наук

Скурихин Евгений Германович

Официальные оппоненты:

Алиев Олег Ибрагимович, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория фармакологии кровообращения, ведущий научный сотрудник

Воронкова Ольга Владимировна, доктор медицинских наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедра патологической физиологии, профессор

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится “___”______________2012 г. в___часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан “  ” 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук                Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Характерным осложнением у онкологических больных, получавших полихимиотерапию, выступает стойкая депрессия кроветворения [Skillings J.R., 1993; Barrett-Lee P.J., 2000; Зак К.П., Грыцюк С.Н., 2001; Бредер В.В. и др., 2002; Littlewood T.J., Collins G.R., 2007; Woo S. et al., 2007]. Лейкопения, анемия, тромбоцитопения и другие гематологические нарушения значительно ухудшают качество жизни пациентов, снижая при этом сопротивляемость к инфекциям, усугубляют многие негативные явления проводимого противоопухолевого лечения [Moullet I. et al., 1998; Groopman J.E., Itri J., 1999; Beutel G., Ganser A., 2007].

За последние 50 лет подходы к терапии цитостатических и лучевых миелодепрессий претерпели значительные изменения. Достаточно длительное время характер лечебных мероприятий при различных нарушениях кроветворения ограничивался антибиотикотерапией возникших инфекционных осложнений и назначением комплекса поддерживающих препаратов. К числу таких соединений относятся неспецифические протекторы гемопоэза (зимозан, спленин, витамины С, В1, В6), гормоны, соли лития и др. [Byron J.W., 1970; Greco F.A., Breton H.D., 1977; Rothstein G. et al., 1978; Алмазов В.А. и др., 1981; Гершанович М.А., 1982; Закенфельд Г.К., 1985; Patchen M.L., Mac Vittie T.J., 1985; Мороз Б.Б. и др., 1986; Гольдберг Е.Д. и др., 2000; Жданов В.В. и др., 2002; Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Машковский М.Д., 2007]. Однако клинические наблюдения показали, что при выраженных и длительно текущих миелодепрессиях применение указанных лекарственных средств малоэффективно, более того, в ряде случаев они вызывают различные неблагоприятные побочные эффекты.

Трансфузия тромбоконцентрата и эритроцитарной массы, обычно применяемая для коррекции соответственно тромбоцитопении и анемии, позволяет быстро восполнить число циркулирующих эритроцитов [Mercuriali F., 1997; Бредер В.В. и др., 2002]. При угрожающих жизни состояниях трансфузия незаменима. В то же время анемия при злокачественном процессе носит хронический характер, а частые гемотрансфузии существенно повышают риск возникновения побочных эффектов, таких как передача вирусных инфекций, аллергические реакции и др. [Brunson M.E., 1990; Skillings J.R., 1993; Barrett-Lee P.J., 2000; Птушкин В.В., 2002].

Настоящим прорывом в борьбе с нейтропениями, анемиями, тромбоцитопениями и другими нарушениями системы крови после интенсивной цитостатической терапии можно считать цитокинотерапию. С патогенетических позиций клиническое применение препаратов, созданных на основе рекомбинантных форм цитокинов (миелоидные колониестимулирующие факторы – ГМ-КСФ, Г-КСФ, интерлейкины, эритропоэтин, тромбопоэтин), весьма перспективно [Geissler K., 2000; Demetri G.D., 2001; Basser R., 2002; Abdelrazik N. et al., 2003; Птушкин В.В., 2004; Переводчикова Н.И., 2005; Stasi R. et al., 2005;  Giannini E.G., 2006; Beutel G., Ganser A., 2007;  Jelkmann W., 2007; Littlewood T.J., Collins G.R., 2007]. Связываясь с высокоаффинными специфическими рецепторами, а при увеличении уровня цитокина в крови и тканях – и с рецепторами умеренной аффинности, факторы роста стимулируют пролиферацию и индуцируют дифференцировку соответствующих коммитированных кроветворных клеток-предшественников [Воробьев А.И., 2002; Скурихин Е.Г. и др., 2005; Гольдберг Е.Д. и др., 2007]. Преимущества таких лекарственных средств обусловлены их исключительно высокой активностью и возможностью целенаправленного воздействия на основное звено патогенеза соответствующего гематологического расстройства [Moore M.A.S., Warren D.I., 1987; Moore M.A., 1989; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Гольдберг В.Е., 2001; Glaspy J.A., 2003]. Недостатками применения препаратов рекомбинантных цитокинов являются малая эффективность при краткосрочном применении и развивающиеся осложнения при длительном введении.

