WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ТАРАСОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

АНАФЕРОНА ДЕТСКОГО:

СПЕКТР ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ И

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Томск - 2012

Работа выполнена в Обществе с ограниченной ответственностью «Научно-производственной фирме «МАТЕРИА МЕДИКА ХОЛДИНГ» и Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор  Сергеева Светлана Александровна

Официальные оппоненты:

Шерстобоев Евгений Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория иммунофармакологии, заведующий лабораторией

Иванова Светлана Александровна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт психического здоровья» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория клеточных и молекулярно-биологических исследований, заведующая лабораторией

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «___»________________ 2012 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «_____»_________________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук  Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы.

На сегодняшний день вирусные инфекции являются ведущей причиной заболеваемости во всем мире и по прогнозам ВОЗ в XXI веке роль инфекций в структуре общей заболеваемости будет только возрастать (Кондюрина Е.Г. и соавт. 2006; Wainberg M.A., 2009; Englund J. et al., 2011). По официальным статистическим данным, ежегодно в России регистрируется более 30 млн. вирусных инфекционных заболеваний, причем вне учета остаются многочисленные легкие клинические и бессимптомные формы.

Открыто более 500 патогенных для человека вирусов, как РНК-содержащих (ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы и пикорнавирусы), так и ДНК-содержащих (аденовирусы и герпесвирусы), ежегодно появляются новые штаммы вирусов. Так с 2002 г. зафиксированы вспышки инфекций, ставших причиной эпидемий и пандемий: птичий грипп, атипичная пневмония и свиной грипп. Из 15 серотипов вируса гриппа птиц наиболее опасен штамм H5N1: средние показатели смертности среди больных превышают 50%. Эпидемия атипичной пневмонии или, по-другому, тяжелого острого респираторного синдрома (severe acute respiratory syndrome) в 2003 г. была вызвана новым вирусом из семейства коронавирусов. Весной 2009 г. в Мексике зафиксирована вспышка свиного гриппа, вызванного вирусом гриппа А(Н1N1/09)v (штамм California04/2009), который возник в результате реассортации генов вируса гриппа А человека, птиц и свиней (Shinde V. et al., 2009; Goel M.K. et al., 2011). Традиционные средства профилактики и лечения гриппа — арбидол и ремантадин мало эффективны против вируса гриппа А(Н1N1/09)v. Тамифлю эффективен только при его применении не позднее 48 часов после начала заболевания, более того, появились резистентные к тамифлю штаммы вируса А(Н1N1/09)v (Meijer A. et al., 2009; Zhou J. et al., 2011), например, штамм вируса с мутацией нейраминидазы H274Y (Kawai N. et al., 2009; Kiso M. et al., 2010).

В связи с высокой медицинской, социальной, экономической значимостью вирусных инфекционных заболеваний, противовирусные препараты занимают одно из первых мест среди наиболее интенсивно разрабатываемых в последние годы лекарственных средств (Ершов Ф.И., Касьянова Н.В., 2004; Wainberg M.A., 2009; Smith J.R., 2010; Razonable R.R., 2011).

Терапия вирусных инфекций является комплексной и включает не только этиотропные средства, действующие непосредственно на вирусы, но и иммуномодуляторы, корригирующие нарушения иммунного ответа, возникающие вследствие вирусных инфекций, симптоматические средства, оказывающие воздействие на общие симптомы вирусных заболеваний (повышенная температура, болевой синдром, кашель и др.), патогенетические средства, используемые при интоксикации, обезвоживании, аллергических реакциях.

Несмотря на большой арсенал существующих противовирусных препаратов, проблема  эффективной профилактики и лечения вирусных инфекций далека от окончательного решения, что связано с многообразием вирусов-возбудителей, изменчивостью антигенных свойств вирусов, часто смешанным характером инфекции, быстро развивающейся резистентностью к препаратам, развитием вторичного иммунодефицита, строгой специфичностью большинства препаратов (Киселев О.И., 2003; Ершов Ф.И., Касьянова Н.В., 2004; Barnett E.D., 1998; Fensterl V., Sen G.C., 2009; Wainberg M.A., 2009; Sarrazin C., Zeuzem S., 2010). Более того, широкое применение существующих противовирусных препаратов, особенно в  педиатрической практике, а также у пациентов с сопутствующими заболеваниями, резко ограничено нежелательными явлениями.

В связи с этим, поиск и создание новых противовирусных лекарственных средств, сочетающих высокую безопасность и эффективность, остается важной и приоритетной задачей современного здравоохранения.

К одним из новых, но уже успешно зарекомендовавших себя для лечения различных заболеваний (инфекционных, воспалительных, психических, метаболических и др.) препаратов, относятся лекарственные средства на основе сверхмалых доз антител к эндогенным регуляторам функций (Эпштейн О.И., 2008). Главной отличительной особенностью данного класса препаратов является высокий профиль безопасности, позволяющий применять их практически во всех группах пациентов, а также эффективность сравнимая с эффективностью современных препаратов, относящихся к «золотому стандарту» в терапии заболеваний. Одним из ярких представителей лекарственных средств на основе сверхмалых доз антител является препарат анаферон детский – препарат на основе сверхмалых доз антител к интерферону гамма человека, изучению спектра противовирусной активности и механизмов действия которого посвящена настоящая диссертационная работа.

Цель исследования.

Изучить спектр противовирусной активности анаферона детского и исследовать механизмы действия препарата.

Задачи исследования.

