WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

МИХАЙЛОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

CТРАТЕГИЯ СОЗДАНИЯ

ЦЕЛЬНОКЛЕТОЧНЫХ АНТИМЕЛАНОМНЫХ ВАКЦИН 

14.01.12 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина»

Российской академии медицинских наук

(директор – академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,  профессор

  Лев Вадимович Демидов

доктор медицинских наук, профессор

  Анатолий Юрьевич Барышников

Официальные оппоненты:

Алексеев Леонид Петрович

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе и инновационной деятельности ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА РАМН

Трещалина Елена Михайловна

доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией комбинированной терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН

Подвязников Сергей Олегович

доктор медицинских наук, профессор  кафедры онкологии ГБОУ ДПО  «Российская медицинская академия  последипломного образования» Минздравсоцразвития России

Ведущая организация:

ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «___» ______ 2012 г. в ___часов на заседании диссертационного совета Д.001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр

им. Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

(115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН ( 115478, г.Москва Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан «__»______2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Юрий Андреевич Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы

Заболеваемость меланомой в последние десятилетия характеризуется неуклонным ростом. На момент обращения до 40% больных имеют диссеминированный процесс, требующий применения химиотерапии, после которой 5-летняя выживаемость не превышает 5%. При генерализованных формах меланомы основным методом лечения является лекарственный с использованием химио- и иммунотерапии. Среди различных средств и методов имммунотерапии меланомы клиническое применение нашли препараты -2b-интерферона. Эффективность консервативного лечения достигает 50%, однако улучшения общей выживаемости достичь не удается. Иммунотерапия применяется при иммуногенных видах опухолей (меланоме, раке почки, немелкоклеточном раке легкого), способных в некоторых случаях к спонтанной регрессии. Предполагают, что механизм спонтанной регрессии связан с активацией эффекторов иммунной системы в частности, Т-лимфоцитов, распознающих и убивающих опухолевые клетки, благодаря экспрессии на их поверхности опухолеассоциированных антигенов [Baumgaertner P., et al., 2011]. Перспективы развития иммунотерапии меланомы связывают с созданием новых селективных методов, основанных на достижениях молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии. Одним из таких методов является вакцинотерапия, включающая различные модификации клеточной технологии, среди которых лучшие терапевтические характеристики имеют генно-инженерные и дендритные вакцины. Главная цель  иммунотерапии меланомы – увеличение у пациентов популяции CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), способных убивать опухолевые клетки [Shanker А., et al., 2009]. Антигенный материал, используемый для создания таких вакцин, может быть в виде цельных опухолевых клеток (аллогенных или аутологичных) или специфических антигенов, РНК, протеинов или пептидных эпитопов, рестриктированных по первому или второму классу гистосовместимости [Heimburg-Molinaro J., et al., 2011]. В экспериментах и в клинике изучаются подходы, использующие аутологичные меланомные клетки, трансфицированные геном интерлейкина-12 (ИЛ-12), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-4 (ИЛ-4) и др. Вакцины на основе ауто- и аллогенных опухолевых клеток, модифицированных указанными генами, проходят клинические испытания [Soiffer R., et. al., 2003; Maio M., et. al., 2002]. Помимо изучения таких вакцин в монорежиме, как правило, в последние годы их комбинируют с адъювантами, которые представлены цитокинами или нагруженными дендритными клетками, инициирующими иммунный ответ презентацией антигенных эпитопов к Т-лимфоцитам [Zhang H.L., et al., 2011]. Несмотря на многообразие иммунотерапевтических подходов, механизм действия вакцин связан с презентацией дендритными клетками опухолеассоциированных антигенов Т-клеткам пациента [Nencioni A., et al., 2004]. Чаще всего используется одна-две антигенные детерминанты c целью достичь монотаргетного контакта вакцины с мишенью, что важно, прежде всего, для уменьшения некоторых побочных эффектов. Однако по аналогии с цельноклеточными антибактериальными вакцинами более эффективное их применение определяет большее число присутствующих в них антигенов [Geier D., et. al., 2002].

