WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

САРКИСЯН МАРГАРИТА СЕРГЕЕВНА

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА НЕКОТОРЫХ НЕНАРКОТИЧЕСКИХ АНАЛЬГЕТИКОВ ПРИ

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ  ИССЛЕДОВАНИИ МОЧИ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пятигорск - 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:        доктор фармацевтических наук, профессор

                                       Лазарян Джон Седракович

Официальные оппоненты:        доктор фармацевтических наук, профессор

Раменская Галина Владиславовна,

ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России,

директор НИИ фармации,

заведующая кафедрой фармацевтической и

токсикологической химии

                                       

                                       доктор фармацевтических наук, профессор

Карташов Владимир Антонович,

ГБОУ ВПО Майкопский ГТУ,

декан фармацевтического факультета

Ведущая организация:   ГБОУ ВПО «Курский ГМУ Минздравсоцразвития России»

                 (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д.3)

Защита состоится «27» марта 2012 г. в 900 часов на заседании диссертационного совета Д.208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России» (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, г.Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан        «25» февраля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                                                         Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время доля ненаркотических анальгетиков в структуре применяемых в медицинской практике лекарственных препаратов значительна. Из этой группы лекарственных препаратов наиболее широко применяются как в медицинской практике по назначению врача, так и самостоятельно: ибупрофен, кеторолак, метамизол натрия, нефопам, парацетамол и трамадол. Данные лекарственные препараты  применяются как индивидуально, так и в сочетании друг с другом или другими наркотическими анальгетиками с целью усиления лечебного эффекта, уменьшения дозировки наркотического анальгетика, или же для усиления состояния наркотического опьянения  и облегчения проявления абстинентного синдрома. При определённых условиях (передозировка, многочисленные торговые названия препаратов, взаимное потенцирование действия) приём изучаемых анальгетиков приводит к острым отравлениям, в том числе со смертельным исходом, что определяет их важное токсикологическое значение. По данным литературы разработаны ряд методик анализа отдельных вышеуказанных анальгетиков в различных биологических объектах. Однако по настоящее время отсутствуют методики их химико-токсикологического анализа при комбинированных отравлениях.

В связи с этим разработка методик дифференциальной диагностики указанных ненаркотических анальгетиков при химико-токсикологическом исследовании мочи является актуальной проблемой.

Цель исследования: разработка схемы химико-токсикологического анализа ибупрофена, кеторолака, метамизола натрия, нефопама, парацетамола и трамадола в моче. Задачи исследования:

  1. Разработать методики идентификации ибупрофена, кеторолака, метамизола, нефопама, парацетамола, трамадола в моче с помощью химических и физико-химических методов.
  2. Разработать методики количественного определения изучаемых анальгетиков в моче.
  3. Разработать методики изолирования изучаемых лекарственных веществ из мочи индивидуально и в различных сочетаниях.
  4. Предложить схему химико-токсикологического анализа при дифференциальной диагностике отравлений изучаемыми анальгетиками.
  5. Внедрить схему химико-токсикологического анализа изучаемых анальгетиков в виде Информационного письма в практику работы химико-токсикологических и судебно - химических лабораторий России.

Научная новизна работы. Предложен методологический подход к разделению и идентификации изучаемых анальгетиков (ибупрофен, кеторолак, метамизол натрия, нефопам, парацетамол, трамадол) при направленном химико-токсикологическом анализе с использованием комплекса химических и физико-химических методов.

В предварительном исследовании предлагается использовать в скрининговом варианте метод ТСХ, а в основном исследовании – химические (хромогенные и микрокристаллоскопические реакции) и физико-химические методы: высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрию (ГХ/МС).

Разработана методика количественного определения ибупрофена, кеторолака, метамизола, нефопама, парацетамола и трамадола методом ВЭЖХ в извлечениях из мочи как индивидуально, так и в различных сочетаниях. Дана валидационная оценка данной методики по основным критериям (линейность, специфичность, предел обнаружения, прецизионность, правильность, предел количественного определения).

Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены условия изолирования изучаемых анальгетиков из водных растворов с последующей разработкой способов их выделения из мочи. Установлена оптимальная кратность экстракции, изучено влияние условий гидролиза на стабильность указанных лекарственных веществ, что позволило разработать методики их изолирования из мочи как индивидуально, так и при различных сочетаниях.

Возможность использования разработанной схемы химико-токсикологического анализа изучаемых анальгетиков была подтверждена на лабораторных животных (крысах).

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования.

Разработанная схема химико-токсикологического анализа (ХТА) ибупрофена, кеторолака, метамизола, нефопама, парацетамола и трамадола позволяет достоверно диагностировать факт отравления и оценить его степень.

По материалам исследования подготовлено и утверждено Ученым советом ФГУ «Российский Центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России (протокол №3 от 09.06.2011 года) Информационное письмо «Дифференциальная диагностика некоторых ненаркотических анальгетиков при химико-токсикологическом исследовании мочи», которое рекомендовано к использованию в химико-токсикологических лабораториях и Бюро СМЭ Российской Федерации.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 62- 67 - ой  региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции»  (Пятигорск, 2007-2012г.г.); на Российской научно-практической конференции (с международным участием) «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе две в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту:

  • результаты разработки методик идентификации и количественного определения ибупрофена, кеторолака, метамизола, нефопама, парацетамола и трамадола в моче;
  • результаты поиска оптимальных условий изолирования исследуемых анальгетиков из мочи;
  • результаты апробации методик химико-токсикологического анализа исследуемых анальгетиков на лабораторных животных;
  • схему химико-токсикологического анализа мочи при отравлениях изучаемыми анальгетиками как индивидуально, так и при различных сочетаниях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 170 страницах и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 31 таблица и 28 рисунков. Список цитируемой литературы включает 206 источников, из них 53 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

  1. Разработка методик идентификации изучаемых анальгетиков

Предварительное исследование по разделению и обнаружению изучаемых анальгетиков

В химико-токсикологическом анализе для идентификации лекарственных веществ принято проводить исследование в два этапа: предварительное и основное.

