WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ИНШАКОВ АНДРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА И МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ К ХИМИОПРЕПАРАТАМ IN VITRO

14.01.12 онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук








Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (директор – академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов)

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор

Барышников Анатолий Юрьевич

Доктор медицинских наук, профессор

Голенков Анатолий Константинович

Официальные оппоненты:

Бухман Владимир Михайлович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией фармакологии

и токсикологии НИИ ЭДиТО

ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН

Евсегнеева Ирина Валентиновна

доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО Первого МГМУ им.И.М.Сеченова

Минздравсоцразвития России

Ведущее научное учреждение:

ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита диссертации состоится «25» мая 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного Совета. Д.001.017.02 ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН  по адресу:115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН.

Автореферат разослан «___» ______________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор                                Барсуков Юрий Андреевич

Введение

Актуальность проблемы

В последнее время в гематологии уделяется большое внимание проблеме лекарственной устойчивости, так как именно с этим связана неэффективность программной химиотерапии.

В настоящее время данная проблема разрабатывается в нескольких направлениях, это и изучение клинической эффективности новых противоопухолевых препаратов с различными механизмами действия, и создание более эффективных химиотерапевтических программ на основе этих препаратов, и высокодозная терапия с пересадкой аутологичных и аллогенных стволовых кроветворных клеток, а также применение модуляторов резистентности, препаратов обладающих способностью подавлять механизмы ответственные за развитие устойчивости.

Определение чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам (ХП) при лейкозах in vitro так же можно рассматривать как актуальное направление в преодолении устойчивости опухолевых клеток к цитостатикам. Причем это направление достаточно широко развивается.

Методы количественного определения устойчивости/чувствительности к химиопрепаратам in vitro с помощью краткосрочного культивирования свежевыделенных опухолевых клеток крови и костного мозга больных позволяют определить лекарственную устойчивость независимо от ее механизма и отражают конечный эффект цитотоксичности. В культуре из опухолевых клеток возможно изучение эффективной комбинации химиотерапевтических препаратов в различных концентрациях. Эти исследования открывают путь для выбора наиболее целесообразных схем лечения, а в отдельных случаях—для индивидуализации терапии.

Таким образом, весьма актуальным является пересмотр с этих позиций широко используемого в настоящее время химиотерапевтического ресурса и переоценка эффективности известных комбинаций противоопухолевых препаратов согласно тестам in vitro. Результаты этих исследований будут обладать высокой актуальностью при лечении хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) и множественной миеломы (ММ) и их рефрактерных форм.

Поскольку многие вопросы, связанные с изучением чувствительности опухолевых клеток к препаратам MTT—тестом и DiSC—методом и с клинической эффективностью детерминированного лечения рефрактерных больных ХЛЛ и ММ остаются неосвещенными в литературе, то это так же послужило основанием для настоящего исследования.

Цель исследования: совершенствование индивидуального подхода к лечению больных хроническим лимфолейкозом и множественной миеломой на основе детерминированного принципа по результатам определения чувствительности опухолевых клеток in vitro к цитостатическим препаратам, с использованием MTT—и DiSC—методов.

Задачи исследования:

  1. Провести скрининг чувствительности опухолевых клеток к широкому спектру противоопухолевых препаратов MTT—и DiSC—методами у больных ХЛЛ и ММ.
  2. Провести корреляционный анализ результатов действия флюдарабина на опухолевые клетки больных ХЛЛ in vitro по MTT—тесту, и клиническим ответом, полученным в режиме монотерапии.
  3. Провести корреляционный анализ результатов действия алкерана на опухолевые клетки рефрактерных больных ХЛЛ in vitro по MTT—тесту, и клиническим ответом, полученным в режиме монотерапии.
  4. Проанализировать клиническую эффективность детерминированного, по результатам чувствительности in vitro DiSC—методом, лечения сарколизином рефрактерных больных ММ.
  5. Проанализировать клиническую эффективность фармакодинамического моделирования чувствительности in vitro плазматических опухолевых клеток к различным концентрациям цитарабина, у больных ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом.
  6. Проанализировать клиническую эффективность детерминированного, по результатам чувствительности in vitro, лечения курсом из нескольких препаратов больных ММ и ХЛЛ.
  7. Провести фармакодинамическое моделирование взаимодействия препаратов в комбинации и выявить преимущественные эффекты взаимодействия in vitro.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые предпринято лечение клинически рефрактерных форм ХЛЛ и ММ с учетом фармакодинамического моделирования in vitro на основе результатов MTT—и DiSC—методов.

Для этого был проведен скрининг чувствительности опухолевых клеток in vitro к различным противоопухолевым препаратам у первичных и ранее леченных больных ХЛЛ и ММ. Были изучены в культуре клеток фармакодинамические кривые зависимости концентрации от количества оставшихся живых после культивирования с ХП опухолевых клеток.

На основании проведенного скринингового исследования чувствительности опухолевых клеток костного мозга in vitro у больных ММ к цитостатическим препаратам, выявлен высокий процент чувствительных больных к цитарабину, который ранее при лечении ММ не применялся. С учетом полученных данных разработан метод интратекальной химиотерапии (ХТ) больных ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом.

Пути практической реализации

Внедрение полученных результатов в клиническую практику. Методы определения чувствительности противоопухолевых препаратов in vitro внедрены в клиническую практику в отделении клинической гематологии и иммунотерапии ГУ МОНИКИ им.М.Ф.Владимирского.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 148 страницах и состоят из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, который содержит 16 отечественных и 135 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 22 рисунками.

Диссертация выполнена в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей (зав.—профессор, доктор медицинских наук А.Ю. Барышников) ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН, на базе отделения клинической гематологии и иммунотерапии (зав.—профессор, доктор медицинских наук А.К. Голенков) ГУ Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф.Владимирского.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 6 статей, 1 брошюра «медицинская технология» и 5 тезисов.

Апробация работы

Апробация диссертационной работы состоялась 21 сентября 2011г. на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории иммунофармакологии, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории лучевых методов лечения опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН, лаборатории клинической иммунологии опухолей НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН, отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского.