Для лечения диссеминированной меланомы кожи монотаргетная стратегия создания вакцин пока себя не оправдывает в силу поликлональности опухоли, а также быстрой селекции клонов. Селекция является следствием не только скорости пролиферации в условиях васкулогенной мимикрии, но и влияния микроокружения. Профиль экспрессии опухолеассоциированных антигенов чрезвычайно разнообразен, что требует мультитаргетных контактов с эффекторами для запуска программы клеточной гибели. Для осуществления этого актуально создание коллекции культур клеток меланомы, презентирующих различные опухолеассоциированные антигены. Созданная Коллекция клеточных культур меланомы является источником вакцин, направленных на различные антигенные детерминанты и способных использовать максимальное число клеток-мишеней у разных пациентов на разных этапах роста и метастазирования опухоли. Таким образом, создание Коллекции клеточных линий, их последующая трансфекция, проведение доклинических и клинических исследований определяют стратегию разработки цельноклеточных вакцин, что является актуальным как решение важной проблемы иммунотерапии меланомы.

Цель исследования. Разработать стратегию создания цельноклеточных антимеланомных вакцин.

Задачи исследования.

  1. Получить и охарактеризовать из опухолевого материала больных клеточные линии меланомы с экспрессией различных опухоль-ассоциированных антигенов.
  2. На основе клеточных линий меланомы, трансфицированных генами

ГМ-КСФ и tag7, разработать новые цельноклеточные аутологичные и аллогенные вакцины.

  1. Изучить основные доклинические характеристики новых вакцин.
  2. Оценить безопасность применяемых вакцин у больных меланомой.
  3. Для оценки специфической активности определить динамику иммунологических показателей в процессе вакцинотерапии.
  4. На основе доклинического и клинического изучения сформулировать алгоритм стратегии создания новых цельноклеточных вакцин.

Научная новизна

Впервые в России из метастазов меланомы кожи человека от 68 пациентов, проходящих лечение в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, получены и охарактеризованы по основным биологическим, иммунологическим, молекулярным и морфогенетическим параметрам 19 клеточных линий.

Получены и наработаны для доклинических и клинических испытаний оригинальные клеточные линии меланомы человека mel P и mel Kor, трансфицированные генами tag7 или ГМ-КСФ соответственно. Проведены доклинические исследования цельноклеточных геномодифицированные вакцин «Аллоген» (из клеточной линии mel Р/tag7) и «Мелавак» (из клеточной линии mel Kor/ГМ-КСФ), показавшие их безопасность. Обнаружена взаимосвязь между динамикой клеточного ответа – снижением числа натуральных киллерных Т-клеток (НКТ-клеток) и прогрессированием процесса. Анализ раково-тестикулярных антигенов и дифференцировочных генов, подтвердивший неоднородность изученных линий клеток и вакцин, позволил установить корреляцию между интенсивностью экспрессии генов раковотестикулярных антигенов (РТА) и степени дедифференцировки клеток в полученных из метастазов клеточных линиях меланомы. На основе результатов доклинического и клинического изучения разработан алгоритм оптимизации создания новых цельноклеточных вакцин из культур опухолевых и дендритных клеток больных меланомой.

Научно-практическая значимость

Создана Коллекция культур клеток меланомы из 19 новых оригинальных клеточных линий – субстрат для создания новых цельноклеточных противомеланомных вакцин. 15 новых линий клеток меланомы защищены патентами РФ, 5 из которых вошли в 100 лучших изобретений РФ за 2009 г. На основе дендритных и меланомных клеток созданы 3 новые цельноклеточные геномодифицированные и нативные вакцины, предназначенные для лечения онкологических пациентов. Разработан иммунобиохимический мониторинг вакцинотерапии с использованием модифицированных вакцин. Результаты данной работы могут быть использованы как в области фундаментальных, так и прикладных исследований. Полученные данные способствуют углубленному пониманию биологии опухолевой клетки и ее механизмов взаимодействия с иммунной системой. Данные о фенотипе опухолевой клетки (разнородная экспрессия антигенов гистосовместимости, костимулирующих молекул) и информация на уровне генов и антигенов дополняют фундаментальную базу знаний, лежащих в основе конструирования новых вакцин и их оптимизации путем соответствующих модификаций.

