WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ДВОРЕЦКАЯ ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ У ЖЕНЩИН С НЕРАЗВИВАЮЩЕЙСЯ БЕРЕМЕННОСТЬЮ

14.01.01 акушерство и гинекология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
 






Москва 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном  образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации 

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор                                      Макаров  Олег Васильевич

доктор медицинских наук,

профессор                                            Ганковская Людмила Викторовна

Официальные оппоненты:

Кузьмин Владимир Николаевич доктор медицинских наук,  профессор   кафедры репродуктивной медицины и хирургии факультета последипломного образования ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И.Евдокимова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Мурашко  Андрей Владимирович   доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО «Первый  МГМУ им  И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации 

Ведущая организация  

ГБУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Министерства здравоохранения Московской области

Защита диссертации состоится «3» декабря 2012 года в 14.00 на заседании Диссертационного совета Д 208.072.12 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России адресу: 117997,
г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «3» ноября 2012 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор    Хашукоева Асият Зульчифовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время проблема неразвивающейся беременности (НБ) остается одной из ведущих в современном акушерстве. Актуальность данной проблемы связана с распространенностью этой патологии в структуре репродуктивных потерь, составляющей 10-20% (Баранов В.С., 2004; Серова О.Ф., 20011). Среди этиологических факторов неразвивающейся беременности, наряду с генетическими, аутоиммунными, выделяют роль урогенитального инфицирования и гормональных нарушений у беременных. Влияние инфекции на течение беременности в 1 триместре объясняется высоким уровнем инфекционной заболеваемости беременных, приводящей к развитию акушерской патологии. Среди инфекций, являющихся причиной неразвивающейся беременности, выделяют вирусную (цитомегаловирус, вирус простого герпеса, вирусы Коксаки А и В, энтеровирусы), бактериальную (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, стрептококки, стафилококки, гонококки) и грибы. Следующей причиной неразвивающейся беременности можно назвать гормональные нарушения. Известно, что у 21-32% женщин с невынашиванием беременности в анамнезе выявлена гиперандрогения (Раисова А.Т.,1999).

Однако не ясно, почему в одних случаях инфекционные агенты и изменения в гормональном статусе женщины приводят к неразвивающейся беременности, а в других –  практически не влияют на ее течение.

Для понимания механизмов этиологии и патогенеза неразвивающейся беременности представляются перспективными исследования в области иммунологии репродукции. Для нормального течения беременности, процессов имплантации, роста и развития эмбриона необходимо состояние локальной иммуносупрессии, которое может быть обеспечено в организме матери сбалансированным действием гормонов, простагландинов, регуляторных молекул иммунной системы (цитокинов, хемокинов, противомикробных пептидов и др.)

В настоящее время активно изучается роль системы врожденного иммунитета в защите репродуктивной системы женщины. Врожденный иммунитет предотвращает развитие инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще не задействованы, а при беременности  –  супрессированы  (Макаров О.В., 2007; Сухих Г.Т., 2010). В последние годы исследуется структура и функции нового класса эффекторных молекул врожденного иммунитета – противомикробных пептидов (ПМП), представляющих собой естественные эндогенные антибиотики с прямым противовирусным, противобактериальным, противогрибковым действием. ПМП формируют молекулярную основу врожденного иммунитета и участвуют в реализации ряда защитно-приспособительных реакций (Коряков В.Н., 2006).  ПМП обнаружены во всех тканях, имеющих контакт с микроорганизмами (кожа, слизистая дыхательных путей, пищеварительный и урогенитальный тракт и др.). Особое значение приобретают противомикробные пептиды в репродуктивной системе женщины при беременности, так как они защищают от инфекции не только материнский организм, но и организм плода.

Отсутствуют работы по анализу противомикробных пептидов в первом триместре беременности, в частности, в слизистой цервикального канала и в периферической крови у женщин с физиологически протекающей беременностью. В настоящее время остается неясным вопрос, какую роль противомикробные пептиды играют в репродуктивной системе женщины при неразвивающейся беременности. Комплексный анализ противомикробных пептидов в вышеуказанных биологических материалах поможет определить возможные критерии риска неразвивающейся беременности, ее ранней диагностики, а также позволят провести отбор пациенток для своевременного лечения. Помимо этого представляется возможность обоснования необходимости применения новых препаратов на основе противомикробных пептидов для коррекции врожденного иммунитета репродуктивной системы у женщин с неразвивающейся беременностью.

