WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На  правах  рукописи

РОЛИК ОЛЬГА ИВАНОВНА

  ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ  ЗАЩИТА  ЭНДОТЕЛИЯ  ДОНОРСКИХ РОГОВИЦ  ГОМОЛОГИЧНЫМИ  КЛЕТОЧНЫМИ  ПЕПТИДАМИ  НА ЭТАПЕ  КОНСЕРВАЦИИ

14.01.07 – глазные  болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук

Москва - 2012 

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Министерства Здравоохранения  России

Научные руководители:

доктор медицинских наук

Борзенок Сергей Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор  Онищенко Нина Андреевна

Официальные оппоненты:

Каспаров Аркадий Александрович доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения реконструктивной микрохирургии глаза НИИ глазных болезней РАМН

Слонимский Юрий Борисович
доктор медицинских наук, профессор, доцент кафедры офтальмологии РМАПО

Ведущая организация:

ФГБУ «МНИИ Глазных болезней им. Гельмгольца» Министерства Здравоохранения  России

Защита состоится «3» декабря 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских диссертаций Д.208.014.01 при ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России по адресу: 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Министерства Здравоохранения России

Автореферат разослан «2» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук В.В. Агафонова

Список сокращений

БАВ  -

Биологически активные вещества

ЗАПК  -

Задняя автоматизированная послойная кератопластика

ПЭК  -

Плотность эндотелиальных клеток

СКП  -

Сквозная кератопластика

СЭМ  -

Сканирующая электронная микроскопия

ТЭМ  -

Трансмиссионная электронная микроскопия

ЭК  -

Эндотелиальные клетки роговицы (задний эпителий роговицы)

ЭЭД  -

Эпителиально-эндотелиальная дистрофия роговицы

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Для прозрачного приживления сквозного трансплантата роговицы необходима максимальная сохранность морфофункционального состояния клеток эндотелия (заднего эпителия) донорской роговицы (Каспаров А.А. и др., 1990; Хорошилова-Маслова И.П. и др., 1990; Явишева Т.М., 1990; Федоров С.Н. и др., 1993; Ронкина Т.И., 1994; Вит В.В., 2003; Abramo F. et al., 1990;  Hwang D.G. et al., 1993; Krachmer J.H. et al., 2005). После изъятия донорский материал претерпевает ряд патологических изменений, связанных с изменением микроокружения и тканевой ишемией, вызывающих снижение потенциала жизнеспособности и структурные перестройки (Hsu J.K.W. et al., 1999; Krachmer J.H., 2005).

Метод гипотермической консервации является краткосрочным и позволяет сохранять трупные донорские роговицы для трансплантации в культуральных средах при низких положительных температурах. В настоящее время с этой целью используется несколько сред: OPTISOL (табельная среда для всех Глазных банков Америки, Азии, Индии и ряда стран Востока),  EUSOL (европейский аналог среды OPTISOL; широко  применяется в Глазных банках стран ЕвроСоюза), среда Борзенка-Мороз (табельная среда для всех Глазных банков Российской Федерации). Эти среды позволяют сохранять жизнеспособность и основные морфометрические характеристики эндотелия до 6-ти суток консервации (Борзенок С.А., 1998-2008; Слонимский Ю.Б., Слонимский А.Ю., 2004; Directory EEBA, 2002-2006; Heck E., 2005; Sato E.H., 2005).

Консервация роговиц методом органного нормотермического культивирования в средах на основе 199 среды на солях Эрла, рекомендованных европейской ассоциацией глазных банков для органного культивирования донорской роговицы, позволяет сохранять роговичный трансплантат до 30-ти суток (Bredehorn-Mayr T. et al., 2009; Pels E., Rijneveld W.J. 2009).

В настоящее время успех выполнения различного вида кератопластик напрямую связывается с повышением жизнеспособности и морфофункциональной сохранности ЭК донорских роговиц в процессе консервации. С целью повышения резистентности ЭК донорских роговиц к гипотермическому стрессу, фактору длительной изоляции и остановки процессов посмертного апоптоза, все большее внимание привлекает возможность добавления БАВ в культуральные среды (Шумаков В.И. и др., 1983; Борзенок С.А., 2006-2008; Chu Y.I., 2000; Krachmer J.H. et al., 2005; Sornelli F. et al. 2010; Fucherluger T.A. et al. 2011; Peh G.S. et al., 2011).

Данные о фармакологической защите трупных донорских роговиц с помощью гомологичных регуляторных пептидов, на этапе консервации в литературе отсутствуют.

Цель работы: повысить жизнеспособность и трансплантационные качества эндотелиальных клеток трупной донорской роговицы в процессе гипотермической консервации и нормотермического органного культивирования.