Материалы и методы исследования

Химиопрепараты для определения цитотоксичности

Доксорубицин (Ebewe, Австрия): флакон, содержащий 10 мг лиофилизированного препарата. Разводили стерильной дистиллированной водой до конечной стоковой концентрации 0,4 мг/мл. Хранили в аликвотах по 0,4 мл при -20°С до использования.

Рубомицин (Феррейн ФАО, Россия): флакон, содержащий 10 мг лиофилизированного препарата. Разводили в 4 мл стерильной дистиллированной воды. Далее 1 мл разводили в 10 раз дистиллированной водой, а затем еще в 5 раз средой RPMI до конечной стоковой концентрации 0,1 мг/мл. Хранили в аликвотах по 0,4 мл при -20°С до использования.

Винкристин (Pierre Fabre Medicament, Франция): флакон, содержащий 1 мг/мл препарата. Хранили в аликвотах по 0,8 мл при -20°С до использования.

Этопозид-Тева (TEVA, Израиль): флакон, содержащий 100 мг/5 мл препарата. Хранили в аликвотах по 0,2 мл при -20°С до использования.

Ara-C (Heinrich Mack Nachf., Германия): флакон, содержащий 20 мг/мл препарата. 0,25 мл препарата разводили в 9,75 мл среды RPMI до конечной стоковой концентрации 0,5 мг/мл. Хранили в аликвотах по 0,4 мл при -20°С до использования.

Преднизолон (Gedeon Richter, Венгрия): ампула, содержащая 30 мг/мл препарата. К 1 мл препарата добавляли 0,2 мл NaCl 0,9% до конечной стоковой концентрации 25 мг/мл. Хранили в аликвотах по 0,4 мл при -20°С до использования.

Дексаметазон (KRKA, Словения): ампула, содержащая 4 мг/мл препарата. Растворяли 1 мл препарата в 12,3 мл среды RPMI до конечной стоковой концентрации 0,3 мг/мл. Хранили в аликвотах по 0,4 мл при -20°С до использования.

Цисплатин (Ebewe, Австрия): стоковый раствор 0,5 мг/мл хранили при +4°С.

Флюдара (Schering AG, Германия): флакон, содержащий 50 мг лиофилизированного препарата. Разводили 5 мл NaCl 0,9% до конечной стоковой концентрации 10 мг/мл. Хранили в аликвотах по 0,04 мл при -20°С до использования.

Лейкеран (Хлорамбуцил, Glaxo Wellcome, UK): 1 таблетка содержит хлорамбуцила 5 мг. Измельченные в ступке таблетки, растворяли до конечной стоковой концентрации 5 мг/мл. Хранили в аликвотах по 0,2 мл при -20°С до использования.

Мелфалан (Glaxo Wellcome, UK): флакон, содержащий 50 мг лиофилизированного препарата. Разводили прилагающимся растворителем до конечной стоковой концентрации 1,25 мг/мл. Препарат готовили непосредственно перед постановкой тестов, разведенный препарат не хранили.

Сарколизин (ООО Фирма ГЛЕС): флакон, содержащий 20 мг лиофилизированного препарата. Разводили NaCl 0,9% до конечной стоковой концентрации 1,25 мг/мл. Препарат готовили непосредственно перед постановкой тестов, разведенный препарат не хранили.

Характеристика больных

Для иммунофенотипирования и определения чувствительности к действию химиопрепаратов, оцениваемых до проведения курса химиотерапии, использовали образцы крови и костного мозга больных хроническим лимфолейкозом и множественной миеломой, находившихся на лечении в Отделении гематологии и иммунотерапии ГУ МОНИКИ им.М.Ф.Владимирского (руководитель – д.м.н., профессор А.К.Голенков).

В работе представлены результаты 73 больных В—ХЛЛ, из них женщин—30 (41,1%), мужчин—43 (58,9%). Возраст больных варьировал от 43 до 78 лет, средний возраст составил 59,5 года. В работе представлены результаты 53 больных ММ, из них женщин—29 (54,7%), мужчин—24 (45,3%). Возраст больных варьировал от 37 до 75 лет, средний возраст составил 58,4 года.

Выделение клеток из периферической крови больных ХЛЛ

Взятие крови проводили в асептических условиях из локтевой вены в стерильные пробирки с раствором гепарина (500 ЕД/мл).

Выделение клеток из цельной крови центрифугированием на градиенте плотности Ficoll-Paque или фиколл-верографин по методу Bjum позволяет получить клеточные суспензии с высоким содержанием мононуклеаров и свести до минимума необходимость последующего лизиса эритроцитов. Периферическую кровь разводили в 2 раза средой 199 и наносили на Ficoll-Paque (Pharmacia, Sweden) в следующих соотношениях: 3 объема лейкоцитарной массы на 1 объем фиколла и центрифугировали при 1500 оборотах/минуту 45 минут при комнатной температуре. Мононуклеарные клетки собирали из интерфазы пастеровской или автоматической пипеткой. Клетки отмывали первый раз в среде 199 20 минут при 1500 оборотах/минуту, а затем еще 2 раза по 10 минут при 1000 оборотах/минуту при комнатной температуре. Подсчет клеток проводили в камере Горяева общепринятым методом.

Выделение клеток из костного мозга больных ММ

Клетки костного мозга больных ММ получали при стернальной пункции в стерильные пробирки с раствором гепарина (500 ЕД/мл). Гепаринизированный костный мозг смешивали с 10% раствором желатина до конечной концентрации 1% и помещали на 30-45 минут в термостат при 370 С. После расслаивания верхний слой осторожно переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 минут при 1000 оборотах/минуту. Для полного удаления эритроцитов осадок ресуспензировали в 1мл раствора для лизиса эритроцитов и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре, затем клетки дважды промывали средой 199 в указанных условиях. Подсчет клеток проводили в камере Горяева общепринятым методом.