Цель исследования

Комплексное исследование уровня противомикробных пептидов (HNP1-3, LL37, НВD1) и экспрессии гена TLR2 крови и слизистой цервикального канала и определение их значимости в диагностики и прогнозировании неразвивающейся беременности.

Задачи исследования

1.  Провести комплексное клинико-лабораторное обследование беременных с неразвивающейся беременностью.

2. Исследовать уровни противомикробных пептидов (HNP1-3, LL37, НВD1) и экспрессии гена TLR2 в цервикальном канале и -дефенсинов (HNP1-3) в плазме крови женщин с физиологически протекающей беременностью

3.Изучить уровни противомикробных пептидов в слизистой
цервикального канала и периферической крови у женщин с
неразвивающейся беременностью.

4. Оценить роль противомикробных пептидов, как возможных маркеров неразвивающейся беременности.

Научная новизна исследования

Получены новые данные об экспрессии противомикробных пептидов (дефенсинов и кателицидинов) на локальном и системном уровне у женщин с физиологически протекающей беременностью. При беременности увеличивается экспрессия -дефенсинов HNP-1-3 в плазме крови и возрастает экспрессия генов молекул врожденного иммунитета HBD-1 в слизистой цервикального канала, что обеспечивает защиту женщины и плода от различных патогенов.

В результате комплексного исследования ПМП у женщин в плазме и слизистой цервикального канала получены новые данные, связанные с патогенезом и диагностикой неразвивающейся беременности. Впервые получены данные о снижении экспрессии генов Toll-подобного рецептора 2 (TLR2) и противомикробного пептида LL-37 у беременных с неразвивающейся беременностью и гиперандрогенией, что свидетельствует о супрессии врожденного иммунитета на уровне слизистой цервикального канала у этих пациенток.

При неразвивающейся беременности наблюдается снижение уровня -дефенсинов (HNP-1-3) в плазме крови, что может свидетельствовать о супрессии эффекторных механизмов врожденного иммунитета на системном уровне.

Практическая значимость работы

На основании анализа противомикробных пептидов (HNP-1-3) в плазме крови определены маркеры неразвивающейся беременности.

Уменьшение концентрации HNP-1-3 в плазме крови (менее 0,1 нг/мл) в 70% определяется у женщин с неразвивающейся беременностью. Резкое снижение концентрации -дефенсинов (HNP-1-3 ) в плазме крови беременных может служить одним из диагностических критериев неразвивающейся беременности.

Диагностика нарушений врожденного иммунитета (снижение экспрессии противомикробных пептидов и распознающего рецептора TLR2) в слизистой цервикального канала позволяет прогнозировать развитие осложнений во время беременности и определить показания к назначению иммунокорригирующей терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. При физиологической беременности увеличивается экспрессия -дефенсинов HNP-1-3 в плазме крови и возрастает экспрессия генов молекул врожденного иммунитета HBD-1 и TLR2 в слизистой цервикального канала

2. У женщин с НБ выявлено достоверное снижение уровня -дефенсинов (HNP-1 -3) в плазме крови по сравнению со здоровыми беременными. У 40% беременных HNP-1-3 не определяется в плазме крови.

3. При гиперандрогении у женщин с НБ наблюдается достоверное снижение экспрессии гена TLR2 по сравнению со здоровыми беременными в 1-м триместре гестации.

4. Снижение уровня -дефенсинов HNP-1-3 в плазме крови менее 0,1 нг/мл и увеличение концентрации кателицидина LL-37 более 2000 пк/мл у беременных в 1 триместре могут явиться маркерами НБ.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы гинекологических отделений ГКБ №55 и ГКБ №4 г. Москвы, а также используются в учебном процессе кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета №1 ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры акушерства  и гинекологии №1  лечебного факультета  РНИМУ им Н.И. Пирогова, кафедры иммунологии РНИМУ им Н.И. Пирогова, врачей гинекологических отделений ГКБ №55  26 июня 2012г, протокол №12.

Публикации

По теме диссертации опубликовано  5  работ, из них  3 –  в изданиях, определенных перечнем ВАК Минобрнауки РФ.