Задачи исследования

  1. Разработать рецептуру органных сред для гипотермической консервации и органного культивирования трупных донорских роговиц с включением в их состав регуляторных клеточных пептидов.
  2. Провести сравнительный анализ изменения морфометрических характеристик эндотелиальных клеток трупных роговиц человека в процессе гипотермической консервации и нормотермического культивирования в культуральных средах, содержащих регуляторные клеточные пептиды тканей роговицы.
  3. Провести сравнительный анализ изменений ультраструктурных характеристик эндотелиальных клеток трупных роговиц человека в процессе гипотермической консервации и нормотермического культивирования  в культуральных средах с добавлением в них регуляторных клеточных пептидов тканей роговицы.
  4. Изучить антиапоптотический эффект регуляторных клеточных пептидов на эндотелий донорской роговицы в процессе гипотермической консервации и органного культивирования.
  5. Разработать прогноз потери эндотелиальных клеток донорских роговиц в процессе консервации.

Научная новизна результатов исследования

  1. Впервые установлено, что апоптотический индекс эндотелиальных клеток донорских роговиц в среде Борзенка-Мороз с добавлением регуляторных клеточных пептидов на сроке консервации 9 суток составляет 17,1% при потере плотности эндотелиальных клеток  в этот срок -  4,8%, по сравнению с апоптотическим индексом эндотелиальных клеток донорских роговиц в условиях стандартной консервации – 18,8% и снижением плотности эндотелия на 7,45%.
  2. Впервые установлено, что добавление регуляторных клеточных пептидов в среду Борзенка-Мороз в течение длительной консервации до
    12-ти суток повышает жизнеспособность эндотелиальных клеток донорских роговиц, что проявляется в снижении потери эндотелиальных клеток с 10,5% до 8,5%, замедлении увеличения площади эндотелиальных клеток с 4% до 3%, уменьшении потери гексагональных клеток с 31,4% до  8,7%.
  3. Впервые установлено, что апоптотический индекс эндотелиальных клеток донорских роговиц, консервированных в органной среде на основе среды 199 на солях Эрла с добавлением регуляторных клеточных пептидов на сроке культивирования 18 суток составляет 8,2% при потере плотности эндотелиальных клеток в этот срок -  4,8%, по сравнению с апоптотическим индексом эндотелиальных клеток донорских роговиц в условиях стандартной консервации – 12,3%, и снижением плотности эндотелиальных клеток на 6,3%.
  4. Впервые установлено, что добавление регуляторных клеточных пептидов в стандартную среду для органного культивирования на основе среды 199 на солях Эрла в течение длительного культивирования до 31-их суток повышает жизнеспособность эндотелиальных клеток донорских роговиц, что проявляется в снижении потери эндотелиальных клеток с 11,3% до 8,5%, замедлении увеличения площади эндотелиальных клеток с 7,3% до 6%, снижении потери гексагональных клеток с 41% до 17%.

Практическая значимость результатов исследования

  1. Доказано, что добавление клеточных пептидов в среду Борзенка-Мороз для гипотермической консервации в процессе ее приготовления на заключительном этапе смешивания компонентов в объеме 10 мл в виде  препарата NeyDIL №37 (Р/У ЛРС-008827/08-061108) пролонгирует сроки консервации донорской роговицы до 9 суток.
  2. Доказано, что добавление клеточных пептидов в стандартную среду для органного культивирования, в процессе ее приготовления на заключительном этапе смешивания компонентов в объеме 10 мл в виде  препарата NeyDIL №37 (Р/У ЛРС-008827/08-061108) пролонгирует сроки консервации донорской роговицы до 24-х суток.
  3. Созданные номограммы для  определения потери эндотелиальных клеток донорских роговиц в процессе консервации в  зависимости от вида, срока консервации, состава сред и исходной плотности эндотелия донорского материала, позволяют индивидуально подходить к выбору донорского материала в зависимости от исходной нозологической формы патологии роговицы реципиента.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Добавление регуляторных клеточных пептидов в среды для гипотермической консервации (среда Борзенка-Мороз) и органного культивирования (среда, рекомендованная европейской ассоциацией глазных банков)  способствует снижению потери эндотелиальных клеток в процессе консервации, сохраняет их мономорфизм и гексагональность, ингибирует процессы клеточного апоптоза, что свидетельствует о повышении жизнеспособности эндотелиальных клеток и позволяет пролонгировать сроки гипотермической консервации до 9-ти суток и нормотермической консервации до 24-х суток.
  2. Созданы номограммы, позволяющие рассчитать потерю эндотелиальных клеток донорских роговиц в процессе консервации в  зависимости от вида, срока консервации, состава сред и исходной плотности эндотелия донорского материала, что позволяет индивидуально подходить к выбору донорского материала в зависимости от исходной нозологической формы патологии роговицы реципиента.