В настоящее время нуклеиновые кислоты и их производные рассматриваются как средства для профилактики и лечения нарушений в системе крови на фоне цитостатической терапии [Серебрянная Н.Б., Новик А.А., 2001; Машковский М.Д., 2007]. Кроме того, препараты нуклеиновых кислот успешно применяют в кардиологии, пульмонологии, андрологии, гастроэнтерологии, эндокринологии, онкологии, неврологии, иммунологии [Каплина Э.Н., 2000, 2005; Караулов А.В., 2002; Машковский М.Д., 2008]. Оправдано их назначение при нарушениях свертывающей системы [Карамышев В. Н., 1993; Касьяненко Ю.И., 1999] и аутоиммунных заболеваниях [Каплина Э.Н., 2005], при диабете, боковом амиотрофическом склерозе, артритах [Bodera P., 2011], бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни лёгких [Parry-Billings M., Ferrari N., Seguin R., 2010], мышечной дистрофии [Heemskerk H. et al., 2010]. Как видно, мишенью для нуклеиновых кислот выступают любые ткани. Однако, как и в случае применения многих высокоактивных молекул, нерешённой проблемой терапии препаратами нуклеиновых кислот является адресная доставка к тканям, относительно низкая концентрация в клетке и быстрая деградация нуклеазами в лизосомах.

Большие надежды в решении этих проблем связывают с модификацией биологически активных соединений с помощью присоединения к ним молекул полиэтиленоксида (пегилирование). Так, использование технологии иммобилизации молекул на носителях низкой молекулярной массы  электронно-лучевым (радиационным) синтезом [Vereschagin E.I. et al., 2001] позволяет, с одной стороны, пролонгировать активность лекарственного средства (в силу более продолжительного нахождения в крови), с другой стороны – устраняет многие нежелательные побочные реакции (в силу низкой иммуногенности и малой токсичности получаемых соединений) (иммобилизированные Г-КСФ, эритропоэтин и др.) [Дыгай А.М., Артамонов А.В., Верещагин Е.И., Мадонов П.Г., 2009; Дыгай А.М. и др., 2009; Андреева Т.В. и др., 2010; Дыгай А.М. и др., 2010, 2011]. Известно, что гиалуронидаза уменьшает вязкость гиалуроновой кислоты, вызывая ее распад до глюкозамина и глюкуроновой кислоты, тем самым, увеличивая проницаемость тканей, в том числе, для фармакологических агентов [Bitencourt C.S. et al., 2011]. С нашей точки зрения, наиболее перспективным является совместное назначение модифицированного лекарственного средства с веществом, снижающим вязкость межклеточного матрикса. Так, в частности, продемонстрировано увеличение биодоступности модифицированного радиационным синтезом Г-КСФ при его совместном назначении с гиалуронидазой [Андреева Т.В. и др., 2010].

В связи с вышесказанным, является актуальным изучение гемопоэзстимулирующей активности, назначаемых изолированно и совместно, иммобилизированных на полиэтиленоксиде электронно-лучевым синтезом олигонуклеотидов и гиалуронидазы.

Цель исследования. Изучить гемопоэзстимулирующую активность иммобилизированных на полиэтиленоксиде олигонуклеотидов, назначаемых изолированно или совместно с иммобилизированной гиалуронидазой, в условиях цитостатической миелосупрессии.

Задачи исследования:

1. Оценить зависимость скорости восстановления лейкоцитов в периферической крови в условиях цитостатической миелосупрессии, вызванной циклофосфаном, от дозы иммобилизированных на полиэтиленоксиде олигонуклеотидов.

2. На модели цитостатической миелосупрессии исследовать влияние различных доз иммобилизированной на полиэтиленоксиде гиалуронидазы на скорость восстановления числа лейкоцитов периферической крови.

3. Разработать схему совместного применения пегилированных веществ, при которой иммобилизированная гиалуронидаза усиливает гемопоэзстимулирующую активность иммобилизированных олигонуклеотидов в условиях цитостатического воздействия.