В качестве предварительного способа исследования нами использован метод ТСХ на пластинах «Сорбфил», в подобранных четырех системах растворителей, использование которых в определённых комбинациях позволяют надёжно разделить и обнаружить изучаемые анальгетики, а также некоторые лекарственные вещества применяемые с ними. Хроматографирование необходимо проводить при комнатной температуре  (20±2°С), в камерах с насыщением парами растворителей в течение 30 минут, при длине пробега системы растворителей – 10 см.

Оптимальными проявителями для детекции зон адсорбции изучаемых анальгетиков являются УФ свет (254нм) с последующей обработкой пластин реактивом Драгендорфа. При этом предел обнаружения составил от 0,2 до 1,5 мкг в пробе. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Хроматографическая подвижность изучаемых анальгетиков

Подвижная фаза

Соотношение растворителей

Значение Rf *100 изучаемых анальгетиков

кеторолак

нефопам

трамадол

парацетамол

ибупрофен

метамизол

морфин

тримеперидин

кодеин

флупиртин

Толуол – этанол – уксусная кислота –

25% аммиак

(S1)

64:30:4:2

75±3,0

25±2,0

28±3,0

61±2,5

81±2,7

17±1,1

10±1,0

15±1,2

15±1,2

62±2,2

Толуол – диоксан –

25% аммиак

(S2)

80:15:5

0

30±2,1

53±2,8

0

0

1,0

0

55±2,0

10±1,2

12±1,0

Этанол – хлороформ – 25%  аммиак

(S3)

50:46:4

55±3,1

91±3,4

91±3,2

82±2,7

52±3,0

45±2,5

80±3,0

90±2,4

90±1,9

95±2,1

Толуол – этанол – уксусная кислота

(S4)

75:20:5

75±2,3

14±1,2

90±2,2

16±1,2

59±2,3

11±0,9

7,0±1,7

10±1,1

8,0±1,2

57±1,6

Полученные результаты могут быть использованы при хроматографическом исследовании для выбора систем растворителей как при направленном, так и при ненаправленном анализе.

В случае направленного анализа (исследуемые анальгетики), нами предлагается вариант методики хроматографического исследования в 2-3-х системах растворителей, с использованием «свидетелей» в виде растворов стандартных образцов ибупрофена, кеторолака, метамизола натрия, нефопама, парацетамола и трамадола.

В случае ненаправленного (группа анальгетиков) анализа на исследуемые лекарственные вещества использован модифицированный вариант метода ТСХ – скрининга, предложенного проф. В.А. Карташовым. В результате предварительного исследования хроматографической подвижности исследуемых анальгетиков в 4-х системах растворителей определяли коэффициент подвижности hRf (Rfх100)  искомых лекарственных веществ. При этом поверхность пластины была разделена на три хроматографические зоны в зависимости от величины hRf:  зона 1  (hRf = 0 – 33); зона 2 (hRf = 33 – 63); зона 3 (hRf = 63-100).  Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2 –  Распределение  изучаемых анальгетиков по хроматографическим зонам

Системы растворителей

Хроматографические зоны

1

2

3

система I

(S1)

метамизол

нефопам

трамадол

морфин

тримепередин

кодеин

парацетамол

флупертин

кеторолак

ибупрофен

система II

(S2)

нефопам

кодеин

флупиртин

трамадол

тримеперидин

-

система III

(S3)

-

метамизол

ибупрофен

кеторолак

парацетамол

нефопам

трамадол

морфин

кодеин

тримеперидин

флупиртин

система IV

(S4)

нефопам

парацетамол

метамизол

морфин

тримеперидин

кодеин

флупиртин

ибупрофен

кеторолак

трамадол

В результате проведённого анализа каждому исследуемому анальгетику соответствует определённый порядок чисел, в зависимости от системы растворителей и порядкового номера зоны. Полученный условный «код» каждого исследуемого лекарственного вещества приведён в таблице 3.

Таблица 3 – «Код» хроматографической подвижности исследуемых анальгетиков

Вещество

Хроматографическая зона

система I - (S1)

система II - (S2)

система III - (S3)

система IV - (S4)

Ибупрофен

3

0

2

2

Кеторолак

3

0

2

3

Метамизол

1

0

2

1

Нефопам

1

1

3

1

Парацетамол

2

0

3

1

Трамадол

1

2

3

3

Морфин

1

0

3

1

Кодеин

1

1

3

1

Тримеперидин

1

2

3

1

Флупиртин

2

1

3

1

Данные таблицы свидетельствуют о том, что при проведении хроматографического исследования извлечений из мочи в четырех системах растворителей можно предположить наличие одного или нескольких изучаемых анальгетиков при любых их сочетаниях. В случае получения результатов, не соответствующих данным, приведенным в таблице, можно сделать заключение об отсутствии изучаемых анальгетиков и не проводить их подтверждающее исследование.