Внедрение  в  практику

Результаты исследований внедрены в работу лаборатории трансплантологии и консервации с Глазным Тканевым банком головной организации и Лаборатории наших филиалов ФГБУ «МНТК «МГ» им. акад. С.Н.Федорова».

Результаты диссертационной работы используются в лекционных курсах для клинических ординаторов, аспирантов и курсантов Научно-педагогического центра ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова», а также ординаторов и аспирантов кафедры глазных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета имени А.И. Евдокимова.

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на IV Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И. Шумакова (Москва, 2008); VI Международном научно-практическом конгрессе «Человек в экстремальных условиях: человеческий фактор и профессиональное здоровье» (Москва, 2008); XIX Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине»  (Москва, 2009);  научно-практической конференции «Экологическая медицина и офтальмология» (Москва, 2009); IV Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2009); IX Съезде офтальмологов России (Москва, 2010); V Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2010) ; клинической конференции МНТК «МГ» (Москва, 2010); 23-й ежегодной конференции Европейской Ассоциации Глазных Банков (Фрайбург, Германия, 2011); научно-практической конференции офтальмологов с международным участием «Филатовские чтения», посвященной 75-летию основания ГУ «Институт глазных болезней и тканевой терапии им. В.П.Филатова Национальной академии медицинских наук Украины» (Одесса, Украина, 2011); 2-м международном ежегодном конгрессе EuCornea (Вена, Австрия, 2011); 5-ом Российском общенациональном офтальмологическом форуме (Москва, 2012).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 21-а печатная работа, из них 4 в журналах, рецензированных ВАК РФ и 4 в иностранной печати. По теме диссертационной работы получен 1 патент РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 122-х страницах машинописного текста; иллюстрирована 17-ью таблицами, 24-мя рисунками. Список литературы включает 151 источник, из них 52 - отечественных и 99 - иностранных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Для выполнения задач исследования были отобраны 174 донорские роговицы. Средний возраст доноров составил 32±4 лет. Показатель трансплантабельности донорских роговиц соответствовал 3А, 3B, 2А и 2В  по классификации С.А. Борзенка (2008). Средняя плотность эндотелиальных клеток (ПЭК) донорского материала, вошедшего в эксперимент, составила 2863±265,2 кл/мм2. Роговицы парных донорских глаз составили контрольную группу. При оценке данных СЭМ и ТЭМ за норму принималась морфометрическая и ультраструктурная картина эндотелиального пласта
6-ти донорских роговиц, полученных не позднее 6-ти часов после констатации биологической смерти.

В качестве препарата, содержащего регуляторные клеточные пептиды роговицы, использовался моноорганный препарат NeyDIL №37 StIII, содержащий гомологичные регуляторные пептиды клеточной цитоплазмы эмбриональных роговых оболочек животных в концентрации 100 мкг/мл.

Было проведено in vitro сравнение ультраструктуры, морфометрических характеристик и витальности (апоптотического индекса) эндотелиальных клеток 84-х трупных донорских роговиц от 42-х доноров трупов в условиях гипотермической консервации (t +6о С) в течение 12-ти суток и эндотелиальных клеток 84-х трупных донорских роговиц от 42-х доноров трупов при нормотермическом культивировании (t +35о С) в течение 31-их суток в консервационных средах с добавлением и без добавления в их состав гомологичных клеточных пептидов роговицы.

Применялась стандартная среда для органного культивирования, рекомендованная Европейской ассоциацией глазных банков, без добавления фетальной бычьей сыворотки (чтобы исключить влияние содержащихся в ней факторов роста и регуляторных пептидов на ЭК, культивированных донорских роговиц). Культивирование трупных донорских роговиц проводилось в СО2 инкубаторе. Замена среды осуществлялась каждые 8 суток.

В опытную среду для органного культивирования 42-х донорских роговиц вводился в процессе приготовления среды на заключительном этапе смешивания компонентов пептидный препарат NeyDIL №37 St.III в концентрации 1 мкг/мл среды, который вводился в процессе приготовления среды на заключительном этапе смешивания компонентов. Контрольная группа состояла из 42-х роговиц парных глаз от тех же доноров. Анализ морфометрических и ультраструктурных характеристик эндотелиальных клеток  в опытной и контрольной группах проводился на 1-ые, 8-ые, 16-ые, 24-ые и 31-ые сутки гипотермической консервации, определение процента апоптотически поврежденных клеток проводилось на 1-ые, 8-ые, 16-ые и
18-ые сутки.