Личное участие автора

Автором лично проведена работа по клиническому и инструментальному обследованию тематических больных, анализу клинико-лабораторных и инструментальных исследований, статистическая обработка полученных данных и анализ результатов исследования.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 94 страницах компьютерного  текста, состоит из введения, обзора литературы, клинической характеристики пациенток и методов обследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя литературы, включающего  121  источник, из них  – 54  отечественных и  – 67 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована  1 таблицей и 20 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Данное исследование  проведено на клинических базах кафедры  акушерства и гинекологии  №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития (заведующий кафедрой – д.м.н., профессор, Засл. Врач РФ Макаров О.В.) в гинекологических отделениях ГКБ №55  г. Москвы (и.о. главного врача – Бышов А.А.), в родильном доме при городской больнице №8 (главный врач – к.м.н. Дуленков А.Б.), женской консультации при родильном доме №10 (главный врач – Озимковская Е.П.) и на кафедре иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова  (заведующий кафедрой – д.м.н., проф. Ковальчук Л.В.). Изучение экспрессии генов противомикробных  пептидов проводили в лаборатории диагностики вирусных инфекций  ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (заведующая лабораторией молекулярной иммунологии – д.м.н. Свитич О.А.).

Диссертационная работа основана на результатах клинико-лабораторного обследования 126 пациенток. Основная группа представлена 47 беременными с неразвивающейся беременностью, которым выполнено инструментальное удаление измененного плодного яйца на сроках 5-13 недель беременности. Средний возраст пациенток основной группы составил 28,3±4,2 лет.

Первую группу сравнения составила 21 небеременная здоровая женщина (группа I) практически того же возраста, что и пациентки в основной группе  –  29,7±4,6 года.

Во вторую группу сравнения вошли 58 пациенток с физиологически протекающей беременностью,  которые были подразделены на 3 подгруппы: 20 женщин с физиологически протекающей беременностью на сроке 5-13 недель составили IIа подгруппу;  во IIб подгруппу вошли 20 беременных на сроках гестации 28-34 недели, а 18 женщин, которым в первом триместре был сделан аборт по показаниям представлены в подгруппе IIв). Средний возраст 28,5±3,9 лет.

Диагноз неразвивающейся беременности (НБ) мы устанавливали, используя данные анамнеза, общего и специального гинекологического исследования и дополнительных методов исследования (УЗИ, определение концентрации в крови хорионического гонадотропина).

При постановке диагноза НБ пациенткам проводили инструментальное удаление измененного плодного яйца с последующей антибактериальной, утеротонической терапией. Случаи неразвивающейся беременности, сопровождающиеся грубыми нарушением эмбриогенеза (анэмбриония), из исследования были исключены.

Всем пациенткам было проведено клинико-лабораторное обследование, которое включало в себя:

1. Подробный сбор анамнестических данных:

2. Объективный осмотр:

3. Гинекологический осмотр:

4. Дополнительные методы обследования:

- RW, BH4, HBS, HCV

- Определение группы крови,  резус-фактора, KELL

- Клинический анализ крови

- Биохимический анализ крови

- Коагулограмма

- Общий анализ мочи

- ЭКГ

- УЗИ органов малого таза

- Определение в крови концентрации хорионического гонадотропина

- Определение стероидного профиля мочи для исключения или подтверждения гиперандрогении

- Бактериоскопическое исследование содержимого влагалища и цервикального канала

- Исследование клеток цервикального канала на наличие ДНК вируса простого герпеса I, II типов, хламидий, уреаплазмы, микоплазмы, цитомегаловируса, вируса папилломы человека методом полимеразной цепной реакции.

Ультразвуковое исследование органов малого таза проводили с помощью аппарата Voluson E8 фирмы GE с использованием мультичастотного микроконвексного внутриполостного ректо-вагинального датчика с частотой 4.0-11.0 МГц. При проведении исследования оценивали  размеры матки,  состояние  эндометрия  и миометрия, эхоструктуру яичников. Особое внимание уделяли размерам  эмбриона  и  плодного  яйца,  особенностям имплантации и хориона.

Для определения срока гестации, при котором произошла гибель плодного яйца, проводили измерение копчико-теменного размера (КТР) эмбриона и средний внутренний диаметр плодного яйца (СДВ). При сомнении в достоверности постановки диагноза НБ проводили повторное исследование через 3-5 дней.

Иммунологические методы исследования заключались в определении уровней дефенсинов и кателицидинов в плазме периферической крови обследуемых пациентов.  Уровни исследуемых противомикробных пептидов определялись с помощью иммуноферментного анализа. Для определения уровня HNP-1 и LL-37 в плазме периферической крови использовали наборы для иммуноферментного определения человеческих HNP1-3 (дефенсинов нейтрофилов) и для иммуноферментного определения человеческих LL-37 фирмы НВТ (Нидерланды).