Прикладное значение выполненной работы заключается в создании Коллекции полноценно охарактеризованных культур клеток, готовых к созданию на их основе цельноклеточных противоопухолевых вакцин. Подтверждением прикладного характера исследований является разрешение МЗиСР РФ на проведение клинических исследований вакцин на основе дендритных и опухолевых клеток, трансфицированных генами tag-7 и ГМ-КСФ [№371-373 от 06.08.08; №282 от 218.06.10 и №286 от 21.06.10].

Основные положения, выносимые на защиту

  • создана Коллекция опухолевых клеточных линий меланомы с различной экспрессией антигенов;
  • созданы и охарактеризованы по основным доклиническим и клиническим показателям 4 новые цельноклеточные вакцины: 2 аутологичные («Аутологичная/tag-7», «Дендритная») и 2 аллогенные («Аллоген», «Мелавак»);
  • доклинические исследования по безопасности исследуемых вакцин показали их безвредность;
  • стратегия мониторинга клинического изучения цельноклеточных вакцин у больных меланомой направлена на контроль цитокиного профиля, НКТ-клеток и числа синтезирующих ИФН- мононуклеарных клеток периферической крови.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 17–20 марта, 2002 г.; I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака», Москва, 18–20 июня, 2002 г.; European Society of gene therapy. 11th Annual Congress, Edinburg, UK, 14–17 November, 2003 г.; VIII Всероссийском научном Форуме с международным участием «Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 27–30 сентября, 2004 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 16-18 марта, 2005 г.; V Симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний», Москва, 2006 г.; Всероссийской научно-практической конференции, Москва, 21– 24 марта 2006 г.; 15 Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, 22–26 мая, 2006 г.; 8th International Biological Therapy of Cancer, Dresden, 21–24 June, 2006 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Онкология сегодня Успехи и перспективы», Казань, 2006 г.; VI съезд онкологов и радиологов СНГ, Баку, 28 сентября–1 октября 2006 г.; Международной конференции «Биотехнология и медицина», Москва, 14-17 марта, 2006 г.; 6th ISREC Conference on Cancer Research, Lausanne, Switzerland, 2006 г.; VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2007 г.; Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы онкологии», Элиста, 23–24 апреля, 2007 г.; 43d Annual Meeting, Chicago, June 1–5, 2007 г.; Европейской школе онкологии «Иммунология для онкологов», Москва, 31 марта– 01 апреля 2008 г.; 3-ем съезде токсикологов России, Москва, 2– 5 декабря, 2008 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Опухоли кожи и мягких тканей», Санкт-Петербург, 2009 г.; Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2–4 июня 2009 г.; Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2009 г.; VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21– 22 апреля, 2009 г.; XIV Российском онкологическом конгрессе, Москва, 23–25 ноября, 2010 г.; Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы», Санкт-Петербург, 27–30 сентября, 2010 г.; Совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории клеточного иммунитета НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, отделения биотерапии НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 24 июня 2011 г.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав собственных результатов, обсуждения, выводов, списка сокращений, списка литературы, включающего 40 отечественных и 326 зарубежных источников и приложения (Протоколы клинического изучения вакцин, разрешения на исследования). Материалы диссертации изложены на 260 страницах машинописного текста и иллюстрированы 74 таблицами и 41 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования и их характеристики