Оценивалось состояние ультраструктуры, морфометрические характеристики и витальность ЭК 42-х донорских роговиц, консервированных в условиях гипотермии в среде Борзенка-Мороз с добавлением в ее состав гомологичных клеточных пептидов в виде пептидного препарата NeyDIL №37 St. III в концентрации 1 мг/мл среды, который вводился в процессе приготовления среды на заключительном этапе смешивания компонентов. Контрольная группа состояла из 42-х роговиц парных глаз от тех же доноров. Анализ морфометрических и ультраструктурных характеристик эндотелиальных клеток  в опытной и контрольной группах проводился на 1-ые, 3-ьи, 6-ые, 9-ые и 12-ые сутки гипотермической консервации, определение процента апоптотически поврежденных клеток проводилось на 1-ые, 3-ьи, 6-ые и 9-ые сутки.

Сканирующая электронная микроскопия выполнялась на базе лаборатории анатомии микроорганизмов ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи. Препараты анализировались с помощью сканирующего электронно-ионного микроскопа “Quanta 200 3D” (FEI Company, США).

Трансмиссионная микроскопия выполнялась на базе лаборатории гистохимии и электронной микроскопии НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Исследование функционально-цитологических характеристик - определение процента живых и апоптотически поврежденных клеток проводилось с помощью флуоресцентной микроскопии пласта ЭК донорских роговиц, окрашенных витальными красителями. Слой клеток изучали под люминесцентным инвертированным микроскопом CKX 41 (Olympus, Япония). В проходящем свете производили оценку морфологии клеток, а в ультрафиолетовом диапазоне –подсчет клеток, окрашенных йодидом пропидия (апоптотически поврежденные ЭК) и бисбензимидом (жизнеспособные ЭК), находящихся в поле зрения микроскопа. Подсчет процента апоптотически поврежденных клеток (апоптотический индекс) производился в 30 полях зрения, включающих каждое от 80 до 100 клеток.

Морфометрические исследования плотности, площади, показателя гексагональности эндотелиальных клеток донорских роговиц, проводились неинвазивным способом в динамическом режиме с помощью компьютерного Кератоанализатора для Глазных банков модели 98 фирмы «Konan» (Япония). Также для более полной оценки морфометрического состояния эндотелиального пласта и ПЭК применялся инвертированный световой микроскоп 307 – 143.003 Leitz Wetzlar GmbH (Германия) для подсчета ПЭК рутинным способом с помощью шаблона.

Статистический анализ результатов экспериментальных исследований состояния эндотелиального пласта трупных донорских роговиц опытных и контрольных групп проводился с помощью методов общей статистики с помощью пакета лицензированных программ статистической обработки данных SPSS v. 12.02 для Windows.

Результаты гипотермической консервации

В процессе длительной гипотермической консервации донорских роговиц человека (до 12-ти суток) в опытной группе с применением клеточных регуляторных пептидов роговицы потеря ЭК была достоверно ниже (8,5%) (рис. 1) по сравнению с роговицами контрольной группы (11,6%) (р<0,05).

Рис. 1. График потери ЭК в процессе гипотермической консервации

При анализе электроннограмм ЭК донорских роговиц опытной и контрольной групп в процессе гипотермической консервации было выявлено соответствие данных СЭМ и ТЭМ. Повреждения клеточного скелета и межклеточных контактов ЭК в процессе консервации, выявленные при СЭМ, соответствовали патологическим изменениям органелл и клеточной цитоплазмы ЭК, выявленным при ТЭМ на тех же сроках, что свидетельствовало о достоверности проведенного исследования.

С помощью СЭМ и ТЭМ было установлено, что консервация при t +6 в среде Борзенка-Мороз, содержащей регуляторные клеточные пептиды роговицы, способствует более длительному (до 9-ти суток), чем в контроле (до 6-ти суток) сохранению цитоархитектоники ЭК. Кроме того, была отмечена большая функциональная сохранность ЭК, что выражалось в сохранении процессов внутриклеточной регенерации (гипертрофия клеток и увеличение их полиморфизма), чего не было выявлено в образцах контрольной группы (рис. 2).

Рис. 2. Архитектоника пласта ЭК в центральной зоне роговицы на 9-ые сутки гипотермической консервации. СЭМ. Роговицы опытной группы: А-800х, Б-3000; роговицы контрольной группы: В-800х, где 1 - разрушение межклеточных взаимоотношений с деструкцией билипидного слоя мембран; Г-3000х, где 1 - уменьшение электронно-оптической плотности внутри клеток и в межклеточном пространстве, разрушение клеточного скелета

Гипотермическая консервация донорской роговицы на протяжении 12-ти суток сопровождалась выраженным повреждением цитоскелета и грубыми ультраструктурными изменениями клеток, характерными для состояния аутолиза. Это позволило сделать вывод, что донорский материал консервированный более 9-ти суток в условиях низких положительных температур не пригоден для оптических кератопластик, так как можно прогнозировать большую потерю ЭК в постоперационном периоде.