Молекулярно-биологические методы состояли из нескольких этапов:

1. Получение клеток слизистой цервикального канала. Взятие клеток слизистой цервикального канала проводили во время осмотра при помощи зеркал. Для получения клеток слизистой цервикального канала перед взятием материала удаляли слизь, помещали ее в чистый эппендорф (для проведения в последующем иммуноферментного анализа) и обрабатывали шейку матки стерильным физиологическим раствором. Затем цитощеткой «Юнона» осторожными вращательными движениями проводили взятие материала. Далее клетки слизистой аккуратно переносили в эпендорф, содержащий культуральную среду Игла, полученную клеточную взвесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут. Клеточный осадок в дальнейшем был использован в работе.

2. Выделение общей РНК из клеток слизистой цервикального канала проводилось методом кислофенольной экстракции.

3. Реакцию обратной транскрипции проводили для синтеза на матрице мРНК к ДНК интересующего гена для последующего определения числа копий с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени.

4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Последовательность праймеров для исследуемых генов подбирали с помощью программы Vector NTI, анализируя последовательность интересующих генов, полученную из GenBank. Прибор АНК-32 позволял анализировать образцы ДНК/РНК в динамическом диапазоне от 1 до 109 копий, одновременно детектировали 4 красителя (FAM/SYBR Green, ROX, R6G, Су5) в одной пробирке. Полученные результаты были обработаны с помощью программного обеспечения, которое прилагалось к прибору АНК-32 (количество копий было получено в десятичных логарифмах). Результаты оценивали относительно 1 млн. копий гена актина человека.

5. Электрофорез в агарозном геле. Для дополнительного подтверждения специфичности ПЦР-продукта проводили электрофорез в 2% агарозном геле с бромистым этидием (Helicon, Россия) в присутствии набора ДНК маркеров с известными длинами (100bp DNA ladder, Сибэнзим, Россия). Заливали гели в формы с «гребенками». Разделение проводили в 1х буфере ТАЕ при напряжении 100В в течение 30 мин. В состав пробы входило 10 мкл ПЦР-продукта и 10 мкл 1х буфера для нанесения проб (СибЭнзим, РФ).

Статистическую обработку материала  проводили методами вариационной статистики. Для статистического анализа были использованы следующие методы:

1.  Проверка нормальности распределения количественных признаков с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (адрес свободного доступа http://www.nsu.ru/mmf/tvims/chernova/ms/lec/node45.html).

2. Для оценки критерия значимости в  двух независимых группах, представленных непараметрическими ранговыми величинами, использовали критерий 2 (Хи-квадрат) и критерия Фишера (пакет программ WinPePi, адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html).

3. Для групп, представленных параметрическими величинами, использовали t-тест Стьюдента.

4. Для определения достоверности различий между выборками, учитывая различную дисперсию и ненормальное распределение значений, применяли непараметрические статистические методы (критерий Манна-Уитни с поправкой Йейтса).

5. Оценку корреляционной зависимости для непараметрических ранговых величин проводили по методу Спирмена (R).

Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах и рисунках, имеют следующие обозначения: М – среднее, s – стандартное (среднеквадратичное) отклонение, n – объем анализируемой подгруппы, р – достигнутый уровень значимости.

Различия между сравниваемыми величинами признавали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возраст обследованных нами пациенток варьировал от  24,1  и до 32,5 лет, средний возраст составил 28,3±4,5 лет. Группы были сопоставимы по возрасту.

Основным поводом госпитализации в стационар пациенток основной группы послужило осложненное течение данной беременности – выявление по данным гинекологического осмотра, УЗИ неразвивающейся беременности.

Нами у обследованных пациенток выявлена более высокая частота работающих с компьютером (почти в два раза), а так же испытывающих постоянный стресс  на производстве или дома. Из вредных привычек женщины как основной, так и контрольной групп курили без статистически достоверной разницы.

Из обследованных нами  126 пациенток  у 14,8%  была выявлена различная сопутствующая экстрагенитальная патология. Наиболее часто встречались хронические воспалительные заболевания:  хронический бронхит (28,6%), хронический тонзиллит и хронический фарингит (13,3%), хронический цистит (13,3%),  хронический пиелонефрит (5,7%), хронический гастрит (13,3%) как в основной, так и в контрольной группах примерно с одинаковой частотой.

