WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Елькина Ольга Викторовна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ

ЛЬНЯНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ,

ПРОИЗРАСТАЮЩЕЙ В ПЕРМСКОМ КРАЕ

Специальность 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь – 2012

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

Петриченко Василий Михайлович

Сыропятов Борис Яковлевич

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Фурса Николай Сергеевич

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «ЯГМА» Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой фармакогнозии и фармацевтической технологии

Дубовик Вера Александровна

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии очного факультета ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздравсоцразвития России

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «18» сентября 2012 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.085.06 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2. Тел./факс (342)233-5501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Автореферат разослан «14» августа 2012 г.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки РФ http://www.mon.gov.ru «31» июля 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России http://www.pfa.ru «14» августа 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.068.01,

кандидат фармацевтических наук, доцент                         И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Актуальной проблемой фармацевтической науки на современном этапе является создание эффективных фитопрепаратов из лекарственного растительного сырья. Это связано с тем, что при использовании синтетических препаратов часто развивается лекарственная резистентность и возникают побочные реакции, в то время как некоторые растительные вещества родственны имеющимся в организме человека,  потому они малотоксичны и бесконфликтно входят в живую клетку.

Основным источником для поиска новых лекарственных растений является арсенал средств народной медицины. Наибольший интерес при этом вызывают растения, обладающие комплексным действием, так как появляется возможность применения одного средства для лечения целого ряда сопутствующих заболеваний. Например, при сердечно-сосудистых заболеваниях нередко наблюдается нарушение водно-солевого обмена и повышенная свертываемость крови, поэтому наряду с кардиотониками возникает необходимость использования мочегонных средств, относящихся к группе салуретиков и препаратов, предотвращающих развитие тромбоза.

Широкое использование льнянки обыкновенной в народной медицине при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы указывает на необходимость углубленного фармакогностического изучения этого растения, химический состав и фармакологические эффекты которого также изучены недостаточно. В связи с этим, комплексное изучение травы льнянки обыкновенной с целью внедрения ее в научную медицину является актуальным.

Цель исследования. Целью работы являлось анатомо-морфологическое и фитохимическое изучение травы льнянки обыкновенной, произрастающей в Пермском крае, исследование возможности получения экстракционных форм и установление их специфической активности и острой токсичности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить качественный состав биологически активных веществ в траве и органах льнянки обыкновенной.

2. Разработать методику количественного определения флавоноидов спектрофотометрическим методом и составить проект нормативной документации на стандартный образец, используемый в методе количественного определения флавоноидов. Адаптировать методику количественного определения иридоидов фотоэлектроколориметрическим методом для травы льнянки обыкновенной.

3. Исследовать динамику накопления биологически активных веществ в траве и органах растения в зависимости от места заготовки, фазы развития и сроков хранения сырья.

4. Разработать оптимальные условия получения экстракционных форм льнянки обыкновенной, исследовать их специфическую активность и острую токсичность.

5. Провести морфолого-анатомическое исследование травы льнянки обыкновенной, выявить диагностические признаки сырья.

6. Установить показатели доброкачественности травы льнянки обыкновенной и разработать проект ФС «Льнянки обыкновенной трава».

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное фармакогностическое исследование травы льнянки обыкновенной. На основании полученных данных разработан проект ФС «Льнянки обыкновенной трава».

Изучены фармакологические эффекты растения. Установлена ранее неисследованная диуретическая активность и влияние на свертывающую систему крови экстракционных форм из травы и органов льнянки обыкновенной.

Изучен химический состав травы и отдельных органов льнянки обыкновенной, а также динамика накопления основных групп биологически активных веществ в разные фазы развития.

Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве льнянки обыкновенной спектрофотометрическим методом. Показана целесообразность стандартизации травы льнянки обыкновенной по содержанию флавоноидов в пересчете на ацетилпектолинарин. Разработан проект фармакопейной статьи «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец».

Впервые установлен состав липофильных веществ травы льнянки обыкновенной методом ГЖХ-МС.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований установлена возможность расширения ассортимента лекарственного растительного сырья за счет использования травы льнянки обыкновенной. Установлены основные показатели подлинности и доброкачественности растительного сырья, которые легли в основу ФС «Льнянки обыкновенной трава» и инструкции по сбору и сушке травы льнянки обыкновенной.

Для разработки методики количественного определения флавоноидов в траве льнянки обыкновенной спектрофотометрическим методом составлен проект ФС «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец».

Научно обоснована целесообразность использования льнянки обыкновенной для получения экстракционных форм, оказывающих диуретическое и антикоагулянтное действие.

Основные положения, выносимые на защиту. Результаты фармакогностического, фитохимического, фармакологического исследования травы льнянки обыкновенной и экстракционных форм на ее основе, обладающих диуретической и противосвертывающей активностью.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.10018875).