4. На модели цитостатической миелосупрессии изучить влияние изолированно вводимых иммобилизированных олигонуклеотидов, а также их комбинации с иммобилизированной гиалуронидазой на костномозговое кроветворение.

5. Вскрыть механизмы гемостимулирующих эффектов пегилированных олигонуклеотидов в условиях их изолированного или сочетанного с иммобилизированной гиалуронидазой применения.

Научная новизна работы. В работе на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной однократным введением циклофосфана в МПД, выявлена гемопоэзстимулирующая активность иммобилизированных олигонуклеотидов (имОН), вводимых мышам линии CBA/CaLac перорально, а также механизмы их действия. Показана возможность повышения иммобилизированной гиалуронидазой фармакологической активности иммобилизированных олигонуклеотидов при цитостатической миелосупрессии.

Результаты скрининговых исследований показали, что в условиях введения цитостатика иммобилизированные олигонуклеотиды ускоряют процессы регенерации периферического звена гранулоцитарного ростка кроветворения во всех исследуемых дозах (50, 100, 150, 200, 250 мг/кг). Наиболее выраженный стимулирующий эффект отмечается у животных, получавших имОН в дозе 200 мг/кг.

На модели миелосупрессии, вызванной циклофосфаном, выявлено, что иммобилизированная гиалуронидаза ускоряет восстановление содержания сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови мышей в дозе 50 ЕД/кг и не влияет на их число в дозе 25 ЕД/кг.

При изучении костномозгового кроветворения животных, подвергнутых  цитостатическому воздействию (циклофосфан), установлено, что наиболее чувствительным к стимулирующему действию иммобилизированных олигонуклеотидов (200 мг/кг) является гранулоцитарный росток кроветворения. В основе эффектов иммобилизированных олигонуклеотидов лежит увеличение содержания эритроидных и гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников в костном мозге и усиление их дифференцировки в зрелые кроветворные клетки, при этом снижаются секреторная активность клеток кроветворного микроокружения и уровень сывороточных ростовых факторов.

На модели миелосупрессии (циклофосфан) продемонстрировано, что  кратковременное (2-кратное) назначение  иммобилизированной гиалуронидазы повышает эффективность коррекции иммобилизированными олигонуклеотидами нарушений со стороны костномозгового эритро- и гранулоцитопоэза, ускоряет восстановление количества лейкоцитов в периферической крови. Более длительное (3-кратное, 7-кратное) введение имГД, напротив, препятствует проявлению гемопоэзстимулирующей активности имОН. В основе феномена потенцирования лежит увеличение содержания гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников в кроветворной ткани.

Практическая значимость работы. Продемонстрирована высокая эффективность перорального использования нового отечественного гемостимулятора, представляющего собой иммобилизированные с помощью оригинальной технологии электронно-лучевого синтеза олигонуклеотиды (разработанной ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г. Новосибирск совместно с ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г. Томск). Полученные результаты о потенцирующих свойствах иммобилизированной гиалуронидазы могут явиться основой для разработки новых методов усиления активности гемостимуляторов при гипопластических состояниях кроветворной ткани.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы.» (Екатеринбург, 2010), VI региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы, из них 2 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками, 30 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 296 источников, из них 84 отечественных и 212 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 625 мышах-самцах линии СВА/CaLac в возрасте 7-8 недель. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) разводки ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется) содержались в соответствии с «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986).

Для моделирования цитостатической миелосупрессии использовали циклофосфан («Биохимик», Саранск), который непосредственно перед применением растворяли в стерильном физиологическом растворе и вводили экспериментальным животным однократно внутрибрюшинно в максимально переносимой дозе (МПД), составившей по результатам пробит-анализа 200 мг/кг. Объем введения составлял 0,1 мл.