  1. Изучить противовирусную активность анаферона детского в условиях экспериментальных моделей вирусных инфекций, вызванных различными штаммами вируса гриппа А и герпесвирусами.
  2. Исследовать эффективность комбинированного применения анаферона детского с ингибитором нейраминидазы – озельтамивиром.
  3. Выявить рецепторы, участвующие в реализации фармакологической активности анаферона детского, с использованием радиолигандного метода анализа и метода оценки функционального состояния рецепторов.
  4. Изучить особенности влияния анаферона детского на систему интерферона гамма – продукцию цитокина, связывание интерферона гамма со своим рецептором и регуляцию биологической активности интерферона гамма естественными аутоантителами к данному цитокину.

Научная новизна.

Показано, что анаферон детский обладает широким спектром противовирусной активности – препарат эффективен в лечении вирусных инфекций, вызванных как РНК-, так и ДНК-содержащими вирусами. Впервые экспериментально доказано, что анаферон детский повышает противовирусную резистентность организма, практически полностью предотвращая гибель экспериментальных животных, инфицированных различными штаммами вируса гриппа А (H3N2, H3N8 и H1N1), включая пандемический штамм 2009 года A/California/07/2009 (H1N1)v, и вируса простого герпеса II типа.

Впервые показано, что по противовирусной активности анаферон детский не уступает озельтамивиру, применяемому при гриппе, ацикловиру, используемому для терапии герпесвирусных инфекций. Впервые обнаружено, что совместное применение анаферона детского с противовирусным препаратом озельтамивиром позволяет повысить эффективность терапии в эксперименте, а также снизить их дозы при сохранении высокой результативности лечения, что особенно важно для повышения безопасности проводимой терапии и сокращения количества нежелательных явлений.

Впервые выявлены рецепторы-мишени анаферона детского: рецептор интерферона гамма (ИФН-), сигма-1 рецептор (1) и альфа рецептор хемокинов 4 типа (CXCR4). Показано, что анаферон детский повышает эффективность взаимодействия ИФН- со своим рецептором. Выявлено, что анаферон детский проявляет свойства антагониста CXCR4 рецептора хемокинов человека, который экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов и участвует в регуляции миграции иммунокомпетентных клеток. Также впервые показано, что анаферон детский ингибирует связывание лигандов с 1 рецептором – мультифункциональным внутриклеточным рецептором, участвующим, в частности, в регуляции иммунного ответа организма.

Впервые, в исследовании in vitro с использованием технологии ELISPOT, обнаружено, что анаферон детский обладает прямой ИФН-индуцирующей активностью.

Впервые выявлено, что одной из возможных фармакологических мишеней анаферона детского является система естественных аутоантител к ИФН-, вовлеченная в регуляцию биологической активности эндогенных интерферонов.

Практическая значимость работы.

В результате проведенной работы получены экспериментальные данные о спектре противовирусной активности анаферона детского и механизмах его действия. Выявлено, что по выраженности противовирусного действия анаферон детский не уступает классическим средствам противовирусной терапии, таким как озельтамивир и ацикловир. Материалы экспериментальных исследований вошли в комплект документов, представленных в Федеральную службу по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации (РФ) и соответствующие службы других стран с целью получения разрешения на широкое медицинское применение препарата в РФ (Регистрационное удостоверение № P N000372/01) и других странах (Камбоджа, Вьетнам, Украина, Республика Беларусь, Таджикистан, Туркменистан, Азербайджан, Грузия, Узбекистан, Казахстан, Республика Молдова, Кыргызстан).

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Анаферон детский — противовирусный препарат, эффективный в отношении как ДНК-, так и РНК-содержащих вирусов. Препарат повышает резистентность организма к действию вирусов, снижая титр вирусов в органах-мишенях, уменьшая заболеваемость и смертность экспериментальных животных, инфицированных различными дозами вирусов гриппа и герпесвирусов, а также тяжесть течения заболевания и длительность основных клинических симптомов у инфицированных экспериментальных животных.
  2. Совместное применение противовирусного лекарственного средства озельтамивира с анафероном детским повышает эффективность проводимой терапии, что, указывает на возможность снижения дозы противовирусных препаратов и, следовательно, их токсичность при сохранении высокой  результативности лечения.
  3. Анаферон детский оказывает прямое ИФН-индуцирующее действие на клетки. Препарат индуцирует продукцию клетками ИФН-, что было доказано in vitro исследованиями с использованием технологии ELISPOT.
  4. Одной из фармакологических мишеней анаферона детского in vivo является система естественных аутоантител к ИФН-, участвующая в регуляции иммунного ответа, в том числе, в модуляции активности системы интерферонов.
  5. Анаферон детский повышает эффективность взаимодействия ИФН- со своим рецептором, а также проявляет свойства антагониста CXCR4 рецептора, ингибируя его функциональную активность. Кроме того, препарат обладает сродством к 1 рецептору.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XI Всероссийском научном форуме с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007);  25  Международном  конгрессе  педиатров  (Athens, Greece, 2007); XII конгрессе  педиатров  России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2008); II Московской международной конференция «Иммунофизиология: естественный аутоиммунитет в норме и патологии» (Москва, 2008); VII Международном конгрессе «Доказательная медицина – основа современного здравоохранения» (Хабаровск, 2008); Конгрессе общества европейских фармакологов 2008 (Manchester, UK, 2008); XV, XVI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2008, 2009); 4 Европейском конгрессе педиатров 2009 (Москва, 2009); 20 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Wien, Austria, 2010); Международном конгрессе по фармакологии (Copenhagen, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ.

Объем и структура работы:  Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 208 источников, из них 72 отечественных и 136 зарубежных. Работа иллюстрирована 27 рисунками и содержит 31 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментальных исследованиях использовано 466 мышей-самок линии Balb/c, 490 белых беспородных мышей обоего пола в возрасте 5-8 недель массой 15-22 г, 60 морских свинок-самок породы «Агути гладкошерстная» в возрасте 6-8 недель массой 250-300 г, полученных из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется). Животные содержались в неполной барьерной системе в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Мыши находились по 10-15 особей, морские свинки – по 5 особей в пластиковых клетках при температуре воздуха 18-220 С и 12-часовом цикле день/ночь, при свободном доступе к воде и пище. Опыты проводили в осенне-зимний период, а забор материала осуществляли в утренние часы.