При изучении изменения витальности ЭК методом флуоресцентной микроскопии с окраской бисбензимидом и йодидом пропидия было выявлено, что процент апоптотически поврежденных клеток в опытной и контрольной  группах на 9-ые сутки превышал верхние границы нормы. После получения данных результатов было решено не продолжать исследование витальности ЭК на 12-ые сутки консервации, так как можно было прогнозировать дальнейшее нарастание процента апоптотически поврежденных клеток (рис. 3).

Рис. 3. График изменения процента ЭК в стадии апоптоза в процессе гипотермической консервации

Результаты нормотермической консервации

В процессе длительного нормотермического культивирования донорских роговиц человека (до 24-х суток) с применением клеточных регуляторных пептидов роговицы, потеря эндотелиальных клеток была меньше  (6,6%) по сравнению с роговицами контрольной группы (10,04%) (рис. 4).

Рис. 4. График потери ЭК в процессе нормотермической консервации

При органном культивировании донорской роговицы в среде с добавлением гомологичных клеточных  пептидов выявлено более длительное (до 24-х суток) ультраструктурное сохранение ЭК (рис. 5, 6).

Рис. 5. Архитектоника пласта ЭК в центральной зоне на 24-ые сутки органного культивирования. СЭМ. Роговицы опытной группы: А-800х, Б-1600х; роговицы контрольной группы: В-800х, Г-1600х, где 1 - уменьшение электронно-оптической плотности внутри эндотелиальных клеток

Рис. 6. Изменение ультраструктуры ЭК роговиц в процессе органного культивирования. ТЭМ. 20000х. 8-ые сутки: А - опыт; Б - контроль; 16 сутки: В - опыт; Г - контроль;  24 сутки: Д – опыт; Е - контроль

Несмотря на длительный срок консервации, ЭК опытной группы максимально сохранили свой мономорфизм, гекса- и пентагональность. Не было выявлено повреждения цитоскелета и нарушения межклеточных связей, что может говорить о протективном действии регуляторных клеточных пептидов на ЭК и повышении их устойчивости к негативному воздействию длительного временного фактора консервации.

Органное культивирование донорской роговицы до 31-их суток  сопровождается выраженным нарушением межклеточных связей, отеком ЭК как в образцах опытной, так и контрольной групп. Это позволяет сделать вывод, что донорский материал, консервированный в условиях нормотермии более 24-х суток, не пригоден для оптических кератопластик, так как полученные результаты позволяют прогнозировать большую потерю ЭК в процессе операции и в послеоперационном периоде.

Анализ витальности ЭК в условиях органного культивирования проводился с интервалом в 8 суток, соответствуя сроку замены среды. Однако при дальнейшем увеличении сроков культивирования данный временной интервал был принят слишком большим, так как показатели апоптотического поражения ЭК уже на 16-ые сутки приближались к верхней границе нормы. Поэтому следующая флуоресцентная микроскопия образцов обеих групп была проведена на 18-ые сутки культивирования. В этот срок превышение нормы клеточного апоптоза было выявлено как в опытной, так и в контрольной группе, поэтому проведение исследования витальности ЭК в более поздние сроки не проводилось (рис. 7).

Рис. 7. График изменения процента ЭК в стадии апоптоза в процессе нормотермического культивирования

Результаты исследования свидетельствуют о том, что регуляторные клеточные пептиды роговицы, входящие в состав органных консервационных сред, обладают антиапоптотическим эффектом на ЭК донорских роговиц, они способствуют сохранению нормальных функциональных показателей ЭК до 9-ти суток при использовании гипотермической консервации и до 24-х суток при органном культивировании.

При сопоставлении данных, полученных при морфометрическом и ультраструктурном анализе изучаемых групп, с данными флуоресцентной микроскопии, выявлено несоответствие благополучной морфологической и ультраструктурной картины эндотелиального пласта с высоким процентом ЭК, находящихся в стадии апоптоза при длительном нормотермическом культивировании (до 24-х суток) и длительной гипотермической консервации (до 16-ти суток). Это свидетельствует о том, что при оценке жизнеспособности роговичного трансплантата недостаточно учитывать только морфометрические и ультраструктурные характеристики ЭК, необходима также морфофункциональная оценка эндотелия, так как клетка с сохранной цитоархитектоникой может быть декомпенсирована в функциональном плане в результате срыва компенсаторно-приспособительных реакций и активации процессов апоптоза.

Исходя из полученных данных по процентному снижению ПЭК в процессе гипотермической и нормотермической консервации, с помощью математического моделирования были рассчитаны формулы и номограммы по прогнозированию ПЭК в зависимости от вида, срока консервации, исходного значения ПЭК донорской роговицы и консервационной среды.