Из образцов опухолевых тканей получено 19 стабильных клеточных линий, прошедших более 30 пассажей. Определение фенотипа клеточной поверхности проводили в реакции непрямой иммунофлуоресценции с оценкой экспрессии антигенов на проточном цитофлуориметре FACSСalibur (Becton Dickinson). Для реакции поверхностной иммунофлуоресценции использовали антитела ICO-90 (СD3 Т-клетки), ICO-180 (СD20 В-клетки), ICO-53 (HLA-A,B,C-антиген гистосовместимости I класса), ICO-1 (HLA-DR-антиген гистосовместимости II класса), ICO-218 (HMW-меланомодифференцировочный антиген), анти-CD86 и анти-CD80 (ко-стимулирующие молекулы) и анти-CD34 (маркер гемопоэтических стволовых клеток и эндотелиальных клеток). Для иммуногистологического исследования использовали антитела против дифференцировочных антигенов меланоцитов CD63, MelanA/МART-1, HMB45, Tyrosinaza. Определение антигенов главного комплекса гистосовместимости HLA-A,B,C клеточных линий проводили набором сывороток антилейкоцитарных HLA-A,B,C. Исследование генов на клеточных линиях проводили методом ПЦР. Определяли экспрессию дифференцировочных антигенов меланомы (ДАМ): MLANA, TYR, SILV, S100B и 15 РТА: семейства GAGE, MAGE, BAGE т NY-ESO-1; а также контрольных генов HLA-G, HLA-E и GAPDH. Клеточные линии обследованы на СМV, ВИЧ, гепатиты В и С, вирус папилломы человека, Mycoplasma sp., Herpes B virus методом молекулярного исследования и микробиологически – на бактерии и грибы.

Получено 5 оригинальных вакцин: 1. Вакцины аутологичные человеческие: «Дендритная», интактная, из нагруженных опухолевым лизатом дендритных клеток больных меланомой; «Аутологичная/tag7», генно-инженерная, из метастатических, трансфицированных геном tag7 клеток больного меланомой. 2. Вакцины аллогенные человеческие: «Аллоген», генно-инженерная, из клеточной линии меланомы человека mel P, трансфицированных геном tag7; «Мелавак», генно-инженерная, из клеточной линии меланомы человека mel Kor, трансфицированных геном ГМ-КСФ. 3. Сингенная мышиная: В16F10/ГМ-КСФ, генно-инженерная, полученная из культуры клеток мышиной меланомы В16F10, трансфицированной геном ГМ-КСФ (аналогично вакцине «Мелавак»). С учетом действующих в РФ требований проведено доклиническое изучение четырех вакцин «Аутологичная/tag-7», «Аллоген», «Мелавак» и «Дендритная»

Доклинические исследования вакцин

Исследования выполнены на 85 гибридных мышах-самцах BDF1 или F1 из питомника «Столбовая» РАМН; 60 неинбредных крысах-самцах и 37 иммунодефицитных мышах-самках Balb/c nude из разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН; на 42 кроликах породы шиншилла из ФГУП «Опытно-производственное хозяйство «Манихино» и 104 морских свинках-самках альбиносах массой тела 240–250г. из питомника ГУНЦ Биомедицинских технологий «Филиал Андреевка» РАМН. Вакцины «Аллоген» и «Мелавак», предназначенные для внутрикожного применения, изучены по программе общей и локальной (местной) токсичности с патоморфологическим исследованием внутренних органов животных. Оценена иммунотоксичность, пирогенность и прогноз туморогенности. Вакцина «Мелавак» изучена по всем стандартным показателям безвредности, рекомендованным для медицинских иммуно-биологическим препаратов. Вакцина «Аллоген», близкая по специфической активности к «Мелавак», изучена по сокращенной программе для оценки возможности оптимизации объема токсикологического исследования вакцин подобного типа. Прогноз туморогенности выполнен с исходными клеточными линиями обеих вакцин, которые были облучены в  дозе 100 Гр на гамма-установке «Стебель-3А».