Инкубация клеток с химиопрепаратами

Для постановки MTT-теста выделенные из периферической крови клетки раскапывали в концентрации 2х105 в 180 мкл полной среды RPMI-1640 в 96-луночные плоскодонные планшеты. Добавляли по 20 мкл в лунку каждого исследуемого препарата. Каждый препарат исследовали в 5 концентрациях (Таблица 2), каждую концентрацию ставили в триплете. В контрольные лунки с клетками добавляли по 20 мкл чистой среды RPMI-1640. В качестве контроля среды использовали лунки содержащие 180 мкл полной и 20 мкл чистой среды RPMI-1640. Для препаратов (преднизолон, 6-меркаптопурин и цисплатин) контролем среды служили лунки содержащие 180 мкл полной среды RPMI-1640 и 20 мкл препарата.

Для постановки DiSC—теста выделенные из костного мозга клетки раскапывали в концентрации 0,5-2х105 в 180 мкл полной среды RPMI-1640 в 96-луночные круглодонные планшеты. Добавляли по 20 мкл в лунку каждого исследуемого препарата. Каждый препарат исследовали в 5 концентрациях (Таблица №5). В контрольные лунки с клетками добавляли по 20 мкл чистой среды RPMI-1640.

В крайние лунки по периметру раскапывали по 200 мкл стерильной дистиллированной воды. Планшеты с клетками инкубировали в течение 96 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2.

Таблица №1. Концентрации препаратов, использованные в исследовании цитотоксичности.

ПРЕПАРАТ

Стоковая концентрация (мг/мл)

Стоковый обем (мл)

Максимальная концентрация в лунке (мг/мл)

Шаг разведения

Доксорубицин

0,4

0,4

0,008

4

Рубомицин

0,1

0,04

0,002

4

Винкристин

1

0,8

0,05

4

Этопозид

20

0,2

0,05

4

Ara-C

0,5

0,4

0,01

4

Преднизолон

25

0,4

0,25

8

Дексаметазон

0,3

0,4

0,006

8

Цисплатин

0,5

0,0125

2

Флюдара

10

0,04

0,033

3

Лейкеран

0,16

0,2

0,031

5

Мелфалан

1,25

0,0125

2

Сарколизин

1,25

0,0125

2

Оценка цитотоксического действия химиопрепаратов МТТ-тестом

МТТ [3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5 дифенилтетразолий бромид] (Sigma", США) растворяли в концентрации 5 мг/мл в PBS и фильтровали через стерильный фильтр 0,20µm (Corning INC, Германия). Хранили в аликвотах по 2 мл при -20° С до использования.

Через 96 часов в планшет с клетками добавляли по 20 мкл MTT в каждую лунку и инкубировали 5-6 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2.

После образования формазана планшеты центрифугировали при 2000 оборотах/минуту 7-10 минут, надосадочную жидкость удаляли. Осадок растворяли, добавляя в лунки по 150-200 мкл диметисульфоксида (DMSO). Планшеты помещали на 5-7 минут в термостат при температуре 37°С. Далее планшеты встряхивали на шейкере, после этого интенсивность окрашивания среды измеряли на спектрофотометре "Multiscan" при =540-690 nm, за blank принимали лунки, содержащие среду без клеток и препаратов. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток.

Процент живых клеток вычисляли по формуле:

N0=

[N1-n] X 100%

N2

N0 процент живых клеток;

N1 средняя оптическая плотность лунок, содержащих клетки и препарат;

N2 средняя оптическая плотность контрольных лунок, содержащих только клетки;

n оптическая плотность лунок, содержащих только препарат (преднизолон или цисплатин).

Для каждого препарата строили график зависимости «доза-эффект» и определяли LD50.

Оценка цитотоксического действия химиопрепаратов DiSC-методом

Приготовление красителей

       1 г, Азур II растворяли в 1 л дистиллированной воды. Раствор вызревал 1 месяц в темноте при комнатной температуре.

       «Исходный раствор» метиленового синего готовили из 5 г NaHCO3, 10 г метиленового синего и 1 л дистиллированной воды. Раствор интенсивно взбалтывали и инкубировали 2 суток при 37°С, далее раствор еще раз взбалтывали и оставляли вызревать 3-5 дней в темном месте при комнатной температуре. «Рабочий раствор» метиленового синего получали разведением «исходного раствора» в 10 раз дистиллированной водой.

       «Буферную воду» готовили из 50 мл раствора 1 (11,8 г/л Na2HPO4x12H2O), 50 мл раствора 2 (9,8 г/л KH2PO4) и 1,9 л дистиллированной воды.

       Конечный раствор по Романовскому: 300 мл «буферной воды», 40 мл Азура II, 20 мл «рабочего раствора» метиленового синего, 40 мл раствора красителя азур-эозин по Романовскому. Перед использованием раствор фильтровали для удаления агломератов красителя.

       Концентрированный раствор 2% FAST GREEN FCF-1% NIGROSIN в 0,15М NaCl. Перед использованием раствор фильтровали для удаления агломератов красителя.

Окрашивание

       Через 96 часов планшет с клетками центрифугировали при 500 оборотах/минуту 5 минут на центрифуге (BACMAN, USA). Автоматической пипеткой из каждой лунки отбирали 100мкл среды, добавляли 100 мкл раствора FAST GREEN-NIGROSIN и ресуспендировали. Через 10 минут 100 мкл клеточной суспензии добавляли в камеру цитоцентрифуги (Hettich Zentrifugen, Германия) и осаждали при 1200 оборотах/минуту 10 минут на предметное стекло (25х75х1,0) через фильтр (Hettich Zentrifugen, Германия).

       Стекла с осажденными клетками фиксировали в этиловом спирте 20-30 секунд и высушивали.

       Фиксированные стекла окрашивали по Романовскому в течение 7-20 минут для определения морфологии. Время окрашивания подбирали эмпирически при каждом новом приготовлении красителя.

       Далее стекла промывали дистиллированной водой в течение 2 минут и высушивали.

Подсчет клеток

       Подсчет клеток производили на световом микроскопе («Zeiss», Германия), при оптическом увеличении х400 или х1000 с использованием иммерсионного масла («Zeiss», Германия).