На основании вышеизложенных данных собственных исследований и данных литературы (Ермаков Н.В., 1989, 1994; Мороз З.И., 1990, 2004; Сургуладзе Н.Г., 1990; Каспаров А.А. и др., 1990), был рассчитаны критерии для выбора донорского материала в зависимости от ПЭК и нозологии, по поводу которой должна проводиться кератопластика (табл. 1).

Таблица 1

Критерии выбора донорского материала для кератопластики в зависимости от нозологической формы патологии роговицы и ПЭК

Нозологическая патология роговицы

ПЭК донорского материала, кл/мм

Задняя автоматизированная послойная кератопластика

Первичная ЭЭД

Вторичная ЭЭД

3000-2600

Сквозная кератопластика

Осложненное бельмо

2900 - 2600

Буллезная кератопатия в том числе при первичной и вторичной ЭЭД

2800 - 2600

Ретрансплантация роговицы

3100 - 2800

Кератиты с помутнением роговицы,
в активной фазе

3100 - 2800

Кератоконус

2500 - 2200

Выводы

  1. Введение гомологичных клеточных пептидов из роговиц животных в виде препарата NeyDIL №37 (Р/У ЛРС-008827/08-061108) в концентрации 1 мкг/мл среды в базисную среду Борзенка-Мороз для гипотермической консервации донорских роговиц в процессе ее приготовления на заключительном этапе смешивания компонентов позволяет пролонгировать время консервации до 9-ти суток с сохранением жизнеспособности и цитоархитектоники эндотелиальных клеток донорских роговиц.
  2. Введение гомологичных клеточных пептидов в виде препарата NeyDIL №37 (Р/У ЛРС-008827/08-061108) в концентрации 1мкг/мл среды в базисную  среду для органного культивирования  донорских роговиц, рекомендованную европейской ассоциацией глазных банков, в процессе ее приготовления на заключительном этапе смешивания компонентов, позволяет пролонгировать время консервации до 24-х суток с сохранением жизнеспособности и цитоархитектоники эндотелиальных клеток донорских роговиц.
  3. Длительное нормотермическое культивирование донорских роговиц человека (до 24-х суток) в стандартной среде для органного культивирования донорской роговицы, рекомендованной европейской ассоциацией глазных банков, с применением клеточных регуляторных пептидов роговицы, позволяет снизить потерю эндотелиальных клеток с 9,7% до 6,1%. Использование гомологичных клеточных пептидов при консервации донорских роговиц человека в условиях гипотермии (до 12-ти) суток в среде Борзенка-Мороз снижает потерю эндотелиальных клеток с 10,2% до 8,5%.
  4. Выявлено, что процент апоптотически поврежденных эндотелиальных клеток в роговицах, консервированных в среде Борзенка-Мороз и органной среде на основе 199 среды на солях Эрла, с добавлением гомологичных клеточных пептидов, в условиях гипотермии и нормотермии в сроки до 9-ти и 18-ти суток, снижается с 18,8% до 17,1% и с 12,3% до 8,2% соответственно.
  5. Предложенные номограммы снижения плотности эндотелия позволяют определять предположительную потерю эндотелиальных клеток донорских роговиц в процессе консервации в  зависимости от вида, срока консервации, состава сред и исходной плотности эндотелия донорского материала, что дает возможность дифференцированно подходить к выбору донорского материала для выполнения разного вида кератопластик.

Практические рекомендации

Для продления сроков гипотермической консервации и сохранения морфофункциональных характеристик ЭК донорских роговиц до 9-ти суток и для повышения жизнеспособности и улучшения трансплантационных качеств ЭК на меньших сроках консервации в среде Борзенка-Мороз, рекомендуется добавлять в среду гомологичные клеточные пептиды в виде препарата NeyDIL №37 (Р/У ЛРС-008827/08-061108) в объеме 10 мл в процессе ее приготовления на заключительном этапе смешивания компонентов, для достижения концентрации препарата 1 мкг/мл среды.

Для продления сроков нормотермической консервации и сохранения морфофункциональных характеристик ЭК донорских роговиц (до 24-х суток) и для повышения жизнеспособности и улучшения трансплантационных качеств ЭК в среде, рекомендованной европейской ассоциацией глазных банков, рекомендуется добавлять в среду гомологичные клеточные пептиды в виде препарата NeyDIL №37 (Р/У ЛРС-008827/08-061108) в объеме 10 мл в процессе ее приготовления на заключительном этапе смешивания компонентов, для достижения концентрации препарата 1 мкг/мл среды.