Клинические исследования вакцин

В клиническое исследование включены 148 больных с метастатической меланомой III–IV стадий, проходивших лечение в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН в 1999–2010 гг. Больные были разделены на 2 группы. Первая группа из 68 больных – доноры опухолевого материала, из которого получены новые клеточные линии – субстрат для разработки вакцин. Вторая группа из 80 больных включена в клинические исследования. Изучены два режима применения вакцин: терапевтический, при наличии опухолевого процесса, и адъювантный, при отсутствии признаков опухолевого процесса. Первичной конечной точкой клинического изучения вакцин была оценка безопасности, вторичной конечной точкой – оценка специфической иммунологической эффективности. О побочных эффектах судили по шкале токсичности СТСАЕ v.3.0. Иммунный ответ на вакцинотерапию оценивали по изменению иммунофенотипа лимфоцитов, количественному определению ЦТЛ по числу клеток, секретирующих ИФН- и гранзим B; иммуногистохимическому исследованию кожи; по оценке цитокинового профиля Th1 (ИЛ-2, ИЛ-12, ИФН-) и  Th2 (ИЛ-4, ИЛ-10). Кроме того, определяли фактор роста эндотелия сосудов (VEGFА); трансформирующий фактор роста 2 (ТGF-2); белок S100 (S100A1B и S100BB формы); молекулу адгезии CD44std.

Для получения разрешения МЗиСР РФ на проведение клинических исследований новых оригинальных цельноклеточных вакцин на основании результатов доклинических исследований подготовлен стандартный комплект документов. Разрешенные клинические испытания вакцин выполнены в соответствии с Протоколами в отделении биотерапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (заведующий отделением биотерапии опухолей профессор Демидов Л.В.) с соблюдением стандартов GCP. Соответственно требованиям МЗиСР РФ для медицинских иммунобиологических препаратов проведены пилотные клинические исследования и открытые исследования I фазы и начата II фаза. Задачи отдельных клинических фаз касались изучения безопасности и эффективности вакцин, определению дозовых характеристик выявленных эффектов и оценки перспективности применения вакцин у онкологических пациентов.

Для проведения статистического анализа данных, включая проверку нормальности распределения количественных признаков, получение описательной статистики и проведение сравнения сформированных групп пациентов с использованием критериев Стьюдента (Т-критерия) и Манна – Уитни (для признаков, имеющих отличное от нормального распределение), а также для формирования графиков использованы пакеты программ EXCEL 2003 и STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

    1. Клеточные линии меланомы как источник антигенов

Из образцов опухоли получено 19 стабильно растущих клеточных линий, представленных тремя вида клеток: эпителиоподобными, веретенообразными и невусоподобными или их сочетаниями. Линии различались по степени полиморфизма и атипии, количеству пигмента, митозов, гигантских многоядерных и одноядерных клеток. По преобладанию морфологических  форм  клеточные линии были разделены на три группы: высокодифференцированные,  умеренно дифференцированные и низкодифференцированные (рис.1). Умеренно дифферен-цированные и низкодифференцированные клеточные линии характеризовались большим объёмом кариологических нарушений и большей экспрессией раково-тестикулярных генов по сравнению с умеренно дифференцированными линиями.

а. Высокодифференцирован-ная клеточная линия mel Si.

б. Умеренно дифференцированная клеточная линия mel Il

в. Низкодифференци-рованная клеточная линия mel Mtp

Рисунок 1. Культуры клеток меланомы различной степени дифференцировки. х 100.