Основное исследование изучаемых анальгетиков с помощью химических и физико-химических методов

Хромогенные и микрокристаллоскопические реакции

В химико-токсикологическом анализе используются хромогенные и микрокристаллоскопические реакции, в случае, если объектом исследования является вещественное доказательство в виде лекарственного препарата одного из изучаемых анальгетиков; искомое вещество выделено из смеси лекарственных веществ или биологического объекта в виде индивидуального соединения. В результате исследования нами выбраны наиболее характерные хромогенные и микрокристаллоскопические реакции на изучаемые анальгетики.

Реакции окрашивания дают с реактивом Либермана все вещества, кроме кеторолака и тримеперидина, с реактивом Марки все, кроме метамизола и парацетамола, а кеторолак, морфин, кодеин дают характерное окрашивание с азотной кислотой концентрированной; метамизол, парацетамола и морфин  с 5% раствором железа(III) хлорида. Предел обнаружения исследуемых веществ составляет 0,5-10 мкг/в пробе. Из микрокристаллоскопических реакций нами предложены следующие: на ибупрофен с 0,2% раствором метилового оранжевого (1 мкг/в пробе), кеторолак с реактивом Драгендорфа  (2 мкг/в пробе), метамизол с 0,2% раствором  метилового оранжевого (6 мкг/в пробе), нефопам с солью Рейнеке (2 мкг/в пробе), – парацетамол с 5% раствором ртути(II) хлорида (2 мкг/в пробе) и трамадол с меднопиридиновым реактивом (1 мкг/в пробе). Таким образом разработаны методики идентификации изучаемых анальгетиков с помощью хромогенных и микрокристаллоскопических реакций, с достаточной чувствительностью, хорошей воспроизводимостью и экспрессностью.

Метод хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС)

Метод ГХ/МС был использован нами в качестве подтверждающего при  идентификации изучаемых анальгетиков.  Анализ проводили на хроматографе Agilent 6850 c кварцевой капиллярной колонкой HP - 5MS (30 м х 0,25 мм) с неподвижной фазой 5% фенил-метил силоксан (толщина плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм). Газ носитель: гелий, расход через колонку постоянный – 1 мл/мин; температурный режим колонки: от 80 С до 180 С в течение 20 мин; от 180С до 265С в течение 10 минут; от 265 С до 290 С в течение 20 минут; испаритель:  режим без деления потока, продувка 50 мл/мин 0,5мин, температура 250С, объем вводимой пробы 1 мкл; температура интерфейса детектора 290С. Детектор: масс-спектрометрический квадрупольный МSD 5975, тип ионизации: электронный удар (70 эв), температура ионного источника – 230С, масс-фильтра – 150С. Наблюдаемый диапазон m/z 30-500.  Идентификацию исследуемых веществ проводили по временам удерживания, которые соответствовали временам удерживания их стандартных образцов, а также  с помощью библиотеки масс-спектров NIST 2.0, применяя систему обработки  хромато-масс-спектральной информации АMDIS, со значениями m/z. Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4 – Результаты идентификации исследуемых анальгетиков с помощью

метода ГХ/МС

Вещество

Время удерживания, мин (n=6)

Предел обнаружения

(мкг/мл)

m/z

Ибупрофен

Rср=7,97;SD=0,01; RSD=0,17%

0,032

206, 161, 91,  119, 107

Кеторолак

Rср=11,51; SD=0,01;RSD=0,08%

39,88

211, 134, 77, 106

Метамизол

Rср=11,41; SD=0,01; RSD=0,07%

0,057

217, 83, 56

Нефопам

Rср=11,71; SD=0,01; RSD=0,06%

0,01

58, 179, 165, 180, 225,

Парацетамол

Rср=9,49; SD=0,01; RSD=0,05%

0,32

109, 151, 43, 80

Трамадол

Rср=10,94; SD=0,01; RSD=0,1%

0,153

58,263, 135

Данные таблицы свидетельствуют о том, что метод ГХ/МС позволяет идентифицировать исследуемые вещества как индивидуально, так и в различных сочетаниях с высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Метод ВЭЖХ нами использован как для идентификации, так и для количественного определения исследуемых анальгетиков. Анализ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02». (г. Новосибирск, ЗАО «ЭкоНова») в следующих условиях: хроматографическая колонка ProntoSil 120-5C-18 AQ; подвижная фаза: элюент А – 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент Б – ацетонитрил, скорость потока – 100 мкл/мин; аналитические длины волн – 230, 244, 262, 272 и 326 нм; время измерения – 0,18 сек; температура термостата колонки - комнатная; градиент ацетонитрила от 10% до 20% за 10 мин, от 20% до 80% за 10 мин далее изократично 80% - 5 минут; общее время хроматографирования 25 минут; объем пробы – 10 мкл.

Идентификацию исследуемых лекарственных веществ осуществляли путем сравнения времени удерживания (ибупрофена tуд=22,39 мин, кеторолака tуд=19,05 мин, метамизола tуд=7,26 мин, нефопама tуд=17,24 мин, парацетамола tуд=8,65 мин, трамадола tуд=15,92 мин),  с временами удерживания стандартных образцов соответствующих анализируемых лекарственных веществ, а также  спектральных отношений их растворов при различных длинах волн: ибупрофена S262/S272=1,961, кеторолака S326/S230=2,326, метамизола S240/S230=1,340, нефопама S262/S240=1,371, парацетамола S240/S230=1,141, трамадола S272/S262=1,772.

Селективность данной методики при анализе смеси изучаемых анальгетиков была подтверждена с помощью расчёта коэффициента разделения пиков, которые составили: метамизол – парацетамол (2,13), парацетамол – трамадол (7,64), трамадол – нефопам (3,95), нефопам – кеторолак (6,12), кеторолак – ибупрофен (10,74). Предел обнаружения исследуемых лекарственных веществ методом ВЭЖХ рассчитывали с помощью метода «3 сигма», значения которых находятся в пределах 0,0017-0,05 мкг/мкл.