Противовирусную активность анаферона детского (ООО «НПФ «МАТЕРИА МЕДИКА ХОЛДИНГ», Россия) в отношении РНК-содержащих вирусов оценивали на модели гриппа А с использованием различных штаммов данного вируса (А/Aichi/2/68 (H3N2), A/Equine/2/Miami/1/63 (H3N8),  A/California/07/2009v (H1N1)v).

Экспериментальных мышей инфицировали однократным интраназальным введением вируса гриппа А в различных дозах (ИД100, LD50 – LD90). Экспериментальным мышам анаферон детский вводили 2 раза в сутки (в 1000 и 1700 часов) в виде водного раствора по лечебно-профилактической схеме (в течение 5 суток до инфицирования и 21 суток после инфицирования) внутрижелудочно в различных дозах (от 10 мл/кг/сут до 20 мл/кг/сут). Животные контрольных групп получали дистиллированную воду по схеме введения анаферона детского (плацебо) или  препарат сравнения озельтамивир (Тамифлю, F. Hoffmann La Roche Ltd) по лечебной (начало введения после инфицирования животных) или лечебно-профилактической схемам (начало введения до инфицирования животных) в различных дозах (от 4 до 30 мг/кг/сут). При исследовании эффективности комбинированного применения анаферона детского с озельтамивиром, препарат растворяли в водном растворе анаферона детского. В исследованиях оценивали следующие показатели: 1) заболеваемость и смертность экспериментальных животных; 2) титр вируса гриппа А в легких; 3) тяжесть течения гриппозной инфекций; 4) развитие постгриппозной пневмонии; 5) состояние легких.

В качестве модельного ДНК-содержащего вируса для оценки противовирусной активности анаферона детского был выбран вирус простого герпеса 2 типа. Экспериментальных мышей (белые беспородные) инфицировали однократным внутрибрюшинным введением 10LD50 штамма MS вируса простого герпеса 2 типа. Экспериментальных морских свинок («Агути гладкошерстная») инфицировали штаммом ЕС вируса генитального герпеса 2 типа, нанося и втирая вирусосодержащую суспензию на скарифицированную с двух сторон медицинским скарификатором поверхность половых органов (инфекционный титр 6lgТЦД50/мл). Мышам анаферон детский вводили внутрижелудочно в виде водного раствора (5 мл/кг 1 раз в сутки) по профилактической (в течение 5 суток, прекращая введение за 1 сутки до заражения) или лечебной схемам (в течение 5 дней, начиная с момента заражения). Животным отрицательного контроля вводили дистиллированную воду (плацебо). Морским свинкам анаферон детский вводили внутрижелудочно в дозе 5 мл/кг 2 раза в сутки в виде водного раствора по лечебной (15 суток после инфицирования) или лечебно-профилактической схемам (в течение 5 суток до и 15 суток после инфицирования). Контрольным группам экспериментальных животных вводили ацикловир (Виролекс, KRKA, Словения) по 50 мг/кг 2 раза в день внутрижелудочно в течение 15 суток после инфицирования или дистиллированную воду (плацебо) – внутрижелудочно 2 раза в день по 5 мл/кг в течение 15 суток после инфицирования.

Особенности ИФН-индуцирующей активности анаферона детского in vitro оценивали с использованием тест-системы ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSPOT), производства компании U-Cytech bioscience (Голландия). Мононуклеарные клетки периферической крови человека (концентрация клеток 4 • 106 клеток/мл) инкубировали в течение 42 часов в 24-луночном планшете в присутствии водного раствора анаферона детского или дистиллированной воды (плацебо), затем клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с антибиотиками, L-глутамином, буфером Hepes и эмбриональной телячьей сывороткой и повторно инкубировали в присутствии анаферона детского или воды дистиллированной в течение 20 часов в ELISPOT планшете. По завершении инкубации измеряли количество клеток, продуцирующих ИФН-, с помощью ELISPOT ридера BIOREADER 3000CL/PRO (BIO-SYS GmbH, Германия).

Уровень естественных аутоантител к ИФН- определяли в сыворотке крови 50 пациентов с ветряной оспой или инфекционным мононуклеозом в возрасте от 4 до 7 лет, принимавших участие в клинических исследованиях анаферона детского, с использованием высокочувствительных ИФА наборов, разработанных компанией U-CyTech bioscience (Голландия) совместно с ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг» (Россия). На клиническое исследование получено разрешение Комитета по этике при Федеральном органе контроля качества лекарственных средств (протоколы № 75 и № 76 от 25.04.06 г.).

Сродство анаферона детского к рецептору ИФН- и 1 рецептору изучали с использованием стандартной методики радиолигандного анализа. В экспериментах использовали гомогенаты мембран клеток Jurkat (линия лейкемических Т-лимфоцитов человека) для оценки влияния анаферона детского на взаимодействие стандартного лиганда с 1 рецептором и моноциты U-937 (лимфобласты, выделенные из тканей легких человека) для оценки влияния анаферона детского на связывание ИФН- со своим рецептором. В качестве стандартных радиолигандов применяли 3H-пентазоцин и 125I-ИФН-. В качестве контроля для измерения неспецифического связывания использовался галоперидол или немеченный ИФН-. Радиоактивность измерялась на сцинтилляционном счетчике Topcount (Packard, США) или CobraTM (Packard, США).