Для определения предположительной потери ЭК донорских роговиц в процессе консервации в зависимости от вида, срока консервации, состава сред и исходной плотности эндотелия донорского материала, рекомендуется использовать предложенные номограммы для расчета ПЭК.

При выборе стратегии консервации трупной донорской роговицы рекомендуется ориентироваться на разработанные рекомендации к выбору донорского материала: для выполнения ЗАПК рекомендуется использовать донорский материал с ПЭК равной 3000-2600 кл/мм. При выполнении СК у пациентов с патологией роговицы, не сопровождающейся большой потерей ЭК в послеоперационном периоде (например, кератопластика по поводу кератоконуса) рекомендуется использовать донорский материал с ПЭК равной 2500-2200 кл/мм, соответственно при кератопластиках по поводу осложненных бельм и кератитов в активной фазе, сопровождающихся большей потерей ЭК в послеоперационном периоде рекомендуется использовать донорский материал с ПЭК равной 3100 – 2800 кл/мм.

Список публикаций по теме диссертации

  1. Борзенок С.А., Ролик О.И.,  Комах Ю.А., Мороз З.И. Пептидная биоревитализация сквозного трансплантата роговицы при ожоговой травме глаза // VI Международный научно-практический конгресс «Человек в экстремальных условиях: человеческий фактор и профессиональное здоровье». Сб. Тез. - М., 2008. - С. 278-279.
  2. Борзенок С.А., Ролик О.И., Мороз З.И., Комах Ю.А., Тонаева Х.Д. Пептиды клеточной цитоплазмы как специфические адаптогены органа зрения при экстремальных воздействиях факторов внешней среды // Экологическая медицина и офтальмология. Сб. Тез. - М., 2009. - С.168-169.
  3. Ролик О.И., Борзенок С.А., Мороз З.И., Комах Ю.А., Ковшун Е.В., Тонаева Х.Д. Ревитализирирующие эффекты в клетках трансплантата трупной донорской роговицы in vitro под влиянием гомологичных клеточных пептидов // В сб.: IV Всероссийская научная конференция молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии». - М.,2009. - С. 54-55.
  4. Takhchidi K.P., Borzenok S.A., Rolik O.I., Komakh Y.A., Volkova O.S.,  Kovshun E.V., Tonaeva K.D., Shipunova A.V. Revitalizing effects in transplant  cells of donor cornea in vitro under the influence of homologous cellular peptides // Сб. тезисов международной ежегодной конференции Европейской ассоциации Глазных банков.- Барселона, 2010.- С. 98.
  5. Ролик О.И., Борзенок С.А., Боровая Т.Г., Диденко Л.В., Комах Ю.А., Мороз З.И., Ковшун Е.В., Тонаева Х.Д., Шипунова А.В. Нормотермическая и гипотермическая консервация донорской роговицы с использованием гомологичных клеточных пепдидов // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии. Сб. Тез. – Санкт-Питербург., 2010.- С. 111-112.
  6. Борзенок С.А., Ролик О.И., Онищенко Н.А., Комах Ю.А., Волкова О.С. Среднесрочная консервация донорских роговиц в двух режимах - нормотермического и гипотермического культивирования с использованием гомологичных клеточных пептидов // 9-го съезд офтальмологов России. Сб. Тез. – М.,- 2010.- С.328-329. 
  7. Ролик О.И., Борзенок С.А., Комах Ю.А., Онищенко Н.А., Мороз З.И., Ковшун Е.В. Среднесрочная консервация донорских роговиц в  нормотермическом и гипотермическом режимах с использованием гомологичных клеточных пепдидов // Вестник трансплантологии и искусственных органов. – Т. 12. Приложение.– Москва, 2010.- С.241-242.
  8. Ролик О.И., Борзенок С.А., Онищенко Н.А., Комах Ю.А. Фармакологическая защита трансплантата роговицы гомологичными клеточными пептидами на этапе нормотермической и гипотермической консервации // Сб. тезисов всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». – Москва, 2010.- С63-64.
  9. Ролик О.И., Борзенок С.А., Онищенко Н.А., Комах Ю.А. Фармакологическая защита трансплантата роговицы гомологичными клеточными пептидами на этапе нормотермической и гипотермической консервации // Стволовые клетки и регенеративная медицина. Сб. Тез. М., 2010.- С.63-64.
  10. Borzenok. S.A., Rolik O.I., Komakh Y.A., Volkova O.S., Kovshun E.V. Homologous cellular peptides protects donor corneal endothelial cells during corneal cold storage at 4°C. // Сборник тезисов международной ежегодной конференции Европейской ассоциации Глазных банков. – Фрайбург., 2011.- С.71.