  1. Количественное определение  изучаемых анальгетиков методом ВЭЖХ

Для количественного определения исследуемых анальгетиков предложена методика ВЭЖХ анализа. Условия хроматографирования приведены выше. Расчет проводили по площади пика с использованием внешнего стандарта. Разработанную методику на водных растворах оценивали по следующим валидационным характеристикам: специфичность, линейность, прецизионность (повторяемость), правильность, предел количественного определения.

Специфичность методики определяли набором хроматограмм растворов стандартных образцов изучаемых лекарственных веществ и извлечений из модельной и контрольной проб мочи. Полученные результаты свидетельствуют о специфичности разработанной методики.

Линейная зависимость соблюдается в пределах концентраций изучаемых лекарственных веществ: для ибупрофена (1 – 50 мкг/мл), кеторолака (0,8 – 10 мкг/мл), метамизола (2 – 10 мкг/мл), нефопама (1– 50 мкг/мл), парацетамола (60 – 500 мкг/мл), трамадола (1 – 50 мкг/мл). Контроль линейной зависимости по каждому исследуемому объекту проводили с помощью расчета коэффициента корреляции, значения которых было не менее 0,99, что позволяет использовать данную методику для количественного определения изучаемых лекарственных веществ в указанном диапазоне концентраций.

Для установления прецизионности готовили растворы стандартных образцов изучаемых анальгетиков в шести повторностях. Результаты анализа приведены в таблице 5.

Таблица 5 – Результаты установления прецизионности методики количественного

определения изучаемых анальгетиков методом ВЭЖХ (n=6)

Вещество

Метрологические характеристики

Ибупрофен

Хср=99,69%;  SD=0,66;  RSD=0,67%;

Кеторолак

Хср=99,79%;  SD=0,27;  RSD=0,27%;

Метамизол

Хср=99,84%;  SD=0,92;  RSD=0,73%

Нефопам

Хср=99,28%;  SD=0,84;  RSD=0,84%

Парацетамол

Хср= 99,84%;  SD=0,92;  RSD=0,73%

Трамадол

Хср=99,62%;  SD=0,72;  RSD=0,73%

Из полученных данных следует, что относительное стандартное отклонение не превышает 1%, что является удовлетворительным для методик количественного определения искомых лекарственных веществ с использованием метода ВЭЖХ.

Для установления правильности  методики готовили 9 растворов стандартных образцов исследуемых анальгетиков на трёх уровнях концентраций в трёх повторностях. Полученные результаты анализа приведены в таблице 6.

Таблица 6 – Результаты установления правильности ВЭЖХ – методики

  определения изучаемых анальгетиков (n=6)

Вещество

Метрологические характеристики, tтабл.=2,36

Ибупрофен

Rср = 99,44%; SD=0,94, RSD=0,95%, Rср =0,74; tрасч. = 1,8

Кеторолак

Rср = 99,89%; SD=0,95; RSD=0,95%; Rср =0,74; tрасч. = 0,3

Метамизол

Rср = 99,89%; SD=0,37; RSD=0,37%;  Rср =0,28; tрасч. = 0,9

Нефопам

Rср = 99,94%; SD=0,88; RSD=0,88%; Rср =0,69; tрасч. =0,2

Парацетамол

Rср = 100,04%; SD=0,41; RSD=0,409%; Rср =0,33; tрасч. =0,3

Трамадол

Rср =99,56%;  SD= 1,14; RSD=1,15%; Rср =0,90; tрасч. =1,2

Результаты определения свидетельствуют о том, что методика не отягощена систематической ошибкой, поскольку соблюдается неравенство tвыч. > tтабл. (Р,f).

  1. Изолирование изучаемых анальгетиков из водных растворов и мочи

В химико-токсикологическом анализе важное значение имеет способ изолирования токсического вещества из биологического объекта. Поэтому для максимального извлечения исследуемого вещества необходимо предварительно установить оптимальные условия его изолирования. При изолировании лекарственных веществ из биологических объектов на степень экстракции влияют рН среды, природа органического растворителя, наличие электролита и др.

Изолирование изучаемых лекарственных веществ из водных растворов

Поскольку данные литературы по изолированию нефопама ограничены, нами предварительно были изучены оптимальные условия его выделения из водных растворов с помощью метода математического планирования эксперимента «латинский квадрат». В результате дисперсионного анализа установлено, что значимость факторов на процесс экстракции нефопама из водных растворов располагается в следующий ряд: электролит > значение рН среды > органический растворитель > время экстракции. Полученные результаты, а также данные литературы нами были учтены при разработке методики изолирования изучаемых анальгетиков.

Так как при ненаправленном химико-токсикологическом анализе изолирование лекарственных веществ проводят при значениях рН среды 2–3 и 9–10, мы посчитали необходимым предварительно определить условия изолирования изучаемых лекарственных веществ из водных растворов. Экстракцию проводили хлороформом и этилацетатом, с электролитом и без электролита, время экстракции 5 мин. Выход  кеторолака (87,02%), ибупрофена (93,34%) выше из кислой среды,  а нефопама (92,56%), трамадола (67,08%), парацетамола (63,12%), метамизола (78,50%) из щелочной. При этом оптимальным экстрагентом  для парацетамола является этилацетат, а для остальных исследуемых анальгетиков -  хлороформ. Наличие электролита существенно повышает степень экстракции метамизола, нефопама и парацетамола.