Влияние анаферона детского на функциональную активность CXCR4 рецептора изучалась с использованием метода оценки концентрации цАМФ методом гомогенной флуоресценции с разрешением по времени (HTRF). В эксперименте использовали клетки CHO-K1 (клетки яичников китайских хомячков), экспрессирующие рекомбинантный рецептор CXCR4. В режиме агониста анаферон детский или воду дистиллированную (плацебо) добавляли в культуру клеток, инкубировали и оценивали концентрацию цАМФ, характеризующую функциональную активность CXCR4 рецептора, с использованием HTRF тест-систем (CisBio, США). В режиме антагониста оценивали способность анаферона детского или воды дистиллированной (плацебо) ингибировать активность стандартного агониста CXCR4 рецептора – SDF-1, оценивая концентрацию цАМФ с использованием HTRF тест-систем (CisBio, США).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием  непараметрических методов статистики в приложении программ Statistica 6.1 и Microsoft Excel 2003. Из элементов описательной статистики вычислялись: среднее арифметическое значение (M), медиана (Ме), стандартная ошибка среднего арифметического значения (m). Статистическая значимость различий количественных признаков оценивалась с использованием  непараметрических  методов (критерий Манна-Уитни, критерий Вилкоксона). Статистическая значимость различий качественных признаков оценивалась с использованием критерия хи квадрат. Различия считались статистически значимыми при  р<0,05. Для анализа связей между признаками применялся непараметрический корреляционный метод Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Противовирусная активность анаферона детского была показана в экспериментальных моделях вирусной инфекции, вызванных различными штаммами вируса гриппа А (H3N2, H3N8, H1N1). Эффект препарата проявлялся в снижении смертности животных, продлении срока их жизни, снижении титра вируса в легочной ткани животных, сокращении тяжести и длительности заболевания. Выявленное ингибирующее действие анаферона детского на репродукцию вируса гриппа А сопровождалось ограничением размеров очагов гриппозной пневмонии как на ранних, так и на поздних сроках инфицирования и уменьшением деструктивных и инфильтративных процессов в легочной ткани.

В экспериментальной модели гриппа А, при которой мышей Balb/c инфицировали LD80 вируса гриппа А (A/Aichi/2/68 (H3N2) или A/Equine/2/Miami/1/63 (H3N8)) показано (рис. 1, 2), что применение анаферона детского (20 мл/кг/сут) по лечебно-профилактической схеме в 2,7 и 4,5 раз, соответственно, повышает выживаемость животных по сравнению с группой плацебо (p<0,001), а применение озельтамивира (20 мг/кг/сут и 4 мг/кг/сут) – в 3,3 и 3 раз, соответственно (p<0,001 от плацебо). Эффект анаферона детского  носил  дозозависимый характер – при сокращении дозы анаферона детского в 2 раза (с 20 мл/кг/сут до 10 мл/кг/сут) выживаемость животных уменьшалась в 2 раза.

В экспериментальной модели «свиного» гриппа анаферон детский обладал выраженным  протективным  эффектом,  проявляющимся  в  снижении смертности животных, инфицированных 10LD50 вируса гриппа A/California/07/2009v (H1N1) (рис. 3), продлении на 2,5 суток срока жизни экспериментальных животных, нормализации весовых показателей и снижении инфекционного титра вируса в легочной ткани животных на 3 и 6 сутки после заражения (табл. 1). Совместное применение анаферона детского с озельтамивиром приводило к значительному повышению выживаемости экспериментальных животных, что свидетельствует о синергизме в действии данных препаратов (рис. 3).

Рисунок 1. Выживаемость экспериментальных мышей, инфицированных летальной дозой вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2).

Рисунок 2. Выживаемость экспериментальных мышей, инфицированных летальной дозой вируса гриппа A/Equine/2/Miami/1/63 (H3N8).

Рисунок 3. Выживаемость экспериментальных мышей, инфицированных летальной дозой вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1)v.

Выявленное ингибирующее действие анаферона детского на репродукцию вируса гриппа А/H1N1 сопровождалось ограничением  размеров  очагов  гриппозной пневмонии как на ранних, так и на поздних сроках после инфицирования и уменьшением деструктивных и инфильтративных процессов в легочной ткани (рис. 4). Озельтамивир в дозе 20 мг/кг/сут проявлял  умеренную протективную активность, снижая титр вируса в легких, однако, не повышая выживаемость экспериментальных животных. Комбинированное применение озельтамивира с анафероном детским было значительно эффективнее монотерапии озельтамивиром.

Рисунок 4. Очаги острой гриппозной пневмонии на 6 сутки после инфицирования вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1)v. А – плацебо, Б –анаферон детский (20 мл/кг/сут), В –озельтамивир (20 мг/кг/сут), Г –анаферон детский (20 мл/кг/сут) + озельтамивир (20 мг/кг/сут).

С целью более детального изучения влияние анаферона детского на репродукцию вирулентного штамма вируса гриппа А(H1N1/09)v в легких мышей было проведено исследование, в котором мышей линии Balb/c инфицировали 100% инфицирующей дозой (100ИД)  и  оценивали  титр  вируса гриппа А через 2, 4, 6 и 8 суток. В качестве препарата сравнения использовали озельтамивир в дозе 30 мг/кг/сут. Показано, что анаферон детский по способности ингибировать репродукцию вируса гриппа А(H1N1/09)v в легких мышей не только не уступает, но даже превосходит озельтамивир (табл. 1).