       В каждом отпечатке подсчитывали 100 клеток. «Мертвые» клетки окрашивались раствором FAST GREEN-NIGROSIN в темно-зеленый или почти черный цвет. «Живые» опухолевые и нормальные клетки окрашивались стандартно.

               Миеломные клетки имеют большое сходство с плазмоцитами. Определить их по морфологическим чертам не трудно. Ядро, эксцентрично расположенное, имеет грубопетлистый рисунок, близкий к отчетливо выраженной «колесовидной» структуре нормальных зрелых плазматических клеток. Для цитоплазмы характерна интенсивно базофильная окраска с околоядерным просветлением, соответствующим локализации центросферы, и более интенсивная по периферии. При внимательном изучении плазматических клеток можно видеть «зернистое» строение цитоплазмы — «гранулоплазму» (при отсутствии истинной зернистости).

От этих напоминающих типичные плазматические клетки отличаются более крупные экземпляры — миеломные клетки ретикулярного типа. Диаметр их достигает 25—30 мк. Ядра их более нежного строения, радиарная исчерченность не отчетлива или полностью отсутствует; ядро содержит одно, иногда два ядрышка, окрашенных в голубой цвет. Цитоплазма этих клеток менее базофильна, в ней отсутствует околоядерное просветление. Среди этих клеток много двухъядерных, а также трех- и четырехъядерных.

Процент живых опухолевых клеток вычисляли по формуле:

N0=

N1 х 100%

N1 + N2 + N3

N0 процент живых опухолевых клеток,

N1 число живых опухолевых клеток,

N2 число мертвых клеток,

N3 число живых нормальных клеток.

Для каждого препарата строили график зависимости «доза-эффект» и определяли LD70.

Определение взаимодействия препаратов в культуре in vitro.

Определение взаимодействия препаратов в культуре клеток in vitro оценивали MTT—тестом. Для этого рассчитывали выживаемость опухолевых клеток (ВОК) по формуле:

ВОК=

N1

N2

N1 средняя оптическая плотность лунок, содержащих клетки и препарат/«коктейль» препаратов;

N2 средняя оптическая плотность контрольных лунок, содержащих только клетки.

       Что бы оценить взаимодействие препаратов в «коктейле» in vitro, при условии, что каждый препарат действует независимо, использовали две модели:

  1. «Мультипликативная» модель, предложенная Valeriote и Lin, показывает, что эффект комбинации препаратов есть продукт эффекта каждого свободного препарата:

«экспериментальная» ВОК(A+B)=ВОК(A) x ВОК(B).

2.         «Максимальная» модель, предложенная Sondak, показывает, что эффект комбинации препаратов подобен эффекту самого активного свободного препарата (Dmax):

«экспериментальная» ВОК(A+B)=ВОК(A), если ВОК(A)<ВОК(B).

Эти модели использовались, чтобы вычислить границы синергетических, аддитивных и антагонистических взаимодействий препаратов в культуре in vitro.

Синергизм наблюдался, если «экспериментальная» ВОК для комбинации препаратов была ниже, чем продукт эффектов каждого из свободных препаратов:

«экспериментальная» ВОК(A+B)<ВОК(A) x ВОК(B).

Аддитивность наблюдалась, если «экспериментальная» ВОК для комбинации препаратов была ниже, чем ВОК для самого активного свободного препарата (Dmax), но выше, чем продукт эффектов каждого из свободных препаратов:

ВОК(A) x ВОК(B)<«экспериментальная» ВОК(A+B)<ВОК(Dmax).

Антагонизм наблюдался, если «экспериментальная» ВОК для комбинации препаратов была выше, чем ВОК для самого активного из свободных препаратов, (Dmax):

«экспериментальная» ВОК(A+B)>ВОК(Dmax).

Статистическая обработка результатов.

Статистический анализ проводили с использованием программ “BIOSTAT” (Version 3.2), Microsoft Excel и Statistica v.5.0. Различия считали статистически достоверными при p<0,05, использовали t-критерий Стьюдента, односторонний и двусторонний точный критерий Фишера, критерий Вилкоксона и корреляцию Спирмена.

Результаты

В работе использовали опухолевые клетки 73-х больных ХЛЛ и 53-х больных ММ. Чувствительность в культуре оценивали МТТ— и DiSC—методами. Каждый препарат тестировали в 5 концентрациях, для каждого препарата определяли значение LD50 .в МТТ—тесте и LD70. в DiSC—методе. Критерием чувствительности была теоретически рассчитанная терапевтическая концентрация в плазме. Условием применения MTT—теста было наличие опухолевого субстрата не менее 70%, а для DiSC—метода не менее 20% в образце.

Скрининг чувствительности опухолевых клеток ХЛЛ и ММ к различным химиопрепаратам в культуре in vitro

Изучая чувствительность опухолевых клеток, 63 больных ХЛЛ к 10 ХП в культуре методом МТТ, получили следующие результаты.

У 14 первичных больных, по сравнению с ранее лечеными чувствительность к ХП была выше (от 73% до 93%). У 49 клинически резистентных, ранее леченных больных чувствительность к ХП снижается, но остается на достаточно высоком уровне у алкерана и флюдарабина. Скрининг чувствительности у всех обследованных в большей степени отражает чувствительность ранее леченых больных, так как они представляют большую группу (Рисунок 1).

Рисунок 1. Чувствительность опухолевых клеток больных ХЛЛ к химиопрепаратам

Сравнили данные чувствительности опухолевых клеток в совокупности по всем препаратам в группах первичных и получавших лечение больных. В группе первичных больных отношение чувствительных клеток ко всем исследованным было достоверно больше, чем в группе ранее леченых (Таблица 2).

Таблица 2. Характеристика лекарственной чувствительности в культуре опухолевых клеток у первичных и ранее леченых больных ХЛЛ

Отношение чувствительные/исследованные (M±m)

Первичные больные

Ранее леченые больные

0,83±0,07

0,51±0,13

p

<0,05

Аналогично изучили чувствительность опухолевых клеток, 53 больных ММ к 12 ХП методом DiSC, получили следующие результаты.