Изучаемые в исследовании иммобилизированные олигонуклеотиды (имОН) представляют собой ДНК из молок лососевых, модифицированные активированным полиэтиленоксидом молекулярной массой 1500 Да с помощью электронно-лучевого синтеза (производитель: ООО «Scientific Future Management», г. Новосибирск). Для получения конъюгатов олигонуклеотиды вносили в 2% раствор полиэтиленоксида (1500 Да), обработанного потоком ускоренных электронов (ионизирующее излучение), генерируемым ускорителем ИЛУ-6. Концентрация ДНК по методу Спирина составляла 45 мг/г. Подобным образом конъюгировали с полиэтиленоксидом гиалуронидазу (имГД): для получения конъюгатов гиалуронидазу вносили в 5% раствор полиэтиленоксида (1500 Да). Иммобилизированные олигонуклеотиды и гиалуронидазу вводили перорально. Доза вводимых имОН составила 50, 100, 150, 200 и 250 мг/кг, доза иммобилизированной гиалуронидазы – 25 и 50 ЕД/кг. Объём введения составлял 0,2 мл. Введение веществ осуществляли ежедневно один раз в день (в 9 ч утра). При изучении зависимости скорости восстановления подавленного циклофосфаном периферического звена гранулоцитарного ростка кроветворения от дозы исследуемых веществ иммобилизированные олигонуклеотиды вводили в течение последующих после цитостатического воздействия 7 суток,  имГД – на 1, 3 и 5-е сутки.

В экспериментах, направленных на разработку схемы совместного применения пегилированных субстанций, при которой иммобилизированная гиалуронидаза способна потенцировать гранулоцитопоэзстимулирующую активность иммобилизированных олигонуклеотидов, вещества вводились мышам в эффективных дозах, выявленных в предыдущих скрининговых исследованиях, по схемам, представленным в таблице.

Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили per os эквивалентный объем физиологического раствора. Фоновые показатели получали при использовании интактных животных.

Таблица

Схемы совместного применения иммобилизированной гиалуронидазы и иммобилизированных олигонуклеотидов

Сроки

исследования

(сутки)

1 схема

2 схема

3 схема

имГД

имОН

имГД

имОН

имГД

имОН

0

введение циклофосфана

1

+

+

+

+

+

+

2

+

+

+

+

+

3

+

+

+

+

+

4

+

+

+

+

5

+

+

+

+

+

6

+

+

+

+

7

+

+

+

+

Примечание. + введение изучаемых субстанций

Показатели периферической крови и костного мозга определяли стандартными гематологическими методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Содержание гранулоцитарно-макрофагальных (КОЕ-ГМ) и эритроидных (КОЕ-Э) клеток-предшественников определяли методом клонирования in vitro в полувязкой культуральной среде [Ventura G.J. et al., 1990; Gerard J. et al., 1990; Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Интенсивность созревания гранулоцитарно-макрофагальных и эритроидных клеток-предшественников оценивали по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в одной лунке) [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Колониестимулирующую (КСА) и эритропоэтическую (ЭПА) активности  кондиционных сред прилипающих и неприлипающих миелокариоцитов, а также сыворотки крови тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. При этом КСА и ЭПА выражали количеством выросших гранулоцитарно-макрофагальных и эритроидных колоний соответственно (на 105 миелокариоцитов) [Гольдберг Е.Д. и др., 1992].

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения IBM. Вычисляли среднее арифметическое (), ошибку среднего арифметического (m), значение вероятности (P) [Зайцев Г.Н., 1984]. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным в случае, если вероятность их тождества была меньше 5% (p<0,05). Используя выборочные коэффициенты асимметрии и эксцесса, оценивали степень приближения закона распределения исследуемого признака к нормальному. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента [Урбах В.Ю., 1975]. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараметрический U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни [Урбах В.Ю., 1975; Гублер Е.В., 1978].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе нами изучалась зависимость скорости восстановления подавленного цитостатиком периферического звена гранулоцитарного ростка кроветворения от доз иммобилизированных олигонуклеотидов (50, 100, 150, 200, 250 мг/кг) и гиалуронидазы (25 и 50 ЕД/кг).

На циклофосфановой модели миелосупрессии было показано, что вводимые в течение 7 дней иммобилизированные олигонуклеотиды препятствовали развитию нейтрофильной лейкопении в периферической крови экспериментальных животных, при этом нейтрофилёз развивался на сутки раньше с показателями мышей, получавшими только алкилирующий агент (рис. 1). Максимально выраженный эффект имОН отмечался в дозе 200 мг/кг (2, 6, 8, 10-е сутки). Примечательно, что на 10-е сутки опыта в группе с использованием пегилированных олигонуклеотидов в дозе 200 мг/кг количество лимфоцитов повышалось и достигало уровня интактного контроля.