Таблица 1

Динамика титра вируса гриппа в легких у мышей при заражении ИД100 штамма вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1)v

Группы животных

Средние значения титров (lg ТЦД50/мл ±m) вируса гриппа A(H1N1)v в гомогенатах легких у инфицированных животных через:

2 сут

4 сут

6 сут

8 сут

анаферон детский

0,54±0,03 n=8

0,59±0,03* n=8

1,63±0,19*

n=8

0,98±0,17*

n=8

озельтамивир

0,52±0,02 n=8

0,54±0,03* n=8

1,77±0,09*

n=8

1,10±0,16*

n=8

плацебо

0,56±0,03  n=8

1,96±0,14 n=8

2,86±0,11

n=8

2,65±0,23

n=8

Примечание: *  – p<0,05 от группы плацебо.

Таким образом, по результатам проведенных экспериментальных исследований анаферона детского на моделях гриппа А можно сделать вывод, что препарат обладает высокой противовирусной активностью и эффективен для лечения и профилактики инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами, что подтверждается результатами клинических исследований анаферона детского, в которых препарат был эффективен в лечении заболеваний, вызываемых не только вирусами гриппа А, но и респираторно-синцитиальным вирусом, калицивирусами, буньявирусами, парамиксовирусами, коронавирусами, пикорнавирусами (Самсыгина Г.А., 2008).

Для оценки противовирусной активности анаферона детского в отношении ДНК-содержащих вирусов был выбран вирус простого герпеса II типа. На модели герпесвирусной инфекции у мышей выявлено, что анаферон детский в 2,4 раза (рис. 5) по сравнению с плацебо (p<0,001) повышает выживаемость экспериментальных животных: в группе плацебо к концу эксперимента погибло 69,2% мышей, в группе анаферона детского – только 28,6%. Средняя продолжительность жизни экспериментальных животных, получавших анаферон детский, была на 3,3 суток больше, чем в группе плацебо (p<0,001).

Определение титра вируса герпеса в мозге мышей показало, что в группе животных, получавших анаферон детский, произошло снижение инфекционности вируса. Препарат в 10 раз (p<0,001) подавлял накопление вируса в головном мозге мышей (рис. 5).

Рисунок 5. Смертность мышей и суммарный титр вируса в головном мозге мышей, инфицированных вирусом простого герпеса II типа.

Способность анаферона детского подавлять репродукцию герпес-вирусов была показана и на модели генитального герпеса у морских свинок. Суммарный титр вируса (|lg(титра вируса|) в вагинальных мазках в группе плацебо составил 115,5, в группе ацикловира – 87,5, у морских свинок, получавших анаферон детский по лечебной схеме – 76,5, по лечебно-профилактической схеме – 55,5 (рис. 6).

Наибольшая противовирусная эффективность зафиксирована у морских свинок, получавших анаферон детский по лечебно-профилактической схеме. Это также подтверждается и клиническим течением инфекции.

Комбинированное (профилактическое и лечебное) введение анаферона детского приводило к более значительному сокращению (табл. 2) сроков заболевания (на 5,2 суток, p<0,05 по сравнению с плацебо) и снижению выраженности симптоматики (в  6  раз  по  сравнению  с  плацебо).  Введение

ацикловира достоверно сокращало по сравнению с плацебо время проявления местных симптомов в среднем на 2 суток (табл. 2) и выраженность клинической симптоматики на 13%.

Рисунок 6. Суммарный титр вируса простого герпеса II типа (|lg(титра вируса|) в вагинальных мазках экспериментальных животных. *  p<0,05 от группы плацебо; #  – p<0,05 от группы ацикловира.

Таблица 2

Продолжительность клинических симптомов заболевания у морских свинок, инфицированных вирусом простого герпеса II типа (М±m)

Группы животных

Продолжительность местных симптомов, сут

Время, необходимое для достижения полной реэпителизации, сут

плацебо, n=15

13,7 ± 2,4

10,8 ± 0,8

ацикловир,  n=15

11,7 ± 2,3*

10 ± 1,3

анаферон детский (лечебный режим), n=15

14,3 ± 1,6

9,7 ± 1,1*

анаферон детский (профилактический и лечебный режим), n=15

8,5 ± 3,7*

0* (поражения слизистой отсутствовали)

Примечание: *  –  p<0,05 от группы плацебо.

Таким образом, на данном этапе экспериментального исследования была доказана эффективность анаферона детского в отношении ДНК-содержащих вирусов герпеса. Противовирусная активность анаферона детского в отношении других представителей ДНК-содержащих вирусов – альфа герпесвирусов (вирусы простого герпеса I и II типов, вирус ветряной оспы), гамма герпесвирусов (вирус Эпштейн-Барр), аденовирусов – была доказана в клинических исследованиях препарата, что подтверждает валидность полученных экспериментальных результатов (Эпштейн О.И., 2008; Zuikova I.N. et al., 2009; Dondurei E.A. et al., 2009).

Проведенные экспериментальные исследования выявили высокую противовирусную активность анаферона детского в отношении ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Выявленное «универсальное» действие препарата свидетельствует о том, что в основе противовирусного действия препарата лежит способность анаферона детского оказывать влияние на основные системы естественной противовирусной резистентности организма. Одной из таких универсальных эндогенных систем, отвечающих за противовирусный иммунный ответ, является система ИФН, влияние на которую может быть одним из ключевых механизмов действия препарата. В проведенных клинических исследованиях анаферон детский индуцировал выработку ИФН у детей с вирусным заболеваниям уже в первые сутки после начала терапии, а также предупреждал угнетение продукции данных цитокинов в период реконвалесценции. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что анаферон детский является индуктором ИФН, однако, не было ясно оказывает ли анаферон детский прямое ИФН-индуцирующее действие на клетки-продуценты ИФН или индукция цитокинов под действием анаферона детского обусловлена опосредованными процессами. В связи с этим, в данной работе in vitro изучали влияние анаферона детского на основные звенья интерфероногенеза (Ершов Ф.И. и соавт., 2005) – «продукцию» (способность препарата индуцировать выработку клетками ИФН) и «действие» (способность препарата модулировать биологические эффекты ИФН, реализуемые через рецепторы ИФН-).