Изолирование изучаемых лекарственных веществ из модельной пробы мочи

Найденные оптимальные условия изолирования из водных растворов  изучаемых анальгетиков методом ВЭЖХ были использованы для определения степени экстракции из модельной пробы мочи.  В качестве объекта исследования нами выбрана моча, как  наиболее предпочтительный биологический объект для проведения химико-токсикологических исследований. Известно, что  изучаемые анальгетики преимущественно выводятся с мочой, главным образом в виде глюкуронидных и сульфатных конъюгатов, в том числе в неизмененном виде. Поэтому с целью повышения степени экстракции ибупрофена, кеторолака, метамизола, нефопама, парацетамола и трамадола из мочи при экспертном исследовании, необходимо проводить гидролиз коньюгатов в биологической жидкости.

В связи с этим, нами было изучено влияние условий кислотного и щелочного гидролиза на стабильность  изучаемых анальгетиков  в модельной пробе мочи. Результаты исследования представлены в таблице 7.

Таблица 7 – Результаты определения степени экстракции изучаемых анальгетиков в условиях гидролиза методом ВЭЖХ (Хср ±Хср)

Вещество

Кислотный гидролиз

Щелочной гидролиз

Без гидролиза

Ибупрофен

84,01±3,1

81,24±3,55

86,16±3,48

Кеторолак

88,95±4,48

59,63±3,3

52,93±3,08

Метамизол

25,55± 1,81

54,21± 3,13

61,71± 3,30

Нефопам

60,91±3,04

91,23±4,61

89,72±5,08

Парацетамол

18,33± 1,45

54,6± 3,87

65,13± 4,18

Трамадол

52,1±3,25

70,64±4,33

69,1± 3,71

Таким образом, для извлечения из мочи при проведении экспертизы метамизола, нефопама, парацетамола и трамадола, необходимо использовать щелочной гидролиз, а для ибупрофена,  кеторолака - кислотный гидролиз, поскольку исследуемые вещества наиболее стабильны в указанных условиях гидролиза. В связи с этим нами разработаны методики изолирования изучаемых анальгетиков с максимальным выходом из кислой среды, из щелочной среды и в случае их совместного присутствия, схемы которых приведены ниже.

  1. Методика изолирования ибупрофена и/или кеторолака – 25 мл мочи подкисляли хлористоводородной  кислотой концентрированной до рН 2-3, затем нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут. После чего проводили двукратную экстракцию хлороформом. Хлороформные извлечения выпаривали до сухого остатка, растворяли в 10 мл 96% этанола и анализировали.
  2. Методика изолирования метамизола, нефопама, парацетамола1 и трамадола (как индивидуально, так и в любых сочетаниях) – 25 мл мочи подщелачивали 30% раствором натрия гидроксида до значения рН среды 9-10, затем нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут. К полученной жидкости добавляли натрия хлорид до насыщения и экстрагировали двукратно хлороформом. Полученные органические извлечения выпаривали до сухого остатка, растворяли в 10 мл 96% этанола и анализировали.
  3. Методика изолирования ибупрофена или кеторолака с метамизолом, нефопамом, парацетамолом и трамадолом (в различных сочетаниях) – 25 мл мочи подкисляли хлористоводородной  кислотой концентрированной до рН 2-3, затем нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут и экстрагировали хлороформом двукратно. К водной фазе добавляли натрия хлорид до насыщения и 30% раствор натрия гидроксида до рН 9-10 и экстрагировали2 хлороформом. Полученные органические извлечения объединяли и выпаривали до сухого остатка,  растворяли в 10 мл 96% этанола и анализировали.

1 – в случае изолирования парацетамола, его экстракцию проводят  двукратно этилацетатом; при сочетании парацетамола с другими анальгетиками экстракцию проводят вначале хлороформом,  затем этилацетатом, извлечения объединяют и выпаривают до сухого остатка.

2 –в присутствии парацетамола, с другими анальгетиками экстракцию проводят вначале хлороформом,  затем этилацетатом, извлечения объединяют и выпаривают до сухого остатка.

Далее проводили идентификацию изучаемых анальгетиков в извлечениях из модельных проб мочи по разработанным ранее методикам с использованием методов  ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ, хромогенных и  микрокристаллоскопических реакций. Проведенные исследования показали, что комбинированное использование разработанных методик позволяет надежно идентифицировать изучаемые анальгетики.

Следующим этапом исследования явилось количественное определение изучаемых лекарственных веществ с помощью ранее разработанной методики ВЭЖХ - анализа и её валидация.

Линейность методики определяли по модельным пробам исследуемых анальгетиков в моче. Установлено, что зависимость площади пика от концентрации исследуемых веществ имеет линейный характер. Коэффициент корреляции во всех случаях составляет не менее 0,99. Далее для установления прецизионности методики количественного определения изучаемых анальгетиков готовили по шесть модельных проб мочи, содержащие количества их стандартных образцов, соответствующие минимальной терапевтической, максимальной суточной и токсической дозам, найденных, исходя из среднесуточного объёма мочи (1500 мл), кинетики изучаемых анальгетиков, а также  с учетом интервала линейности методики. Результаты определения представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Результаты количественного определения изучаемых  лекарственных веществ в

модельной пробе мочи методом ВЭЖХ (n=6)