Апробация полученных результатов. Основные положения работы доложены и обобщены на научно-практических конференциях: Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования (ПГФА, Пермь, 2009 – 2012); International conference “Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine” (Saint Petersburg, 2011); Межвузовская научная конференция студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (Санкт-Петербург, 2009); ежегодная конференция «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010); IV международная пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (Москва, 2011); Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010); конференция молодых ученых и студентов ТГМУ им. Абуалиибни Сино с международным участием «Современная медицина в Таджикистане; проблемы, достижения и перспективы развития» (Душанбе, 1012); III международная научно-практическая конференция "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2012).

Личное участие автора. Автор непосредственно участвовал в проведении научных экспериментов, обработке и интерпретации экспериментальных данных, в апробации результатов исследования, подготовке основных публикаций по выполненной работе.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 18 научных работ, из них в изданиях, рекомендованных ВАК – 6 статей.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 185 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований, и выводов. Работа иллюстрирована 56 таблицами и 42 рисунками. Библиографический указатель включает 169 источников, из них 27 на иностранных языках.

Во введении изложена актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, обозначена новизна и практическая значимость проведенных исследований; описаны положения, выносимые на защиту.

Первая глава содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы: распространение рода Linaria Mill. и вида L. vulgaris Mill. в Российской Федерации и за рубежом, систематическое положение и ботаническое описание L. vulgaris; данные по химическому составу и использованию вида в народной медицине.

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.

В третей главе отражены результаты исследований качественного состава фенольных, иридоидных соединений, углеводов, липофильных веществ льнянки обыкновенной. Приведена адаптация методики количественного определения иридоидов фотоэлектроколориметрическим методом. Описана динамика накопления флавоноидов и ирдоидов в траве и органах растений, произрастающих в разных местообитаниях.

В четвертой главе изложена технология получения экстракционных форм льнянки обыкновенной и исследование их диуретической и антимикробной активности, влияния на свертывающую систему крови и острой токсичности.

В пятой главе приведена разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье: результаты морфолого-анатомических исследований льнянки обыкновенной, стандартизация сырья и разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на ацетилпектолинарин. Описана разработка нормативной документации на государственный стандартный образец ацетилпектолинарин, приведены валидации методик.

В приложении представлены проект ФС «Льнянки обыкновенной трава», проект ФС «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец», инструкция по сбору и сушке травы льнянки обыкновенной, хроматограммы и спектры, подтверждающие результаты исследования химического состава льнянки обыкновенной, основные документы, отражающие внедрение результатов диссертационной работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектом фармакогностического исследования являлась надземная часть с корнями дикорастущего многолетнего травянистого растения льнянки обыкновенной (л. обыкновенная) –Linaria vulgaris (L.vulgaris).

Образцы для исследования собраны в 2008 – 2011 гг. в разных ботаникогеографических зонах Пермского края.

Морфолого-анатомическое строение исследовали на свежем и гербарном материале (30-50) образцов по общепринятым методикам. Изучение объектов проводили с помощью микроскопа МБИ – 1. Изучение срезов и выполнение микрофотографий осуществляли с помощью микроскопа “Motic” (Германия) с цифровой насадкой. Полученные изображения редактировали с применением программ «Motic Image 2000» и «Adobe Photoshop 7.0».

Качественный состав и количественное содержание БАВ исследовали с помощью современных методов фитохимического анализа: хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента, фотоэлектроколориметрия, УФ спектроскопия, высокоэффективная жидкостная хроматография. Спектрофотометрическое исследование проводилось на приборе СФ-2000. Обнаружение фенольных соединений методом ВЭЖХ проводили на отечественном жидкостном хроматографе «Милихром – 6» на колонке КАХ-6-80-4, заполненной сорбентом Сепарон С-18 с последующей компьютерной обработкой результатов анализа в программе “UniChrom”. Липофильный состав льнянки обыкновенной определяли методом хромато-масс-спектрометрии на хромат-масс-спектрометре Agilent 6890N/5975B.

Стандартизацию цельного и измельченного сырья проводили согласно методикам ГФ XI. При разработке проекта ФС на сырье руководствовались ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества ЛС. Основные положения».

Исследование диуретической активности проводили на белых крысах мужского пола линии Wistar массой 190-200 г. Препараты сравнения готовили из травы хвоща полевого и листьев брусники. Экскрецию креатинина с мочой определяли унифицированным методом Поппера, основанном на реакции Яффе с помощью стандартного набора реактивов. Концентрацию ионов натрия и калия в моче определяли методом фотометрии на пламенном фотометре JENWAYPSP7.

Антикоагулянтную активность экстрактов исследовали invitro с помощью коагулометра «Minilab-701». Для исследования использовали кровь собаки, стабилизированную 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 9:1. Индуктором свертывания крови служил 0,28% раствор кальция хлорида. Эталоном антикоагулянтной активности служил гепарин, который испытывали в концентрации 1 ED/мл в аналогичных условиях.