Прямое ИФН-индуцирующее действие анаферона детского изучено с использованием методики ELISPOT, являющейся производной биологического и иммуноферментного методов анализа. В данном методе с помощью антител к ИФН-, адсорбированных на поверхности твердофазного планшета, оценивают количество клеток, продуцирующих ИФН- под действием препарата. Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что анаферон детский является индуктором ИФН- – количество мононуклеарных клеток периферической крови, продуцирующих ИФН-, проинкубированных в течение 42 часов в присутствии анаферона детского, было значительно больше (в 10 раз, р<0,001), чем в контрольных образцах (клетки периферической крови человека, инкубация с дистиллированной водой): медиана = 1 (min=0; max=2) в контроле и медиана = 10 (min=10; max=14) в группе анаферона детского.

Одним из механизмом, согласующимся с современным пониманием иммунологических процессов, участвующих в регуляции системы ИФН, является влияние на систему естественных аутоантител к ИФН-, регулирующих силу и продолжительность иммунного ответа in vivo (Van der Meide P.H et al., 1991). С целью подтверждения данной гипотезы у пациентов с герпесвирусными инфекционными заболеваниями (ветряная оспа и инфекционный мононуклеоз), которые принимали участие в клинических исследованиях анаферона детского, в динамике был определен уровень естественных аутоантител к ИФН-.

Обнаружено, что при вирусной инфекции уровень естественных аутоантител к ИФН- значительно повышается по сравнению со здоровыми добровольцами уже в первые 48 часов с момента появления клинических симптомов вирусной инфекции, а затем постепенно снижается, что согласуется с доступными литературными данными (Caruso A. et al., 1990). Прием анаферона детского приводил к нормализации уровня естественных аутоантител в более короткие сроки. Так, к 8 суткам терапии уровень естественных аутоантител к ИФН снизился у 60% пациентов, принимавших анаферон детский, и составил в среднем 27,5 УЕ/мл, а в группе плацебо практически не изменился и составил в среднем 38,5 УЕ/мл (снижение зафиксировано только у 30% пациентов).

Наличие взаимосвязи между клинической эффективностью анаферона детского и влиянием препарата на естественные аутоантитела к ИФН- было также подтверждено с помощью непараметрического корреляционного анализа. В частности была выявлена зависимость изменения уровня естественных аутоантител к ИФН- в сыворотке крови пациентов от длительности лихорадки, коэффициент корреляции Спирмена составил +0,43.

Во втором исследовании по оценке уровня естественных аутоантител к ИФН- у пациентов с инфекционным мононуклеозом использовали усовершенствованные ИФА наборы, позволяющие определять концентрацию не только свободной фракции естественных аутоантител, но и их общий уровень. Было показано, что в среднем на 5-6 сутки от появления первых симптомов инфекционного мононуклеоза уровень естественных аутоантител к ИФН- в сыворотке крови в 3 раза превышает значения, зафиксированные у здоровых людей (рис. 7).

Так же, как и в первом исследовании, анаферон детский влиял на характер изменения уровня естественных аутоантител к ИФН-. Доля детей, у которых было зафиксировано повышение данного показателя к окончанию терапии (14 сутки), была в 2 раза выше (p=0,06) в группе анаферона детского по сравнению с группой плацебо (66,7% против 33,3% детей, соответственно). У данных пациентов анаферон детский статистически значимо повышал уровень естественных аутоантител к ИФН- на 39,4% против 21,7% в группе плацебо (p<0,01). Через 14 дней после окончания терапии уровень естественных аутоантител к ИФН- был сопоставим с группой плацебо.

Рисунок 7. Динамика уровня естественных аутоантител к ИФН- в сыворотке крови пациентов с инфекционным мононуклеозом.

Биологическая активность ИФН- реализуется через специфические клеточные рецепторы и внутриклеточный сигнальный протеинкиназный каскад, приводящий к активации соответствующих транскрипционных факторов и транскрипции целого семейства генов, кодирующих факторы резистентности к инфекционным агентам и комплементарные цитокины. Поэтому была проведена работа по изучению влияния анаферона детского на взаимодействие ИФН- со своим рецептором.

В результате данной работы с использованием радиолигандного метода анализа рецепторного связывания показано, что анаферон детский на 52,9% увеличивает количество ИФН-, связавшегося со своим рецептором: количество ИФН- (% от связывания в стандартных условиях), связавшегося со своим рецептором в присутствии плацебо (вода дистиллированная) составило 114,4±10,81%, а в присутствии анаферона детского 152,9±3,05% (p<0,05 от плацебо). Увеличивая количество комплексов рецептор-ИФН-, анаферон детский может усиливать ответ клетки на действие ИФН-, в частности, индуцировать экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости I, II типов и Fc-рецепторов, активировать моноциты, стимулировать функциональную активность NK-клеток, регулировать синтез иммуноглобулинов.

Способность препарата увеличивать количество ИФН-, связывающегося со своим рецептором, позволяет сделать предположение, что анаферон детский увеличивает количество активных рецепторов, экспрессированных на клеточной мембране и, возможно, является аллостерическим модулятором рецептора ИФН-. Выявленный эффект нашел подтверждение и в клинических исследованиях препарата – анаферон детский увеличивает субпопуляцию лимфоцитов, экспрессирующих на клеточной мембране рецепторы к ИФН- (CD119+ лимфоциты) (Сизякина Л.П., Мельникова М.О., 2009).