Рис. 1. Влияние различных доз иммобилизированных олигонуклеотидов на содержание сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови мышей линии CBA/CaLac при назначении циклофосфана. Окрашенным символом обозначена достоверность различия от цитостатического контроля (P<0.05)

Таким образом, по результатам скрининговых исследований установлено, что в условиях цитостатической миелосупрессии пероральный приём иммобилизированных олигонуклеотидов вызывал умеренное повышение содержания нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов. Прослеживается зависимость выраженности эффекта от дозы препарата: 200 мг/кг > 150 мг/кг > 100 мг/кг > 50 мг/кг. 

При изучении вопроса о возможном влиянии иммобилизированной гиалуронидазы (25 и 50 ЕД/кг) на процессы восстановления кроветворения был выявлен ряд закономерностей. Пероральное введение экспериментальным животным имГД на 1, 3 и 5-е сутки после цитостатического воздействия повышало количество палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови (10, 12-е сутки). Как и в случае с имОН, прослеживается зависимость стимулирующего эффекта от дозы назначаемой имГД: наибольший прирост нейтрофилов наблюдался в группе 50 ЕД/кг. В противоположность этому, содержание лимфоцитов в крови мышей, получавших пегилированную гиалуронидазу, уменьшалось (6, 8, 12-е сутки).

Итак, в условиях введения циклофосфана вводимая перорально иммобилизированная гиалуронидаза оказывала избирательное стимулирующее влияние на содержание нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, при этом эффект в группе мышей, получавших препарат в дозе 50 ЕД/кг, оказался выше, чем в группе животных, которым вводили имГД в дозе 25 ЕД/кг.

Обнаруженная активность вводимых изолированно пегилированных субстанций в отношении лейкоцитов периферической крови предопределила изучение их действия на костномозговое кроветворение. Так, в условиях введения циклофосфана иммобилизированные олигонуклеотиды в дозе 200 мг/кг достоверно повышали содержание незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге на 8-е сутки (на 47,2%), а их зрелых форм на 4-е сутки (на 15,3%), способствовали накоплению эритрокариоцитов на 2, 4-е сутки исследования (рис. 2, 3). В период с 11-х по 13-е сутки исследования отмечался прирост числа моноцитов (на 100-400% выше цитостатического контроля). В противоположность этому, содержание лимфоидных клеток  у мышей снижалось (4, 5-е сутки).

На фоне введения ЦФ иммобилизированная гиалуронидаза (50 ЕД/кг) достоверно увеличивала количество костномозговых незрелых (на 18-194%) и зрелых (на 55-108%) нейтрофильных гранулоцитов на 11-15-е сутки, моноцитов – на 10-13-е сутки (на 50-400%) и эритрокариоцитов – на 5-е сутки (на 82%) по отношению к цитостатическому контролю. В то же время, на лимфоидные элементы и эозинофильные клетки имГД не оказывала существенного влияния.

Таким образом, в условиях цитостатической миелосупрессии пегилированные на полиэтиленоксиде олигонуклеотиды (200 мг/кг) и гиалуронидаза (50 ЕД/кг) увеличивали активность костномозгового эритро- и гранулоцитопоэза. При этом препараты не влияли (имГД) либо уменьшали (имОН) (за счёт выхода в периферическую кровь) количество лимфоцитов в кроветворной ткани.

Рис. 2. Влияние изолированно и совместно вводимых имОН (200 мг/кг) и имГД (50 Ед/кг) на содержание эритрокариоцитов в костном мозге мышей линии CBA/CaLac при назначении циклофосфана. Окрашенным символом обозначена достоверность различия показателя от такового в цитостатическом контроле (P<0.05), + достоверность различия с животными, получавших изолировано иммобилизированные олигонуклеотиды (P<0.05).

В целом полученные результаты указывают на перспективность использования изолированно вводимых иммобилизированных олигонуклеотидов и гиалуронидазы при цитостатических лейкопениях и анемиях. Как было уже сказано выше, гиалуронидаза in vitro и in vivo во многом усиливает проявление эффектов целого ряда биологически активных молекул (Г-КСФ, инсулин и др.) [Дыгай А.М. и др., 2011; Morrow L. et al., 2011]. В этой связи, следующая серия экспериментов была направлена на изучение возможности усиления имГД гемопоэзстимулирующей активности имОН на модели циклофосфановой миелосупрессии.