Исследования антимикробной активности проводили в соответствии с ГФ XI по отношению к 3 видам тест-микроорганизмов: Escherichia coli АТСС 25922; Staphylococcus aureus АТСС 6538-P; Candida albicans АТСС 885-653.

Изучение острой токсичности сухих экстрактов льнянки обыкновенной проводили на белых мышах при однократном пероральном введении экстрактов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ статистической обработки данных «STAT – Статистика». Для выявления статистической значимости различий использовали параметрический критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Химический состав и распределение основных групп БАВ в льнянке обыкновенной

На основании результатов качественного анализа установлено, что преобладающими группами БАВ в траве л. обыкновенной являются фенольные соединения и иридоиды. Изучена химическая изменчивость указанных групп природных соединений по органам растения и в зависимости от фазы развития.

Фенольные соединения

Состав фенольных соединений л. обыкновенной изучен методами хроматографии на бумаге, ТСХ и ВЭЖХ. Методом ТСХ обнаружено 8 веществ фенольной природы (табл. 1). Сравнительный хроматографический анализ травы и органов л. обыкновенной показал, что качественный состав фенольных соединений отличается незначительно, компонентный состав колеблется от четырех до шести веществ. Компоненты 3, 4, 5, 6 по флюоресценции в УФ свете после обработки хромогенным реактивом отнесены к флавоноидам, соединения 1, 2, 7, 8 – к фенолкарбоновым кислотам. С помощью аутентичных образцов (по значению Rf и методом добавки) вещество 5 было идентифицировано как линарин, соединение 6 – как ацетилпектолинарин.

Иридоиды

Иридоидный состав л. обыкновенной изучен методом хроматографии на бумаге. Обнаружено 7 веществ иридоидной природы (табл. 2). Анализируя характер окраски компонентов при проявлении их хромогенными реактивами, установлено, что вещество 4 проявляется только реактивом Бэкона-Эдельмана, а вещества 3, 6, 7 приобретают синюю окраску различной интенсивности при обработке реактивом Шталя. При анализе литературных данных было выявлено, что такое поведение характерно для соединений подгруппы каталпола. Компоненты 1, 2 и 5 проявляют сиреневую окраску под влиянием реактива Шталя, данный факт, позволяет отнести их к подгруппе аукубина.

Исследовано количественное содержание флавоноидов и иридоидов в зависимости от фазы развития в разных органах л. обыкновенной (рис. 1). Для этого разработана методика количественного определения флавоноидов и оптимизирована методика количественного определения иридоидов. Оптимальной для сбора является фаза цветения, т.к. в этот период отмечается высокое содержание БАВ (флавоноиды – 16,7%; иридоиды – 0,21%). Наибольшее количество действующих веществ накапливается в листьях, стеблях и генеративных органах. Учитывая незначительное содержание флавоноидов в корнях

Таблица 1

Вещество

ЗначениеRf

Окраска

Трава

Органы

Видимый свет

УФ

УФ+NH3

AlCl3, 5%

AlCl3, 5% + УФ

Цветки

Плоды

Листья

Стебли

Корни

1

0,22 ± 0,01

--

--

--

--

голубая

+

+

+

+

+

+

2

0,46 ± 0,01

--

--

--

--

голубая

--

--

--

--

--

+

3

0,51 ± 0,01

--

--

--

бледно-желтая

желтая

--

--

--

--

+

--

4

0,54 ± 0,01

желтая

фиолетовая

фиолетово-коричневая

желтая

фиолетово-коричневая

+

+

+

+

+

+

5

0,58 ± 0,01

--

--

--

бледно-желтая

желтая

+

+

+

+

+

+

6

0,68 ± 0,01

желтая

фиолетовая

фиолетово-коричневая

желтая

фиолетово-коричневая

+

+

+

+

+

+

7

0,80 ± 0,01

--

--

--

--

желто-голубая

+

+

+

--

--

--

8

0,95 ± 0,01

--

--

--

--

голубая

--

--

--

--

+

Линарин

0,58 ± 0,01

желтая

фиолетовая

фиолетовая

бледно-желтая

желтая

Ацетилпекто-линарин

0,68 ± 0,01

желтая

фиолетовая

фиолетово-коричневая

желтая

фиолетово-коричневая

Хроматографическая характеристика фенольных веществ и их распределение по органам льнянки обыкновенной

Таблица 2

Хроматографическая характеристика иридоидов и их распределение в траве и органах льнянки обыкновенной