У 26 первичных больных, по сравнению с ранее леченными чувствительность к ХП была выше (от 62,5% до 95%). У 27 клинически резистентных больных чувствительность к ХП значительно снижается, но остается на достаточно высоком уровне у алкерана, сарколизина и цитарабина. (Рисунок 2)

Рисунок 2. Чувствительность опухолевых клеток больных ММ к химиопрепаратам

Сравнили данные чувствительности опухолевых клеток в совокупности по всем препаратам в группах первичных и получавших лечение больных. В группе первичных больных отношение чувствительных клеток ко всем исследованным было достоверно больше, чем в группе ранее леченых (Таблица 3).

Таблица 3. Характеристика лекарственной чувствительности в культуре опухолевых клеток у первичных и ранее леченых больных ММ

Отношение чувствительные/исследованные (M±m)

Первичные больные

Ранее леченые больные

0,798±0,1

0,396±0,21

p

<0,05

Это свидетельствует о том, что развивающаяся клиническая рефрактерность у больных сопровождалась снижением чувствительности опухолевых клеток к ХП в культуре, по сравнению с пациентами, которые еще не лечились, и согласуется с опубликованными данными у больных острыми лейкозами.

Сравнение клинического ответа и чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину in vitro у больных ХЛЛ

В группе из 33 больных ХЛЛ было проведено исследование чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину МТТ—тестом. Сравнили результаты чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину по значениям LD50 с клиническим ответом: полная и частичная ремиссии, стабилизация и прогрессирование болезни (ПР, ЧР, СБ, ПБ). Эти данные показывают, что лучшему клиническому эффекту соответствуют более низкие значения LD50. Далее были сформированы две группы больных: ответившие на лечение (достигших полной и частичной ремиссии) и не ответивших (у которых наступило прогрессирование заболевания или стабилизация болезни). Значение LD50 в группе ответивших было достоверно ниже (Рисунок 3).

А

Б

Рисунок 3. Значения LD50 в группах больных ХЛЛ с разным клиническим ответом на лечение флюдарабином (n=33)

Анализируя фармакодинамические кривые жизнеспособности опухолевых клеток от концентраций флюдарабина, были выделены 2 группы: чувствительные и нечувствительные. Критерием чувствительности были LD50 и ТПК флюдарабина, которая составила ~0,97 мкг/мл.

Сравнение фармакодинамических кривых показало, что у чувствительных пациентов средние значения живых клеток по 5 концентрациям флюдарабина достоверно меньше, чем у нечувствительных больных. Значения LD50 в этих группах также достоверно различаются.

А

Б

Рисунок 4. Фармакодинамические кривые (А) и значения LD50 (Б) флюдарабина в культуре опухолевых клеток больных ХЛЛ in vitro (n=33)

Больным было проведено лечение флюдарабином в режиме монотерапии. При анализе клинической эффективности были получены следующие результаты. У чувствительных зафиксировано 9 полных ремиссий, 5 частичных ремиссий (всего 82,4% ответивших) и 3 стабилизации болезни. В группе нечувствительных клиническая эффективность была ниже: 2 полных ремиссии, 4 частичных ремиссии (всего 37,5% ответивших), 7 стабилизаций болезни и у троих возникло прогрессирование заболевания. Полученные данные свидетельствуют о достоверно худших клинических результатах у нечувствительных пациентов согласно МТТ—тесту (Таблица 4).

Таблица 4. Сравнение клинической эффективности флюдарабина у чувствительных и не чувствительных к нему in vitro больных ХЛЛ (n=33)

Группы

Клинический ответ

Всего ответивших

Чувствительные (n=17)

9 ПР (53%)

5 ЧР (29,4%)

3 СБ (17,6%)

82,4%*

Нечувствительные (n=16)

2 ПР (12,5%)

4 ЧР (25%)

7 СБ (43,8%)

3 ПБ (18,7%)

37,5%*

*p<0,05

Сравнение клинического ответа и чувствительности опухолевых клеток к алкерану in vitro у больных ХЛЛ

В группе 17 больных ХЛЛ сравнили результаты чувствительности опухолевых клеток к алкерану по значениям LD50 в МТТ-тесте и клиническому ответу.

Для этого были сформированы две группы больных: ответившие на лечение (достигших полной и частичной ремиссии) и не ответивших (у которых наступило прогрессирование заболевания или стабилизация болезни). Значение LD50 в группе ответивших было достоверно ниже (Рисунок 5).

Рисунок 5. Значения LD50 у больных ХЛЛ в группах ответивших и не ответивших на лечение алкераном (n=17)

Анализируя фармакодинамические кривые (Рисунок 6) были выделены 2 группы: чувствительные и нечувствительные больные к действию алкерана in vitro. Критерием чувствительности были LD50 и теоретически рассчитанная терапевтическая концентрация в плазме (ТПК) алкерана, которая составила ~2,5 мкг/мл.

Сравнение фармакодинамических кривых показало, что у чувствительных больных средние значения живых клеток по 5 концентрациям алкерана достоверно меньше, чем у не чувствительных больных. Значения LD50 в этих группах также достоверно различаются.

А

Б

Рисунок 6. Фармакодинамические кривые (А) и значения LD50 (Б) алкерана в культуре опухолевых клеток больных ХЛЛ in vitro (n=17)

Больным было проведено лечение алкераном в режиме монотерапии, ранее алкеран в монотерапии ХЛЛ не применялся.

При анализе клинической эффективности были получены следующие результаты в двух группах. У чувствительных зафиксировано 1 полная ремиссия, 7 частичных ремиссий (всего 72,7% ответивших) и 3 стабилизации болезни. В группе нечувствительных, клиническая эффективность была ниже: 1 частичная ремиссия (всего 16,7% ответивших), 4 стабилизации болезни и у 1 возникло прогрессирование болезни (Таблица 5). Полученные данные свидетельствуют о достоверно худших клинических результатах у нечувствительных пациентов согласно МТТ—тесту.