При изучении менструальной и репродуктивной функции в основной группе чаще встречались дисфункция яичников (17,1%), так же хронические воспалительные процессы – хронический цервицит  (40,4%),  эктопия шейки матки (36,2%), хронический сальпингоофорит  (19,2%),  хронический эндометрит (6%), бактериальный вагиноз (17,1%) с обнаружением бактериальной, вирусной и смешанной инфекции.

У большинства обследованных нами пациенток данная беременность была первая. Естественно возникает вопрос о прогнозировании, течении настоящей беременности, возможных осложнениях и разработки профилактики и лечения, учитывая возможный инфекционный процесс и условия для репродуктивной потери.

Работами отечественных и зарубежных ученых показано, что при беременности происходит активация системы врожденного иммунитета на фоне супрессии адаптивного (Сухих Г.Т., 1997). Наши исследования дополнили эти данные. Анализ экспрессии гена TLR2 клетками цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью выявил достоверное увеличение экспрессии гена TLR2 в I триместре (рис.1).

Полученные нами данные показали, что экспрессия -дефенсина-1 клетками цервикального канала достоверно возрастает при беременности в первом триместре по сравнению с таковой у небеременных женщин (р<0,05). Также следует отметить, что к третьему триместру уровень экспрессии гена HBD-1 снижается у женщин с физиологически протекающей беременностью, но остается выше, чем в группе сравнения I.

Рис. 1. Экспрессия гена TLR2 клетками слизистой цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью (в I и III триместрах) и у небеременных женщин.

Примечание: * –  значение достоверно отличается от значения в группе небеременных женщин (р<0,05); ** – значение достоверно отличается от значения в группе беременных женщин в I триместре (р<0,05).

На рисунке 2  представлены данные экспрессии гена HBD-1 клетками слизистой цервикального канала здоровых беременных (I и III триместр) (подгруппы IIа и IIб) и здоровых небеременных женщин (группа I).

Известно, что в отличие от -дефенсинов, имеющих местное действие, -дефенсины представляют собой молекулы системного действия. Их выброс из гранул нейтрофилов в кровь является одним из регуляторных механизмов стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета за счет угнетения продукции глюкокортикостероидов, обладающих подавляющим действием на иммунные реакции и вызывающих формирование иммунодефицитного состояния. Данное положение послужило причиной изучения уровня -дефенсинов HNP-1 в плазме крови здоровых беременных женщин. Анализ уровня (HNP1-3) выявил достоверное увеличение концентрации этих пептидов в плазме здоровых беременных по сравнению с группой небеременных (р<0,05). 

Рис.2. Уровень экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала у здоровых беременных и небеременных женщин.

Примечание: *  - значение достоверно отличается от значения в группе небеременных женщин (р<0,05).

Полученный результат можно объяснить активацией нейтрофилов – основных клеток, высвобождающих HNP1-3. При беременности происходит увеличение количества  нейтрофилов в  периферической крови и их активация. Таким образом можно предположить, что уровень -дефенсинов в плазме крови коррелирует с активацией нейтрофилов (рис.3). 

На основании полученных данных можно сделать вывод, что при беременности происходит увеличение экспрессии генов -дефенсина HBD-1 и TLR2, осуществляющих защиту матери и плода от патогенов на уровне слизистых. В периферической крови возрастает концентрация нейтрофильных        -дефенсинов, регулирующих системный воспалительный ответ и обладающих прямым противомикробным действием. Концентрация кателицидина LL-37 несколько снижена в группе беременных женщин.

Рис.3. Концентрация HNP1-3 в плазме крови у обследованных женщин.

Примечание: * - значение достоверно отличается от значения в группе небеременных женщин (р<0,05).