№ вещества

Значение Rf в системе БУВ 4:1:2

Окраска

  Трава

Органы

Реактив

Бэкона-Эдельмана

Реактив

Шталя

Реактив

Трим-Хилла

Цветки

Плоды

Листья

Стебли

Корни

видимый

УФ-свет

видимый

УФ-свет

видимый

УФ-свет

1

0,04 ± 0,01

коричневая

ярко-коричневая

бледно-сиреневая

сиреневая

бледно-желтая

бледно-голубая

--

+

+

--

--

--

2

0,09 ± 0,01

бледно-коричневая

коричневая

бледно-сиреневая

сиреневая

бледно-желтая

бледно-голубая

+

+

+

+

+

+

3

0,12 ± 0,01

коричневая

ярко-коричневая

синяя

ярко-синяя

бледно-желтая

бледно-голубая

+

--

--

+

+

--

4

0,18 ± 0,01

коричневая

ярко-коричневая

--

--

--

--

+

+

+

--

+

+

5

0,28 ± 0,01

коричневая

ярко-коричневая

сиреневая

ярко-сиреневая

бледно-желтая

бледно-голубая

+

+

+

+

+

+

6

0,34 ± 0,01

бледно-коричневая

коричневая

бледно-синяя

бледно-синяя

--

--

--

--

--

+

--

--

7

0,48 ± 0,01

--

--

сине-зеленая

бледно-синяя

--

--

+

--

--

+

--

--

растения, а так же сложность их заготовки вследствие временных и  материальных затрат в качестве сырья л. обыкновенной целесообразно использовать только надземную часть, заготовленную в фазу цветения.

Исследование влияния сроков хранения сырья на количественное содержание флавоноидов и иридоидов показало, что содержание флавоноидных соединений за три года, в среднем, уменьшается на 18% (рис. 2). За первый год хранения снижение происходит, в среднем, на 6 %, за второй год сырье теряет максимальное количество флавоноидов, в среднем, 11%, тогда как за третий год значительных изменений в содержании действующих веществ не установлено, количество уменьшается, в среднем, на 1 – 3%. Содержание иридоидов за три года, в среднем, уменьшается на 22%. За первый год хранения сырье теряет максимальное количество суммы иридоидов – в среднем 12%. За второй и третий год хранения снижение количественного содержания БАВ происходит, в среднем, на 4% – 6%.

Углеводы

Хроматографические исследования компонентного состава углеводов в траве л. обыкновенной методом хроматографии на бумаге показали, что свободные сахара представлены тремя веществами, после кислотного гидролиза обнаруживается шесть веществ. В сравнении со стандартными образцами (по окраске хромогенным реактивом, по значению Rf и методом добавки) идентифицированы три соединения, относящиеся к группе гексоз (глюкоза, галактоза, рамноза), и одно вещество из группы пентоз (арабиноза). Два соединения идентифицировать не удалось. Среди идентифицированных веществ одно соединение обнаруживается только после кислотного гидролиза и три вещества присутствуют в свободном и связанном состоянии.

Алкалоиды

Содержание алкалоидов в сырье определено двумя способами. При осаждении извлеченной суммы алкалоидов пикриновой кислотой их количественное содержание составило 0,051 ± 0,009% в пересчете на пеганин, содержание суммы алкалоидов после предварительной хроматографической очистки составило 0,031 ± 0,009 %.

Липофильные вещества

Для анализа получены липофильные экстракты л. обыкновенной экстракцией хлороформом, дихлорэтаном и четыреххлористым углеродом. При анализе полученных данных установлено, что используемый экстрагент влияет на компонентный состав липофильных веществ незначительно (табл. 3). В каждом экстракте идентифицировано от 11 до 12 веществ, составляющих около 80% от суммы всех извлеченных соединений. Среди идентифицированных компонентов обнаружены

Рис. 1. Количественное содержание флавоноидов и иридоидов в органах льнянки обыкновенной в разные фазы развития

Рис. 2.Количественное содержание флавоноидов и иридоидов в образцах льнянки обыкновенной в зависимости от срока хранения

алканы, высшие жирные кислоты, эфиры высокомолекулярных спиртов и один непредельный лактон.