Таблица 5. Сравнение клинической эффективности алкерана у чувствительных и нечувствительных к нему in vitro больных ХЛЛ (n=17)

Группы

Клинический ответ

Всего ответивших

Чувствительные (n=11)

1 ПР (9,1%)

7 ЧР (63,6%)

3 СБ (27,3%)

72,7%*

Нечувствительные (n=6)

1 ЧР (16,7%)

4 СБ (66,6%)

1 ПБ (16,7%)

16,7%*

*p<0,05

Таким образом, полученные результаты указывают, что МТТ—тест может использоваться как достоверный метод в определении чувствительности опухолевых клеток in vitro к флюдарабину и алкерану, и позволяет прогнозировать клиническую значимость препаратов.

Сравнение клинического ответа и чувствительности опухолевых клеток к сарколизину in vitro у больных ММ

Исследовали чувствительность in vitro опухолевых плазмоцитов 10 клинически рефрактерных больных ММ к препаратам, входящим в индукционные схемы М-2 и ЦСВП. На Рисунке 7 видно, что противоопухолевая активность в схемах сохранилась только у алкерана и сарколизина. Остальные препараты, в 40% и 43% случаев не будут активны.

А

Б

Рисунок 7. Чувствительность опухолевых клеток in vitro к химиопрепаратам, входящим в схемы М-2 и ЦСВП (А), значения LD70 алкерана и сарколизина (Б) у рефрактерных больных ММ (n=10)

Таким образом, было предложено выделить из комбинаций сарколизин, и применить его в режиме монотерапии с учетом дозового преимущества. Сарколизин был взят для клинического исследования в связи с тем, что его скрининговая концентрация, на которой гибнет 70% опухолевых клеток в 2,3 раза достоверно меньше, по сравнению с концентрацией алкерана.

Далее, больным была проведена терапия сарколизином, курсовая доза которого на 43% превышала курсовую дозу алкерана.

В результате проведенного лечения был получен положительный результат у 60% больных: 1—полный ответ (ПО), у 2-х больных—частичный ответ (ЧО), у 3-х—объективный ответ (ОбО), длительность ответа в среднем составила 11 месяцев. Отсутствие ответа (ОО) наблюдалось у 4-х (40%) больных, причем у 3-х из них (30%), несмотря на проводимую терапию болезнь прогрессировала (Таблица 6).

Таблица 6. Клиническая эффективность сарколизина у рефрактерных больных ММ (n=10)

Группы

Клинический ответ

Общий процент

Ответившие

(n=6)

1 ПО (10%)

2 ЧО (20%)

3 ОбО (30%)

60%

Не ответившие (n=4)

1 ОО (10%)

3 ПБ (30%)

40%

Таким образом, сложилась отличная от эмпирического подхода ситуация, когда в качестве противоопухолевого агента использовали препарат, чувствительность миеломных клеток к которому определена лабораторным путем и получили положительные результаты.

Сравнение клинического ответа и чувствительности опухолевых клеток к цитарабину in vitro у больных ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом

Провели исследование противоопухолевого действия цитарабина in vitro, у 9 больных ММ, осложеннной внутриспинальным опухолевым ростом, причем ранее цитарабин при лечении ММ не применялся.

Согласно значениям LD70 были выделены две группы чувствительные и не чувствительные к действию цитарабина in vitro (Рисунок 8). Критерием чувствительности была ТПК цитарабина, которая составила ~0,63 мкг/мл. Значения LD70 в этих группах достоверно различаются.

Рисунок 8. Сравнение значений LD70 в группах чувствительных и не чувствительных in vitro к цитарабину больных ММ (n=9)

Рассмотрим фармакодинамические кривые. На Рисунке 9 видно, что у чувствительных больных средние значения живых клеток по 5 концентрациям цитарабина достоверно меньше, чем у не чувствительных. В интервале от 0,04 до 2,5 мкг/мл сохранялись практически одинаковые различия у двух групп по количеству живых опухолевых клеток, равные в среднем 17% и только на максимальной концентрации эта разница уменьшалась почти в 2 раза. В тоже время видно, что в интервале от 0,04 до 0,63 (ТПК) мкг/мл происходит лизис в среднем 70% опухолевых клеток, и остаточные живые клетки составляют около 30%. Таким образом, чтобы получить максимальный цитостатический эффект с минимальным различием между двумя группами, надо увеличить концентрацию препарата минимум в 16 раз от ТПК. Что в рамках стандартной противоопухолевой терапии сделать невозможно. Но этот принцип может быть реализован при интатекальном введении цитарабина в спинномозговую полость.

Рисунок 9. Фармакодинамичкеские кривые цитарабина в культуре опухолевых клеток больных ММ in vitro (n=9)

Таким образом, больным была проведена интратекальная ХТ цитарабином, разовая доза вводимого препарата составила 50 мг.

Группу ответивших составили 6 человек, 5 чувствительных и 1 не чувствительный по результатам in vitro. У них наблюдалось снижение опухолевой массы на 62-100% и неврологическая ремиссия. Группу не ответивших составили 3 больных нечувствительных по результатам in vitro, снижение опухолевой массы у них наблюдалось менее чем на 23% и отсутствовала неврологическая ремиссия.

Таблица 7. Клиническая эффективность цитарабина у больных ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом (n=9)

Группы

Общий процент

Клинический ответ

Ответившие

(n=6)

66,7%

5—чувствительных

1—нечувствительный

Редукция опухоли на 62-100%

Неврологическая ремиссия

Не ответившие (n=3)

33,3%

Редукция опухоли на 23%

Из вышесказанного следует, что клинические результаты цитарабина, который ранее не использовали в терапии ММ, показали его высокую эффективность и подтвердили полученные данные в исследованиях in vitro DiSC—методом.

Сравнение клинического ответа и чувствительности опухолевых клеток к ряду химиопрепаратов in vitro у больных ХЛЛ

Исследовали группу из 25 больных ХЛЛ. Больные получали следующие препараты: винкристин, преднизолон, доксорубицин, рубомицин, мелфалан и лейкеран. Пациентам было проведено исследование чувствительности опухолевых клеток к этим ХП МТТ—тестом.