Далее нами проведены исследования по изучению экспрессии ПМП у женщин с неразвивающейся беременностью. Эта группа была неоднородной, и среди обследованных женщин у 29,0 % определялась гиперандрогения, у 23,7%  –  хронический сальпингоофорит. В дальнейшем нами были проанализированы уровни экспрессии генов TLR2 и HBD-1 у женщин этих групп. Нами установлено, что у пациенток с неразвивающейся беременностью  и  гиперандрогенией выявлены изменения в системе врожденного иммунитета на уровне слизистой цервикального канала, выражающиеся в снижении экспрессии TLR2 по сравнению с группой здоровых беременных. Известно, что андрогены супрессируют функциональную активность клеток врожденного иммунитета, в частности, фагоцитоз, выработку цитокинов, кислородных радикалов макрофагами (Yamaguchi T., 2001), экспрессию TLR4 (Rettew J.A., 2008)

Наши данные о снижении экспрессиии TLR2 в слизистой цервикального канала позволят в дальнейшем подойти к пониманию механизмов патогенеза неразвивающейся беременности при гиперандрогении. Известно, что так называемые сигналы опасности (белки теплового шока, модифицированный коллаген, фибриноген и др.), появляющиеся в дефектных, разрушившихся или подвергшихся стрессу клетках организма распознаются также в основном TLR2. При неразвивающейся беременности эндогенные лиганды появляются, но снижение экспрессии распознающих рецепторов не обеспечивает достаточной активации эффекторных механизмов врожденного иммунитета, таких как выработка противомикробных пептидов, провоспалительных цитокинов и др., и в организме развивается тяжелейший патологический процесс.

Об этом свидетельствует и значительное уменьшение в плазме крови женщин с неразвивающейся беременностью концентрации нейтрофильных -дефенсинов HNP-1-3 – ПМП, вовлеченных в системные иммунные механизмы. У 40,0 % пациенток с неразвивающейся беременностью HNP-1-3 вовсе не определяются в плазме, у 30,0 % – его концентрация менее 0,1 нг/мл. Полученные нами данные позволяют считать, что уменьшение концентрации HNP-1-3 в крови беременных может служить диагностическим критерием невынашивания беременности.

Концентрация LL-37 у женщин с неразвивающейся беременностью в слизи цервикального канала была достоверно выше группы здоровых беременных и сопоставима с показателями небеременных женщин (рис 4).

Можно предположить, что увеличение концентрации кателицидина LL-37 –  неблагоприятный прогностический признак и может свидетельствовать об увеличении количества нейтрофилов в слизи, их гибели и высвобождении LL-37 из гранул.

Согласно проведенных нами исследованиям у женщин при нормальном течении беременности уровень противомикробных пептидов HNP1-3 в плазме крови повышался по сравнению с небеременными женщинами, что  свидетельствует об активации гуморальных компонентов врожденного иммунитета на системном уровне при беременности.

Рис.4.  Изменение концентрации кателицидина LL-37 в слизи цервикального канала женщин с неразвивающейся беременностью

Примечание: * –  значение достоверно отличается от показателя в группе пациентов без гиперандрогении (р<0,05).

Нами у пациенток с неразвивающейся беременностью была определена концентрация HNP1-3 в плазме крови и установлено, что средние показатели HNP1-3 были достоверно ниже, чем в подгруппах сравнения IIа и IIв (р<0,05) и составили 0,018±0,012 нг/мл.

При анализе индивидуальных данных нами выявлено, что  «нулевые» значения HNP1-3 в плазме крови пациенток с неразвивающейся беременностью встречались у 42,0 % пациенток, концентрация нейтрофильных пептидов до 0,1 нг/ мл –  у 31,0 %,  более 0,1 нг/мл  – лишь у 27,0 % пациенток. В то же время нами установлено, что у здоровых беременных HNP1-3 определялись всегда, причем почти у 70,0 % пациенток концентрация нейтрофильных пептидов была в диапазоне от 0,1 нг/мл до 1,0нг/мл, а у 25,0 % пациенток – выше 1,0нг/мл (рис. 5).

Рис.5. Концентрация -дефенсинов HNP1-3 в плазме крови женщин с неразвивающейся беременностью и здоровых беременных.

Нами установлено, что у пациенток с гиперандрогенией изменения концентрации HNP-1-3 в плазме крови не отличались от основной группы. У 72,0 % пациенток показатели нейтрофильных пептидов были менее 0,1 нг/мл (рис.6). Полученные нами данные выявили совершенно другие механизмы при урогенитальной инфекции: экспрессия TLR2 возрастает в несколько раз, что приводит к продукции провоспалительных цитокинов и прерыванию беременности, а концентрация HNP-1-3 в плазме крови при УГИ превышает аналогичные показатели при неразвивающейся беременности.

Таким образом, определение концентрации нейтрофильных пептидов в плазме крови может служить надежным методом в диагностике и прогнозировании течения различной патологии беременности.