Первый этап работы был посвящён решению вопроса, касающегося выбора схемы введения иммобилизированных субстанций (табл.). Предварительно экспериментальные животные были поделены на три группы. При этом всем особям независимо от групповой принадлежности иммобилизированные олигонуклеотиды вводились однократно на 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7-е сутки после цитостатического воздействия. Межгрупповые различия заключались в особенностях введения имГД. Иммобилизированную гиалуронидазу мыши первой группы получали ежедневно на 1-7-е сутки опыта, животные второй группы – на 1, 3, 5-е сутки после цитостатической атаки, мыши третьей группы – на 1 и 2-е сутки. Следует отметить, что иммобилизированные олигонуклеотиды назначали через 1 час после введения имГД.

Рис. 3. Влияние изолированно и совместно вводимых имОН (200 мг/кг) и имГД (50 Ед/кг) на содержание незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге мышей линии CBA/CaLac при назначении циклофосфана. Окрашенным символом обозначена достоверность различия показателя от такового в цитостатическом контроле (P<0.05), + достоверность различия с животными, получавших изолировано иммобилизированные олигонуклеотиды (P<0.05).

Анализ полученных данных показал, что схема введения иммобилизированной гиалуронидазы существенно влияла на проявление гранулоцитопоэзстимулирующей активности имОН. Так, назначение имГД в течение 7-и дней не оказывало потенцирующего влияния на инициированное имОН усиление выхода в кровь клеток гранулоцитарного ростка кроветворения. Напротив, в 1 группе наблюдалось падение числа сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови на 6-е сутки (на 33,6%, P<0,05) по сравнению с показателями мышей, получавших только имОН.

Введение иммобилизированной гиалуронидазы на 1, 3, 5-е сутки опыта отменяло стимуляцию гранулоцитарного ростка кроветворения, наблюдаемую в группе с иммобилизированными олигонуклеотидами. В этой группе динамика содержания нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов в периферической крови практически не отличалась от таковой у мышей, получавших только циклофосфан. Исключение составили 12-е сутки, когда количество палочкоядерных нейтрофилов достоверно уменьшалось и составило 75,5% от интактного контроля при 353% в цитостатическом контроле и 221% – у животных с имОН.

Ожидаемый потенцирующий эффект наблюдался в случае дополнительного введения иммобилизированной гиалуронидазы дважды: на 1 и 2-й день после введения алкилирующего агента. У мышей 3 группы отмечался более интенсивный прирост числа лимфоцитов, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови, чем у животных, получавших только имОН (10, 12-е сутки).

Таким образом, в условиях цитостатической миелосупрессии кратковременное назначение (дважды) иммобилизированной гиалуронидазы повышало эффективность коррекции пегилированными олигонуклеотидами нарушений со стороны белой крови. Более длительное введение имГД, напротив, препятствовало проявлению гранулоцитопоэзстимулирующей активности имОН.

Костномозговое кроветворение мышей, одновременно получавших иммобилизированные олигонуклеотиды и гиалуронидазу (3 схема), существенно отличалось от такового в группах экспериментальных животных, которым препараты вводили изолировано. Так, совместное введение пегилированных субстанций повышало ОКК не только относительно цитостатического контроля, но и по сравнению с животными, получавшими по отдельности имОН или имГД (3-и сутки). Анализ морфологического состава костного мозга показал, что в основе выявленного эффекта лежало достоверное повышение количества незрелых нейтрофилов, эритрокариоцитов и лимфоцитов. Кроме 3-их суток опыта увеличение числа незрелых нейтрофильных гранулоцитов в опыте отмечалось на 4, 6-е сутки, а эритроидных элементов – на 4, 5-е сутки. При этом содержание указанных форм миелокариоцитов было достоверно выше в группе с изолировано вводимыми иммобилизированной гиалуронидазой и иммобилизированными олигонуклеотидами. Количество эозинофильных гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов и эритроидных клеток на протяжении всего исследования оставалось ниже интактного контроля.

Полученные результаты свидетельствуют о взаимопотенцирующем действии препаратов иммобилизированной гиалуронидазы и иммобилизированных олигонуклеотидов, заключающемся в ускорении процессов регенерации кроветворной ткани и восстановлении клеточности эритроидного и гранулоцитарного ростков при цитостатической миелосупрессии.