Таблица 3

Результаты идентификации липофильных веществ льнянки обыкновенной

Вещество

Совпадение спектра, %

Время удерживания, мин

Процент от площади всех пиков

хлороформ

четырех-хлористый углерод

дихлоэтан

2(4H)-Бензофуранон, 5,6,7,7a-тетрагидро-4,4,7a-триметил

93

12,387

0,110

0,036

0,131

Миристиновая кислота

95

13,500

--

0,119

--

Пальмитиновая кислота

95

14,573

3,600

2,590

2,506

Линолевая кислота

94

15,414

1,570

1,179

1,248

Линоленовая кислота

91

15,449

1,330

0,986

0,693

3-тетрадекановый эфир метоксиуксусной кислоты

90

15,951

0,180

0,155

0,147

Трикозан

91

16,110

0,540

0,484

0,505

4-тетрадекановый эфир метоксиуксусной кислоты

90

16,778

0,380

0,345

0,322

Эрикозан

91

16,929

0,760

0,765

0,743

Гептакозан

91

17,753

3,740

3,489

3,823

Октакозан

91

18,223

1,120

1,139

--

Нонакозан

91

18,791

54,730

45,495

52,591

Гентриаконтан

93

20,103

14,230

13,118

14,211

Разработка технологии экстракционных форм льнянки обыкновенной

С целью получения из травы л. обыкновенной препаратов с высоким содержанием комплекса БАВ нами разработана технология сухого экстракта: сырье л. обыкновенной, измельченное до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, и отсеянное от пыли, экстрагировали методом ремацерации с делением экстрагента на 3 части, с нагреванием и подключением вакуума на стадии слива. Сырье последовательно настаивали с первой частью экстрагента (5 частей), затем со второй и третьей (по 2,5 части каждая), каждый раз сливая вытяжку. В качестве экстрагента использовали 60%-ный этанол. Соотношение сырья и экстрагента 1:10. Время настаивания с каждой частью экстрагента 40 мин при температуре 42 °С. Полученную вытяжку после очистки сгущали в роторном выпарном аппарате при температуре 60-70 °С, затем высушивали в сушильном шкафу при температуре 60 °С.

По разработанной методике были получены сухие экстракционные формы из травы и различных органов л. обыкновенной.

Фармакологические свойства экстракционных форм

Проведенные нами фармакологические исследования показали, что сухие спиртовые экстракты из травы л. обыкновенной обладают диуретической активностью. Способность усиливать диурез характерна для всех экстракционных форм л. обыкновенной (рис. 3). При этом, за первые 3 ч опыта выделялся больший объем мочи, чем за последующее время эксперимента. Исходя из этого можно сделать вывод о том, что биологически активные вещества растения оказывают максимальный эффект в первые 3 ч после введения. Максимальный объем выделенной мочи был получен при введении экстракта из листьев л. обыкновенной и составлял около 5 мл за все время эксперимента, что превышает объем жидкости, выделившейся под влиянием экстракта хвоща полевого в два раза и сопоставимо с этим показателем для экстракта брусники (4,8 мл). Меньшую активность проявили экстракт цветков и травы л. обыкновенной. Диурез за 6 ч эксперимента для них составил 3,3 и 3,1 мл, соответственно. Экстракты стеблей и плодов л. обыкновенной проявили наименьшую активность, находящуюся на уровне активности хвоща полевого.

Рис. 3. Влияние экстрактов льнянки обыкновенной на диурез

Примечание: * – р<0,05 в сравнении с контролем

Далее было изучено влияние экстрактов на экскрецию ионов натрия и калия (рис. 4). Наибольшее влияние на экскрецию ионов калия

Рис. 4. Влияние экстрактов льнянки обыкновенной на экскрецию ионов натрия и калия

(Примечание: * – р<0,05 в сравнении с контролем; «0» – не удалось определить из-за недостаточного диуреза)

оказывают экстракты цветков, травы и листьев л. обыкновенной. Наибольшая интенсивность выведения ионов калия наблюдается во вторые 3 ч эксперимента. Для экстракта из цветков л. обыкновенной она составляет 4887 мг/л. Таким образом, экстракты растения усиливают экскрецию калия, что позволяет рекомендовать их к применению при гиперкалиемии.

При изучении влияния экстрактов л. обыкновенной на экскрецию натрия было выявлено, что все экстракты растения усиливают выведение ионов натрия. Наибольшее влияние на их экскрецию оказывают экстракты цветков, травы и листьев л. обыкновенной. За 6 ч эксперимента под их действием выделяется, соответственно, 0,32; 0,47 и 0,59 мг ионов натрия, что значительно превышает количество ионов, выделившихся под действием экстракта хвоща полевого (0,2 мг). Было обнаружено, что наибольшая интенсивность выведения ионов наблюдается за вторые 3 ч эксперимента под действием тех экстрактов, исследование для которых было возможно. Содержание ионов натрия в моче, выделяемой за вторые 3 ч под действием экстрактов из стеблей и плодов л. обыкновенной, не удалось определить из-за недостаточного количества выделенной мочи. Несмотря на большую интенсивность экскреции ионов натрия во второй половине опыта, абсолютное количество (мг) ионов за первые 3 ч эксперимента часто оказывается больше, чем за вторые 3 ч, что связано с наиболее интенсивным диурезом в первой половине опыта. Таким образом, экстракты л. обыкновенной усиливают экскрецию натрия, что позволяет отнести их к салуретикам и рекомендовать к применению при гипертонической болезни.

Нами было изучено влияние на свертывающую систему крови. Анализ данных показал, что наибольшей активностью обладает экстракт из цветков л. обыкновенной (табл. 4). Он удлиняет время свертывания крови на 30,9%. Активность экстрактов из травы и других частей растения не превышает 15%.