Были выделены три группы по наличию чувствительных in vitro препаратов, назначаемых в курс ХТ: I—группа, больные которых получали только чувствительные in vitro препараты; II—группа, больные которые получали и чувствительные, и устойчивые in vitro препараты; III—группа, больные которые получали только устойчивые препараты. Сравнение полученных данных в трех группах показало достоверные различия по клиническому ответу у больных в I-ой и III-ей и во II-ой и III-ей группах. Достоверных различий по клиническому ответу между I-ой и II-ой группами не было выявлено.

Таблица 8. Сравнение результатов чувствительности in vitro в МТТтесте у больных ХЛЛ с клиническим ответом (n=25)

Группы

Клинический ответ

Всего ответивших

I (n=11)

Только чувствительные in vitro ХП

4 ПР (36,4%)

7 ЧР (63,6%)

100%*

II (n=10)

Чувствительные и устойчивые in vitro ХП

5 ПР (50%)

3 ЧР (30%)

2 СБ (20%)

80%**

III (n=4)

Только устойчивые

in vitro ХП

4 СБ (100%)

0%*,**

*,**p<0,05

Аналогично, была исследована группа из 33 больных ММ. Пациенты получали те же препараты кроме лейкерана. Пациентам было проведено исследование чувствительности опухолевых клеток к этим ХП DiSC-методом. Так же были выделены три группы по наличию чувствительных in vitro препаратов, назначаемых в курс ХТ для каждого больного. Достоверных различий между I-ой и II-ой группами так же не было выявлено.

Таблица 9. Сравнение результатов чувствительности in vitro по DiSCметоду у больных ММ с клиническим ответом (n=33)

Группы

Клинический ответ

Всего ответивших

I (n=13)

Только чувствительные in vitro ХП

4 ПО (30,8%)

6 ЧО (46,2%)

2 ОбО (15,3%)

1 ОО (7,7%)

92,3%*

II (n=14)

Чувствительные и устойчивые in vitro ХП

4 ЧО (28,6%)

6 ОбО (42,8%)

4 ОО (28,6%)

71,4%**

III (n=6)

Только устойчивые

in vitro ХП

4 ОО (66,7%)

2 ПБ (33,3%)

0%*,**

*,**p<0,05

Таким образом, возможно стоит задуматься о целесообразности неоправданного назначения неэффективных ХП или заменять их соответствующими аналогами и использовать индивидуальный подход в назначении ХТ.

Исследование комбинации препаратов in vitro MTT-тестом на опухолевых клетках больных ХЛЛ

Возникает закономерный вопрос, насколько правомочно убирать из курса неэффективные препараты, не наблюдается ли между ХП эффект синергизма или же они взаимодействуют по принципу аддитивности, или антагонизма?

Что бы получить ответ на этот вопрос, было проведено исследование комбинаций in vitro тех препаратов, которые назначались больным ММ и ХЛЛ, согласно данным курсов химиотерапии.

В исследовании использовали опухолевые клетки 10 больных ХЛЛ (4—первичных и 6—ранее леченых, 6—мужчин и 4—женщины), МТТ—тест и следующие препараты доксорубицин, рубомицин, винкристин, преднизолон, мелфалан и лейкеран, а так же их комбинации. Комбинации доксорубицин+рубомицин, мелфалан+лейкеран не исследовали, поскольку эти препараты принадлежат к одним группам: антрациклины и хлорэтиламины, соответственно, и в схемах ПХТ одновременно не используются.

Таким образом, было исследовано 13 комбинаций препаратов по пять концентраций в каждой, всего 50 сравнений по каждой комбинации. Сравнение проводили согласно «мультипликативной» и «максимальной» теориям.

Таблица 10. Эффекты взаимодействия препаратов in vitro у больных ХЛЛ (n=10)

Комбинации

Син.

Адд.

Ант.

Докс.+Винк.

4,35%

91,3%

4,35%

Докс.+Пред.

11,1%

82,5%

6,4%

Докс.+Мелф.

0%

93,6%

6,4%

Докс.+Лейк.

0%

93,6%

6,4%

Руб.+ Винк.

2%

84,9%

13,1%

Руб.+ Пред.

8,7%

84,9%

6,4%

Руб.+Мелф.

4,35%

91,3%

4,35%

Руб.+ Лейк.

2%

98%

0%

Пред. + Винк.

8,7%

91,3%

0%

Пред. +Мелф.

4,4%

95,6%

0%

Пред. + Лейк.

6,4%

84,9%

8,7%

Винк. +Мелф.

4,4%

95,6%

0%

Винк. + Лейк.

6,4%

93,6%

0%

p<0,001

Как видно из Таблицы 10 синергизм не был выявлен только в 2 комбинациях доксорубицин+мелфалан и доксорубицин+лейкеран, а максимальный процент синергетического взаимодействия наблюдался в комбинации доксорубицин+преднизолон и составил 11,1%. Антагонизм же не был выявлен в 5 комбинациях рубомицин+лейкеран, преднизолон+винкристин, преднизолон+мелфалан, винкристин+мелфалан и винкристин+лейкеран, а максимальное его значение наблюдалось в комбинации рубомицин+винкристин и составило—13,1%.

Аддитивный эффект достоверно (p<0,001) превалировал над синергизмом и антагонизмом во всех исследуемых комбинациях in vitro, и минимальное его значение—82,5% наблюдалось в комбинации доксорубицин+преднизолон, а максимальное—98% в комбинации рубомицин+лейкеран.