Исследование гемостимулирующих свойств потенциально активных молекул подразумевает вскрытие механизмов вызываемых ими эффектов. Знание особенностей реакций основных элементов, участвующих в кроветворении (стволовые клетки, коммитированные предшественники, клетки кроветворного микроокружения), позволяет во многом предотвратить врачебные ошибки при клиническом применении препаратов – гемостимуляторов (в том числе, развитие различных неблагоприятных для организма реакций).

В нашем исследовании были изучены сдвиги со стороны коммитированных предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза и уровень колониестимулирующей и эритропоэтической активностей в биологических средах (кондиционные среды клеток костного мозга и сыворотка крови).

Проведённые эксперименты позволили установить, что пероральное введение иммобилизированных олигонуклеотидов на фоне цитостатической миелосупрессии приводило к увеличению содержания гранулоцитарно-макрофагальных (2-е сутки) и эритроидных (3, 4-е сутки) колониеобразующих единиц в костном мозге (рис. 4, 5). При этом наблюдалась стимуляция дифференцировки коммитированных кроветворных предшественников (2, 3-и сутки). На 6-е сутки опыта индекс созревания гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников у животных, получавших имОН, составил 10% от исходного при 291% в цитостатическом контроле.

Рис. 4. Влияние изолировано и совместно вводимых имОН (200 мг/кг) и имГД (50 Ед/кг) на содержание гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в костном мозге мышей линии CBA/CaLac при цитостатическом воздействии. Окрашенным символом обозначена достоверность различия показателя от такового в цитостатическом контроле (P<0.05), + достоверность различия с животными, получавших изолировано иммобилизированные олигонуклеотиды (P<0.05).

Иммобилизированная гиалуронидаза не влияла на содержание и функциональную активность эритроидных клеток-предшественников на протяжении всего периода после введения циклофосфана (рис. 4, 5). В свою очередь количество гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц падало на 6-е сутки опыта.

При совместном назначении иммобилизированных олигонуклеотидов и гиалуронидазы содержание КОЕ-ГМ в костном мозге существенно увеличивалось на 3 и 4-е сутки после цитостатического воздействия (рис. 4). Величина показателя на 95% (P<0,05) превосходила таковую в группе животных с изолировано вводимыми имОН. В то же время, имГД снижала инициированный иммобилизированными олигонуклеотидами рост количества КОЕ-Э с 282% до 185% (4-е сутки) (рис. 5). Индекс созревания эритроидных клеток-предшественников у мышей опытной группы не отличался от показателя в группе с изолированной иммобилизированной гиалуронидазой на протяжении всего периода исследования.

Рис. 5. Влияние изолировано и совместно вводимых имОН (200 мг/кг) и имГД (50 Ед/кг) на содержание эритроидных предшественников в костном мозге мышей линии CBA/CaLac при цитостатическом воздействии. Окрашенным символом обозначена достоверность различия показателя от такового в цитостатическом контроле (P<0.05), + достоверность различия с животными, получавших изолировано иммобилизированные олигонуклеотиды (P<0.05).

При изучении колониестимулирующей и эритропоэтической активностей оказалось, что в условиях введения циклофосфана изолированные иммобилизированные олигонуклеотиды и гиалуронидаза, а также комбинация исследуемых препаратов отменяли высокие уровни сывороточной КСА (2-е сутки) и ЭПА (4-е сутки) и снижали продукцию факторов роста КОЕ-ГМ (5-е сутки) и КОЕ-Э (3-и сутки) клетками кроветворного микроокружения.

Итак, при цитостатической миелосупрессии иммобилизированная гиалуронидаза усиливает стимулирующий эффект иммобилизированных олигонуклеотидов в отношении гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников и снижает скорость восстановления КОЕ-Э. В противоположность этому, дополнительное введение имГД оказывало ингибирующее влияние на продукцию ростовых факторов клетками кроветворного микроокружения, снижало их уровень в сыворотке крови.