Анализ клеточных линий выявил экспрессию антигена CD63 во всех исследованных образцах (100%), антигена HMB45 – в 11 (58%), антигенов MelanA/MART1 и Tyrosinase в 7 из 19 образцах (37%). На поверхности всех клеток культивируемых клеточных линий отсутствовали маркеры Т- и В-лимфоцитов CD3 и CD20. Ко-стимулирующая молекула CD80 экспрессирована в 9 случаях (47%), лишь в одном случае (5%) клетки экспрессировали антиген CD86. Обе молекулы CD86 и CD80 экспрессировала одна клеточная линия mel P. Антиген CD54 молекулы адгезии ICAM-1 определялся на всех исследованных клеточных линиях (100%), а экспрессия CD95 была отрицательной во всех исследуемых случаях. Положительная экспрессия антигена CD34 найдена в 42% случаев. Положительная экспрессия меланомаассоциированного антигена HMW, выявлена в 10 из 15 образцов клеточных линий (66,5%). На рис. 2. представлен пример гистограмм клеточной линии mel Mtp, окрашенной с помощью МКА СD63, СD34, СD95, СD54. Экспрессия антигенов гистосовместимости I класса (HLA-A,B,C) имеется на 18 из 19 клеточных линиях (94,7%), а экспрессия антигена II класса (HLA-DR) – только на 4 линиях (21%). После культивирования число линий с антигеном гистосовместимости II класса увеличилось более чем в 3 раза и составило 13 из 19 (68%). К 30-му пассажу антигены гистосовместимости I и II классов определялись уже на 13 клеточных линиях (68%) и только на клеточной линии mel Kor эти антигены отсутствовали на всех пассажах. Исследование антигенов I класса гистосовместимости выявило следующую картину: аллель А26(10) и аллель А3 обнаружен на 6 линиях (32%); аллель А2 и аллель А23 – на 5 линиях (26%) ( табл.1).

Таблица 1. HLA-фенотип клеточных линий меланомы

Клеточная линия

Фенотип

mel P

А23(9), А26(10); В7, В56(22)

mel Kor

А3, А26(10), В62(15), В55(22)

mel Mtp

А3, A26(10), В13, В41

mel Il

А23(9), А26(10); В7, В56(22)

mel Is

А2, В7, В64(14)

mel Si

А1, А3, В51(5), В39(16)

mel Me

А2, A31(19), В58(17), В56(22)

mel Gus

А1, A3, В8, В60(40)

mel Z

А11, A26(10); В62(15), В44(12)

mel Ksen

А24(9), A30(19); В39(16),В60(40)

mel Hn

А1, A23(9); В51(5), В8

mel Gi

А1, A30(19), В8, В44 (12)

mel Ibr

А2, А24(9), В35, В62(15)

mel R

А2, В27, В64(14)

mel Rac

А23(9), A26(10), В39(16), В8

mel Ch

А1, A3, В8, В63(15)

Mel Bgf

A2, А23(9), В62(15), В18

mel H

А3, A30(19), В13, В7

mel Cher

А2, А25(10), В51(5), В49(21)





Для передачи на хранение в Специализированную коллекцию клеточных культур института Цитологии РАН все линии обследованы иммуноферментными методами на отсутствие бактериального и грибного обсеменения. Для исключения ДНК- и РНК-содержащих вирусов (ВИЧ, гепатитов В и С, папилломы человека, Herpes B), хламидий (СМV), токсо- и микоплазм (Mycoplasma species) проведена ПЦР-диагностика. В результате получено доказательство отсутствия указанных видов загрязнения в 19 тестированных культурах меланомы клеток, которые стали основой посевного и рабочего банков. Посевной банк одобрен и зарегистрирован Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.

Рисунок 2. Гистограммы распределения клеток линии mel Mtp по интенсивности флуоресценции; синяя кривая – негативный контроль, зеленая кривая – клетки, положительно окрашенные моноклональными антителами.

Исследование экспрессии генов на клеточных линиях меланомы человека выполнено с помощью ПЦР. Полученные цифровые значения интенсивности полос продуктов ПЦР ранжированы по величинам их интенсивности на ранги: «0» – фоновое значение (желтый цвет от 0 до 50); «1» – малая интенсивность (зеленый цвет от 51 до 699); «2» – средняя интенсивность (серый цвет от 700 до 1299); «3» – высокая интенсивность (красный цвет – >1300) (табл. 1). Из таблицы видно, что наиболее распространенным является ген S100В, который экспрессирован в 18 из 19 (95%) линий клеток. Реже встречается экспрессия гена SILV – в 16 из 19 (84%) линий клеток, гена TYR –в 15 из 19 линий клеток (79%) и гена MLAN – в 14 из 19 линий клеток (74%). Раково-тестикулярные гены экспрессированы более неоднородно: MAGE A2 выявлен на 18 из 19 линий клеток (95%), а ген MAGE В2 – только в 7 случаях (37%) (табл.2).