К другому рецептору иммунной системы, на который оказывает действие анаферон детский, относится альфа-хемокиновый рецептор CXCR4. Было выявлено, что анаферон детский является антагонистом данного рецептора: вода дистиллированная (плацебо) ингибировала активность агониста данного рецептора SDF-1 на 3,5±2,54%, а анаферон детский на 16,7±2,56% (p<0,05 от плацебо). К препаратам, являющимся антагонистами данного рецептора, относится группа антиретровирусных препаратов, т.к. через данный корецептор CD4 рецептора ВИЧ проникает в клетки.

Кроме того, анаферон детский  на 62% ингибировал связывание стандартного лиганда с 1 рецептором: препарат в модельной системе вытеснял более 60% 3H-пентазоцина с 1 рецептора. Реализация активности через данный рецептор описана и для некоторых современных иммуномодулирующих препаратов, например, для препарата SR31747A, находящегося на стадии IIb клинических испытаний. SR31747A – иммуномодулятор с потенциальной противоопухолевой активностью, одним из механизмов действия которого является аллостерическая модуляция периферических 1 рецепторов.

Исходя из полученных в настоящей работе результатов, касающихся противовирусной активности анаферона детского, влияния препарата на систему ИФН, воздействия на эффективность лиганд-рецепторного взаимодействия, участия системы естественных аутоантител к ИФН- в реализации его фармакологической активности, а также принимая во внимание имеющееся данные об иммуномодулирующей активности препарата и его влиянии на продукцию сопряженных с ИФН- цитокинов, можно представить механизм действия препарата следующим образом (рис. 8).

Рисунок 8. Схематическое представление механизмов действия анаферона детского.