Механизм действия иммобилизированных олигонуклеотидов, по всей видимости, не ограничивается их стимулирующим влиянием на коммитированные кроветворные клетки-предшественники. По некоторым данным олигонуклеотиды in vitro способны стимулировать образование колоний из колониеобразующих единиц гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарного типа (КОЕ-ГЭММ) [Patinkin D. et al., 2003]. Учитывая сведения литературы и результаты собственных исследований о возможности управления функциями клеточных элементов путём модификации свойств гликокаликса и межклеточного матрикса с помощью гиалуронидазы [Noble P.W., 2002; Stern R., 2003; Дыгай А.М. и др., 2009], весьма обоснованным выглядит предположение о зависимости ускорения процессов регенерации кроветворной ткани и восстановления клеточности периферической крови от изменения способности кроветворных клеток-предшественников под влиянием иммобилизированной гиалуронидазы отвечать на регуляторные стимулы, определяемые введением имОН. Мы не исключаем также возможность стимуляции гемопоэза продуктами деградации гиалуроновой кислоты. Так, усиление грануломоноцитопоэза может быть связано со стимуляцией глюкуроновой кислотой процессов пролиферации гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников и образования гемопоэтических островков гранулоцитарного типа [Гольдберг Е.Д. и др., 2007].

ВЫВОДЫ

1. Введение иммобилизированных олигонуклеотидов на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии (циклофосфан в МПД) сопровождается ускорением восстановления содержания нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови, при этом наиболее выраженный гемостимулирующий эффект наблюдается при использовании иммобилизированных олигонуклеотидов в дозе 200 мг/кг.

2. Иммобилизированная гиалуронидаза в дозе 50 ЕД/кг обладает умеренными гемостимулирующими свойствами, проявляющимися в увеличении количества нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови в условиях введения циклофосфана.

3. Введение иммобилизированной гиалуронидазы (на 1 и 2-е сутки после цитостатического воздействия, но не более длительными курсами), существенно повышает эффективность коррекции иммобилизированными олигонуклеотидами нарушений в периферическом звене гранулоцитарного ростка кроветворения при назначении циклофосфана.

4. При цитостатическом воздействии иммобилизированные олигонуклеотиды в большей степени стимулируют костномозговой гранулоцитопоэз, а иммобилизированная гиалуронидаза способствует возрастанию в костномозговой ткани числа эритроидных и нейтрофильных клеток. Совместное применение иммобилизированной гиалуронидазы  и иммобилизированных олигонуклеотидов сопровождается потенцированием их гемостимулирующих эффектов, заключающемся в ускорении процессов регенерации кроветворной ткани и восстановления количества лейкоцитов в периферической крови.

5. В основе гемопоэзстимулирующей активности пегилированных олгинуклеотидов, а также усиления их действия иммобилизированной гиалуронидазой лежит увеличение содержания коммитированных кроветворных клеток-предшественников в костном мозге на фоне снижения продукции колониестимулирующих активностей клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дыгай А.М., Скурихин Е.Г., Першина О.В., Жданов В.В., Хмелевская Е.С., Андреева Т.В., Попонина А.М., Зюзьков Г.Н., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Мирошниченко Л.А., Ставрова Л.А., Чайковский А.С., Маркова Т.С., Гурто Р.В., Брюшинина О.С., Слепичев В.А.. Гемопоэзстимулирующая активность препаратов иммобилизированных олигонуклеотидов и гиалуронидазы в условиях цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. – 2010. – Т. 150, № 11. – С. 545-549.

2. Дыгай А.М., Скурихин Е.Г., Першина О.В., Минакова М.Ю., Хмелевская Е.С., Андреева Т.В., Попонина А.М. Моноаминергическая регуляция кроветворения при экстремальных воздействиях // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2010. – Т. 32, № 4. – С. 64-68.

3. Попонина А.М., Андреева Т.В., Хмелевская Е.С. Эффекты и механизмы гемопоэзстимулирующего действия иммобилизированных олигонуклеотидов при цитостатической миелосупрессии // Сибирский онкологический журнал. – 2011. – Приложение 1. – С. 95.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

имГД – иммобилизированная гиалуронидаза

имОН – иммобилизированные олигонуклеотиды

КОЕ-ГМ – гранулоцито-макрофагальная колониеобразующая единица

КОЕ-ГЭММ – гранулоцито-эритро-макрофагально-мегакариоцитарная колониеобразующая единица

КОЕ-Э – эритроидная колониеобразующая единица

КСА – колониестимулирующая активность

МПД – максимально переносимая доза

ЭПА – эритропоэтическая активность




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.