Вещество

Внесено

мг/25мл

Метрологические характеристики

Ибупрофен

4,1

Хср=83,72; SD=3,79; RSD=4,52%

20,0

Хср= 83,78; SD=3,26; RSD=3,9%

200

Хср= 84,59; SD=3,24; RSD=3,83%

Кеторолак

0,17

Хср=88,04;SD=4,45; RSD=5,06%

0,50

Хср=87,49; SD=4,3; RSD=4,91%

1,70

Хср=89,29; SD=3,49; RSD=3,9%

Метамизол

4,2

Хср=  60,11; SD=3,53;RSD=5,87%

50,0

Хср=62,8; SD=3,25; RSD=5,18%;

83,0

Хср= 63,16;  SD=3,16;RSD=5,01%

Нефопам

0,5

Хср=  60,11; SD=3,53;RSD=5,87%

3,0

Хср=62,8; SD=3,25; RSD=5,18%;

5,0

Хср= 63,16;  SD=3,16;RSD=5,01%

Парацетамол

8,3

Хср=91,97; SD=5,32; RSD=5,78%

50

Хср=92,403; SD=4,1; RSD=4,18%

115

Хср=94,47; SD=3,95; RSD=5,18%

Трамадол

0,83

Хср= 56,12; SD=3,64; RSD=6,5%

6,6

Хср=  55,7; SD=3,33; RSD=5,98%

8,3

Хср=55,1; SD=3,23; RSD=5,87%

Данные таблицы свидетельствуют о том, что разработанные методики позволяют определять количественное содержание исследуемых лекарственных веществ в моче с относительным стандартным отклонением, не превышающим 6,5%, что является удовлетворительным для методик количественного определения лекарственных веществ из биологических объектов с использованием метода ВЭЖХ.

Далее, нами проведена сравнительная оценка методик количественного определения изучаемых лекарственных веществ в модельной пробе мочи и водных растворах с учетом степени их экстракции. Исследование проводили на трёх уровнях концентраций, в трёх повторностях, соответствующих их минимальной терапевтической, максимальной суточной и токсической дозам. Полученные результаты приведены в таблице 9.

Таблица 9 - Результаты количественного определения изучаемых  лекарственных веществ в

модельной пробе мочи, (n=9)

Лекарственное вещество

Внесено, мг/25мл

Найдено,мг/25мл

(n=3)

R%, водные растворы

Кпересчета

Найдено с учетом Кпересчета, мг/25мл

R%, модельные пробы мочи

Метрологические характеристики

Ибупрофен

4,1

3,38

93,34

1,13

3,83

93,18

Rср=95,71; SD=3,95; RSD=4,13%; R =±3,32;

20

17,01

19,40

97,02

200

171,59

193,89

96,95

Кеторолак

0,17

0,15

87,02

1,03

0,157

91,02

Rср=91,30; SD=4,64; RSD=5,08%; R =±8,61;

0,5

0,44

0,454

90,68

1,7

1,52

1,56

92,21

Нефопам

0,5

0,45

92,56

1,02

0,46

91,33

Rср=94,64; SD=5,63; RSD=5,95%; R=±4,44

3

2,74

2,80

93,26

5

4,87

4,96

99,33

Метамизол

8,3

2,57

78,50

1,32

3,31

78,89

Rср=81,43; SD=4,43; RSD=5,44%; R =±3,49

50

31,63

41,54

83,07

83

51,76

68,32

82,32

Парацетамол

8,3

4,69

63,12

1,22

5,813

69,78

Rср=68,51; SD=3,51; RSD=5,13%; R =±2,76

50

28,05

34,22

68,45

115

63,65

77,40

67,31

Трамадол

0,83

0,60

67,08

1,01

0,61

74,32

Rср=72,84;SD=4,69; RSD=6,44%; R =±3,68

6,6

4,69

4,74

71,82

8,3

5,96

6,01

72,38

Данные таблицы свидетельствуют о том, что на всех трех уровнях концентраций анализируемых модельных проб мочи с учётом коэффициента пересчета получены результаты, сопоставимые с результатами их количественного определения в водных растворах. Относительное стандартное отклонение методики не превышает 6,4%.

Апробация методики химико-токсикологического анализа изучаемых анальгетиков на лабораторных животных

Разработанная схема изолирования изучаемых анальгетиков, их идентификация и количественное определение была апробирована на лабораторных животных – белых беспородных крысах – самцах массой 180 – 200 граммов. Экспериментальные исследования при работе с лабораторными животными проводились с соблюдением этических норм. Исследуемые лекарственные вещества в виде водных растворов вводили перорально крысам (n=3) в концентрациях соответствующих их терапевтической и токсической дозам индивидуально, а также их смеси в терапевтических дозах (n=3), в пересчёте на массу крысы. Сбор мочи у крыс проводили в течение 12 часов. Отобранные объекты (по 5 мл) были подвергнуты изолированию с последующей идентификацией и количественным определением. Параллельно проводили исследование контрольных опытов (n=3).

Обнаружение и идентификацию изучаемых анальгетиков в извлечениях из мочи крыс проводили методами  ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ и химических реакций. Полученные результаты свидетельствуют о том, что комплексное использование указанных методов позволяет достоверно идентифицировать изучаемые лекарственные вещества в моче крыс. Далее нами проведено количественное определение изучаемых анальгетиков в моче лабораторных животных с помощью ранее разработанной методики ВЭЖХ анализа.  Полученные данные представлены в таблице 10.