Выводы

  1. У первичных больных хроническим лимфолейкозом и множественной миеломой средняя чувствительность к широкому спектру химиопрепаратов по результатам тестов in vitro достоверно выше, чем у клинически рефрактерных.
  2. При анализе клинической эффективности флюдарабина в группе больных ХЛЛ, чувствительных по результатам тестов in vitro, выявлено достоверно больше (p<0,05) ответивших на терапию пациентов, чем в группе нечувствительных.
  3. В группе больных ХЛЛ, чувствительных к алкерану по результатам тестов in vitro, выявлено достоверно больше (p<0,05) ответивших на терапию пациентов, чем в группе нечувствительных больных.
  4. У рефрактерных больных ММ скрининговая концентрация сарколизина, на которой in vitro гибнет 70% опухолевых клеток, в 2,3 раза достоверно ниже (p<0,05) по сравнению с концентрацией алкерана. После терапии сарколизином по принципу дозового преимущества согласно чувствительности in vitro получен положительный клинический результат у 60% больных.
  5. Выявлена in vitro высокая противоопухолевая активность цитарабина на малых концентрациях и при длительной экспозиции на плазматических опухолевых клетках больных ММ.
  6. В группе больных ММ, осложненной внутриспинальным опухолевым ростом, чувствительных к цитарабину , по результатам тестов in vitro, количество ответивших на терапию пациентов достоверно больше (p<0,05), чем в группе нечувствительных.
  7. У больных ХЛЛ и ММ отсутствуют достоверные различия по клиническому ответу в группах, получавших только «чувствительные» in vitro препараты и группах, которые получали «чувствительные» и «устойчивые» in vitro препараты. Это дает возможность исключать заведомо неэффективные ХП.
  8. В исследуемых in vitro комбинациях препаратов (доксорубицин, рубомицин, винкристин, преднизолон, мелфалан и лейкеран) аддитивный эффект достоверно (p<0,001) превалировал над синергизмом и антагонизмом у больных ХЛЛ.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

  1. Иншаков А.Н. Характеристика лекарственной устойчивости опухолевых плазмоцитов in vitro у больных множественной миеломой с различным ответом на химиотерапию./ А.К. Голенков, Е.В. Катаева, Е.В Трифонова, А.Н. Иншаков, Н.П. Логачева, А.Ю. Барышников и др.//Журн. Терапевтический архив. – 2000. Т.72. С.38-41
  2. Inshakov A.N. Clinical evolution of CLL patients according to in vitro drug sensitivity of blood lymphocytes/ A.K. Golenkov, E.V. Kataeva, T.A. Mitina, E.A. Zaradieva, A.N. Inshakov, E.U. Lysuk// Leukemia 2000 towards the cure, September 7-9, 2000. Program and abstract book, P.63
  3. Inshakov A.N. Clinical response and chemosensitivity tumor cells in vitro at the patients with limphoproliferative disease/ A.K. Golenkov, E.V. Kataeva, E.V. Trifonova, T.D. Lutskaya, T.A. Mitina, N.P. Logacheva, A.N. Inshakov, A.Yu. Baryshnikov// Leukemia. – 2001. V.15. №3. P.504
  4. Иншаков А.Н. Применение МТТ-теста и DiSC-метода в определение чувствительности к химиопрепаратам in vitro у больных ХЛЛ и множественной миеломой/ А.Н. Иншаков, Н.П. Логачева, Т.Н. Заботина, А.К. Голенков, А.Ю. Барышников// Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний. Материалы симпозиума. – 2001. С.12
  5. Иншаков А.Н. Сравнительный анализ данных МТТ-пробы у больных хроническим лимфолекозом с различным ответом на химиотерапию./ Е.В. Катаева, А.К. Голенков, Е.В. Трифонова, Т.Д. Луцкая, А.Н. Иншаков, Н.П. Логачева, Е.Ю. Лысюк, А.Ю. Барышников.// Российский биотерапевтический журнал. – 2002. -, Т.2,  №1. - С. 65-67
  6. Inshakov A.N. Determinet treatment with sarcolysin on sensitivity in vitro refractory B-CLL patients/ A.K. Golenkov, E.V. Kataeva, N.A. Oborotova, A.N. Inshakov, A.Yu. Baryshnikov, N.P. Logacheva// The Hematology Journal. – 2002. – V.3. Suppl.1. P.311
  7. Иншаков А.Н. Терапия резистентных больных множественной миеломой сарколизином по принципу дозового преимущества с учетом чувствительности in vitro./ Е.В. Трифонова, А.К. Голенков, Е.В. Катаева, Т.А. Митина, Т.Д. Луцкая, А.Ю. Барышников, А.Н. Иншаков.// Альманах «Геронтология и гериатрия» – 2007. №7. – С. 201-206
  8. Inshakov A.N. Determined treatment with the fludarabine and cyclophosphamide of the resistant and relapsed B-CLL patients on the B-cells sensitivity in vitro/ E. Kataeva, A. Golenkov, A. Inshakov, A. Baryshnikov// Leukemia Research – 2007. V.31. – P.s82
  9. Иншаков А.Н. Химиотерапия сарколизином рефрактерных больных хроническим лимфолейкозом с учетом чувствительности опухолевых клеток в культуре / Е.В. Трифонова, А.К. Голенков, Е.В. Катаева, Т.А. Митина, Т.Д. Луцкая, А.Ю. Барышников, А.Н. Иншаков.// Альманах «Геронтология и гериатрия» – 2007. №7. – С. 206-212
  10. Иншаков А.Н. Способ прогнозирования эффективности лечения резистентных форм хронического лимфолейкоза путем оценки чувствительности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам in vitro./ А.К. Голенков, Е.В. Катаева, Т.Д. Луцкая, Т.А. Митина, Е.В Трифонова, Л.Л.Высоцкая, Г.А. Дудина, Н.В. Инюткина, А.Н. Иншаков, Н.А. Оборотова, А.Ю. Барышников.// Медицинская технология. – 2009.
  11. Иншаков А.Н. Фармакодинамическое моделирование in vitro клинической эффективности флюдарабина при резистентных формах хронического лимфолейкоза./ А.Н. Иншаков, А.Ю. Барышников, Е.В. Катаева, Е.В. Трифонова, А.К. Голенков.// Российский биотерапевтический журнал. – 2009. -, Т.8,  №4. - С. 25-28
  12. Иншаков А.Н. Фармакодинамическое моделирование сарколизина in vitro и его клиническая эффективность при резистентных формах множественной миеломы./ А.Н. Иншаков, Н.А. Оборотова, А.Ю. Барышников, Е.В. Трифонова, Е.В. Катаева, А.К. Голенков// Российский биотерапевтический журнал. – 2009. -, Т.8,  №3. - С. 81-83



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.