ВЫВОДЫ

        1. Анаферон детский обладает широким спектром противовирусной активности в отношении различных штаммов вируса гриппа А, в том числе и особо опасных штаммов А/H1N1 и герпесвирусов.
        2. Совместное применение анаферона детского со средством специфической противовирусной терапии озельтамивиром повышает эффективность проводимого лечения гриппа.
        3. Одним из механизмов реализации фармакологической активности анаферона детского является влияние препарата на эффективность лиганд-рецепторного взаимодействия и функциональное состояние рецепторов, вовлеченных в регуляцию иммунного и противовирусного ответа организма, в частности 1 рецептор и альфа-хемокиновый рецептор CXCR4.
        4. Анаферон детский оказывает разностороннее воздействие на систему ИФН-, индуцируя выработку ИФН- лимфоцитами и усиливая биологические эффекты данного цитокина за счет регуляции эффективности взаимодействия ИФН- с его рецепторами.
        5. Одной из фармакологических мишеней анаферона детского in vivo является система естественных аутоантител к ИФН, влияние на которую обуславливает более быстрый и выраженный иммунный ответ на вирусную инфекцию.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Иммуномодулирующий эффект анаферона детского при гриппе у детей // Вопросы современной педиатрии. – 2006. –  Т.5, № 1. – С.193 (в соавт. с Егоровым В.Б., Ушаковой И.А., Кузнецовой Е.В.).
  2. Интерфероновый статус у детей при гриппе и других ОРВИ. Интерферонотерапия // Вопросы современной педиатрии.– 2006.– Т.5, № 1. – С.435-436 (в соавт. с Осидак Л.В., Головачевой Е.Г., Образцова Е.В. и др.).
  3. Результаты клинических исследований лечебной эффективности анаферона при гриппе и других ОРВИ у детей // Медицинская иммунология. – 2006. – Т.8, №2-3. – С.461-462 (в соавт. с Савельевой К.В., Учайкиным В.Ф., Кладовой О.В. и др.).
  4. Эффективность анаферона детского в лечении острых вирусных кишечных инфекций у детей младшего возраста // Детские инфекции. – М. – 2006. – Приложение – С.167-168 (в соавт. с Мартюшев-Покладом А.В., Елфимовой У.В., Сергеевой С.А. и др.).
  5. Эффективность анаферона детского в лечении герпес-вирусных инфекций у детей // Медицинская иммунология. – 2007. – Т.9, №2-3. – С.355-356 (в соавт. с Елфимовой У.В., Качановой М.В., Сергеевой С.А. и др.).
  6. Клиническая эффективность применения Анаферона детского в лечении ветряной оспы у детей // Детские инфекции. – 2007. - №4. – С.61-68 (в соавт. с Кудиным М.В., Федоровым Ю.Н., Скрипкиным А.В. и др.).
  7. Clinical efficacy of anaferon, a novel oral antibody therapeutic, in pediatric acute viral gastroenteritis // 25th International Congress of Pediatrics «For the health and well-being of our children». – Athens - Greece. – 2007. – PP 0526 (with Dugina Y., Elfimova U., Martyushev-Poklad A. et al.)
  8. Anaferon in pediatric febrile viral infections: a brief review of the results of clinical trials in Russia // 25th International Congress of Pediatrics «For the health and well-being of our children». – Athens - Greece. – 2007. – PP 0531 (with Dugina Y., Elfimova U., Martyushev-Poklad A. et al.)
  9. Анаферон детский: опыт клинического применения в терапии ветряной оспы у детей // Мат. XII Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии». – М. – 2008. – С. 326 (в соавт. с Дугиной Ю.Л., Качановой М.В., Эпштейном О.И. и др.).
  10. Определение уровня естественных аутоантител к интерферону-гамма в сыворотке крови здоровья добровольцев и пациентов с ветряной оспой с помощью иммуноферментного анализа // Тез. докл. XV Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». – М. – 2008. – С.664-665 (в соавт. с Машкиной М.В., Дугиной Ю.Л., Качановой М.В. и др.).
  11. Разработка иммуноферментного анализа для количественного определения естественных аутоантител – потенциальной эндогенной мишени влияния сверхмалых доз антител // Иммунофизиология. Естественный аутоиммунитет в норме и патологии / ред. Полетаев А.Б. и Данилова А.Н. – М. – 2008. – С.203-205 (в соавт. с Машкиной М.В., Акиндиновой Ю.О., Дугиной Ю.Л. и др.).
  12. Лечение и профилактика ветряной оспы у детей в современных условиях // Мет. реком.. – СПб., 2008. – 32 с. (в соавт. с Тимченко В.Н., Сергеевой С.А., Булиной О.В. и др.)
  13. Исследование лечебно-профилактической активности анаферона детского на экспериментальной модели гриппа у мышей // Тез. докл. VII Международного конгресса «Доказательная медицина – оcнова современного здравоохранения». – Хабаровск. – 2008. – С.229-232 (в соавт. с Шишкиной Л.Н., Сергеевым А.Н., Евтиным Н.К. и др.).
  14. Применение сверхмалых доз антител к гамма-интерферону в лечении и профилактике вирусных инфекций // Антибиот. и химиотер.. – 2008. – Т.58, №3-4. – С.32-35 (в соавт. с Васильевым А.Н., Сергеевой С.А., Качановой М.В. и др.).
  15. Изучение эффективности лечебно-профилактического действия анаферона детского при гриппозной инфекции у мышей // Бюл. экспер. биол. и мед. – 2008. – Т.146, №12. – С.671-673 (в соавт. с Шишкиной Л.Н., Сергеевым А.Н., Кабановым А.С. и др.).
  16. Противовирусная активность сверхмалых доз антител к гамма-интерферону // Вестник Международной Академии наук (Русская секция). – 2008. - №2. – С.20-23 (в соавт. с Эпштейном О.И., Дугиной Ю.Л., Качановой М.В. и др.).
  17. Oral antibody to interferon gamma in ultra low doses: clinical efficacy and interferon stimulation in patients with upper respiratory viral infections // Fundam Clin Pharmacol. – 2008. – Vol.22, Suppl.2. – P.37 (with Dugina J., Sergeeva S., Epstein O.).
  18. Противовирусная активность анаферона детского в отношении различных штаммов вируса гриппа // Тез. докл. XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – М. – 2009. – С.745 (в соавт. с Хейфец И.А., Дугиной Ю.Л., Качановой М.В. и др.).
  19. Интерфероновый статус у детей при острых респираторных инфекциях. Интерферонотерапия // Бюл. экспер. биол. и мед. – 2009. – Т.148, №8. – Приложение. – С.22-26 (в соавт. с Образцовой Е.В., Осидак Л.В., Головачевой Е.Г. и др.).
  20. Оценка эффективности и безопасности анаферона детского при лечении ветряной оспы у детей // Бюл. экспер. биол. и мед. – 2009. – Т.148, №8. – Приложение. – С.39-42 (в соавт. с Тимченко В.Н., Павловой Е.Б., Черновой Т.М. и др.).
  21. Antibodies to human interferon gamma in ultra low doses for herpes viral infection treatment: metaanalysis of randomized controlled clinical trials // 4th Europaediatrics 2009 «East and West, North and South: Balanced Paediatric Care in Europe». – Moscow – 2009. – PP 643 (with Dugina J., Kachanova M., Sergeeva S. et al.).
  22. Анаферон – эффективное средство для лечения и профилактики широкого спектра инфекционных заболеваний // Вестник Международной Академии наук (Русская секция). – 2010. - №1. – С.23-27 (в соавт. с Качановой М.В., Горбуновым Е.А., Заболотневой Ю.А. и др.)
  23. Antiviral activity of anaferon for children in pandemic A/H1N1 in mice // WorldPharma 2010. – Denmark. – Copenhagen. – 2010. – PP 1798 (with Epstein O., Dugina J., Sergeeva S.)
  24. Antibodies to interferon-gamma in ultra-low doses: a new option for pandemic influenza // 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. – Austria. – Vienna. – 2010. – PP 1106 (with Zarubaev V., Tafani J., Sergeeva S. et al.)
  25. Противовирусная активность анаферона детского у мышей, зараженных пандемическим вирусом гриппа А (H1N1/09) // Бюл. экспер. биол. и мед. – 2010. – Т.149, №5. – С.546-548 (в соавт. с Шишкиной Л.Н., Скарнович М.О., Кабановым А.С. и др.).
  26. Изучение эффективности анаферона детского у мышей, инфицированных пандемическим вирусом гриппа А(H1N1/09)v // Журн. микробиол. – 2011. – №1. – С. 83-86 (в соавт. с Шишкиной Л.Н., Скарновичем М.О., Кабановым А.С. и др.)
  27. Activity of ultra-low doses of antibodies to gamma-interferon against lethal influenza A(H1N1)2009 virus infection in mice // Antiviral Res. – 2012. – Vol. 93. – P. 219-224 (with Zarubaev V.V., Gorbunov E.A., Sergeeva S.A. et al.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИЧ                – вирус иммунодефицита человека

ВОЗ                –        Всемирная организация здравоохранения

ДНК                –        дезоксирибонуклеиновая кислота

ИД                –        инфицирующая доза

ИФА                –        иммуноферментный анализ

ИФН                –        интерферон

ОРВИ         –        острые респираторные вирусные инфекции

РНК                –        рибонуклеиновая кислота

ТЦД                –        тканевая цитотоксическая доза

УЕ                –        условная единица

цАМФ        –        циклический аденозинмонофосфат

CHO                –        клетки яичников китайских хомячков

CXCR4        –        альфа рецептор хемокинов 4 типа

ELISPOT –        enzyme-linked immunosorbent spot

HTRF  –        homogeneous time resolved fluorescence

LD                –        летальная доза

1                –        сигма 1 рецептор






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.