Рис.6. Концентрация -дефенсинов HNP1-3 в плазме крови женщин с

неразвивающейся беременностью и беременных с гиперандрогенией.

Методы оценки врожденного иммунитета (определения экспрессия генов TLR2 в слизистой репродуктивной системы в комплексе с оценкой противомикробных пептидов и цитокинов) позволят вскрыть механизмы патогенеза патологии беременности, открыть новые маркеры патологии и обосновать назначение иммунотропных препаратов, действие которых направлено на регуляцию врожденного иммунитета (противомикробных пептидов, агонистов Toll-подобных рецепторов, противовоспалительных цитокинов, растворимых рецепторов и др.).


ВЫВОДЫ

1. При физиологической беременности увеличивается экспрессия -дефенсинов HNP-1-3 в плазме крови и возрастает экспрессия генов молекул врожденного иммунитета HBD-1 и TLR2 в слизистой цервикального канала, что обеспечивает защиту женщины и плода от различных патогенов на системном и локальном уровнях.

2. У женщин с неразвивающейся беременностью выявлено достоверное снижение уровня -дефенсинов (HNP-1 -3 ) в плазме крови по сравнению со здоровыми беременными. У 40% беременных HNP-1-3 не определялся в плазме крови. Это позволит с высокой чувствительностью прогнозировать неразвивающуюся беременность.

3. У пациенток с неразвивающейся беременностью и гиперандрогенией наблюдается достоверное снижение экспрессии гена TLR2 по сравнению со здоровыми беременными в 1-м триместре гестации.

4. Снижение уровня -дефенсинов HNP-1-3 в плазме менее 0,1 нг/мл и увеличение концентрации кателицидина LL-37 более 2000 пк/мл у беременных в 1 триместре могут явиться маркерами неразвивающейся беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Факторами риска неразвивающейся беременности являются:

       –  хронические воспалительные заболевания органов малого таза

       –  наличие урогенитальной инфекции в анамнезе

       –  увеличение концентрации андрогенов.

2. Для своевременного прогнозирования неразвивающейся беременности в комплекс обследования целесообразно включить оценку врожденного иммунитета с определением в 1 триместре гестации концентрации -дефенсинов HNP-1-3 в плазме крови. При отсутствии пептидов в плазме или их концентрации менее 0,1нг/мл пациенты включаются в группу риска по неразвивающейся беременности и угрозе прерывания и проходят целенаправленное обследование и соответствующую терапию.

       3.Увеличение концентрации кателицидина LL-37 в слизи цервикального канала более 2000 пг/мл позволяет отнести данных пациенток в группу риска по угрозе прерывания и неразвивающейся беременности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дворецкая Е.В. Профилактика гнойно-септических осложнений при неразвивающейся беременности. /Озолиня Л.А., Нечипоренко О.А., Дворецкая Е.В., Алиева М.А.,. Кузнецов П.А. // Диагностика, лечение и реабилитация. Материалы научно-практической конференции, посвященные 50-летию ГКБ№55. – Москва. – 2006. – с. 59-63.

2. Дворецкая Е.В. Состояние некоторых факторов локального иммунитета шейки матки при невынашивании беременности бактериально-вирусной этиологии и применение препарата «Эпиген-интим». /Озолиня Л.А., Сумеди Т.Н., Дворецкая Е.В. // Акушерство и гинекология. 2007. №6. с. 43-48.

3. Дворецкая Е.В.  Анализ противомикробных пептидов человека в биологических жидкостях. / Карташов Д.Д., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Ганковская О.А., Щукина А.В., Дворецкая Е.В. //Российский аллергологический журнал. 2009.   №3. -  Выпуск 1. с. 354-357.

4. Дворецкая Е.В. Нарушение микробиоциноза влагалища как фактор невынашивания беременности. / Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Свитич О.А., Романовская В.В., Кузнецов П.А., Магомедова А.М., Дворецкая Е.В. // Лечение и профилактика. –  2012. – № 1(2). – С. 39-44.

5. Дворецкая Е.В. Прогностическое значение экспрессии генов молекул врожденного иммунитета (TLR2, TLR4 и HBD1) при невынашивании беременности. /Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Свитич О.А.,  Романовская В.В.,  Кузнецов П.А.,  Магомедова А.М., Дворецкая Е.В. // Лечащий врач.   №9.   2012.   с. 84-89.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.