Таблица 4

Антикоагулянтная активность

сухих спиртовых экстрактов льнянки обыкновенной

Часть растения, из которой получен экстракт

Время свертывания,c

Изменение свертываемости, %

Р

контроль

опыт

Трава

21,9 ± 0,91

25,2 ± 0,65

-15,1

<0,01

Цветки

38,1 ± 1,99

49,9 ± 2,55

-30,9

<0,002

Листья

32,3 ± 1,83

36,7 ± 2,15

-13,6

>0,05

Стебли

30,5 ± 1,79

33,2 ± 2,01

-8,9

>0,05

Плоды

23,6 ± 0,93

24,9 ± 0,69

-5,5

>0,05

Гепарин

29,9 ± 0,48

36,6 ± 1,82

-22,4

<0,01

Примечание: Р – в сравнении с контролем

Обнаружена антимикробная активность спиртовых и липофильных экстрактов из травы л. обыкновенной. Установлено, что спиртовый экстракт из травы растения обладает антибактериальной активностью в отношении S. aureus и E. coli. В разведении 1:50 тормозится размножение всех исследованных микроорганизмов за исключением C. albicans. При увеличении разведения препарата антимикробная активность не проявляется. Хлороформный экстракт в разведении 1:10 полностью задерживает рост исследованных микроорганизмов, за исключением E. coli. В разведении 1:20 экстракт подавляет рост только S. aureus. Извлечение, полученное экстракцией четыреххлористым углеродом, в разведении 1:50 подавляет рост S. aureus. При увеличении разведения препарата антимикробная активность не проявляется. Наиболее чувствительным к действию липофильных экстрактов оказался золотистый стафилококк, рост которого подавляется при разведении 1:50.

Определена острая токсичность экстрактов. Основываясь на полученных результатах, можно сделать вывод о практической безвредности экстрактов льнянки обыкновенной и их принадлежности к 4 классу опасности (вещества малоопасные) по ГОСТ 12.1.007-76, т.к. средняя смертельная доза при введении в желудок более 5000 мг/кг.

Разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье

Изучены морфолого-анатомические особенности л. обыкновенной. Листовая пластинка линейно-ланцетной формы с цельным, слегка завернутым краем. Чашелистики чашечки ланцетные, тонко-заостренные. Венчик двугубый со шпорцем, бледно-желтый с оранжевым пятном на выпуклой средней части нижней губы.

Анатомо-диагностическими признаками (рис. 5, 6) травы л. обыкновенной являются трихомы стеблевого листа и главной оси соцветия, которые состоят их двух-, трех- или четырехклеточной ножки и двухклеточной головки. Стеблевой лист гипостоматический,

Рис. 5.

Продолжение.

В, Г – железистые волоски стеблевого листа (ув.  400).

Рис. 6. Схема строения стебля льнянки обыкновенной на поперечном срезе А – нижняя и средняя часть; Б – верхняя часть.

изолатеральный с аномоцитным типом устьчного аппарата (устьица окружены 3 – 4 околоустьичными клетками). Проводящая система стебля представлена вторичным непучковым или переходным строением.

Оформление проекта ФС «Льнянки обыкновенной трава» проведено в соответствии с ОСТ № 91500.05.001 – 00. Разработана методика количественного определения флавоноидов в сырье л. обыкновенной с использованием прямой спектрофотометрии в пересчете на ацетилпектолинарин (А1%1см = 416,7, при = 332 нм). Изучено влияние времени экстракции, природы и концентрации экстрагента, соотношения сырья и экстрагента на выход флавоноидов. Ошибка метода с достоверной вероятностью 95% составляет 3,56%. Валидацию метода проводили по показателям правильность, повторяемость и воспроизводимость.

Для определения числовых показателей проведен товароведческий анализ на восьми образцах цельного и измельченного сырья в пятикратной повторности. Цельное сырье. Содержание флавоноидов не менее 8%, влажность не более 12%; золы общей не более 7%; золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 1%; стеблей, в том числе отделенных при анализе, не более 14%; органической примеси не более 2%; минеральной примеси не более 0,5%.

Измельченное сырье. Содержание флавоноидов не менее 8%, влажность не более 12%; золы общей не более 7%; золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 1%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, не более 1,5%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,2 мм, не более 7%; органической примеси не более 2%; минеральной примеси не более 0,5%.

Срок годности сырья рекомендовано установить не более 3-х лет.

Разработан проект ФС «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец». Подлинность доказана с помощью качественных реакций, температуры плавления и методами ИК и ПМР спектроскопии. Определен удельный показатель поглощения ацетилпектолинарина. Содержание С31Н36О16 в субстанции в пересчете на сухое вещество определено спектрофотометрическим методом.