Таблица 10 – Результаты количественного определения изучаемых анальгетиков в

  извлечениях из мочи методом ВЭЖХ

Вещество

Терапевтическая доза

Метрологические характеристики

Токсическая доза

Метрологические характеристики

внесено, мг

найдено, мг/5мл

выход, %

внесено, мг

найдено, мг/5мл

выход, %

Ибупрофен

3,375

0,228

0,208

0,226

6,76

6,16

6,70

Хср= 6,54%

Sxср =0,19

Хср= 0,82

ср = 12,54%

202,300

9,470

8,700

9,160

4,68

4,30

4,58

Хср= 4,50%

Sxср =0,11

Хср= 0,48

ср = 10,56%

Кеторолак

0,170

0,097

0,104

0,096

57,06

60,58

56,47

Хср= 58,02%

Sxср =1,50

Хср= 6,46

ср = 11,14%

1,686

0,761

0,714

0,707

45,14

42,35

41,93

Хср= 43,14%

Sxср =1,01

Хср= 4,33

ср = 10,04%

Метамизол

8,43

1,676

1,849

1,818

19,88

21,93

21,57

Хср= 21,13%

Sxср =0,63

Хср= 2,72

ср = 12,86%

84,30

13,390

12,470

12,280

15,88

14,79

14,57

Хср= 15,08%

Sxср =0,41

Хср= 1,74

ср = 11,55%

Нефопам

0,510

0,384

0,394

0,418

75,29

77,25

81,96

Хср=78,17%

Sxср =1,98

Хср= 8,51

ср = 10,89%

5,06

1,585

1,699

1,603

31,32

33,58

31,68

Хср=32,19%

Sxср =0,70

Хср=3,01

ср = 9,36%

Парацетамол

8,43

0,652

0,586

0,628

7,73

6,95

7,45

Хср=7,38%

Sxср =0,23

Хср= 0,98

ср = 13,29%

118,00

5,970

5,650

5,490

5,06

4,79

4,65

Хср=4,83%

Sxср =0,12

Хср= 0,52

ср = 10,71%

Трамадол

0,85

0,637

0,585

0,638

74,94

68,82

75,,06

Хср=72,94%

Sxср =2,06

Хср= 8,86

ср = 12,15%

8,43

2,381

2,333

2,437

28,24

26,49

28,91

Хср=27,88%

Sxср =0,72

Хср= 3,10

ср = 11,17%

Данные таблицы свидетельствуют о том, что разработанная методика позволяет определить количественное содержание  изучаемых анальгетиков в моче лабораторных животных в присутствии эндогенных соединений как при введении терапевтических, так и токсических доз. При введении крысам смеси всех изучаемых анальгетиков в терапевтических дозах, было определено их количественное содержание за исключением парацетамола. Данный факт, очевидно связан с тем, что всасывание парацетамола в присутствии пяти исследуемых лекарственных веществ замедленно и его содержание ниже предела количественного определения методики. Относительная погрешность используемой методики не превышает 14%.

Поскольку отравление всей смесью изучаемых лекарственных веществ маловероятно, то разработанная методика позволит надежно идентифицировать комбинированные отравления, в том числе и парацетамолом.

Таким образом, разработанная схема химико-токсикологического анализа позволяет надежно проводить дифференциальную диагностику отравлений ибупрофеном, кеторолаком, метамизолом, нефопамом, парацетамолом и трамадолом индивидуально и при сочетанном применении.

Схема химико-токсикологического анализа ибупрофена, кеторолака, метамизола, нефопама, парацетамола и трамадола представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 -

Рисунок 1 - Схема химико-токсикологического анализа некоторых ненаркотических анальгетиков