  11. Ролик О.И., Борзенок С.А., Тахчиди Х.П., Комах Ю.А., Онищенко Н.А. Применение гомологичных клеточных пептидов при среднесрочной консервации донорских роговиц в нормотермическом и гипотермическом режимах // Филатовские чтения. Сб. тезисов – Одесса, 2011. - С.38.
  12. Ролик О.И., Борзенок С.А., Онищенко Н.А., Мороз З.И., Комах Ю.А., Волкова О.С. Применение гомологичных клеточных пептидов при среднесрочной консервации донорских роговиц в двух режимах – нормотермическом и гипотермическом // Федоровские чтения – 2011. Сборник тезисов – Москва, 2011. – С.272-273.
  13. Ролик О.И., Борзенок С.А., Тахчиди Х.П., Онищенко Н.А., Малюгин  Б.Э., Комах Ю.А., Мороз З.И., Ковшун Е.В. Протективное действие гомологичных клеточных пептидов на эндотелиальные клетки днорской роговицы в процессе нормотермической и гипотермисеской консервации // Актуальные вопросы офтальмологии: Сб. тезисов. –  Краснодар, 2011. – С.75.
  14. Rolik O.I., Borzenok S.A., Komakh Y.A., Kovshun E.V., Volkova O.S. Нomologous cellular peptides protect donor corneal endothelial cells during organ culture [Электронный ресурс] // Тезисы 2-ого международного ежегодногоконгресса EuCornea. – Венна, 2011. Доступ: http://www.eucornea.org/Vienna11/freepaperdetails.asp?id=12049&day=0
  15. Борзенок С.А., Ролик О.И., Онищенко Н.А., Комах Ю.А. Методы консервации донорских роговиц  и применение гомологичных клеточных пептидов (обзор литературы) // Офтальмохирургия. - 2011.- №4.- С. 75-78.
  16. Борзенок С.А., Ролик О.И., Онищенко Н.А., Комах Ю.А.  О возможности совершенствования консервации донорских роговиц путем применения регуляторных пептидов. (Аналитический обзор) // Вестник трансплантологии и искусственных органов. – М., 2011.- № 4. - С.101-105.
  17. Борзенок С.А., Ролик О.И., Онищенко Н.А., Комах Ю.А., Делекторская В.В., Шацких А.В. Применение гомологичных клеточных пептидов при среднесрочной консервации донорских роговиц в гипотермическом режиме // Вестник Оренбургского государственного университета. -  2011. - № 14. - С.79-82.
  18. Борзенок С.А., Ролик О.И., Онищенко Н.А., Комах Ю.А., Делекторская В.В. Применение гомологичных клеточных пептидов для улучшения морфофункционального состояния эндотелия донорских роговиц при  хранении в нормотермическом и гипотермическом режимах // Вестник трансплантологии и искусственных органов. –M., 2012. -  №1. - С.78-85.
  19. Ролик О.И., Комах Ю.А., Мороз З.И., Сабурина И.Н., Онищенко Н.А., Борзенок С.А. Антиапоптотический эффект гомологичных клеточных пептидов при среднесрочной консервации донорских роговиц в двух режимах – нормотермическом и гипотермическом // Федоровские чтения – 2012. Сб. Тез. – Москва, 2012. – С.150-151.
  20. Борзенок С.А., Ролик О.И., Онищенко Н.А., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В., Комах Ю.А. Антиапоптотическое действие гомологичных клеточных пептидов на эндотелиальные клетки донорской роговицы при консервации в режимах нормотермии и гипотермии // V Российский общенациональный офтальмологический форум: Сб. Науч. Трудов. – Москва, 2012. – Том 2. – С.747-748.
  21. Борзенок С.А., Малюгин Б.Э., Онищенко Н.А., Ролик О.И., Комах Ю.А., Мороз З.И., Сабурина И.Н. Антиапоптотический эффект гомологичных клеточных пептидов при среднесрочной консервации донорских роговиц в нормотермическом и гипотермическом режимах // Вестник трансплантологии и искуственных органов. – Том 14. – Приложение. – М., 2012. – С. 297.

Патенты РФ на изобретения по теме диссертации

Тахчиди Х.П., Борзенок С.А., Малюгин Б.Э., Ролик О.И., Комах Ю.А.,
Мороз З.И.,Ковшун Е.В. «Средство для консервации донорской роговицы».

Патент РФ  на изобретение № 2450515 от 20.04.2012

Биографические данные

Ролик Ольга Ивановна, 1984 года рождения, в 2007 году окончила Московский Государственный Медико-стоматологический Университет по специальности «Лечебное дело».

С 2007 по 2009 год проходила обучение в клинической ординатуре по специальности «офтальмология» на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. С 2009 по 2012 год обучалась в очной аспирантуре на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Является автором 30 печатных работ, 1 патента на изобретение.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.