Выводы

1.        С применением химических, хроматографических и спектральных методов анализа доказано наличие в траве льнянки обыкновенной основных групп биологически активных веществ: флавоноидов, иридоидов, полисахаридов, липофильных веществ (алканы, высшие жирные кислоты, эфиры высших жирных кислот, непредельный лактон), фенолкарбоновых кислот, алкалоидов. С помощью стандартных образцов идентифицированылинарин, ацетилпектолинарин, глюкоза, галактоза, арабиноза, рамноза. Установлено распределение компонентов по органам растения. Наибольшее количество фенольных веществ обнаружено в корнях, иридоидов – в листьях.

2.        Разработана методика количественного определения флавоноидов в траве льнянки обыкновенной методом прямой спектрофотометрии в пересчете на ацетилпектолинарин. Ошибка единичного определения составляет 3,56%. Методика рекомендована для включения в проект ФС. Составлен проект ФС «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец». Адаптирована методика количественного определения иридоидов к траве льнянки обыкновенной. Ошибка единичного определения составляет 2,13%.

3.        Наибольшее количественное содержание флавоноидов обнаруживается в цветках растения, иридоидов – в листьях, в корнях содержание действующих веществ минимально. Содержание флавоноидов в зависимости от места сбора сырья варьирует от 10 до 16%, иридоидов – от 0,22 до 0,32%. Доказана целесообразность заготовки надземной части растения без подземных органов в период цветения (июль – август). Обоснован срок хранения сырья – не более 3-х лет.

4.        Для получения экстракционных форм из травы и органов льнянки обыкновенной определены оптимальные условия экстракции. Установлено, что сухие экстракционные формы перспективны для внедрения в медицинскую практику, т.к. оказывают диуретическое, антикоагулянтное и антимикробное действие. Экстракты не оказывают токсического действия в дозе 5000 мг/кг и относятся к веществам малоопасным.

5.        В ходе морфолого-анатомических исследований травы льнянки обыкновенной выделены макро- и микродиагностические признаки растительного сырья, позволяющие устанавливать подлинность.

6. Установлены числовые показатели цельной и измельченной травы льнянки обыкновенной, характеризующие доброкачественность сырья. На основании полученных результатов составлен проект фармакопейной статьи «Льнянки обыкновенной трава» – «Linariae vulgaris herba».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Блудова, М.Ю. Гипогликемическая активность Linaria vulgaris / М.Ю. Блудова, О.В. Щербакова // Вестник Российского государственного медицинского университета. – Москва, 2011. – Спец. вып. 1. – С. 198.
  2. Бомбела, Т.В. Инновационный подход к созданию лекарственных препаратов для лечения социально значимых заболеваний / Т.В. Бомбела, Э.А. Коркотян, Т.С. Шестакова, Е.Е. Галишевская, О.А. Кроткова, О.В. Елькина // Менеджмент качества в сфере здравоохранения и социального развития. – 2012. – № 1(11). – С. 97-100.
  3. Елькина, О.В. Выбор метода экстрагирования для получения сухого экстракта из травы льнянки обыкновенной / О.В. Елькина, Ю.С. Ветошкина // Мат-лы годичной научн.-практ. конф. молодых ученых и студ. ТГМУ «Современная медицина в Таджикистане: проблемы, достижения и перспективы развития». – Душанбе, 2012. С. 146.
  4. Елькина, О.В. Морфологическая характеристика льнянки обыкновенной / О.В. Елькина, Ю.С. Ветошкина // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – Пермь, 2012. –№9. – С. 168-169.
  5. Елькина, О.В. Оценка антимикробной активности экстрактов из льнянки обыкновенной (Linaria vulgaris) / О.В. Елькина, Б.Я. Сыропятов, В.М. Петриченко, Т.Ф. Одегова // Сборник статей третьей международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. Под. ред. А.П. Кудинова, Б.В. Крылова. – Санкт-Петербург, 2012. – Т.2. – С. 78-80.
  6. Петриченко, В.М. Биологические и химические свойства растений семейства норичниковые / В.М. Петриченко, Т.В. Сухинина, Б.Я. Сыропятов, Е.Е. Галишевская, Т.С. Шестакова, С.А. Калинина, О.А. Кроткова, О.В. Щербакова // Региональный конкурс РФФИ-Урал. Результаты научных исследований, полученные за 2007-2009 гг. Сборник статей. – Пермь: НПУ Уро РАН, 2010. – ч. 2. – С. 113-117.
  7. Петриченко, В.М. Хромато-масс-спектрофотометрическое исследование липофильных веществ травянистой части льнянки обыкновенной / В.М. Петриченко, О.В. Щербакова, А.А. Горбунов // Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез. Материалы всероссийской конференции. – Краснодар, 2010. – С. 133.
  8. Щербакова, О.В. Влияние сухих экстрактов из травы льнянки обыкновенной на уровень диуреза и экскрецию натрия и калия у крыс / О.В. Щербакова, Б.Я. Сыропятов, В.М. Петриченко // Вестник уральской медицинской академической науки.– Екатеринбург, 2011. – Тематический вып. по фармации №2 3/1 (37). – С.52.
  9. Щербакова, О.В. Влияние сухих экстрактов льнянки обыкновенной (Linaria vulgaris Mill.) на гемостаз / О.В. Щербакова, В.М. Петриченко, Б.Я. Сыропятов // Вестник Воронежского государственного университета. Серия Химия. Биология. Фармация. – Воронеж, 2011. – №2. – С. 240-242.
  10. Щербакова, О.В. Исследования по выбору оптимальных условий получения сухого экстракта льнянки обыкновенной / О.В. Щербакова, Ю.С. Ветошкина, Н.И. Шрамм, В.М. Петриченко // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – Пермь, 2011. – №8. – С. 226-228.
  11. Щербакова, О.В. К разработке методики количественного определения суммы иридоидов в траве льнянки обыкновенной (Linaria vulgaris) / О.В. Щербакова, В.М. Петриченко // Материалы ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье». – Екатеринбург, 2010. – С. 113-117.
  12. Щербакова, О.В. Методика количественного определения суммы иридоидов в траве Linaria vulgaris Mill. / О.В. Щербакова, В.М. Петриченко // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – Пермь, 2010. – №6. – С. 241-244.
  13. Щербакова, О.В. Микроскопическое исследование травы льнянки обыкновенной / О.В. Щербакова, В.М. Петриченко, В.Б. Марценюк // Фармация. – 2012. - №3. – С. 30-32.
  14. Щербакова, О.В. Разработка методики количественного определения флавоноидов в сырье льнянки обыкновенной / О.В. Щербакова, В.М. Петриченко // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – Пермь, 2009. – №5. – С. 206-207.
  15. Щербакова, О.В. Содержание флавоноидов в сырье Linaria vulgaris, собранном в различных населенных пунктах / О.В. Щербакова, В.М. Петриченко // Тезисы докладов межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений». – Санкт-Петербург: ГОУ ВПО СПГХФА, 2009. – С. 36-37.
  16. Щербакова, О.В. Спектрофотометрический метод определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части Linaria vulgaris (Scrophulariaceae) / О.В. Щербакова, В.М. Петриченко, Л.А. Чекрышкина // Растит. ресурсы. – 2011. – Т. 47, вып. 11. – С. 141-145.
  17. Щербакова, О.В. Токсичность экстрактов из растений семейства норичниковые / О.В. Щербакова, С.А. Калинина, В.М. Петриченко, Б.Я. Сыропятов, М.Ю. Ковалева // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – Пермь, 2010. – №7. – С. 227-229.
  18. Scherbakova, O.V. Diuretic activity of dry extracts of yellow toadflax (Linaria vulgaris) / O.V. Scherbakova, V.M. Petrichenko, B.Ya. Syropyatov // Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine. – Saint Petersburg, 2011. – С. 294-295.