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

  1. Разработаны методики разделения и обнаружения ибупрофена,  кеторолака метамизола, нефопама, парацетамола, трамадола и сочетаемых с ними морфина, кодеина, тримеперидина или флупиртина методом ТСХ, с использованием 4-х оптимальных систем растворителей, с детекцией зон их адсорбции УФ светом и реактивом Драгендорфа. Предел обнаружения изучаемых анальгетиков составляет 0,2 - 1,5 мкг/в пробе.
  2. Предложена ТСХ – методика обнаружения изучаемых анальгетиков на предварительном этапе анализа при направленном, с использованием «свидетелей», и при ненаправленном анализе (группа анальгетиков) в зависимости от их распределения по соответствующим хроматографическим  зонам.
  3. Показана возможность использования хромогенных и микрокристаллоскопических реакций для идентификации изучаемых анальгетиков при анализе вещественных доказательств (лекарственных препаратов)  или выделенных из мочи индивидуальных соединений. Предел обнаружения исследуемых лекарственных веществ с  помощью хромогенных реакций  составляет 0,5 - 10 мкг в пробе, микрокристаллоскопических реакций 1 - 6 мкг в пробе.
  4. Разработана  методика идентификации изучаемых лекарственных веществ методом хромато – масс – спектрометрии  индивидуально и в различных сочетаниях. Методика отличается высокой чувствительностью (0,032 - 39,88 мкг/мл), специфичностью и воспроизводимостью,  с относительным стандартным отклонением не превышающего 1%.
  5. Разработана методика идентификации изучаемых анальгетиков методом ВЭЖХ как индивидуально, так и в различных сочетаниях. Валидационная оценка предложенной методики анализа показала, что она чувствительна, специфична, воспроизводима, с относительным стандартным отклонением не превышающим 1%.
  6. Разработана методика количественного определения изучаемых лекарственных веществ методом ВЭЖХ. Валидационная оценка методики по параметрам: специфичность, линейность, прецезионность, правильность и предел количественного определения подтвердила пригодность её использования.
  7. Определены оптимальные условия изолирования изучаемых анальгетиков из водных растворов. Установлено, что на процесс экстракции оказывает влияние значение рН среды, природа экстрагента, наличие электролита. Максимальная степень экстракции достигается при значении рН среды 2-3  - для ибупрофена (93,34±1,36%) и кеторолака (87,02±1,4%); при рН среды 9-10 - для метамизола (78,50±0,44%), нефопама (92,56±0,38), парацетамола (63,12±0,71%), трамадола (67,08±0,47%), с использованием в качестве экстрагента хлороформа, а для парацетамола – этилацетата. Определена кратность экстракции, равная двум.
  8. Изучено влияние условий кислотного и щелочного гидролиза на стабильность изучаемых анальгетиков в модельной пробе мочи. Установлено, что при изолировании из мочи ибупрофена, кеторолака следует проводить кислотный гидролиз, а для нефопама, метамизола, парацетамола и трамадола – щелочной.
  9. Установлена степень экстракции, изучаемых анальгетиков при их изолировании из модельной пробы мочи в оптимальных условиях, которая составила для ибупрофена (84,01±3,1%), кеторолака (88,95±4,48%), метамизола (61,71±3,3%), нефопама (91,23±4,61%), парацетамола (54,6±3,87%), трамадола (70,64±4,33%).
  10. Подтверждено, что комплексное использование методов ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ, хромогенных и микрокристаллоскопических реакций позволяет идентифицировать изучаемые анальгетики в извлечениях из модельных проб мочи, с достаточно высокой чувствительностью и надёжностью. Доказана валидность методики количественного определения изучаемых анальгетиков в извлечениях из модельных проб мочи с помощью метода ВЭЖХ.
  11. Предложена схема изолирования изучаемых анальгетиков из мочи, их идентификации и  количественного определения индивидуально и при различных сочетаниях, с использованием комплекса физико-химических и химических методов.
  12. Проведена апробация разработанной схемы химико-токсикологического анализа изучаемых анальгетиков на лабораторных животных. Установлено, что предложенная схема позволяет проводить диагностику отравлений изучаемыми анальгетиками как индивидуально, так и в различных сочетаниях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Саркисян, М.С. Разработка методики идентификации и количественного определения нефопама и трамадола с помощью ВЭЖХ и её валидация/ М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян// Вестник РУДН. (г. Москва). Серия: Медицина.- М., 2009.-№4.- С. 229-230. (Из перечня журналов, рекомендуемых ВАК РФ).
  2. Саркисян М.С. Химико-токсикологическое исследование метамизола в моче / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // Токсикологический вестник. – 2012. - №1. – С. 44-48. (Из перечня журналов, рекомендуемых ВАК РФ).
  3. Саркисян, М.С. Идентификация некоторых анальгетиков методом тонкослойной хроматографии  М.С. Саркисян  // Профессия и здоровье: Материалы VI Всероссийского конгресса - 30 окт.-1 нояб.– М.: «Дельта», 2007г. - С. 615-617.
  4. Саркисян М.С. Идентификация нефопама методом тонкослойной хроматографии  М.С. Саркисян  // Медико-фармацевтический конгресс 14-я международная фармацевтическая выставка 23-26 октября 2007г. Материалы научной программы С.149-151.
  5. Саркисян, М.С. Определение степени экстракции некоторых анальгетиков из водных растворов методом УФ-спектрофотометрии / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян, М.Г. Цыбулина// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч. тр.- Пятигорск, 2008. – Вып. 63. – С. 330-331.
  6. Саркисян, М.С.  Дифференциальная диагностика отравлений некоторыми анальгетиками методами ТСХ и ВЭЖХ / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян, М.Г. Цыбулина// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч. тр.- Пятигорск, 2009. – Вып. 64. – С. 335-337.
  7. Изучение оптимальных условий экстракции нефопама из водных растворов /М.С. Саркисян/ Человек и лекарство: тез. докл.16 Рос. нац. конгресса 6-10 апр. 2009 г. -М., 2009.- С.733.
  8. Саркисян, М.С.  Валидационная оценка методики анализа некоторых нестероидных противовоспалительных препаратов методом вэжх Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикуологических исследований и фармацевтического анализа / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, 28 сентября- 3октября 2009года, г. Пермь,  Пермь ГОУ ВПО ПГФА Росздрава, 2009. С. 103-108.
  9. Саркисян,  М.С. Применение хромогенных и микрокристаллоскопических реакций для идентификации некоторых анальгетиков/ М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // О проблемных вопросах организации производства судебно-медицинских экспертиз: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. 5-6 ноябр. 2009г. -М.: РИО ФГУ РЦМСМЭ Минздравсоцразвития России, 2009. – С. 344-349.
  10. Саркисян,  М.С. Химико-токсикологический анализ кеторолака в моче методами ВЭЖХ и ТСХ при комбинированных отравлениях/ М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч. тр.- Пятигорск, 2010. – Вып. 65. – С. 385-390.
  11. Саркисян, М.С. Химико-токсикологическое исследование нефопама в моче/ М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч. тр.- Пятигорск, 2011. – Вып. 65. – С. 3457-460.

САРКИСЯН МАРГАРИТА СЕРГЕЕВНА

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА НЕКОТОРЫХ НЕНАРКОТИЧЕСКИХ АНАЛЬГЕТИКОВ ПРИ

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ  ИССЛЕДОВАНИИ МОЧИ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 25.02.2012г. формат бумаги 60х84-1/16

Бумага книжно-журнальная. Усл. печ. л. 1,06

Тираж 100 экз. Заказ №____

Отпечатано в типографии ООО «РИА – КМВ»

357500, г. Пятигорск, ул. Февральская, 54. тел. (8793) 33-36-56, тел. /факс 39-09-03







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.