Автор выражает искреннюю благодарность за помощь в работе к.ф.н., доценту Бомбела Т.В., сотрудникам кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и кафедры микробиологии ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России.

Елькина Ольга Викторовна (Россия)

Фармакогностическое изучение льнянки обыкновенной, произрастающей в Пермском крае

С использованием спектрофотометрии, хромато-масс-спектрометрии, фотоэлектроколориметрии, ВЭЖХ, хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента и других методов изучен состав биологически активных веществ в траве льнянки обыкновенной (Linaria vulgaris Mill.), сем. норичниковые (Scrophulariaceae). В ходе морфолого-анатомических исследований растения выделены макро- и микродиагностические признаки, позволяющие устанавливать подлинность сырья. Сухие экстракционные формы из травы льнянки обыкновенной оказывают диуретическое, антикоагулянтное и антимикробное действие. Экстракты не оказывают токсического действия в дозе 5000 мг/кг и относятся к веществам малоопасным. Установлены числовые показатели цельной и измельченной травы растения. На основании полученных результатов составлен проект фармакопейной статьи «Льнянки обыкновенной трава» – «Linariae vulgaris herba».

Elkina Olga Viktorovna (Russia)

Pharmacognostic study of growing in Perm territory yellow toadflax

Composition of biologically active substances in yellow toadflax (Linaria vulgaris Mill., Scrophulariaceae) was investigated by spectrophotometry, chromatography-mass spectrometry, fotoelektrokolorimetriya, HPLC, paper chromatography and other methods. Macro- and microdiagnostic signs for establishment of herba uthenticity were selected by morphological and anatomical studies. Dry extracts from yellow toadflax herb show diuretic, anticoagulant, antimicrobial effect. Extracts don’t possess a toxic effect at a dose of 5000 mg / kg. The amounts of whole and cutted herb of plants were obtained. On the basis of the results the project of pharmacopoeial article “yellow toadflax herb” was made.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.