Таблица 2. Экспрессия дифференцировочных, РТА, НLA генов в клеточных линиях меланомы человека

Клеточ-ные

линии

/гены

BAGE

GAGE2

GAGE3

GAGE4

HLA-E

MAGE-A2

MAGE-A4

MAGE-A6

MAGE-A10

MAGE-A12

MAGE-B1

MAGE-B2

MAGE-C1

MLANA

NY-ESO-1

TYR

SILV

S100B

MAGE-A1

MAGE-A3

HLA-G1

G3PDH

n

mel P

1

0

1

1

2

3

1

3

0

2

0

0

1

1

1

3

3

2

0

3

3

3

17

mel Kor

2

2

2

2

2

3

3

3

3

3

1

0

2

3

2

3

3

2

3

3

2

3

21

mel Mtp

1

2

2

3

2

3

3

3

3

3

0

0

2

3

2

3

3

2

3

3

3

3

20

mel Il

0

0

1

2

2

1

0

2

0

2

1

0

1

2

1

3

2

1

0

2

2

3

16

mel Is

2

2

2

2

2

2

1

3

1

3

0

0

2

3

1

3

3

2

1

3

3

3

20

mel Si

1

0

1

0

2

1

0

1

1

0

1

0

1

3

0

3

3

2

0

1

3

3

15

mel Me

1

0

0

0

2

0

0

0

0

0

1

0

0

3

1

3

3

2

0

0

3

3

10

mel Gus

1

1

2

3

2

2

2

3

1

3

1

2

0

3

2

3

3

2

1

2

2

3

21

mel Z

0

0

0

0

2

1

0

1

0

1

0

0

0

2

1

2

2

2

1

1

2

2

13

mel Ksen

1

2

1

2

1

2

1

1

1

2

0

0

1

0

1

1

2

1

1

2

2

2

19

mel Hn

1

1

1

1

1

1

1

2

1

2

0

1

1

1

1

2

1

1

1

2

1

2

21

mel Gi

2

2

1

2

2

2

1

2

1

3

0

1

2

0

0

0

1

2

2

2

3

3

18

mel Ibr

3

2

2

2

2

2

1

3

2

3

1

2

2

0

1

1

1

2

3

3

3

3

21

mel R

1

1

1

1

1

2

0

1

1

2

0

0

0

1

0

1

0

1

1

2

2

2

16

mel Rac

2

0

1

1

3

2

2

2

2

3

1

0

2

1

1

2

2

3

3

1

3

3

20

mel Ch

1

1

2

2

2

2

1

3

2

2

0

0

2

0

2

0

0

1

2

2

2

3

17

mel BGF

0

2

2

1

3

1

0

2

0

1

0

1

1

0

0

0

1

1

1

1

3

3

15

mel H

1

2

2

2

2

2

1

3

2

3

0

1

2

1

2

0

0

0

2

3

3

3

18

mel Cher

1

0

0

0

2

3

1

3

2

3

1

3

2

1

1

1

2

1

1

3

2

3

19

Кол-во антигенов

16

13

16

15

19

18

13

18

14

17

8

7

15

14

15

15

16

18

15

18

19

19

Определение экспрессии генов РТА и дифференцировочных меланомных антигенов и последующий двумерный иерархический кластерный анализ данных ПЦР ОТ позволили выделить 6 групп клеточных линий с различной степенью цитодифференцировки. Высокодифференцированные и умеренно дифференциро-ванные клетки практически не экспрессируют гены РТА в отличие от низко-дифференцированных.

Клеточные вакцины, модифицированные геном tag-7

    1. Аутологичная клеточная вакцина, модифицированная геном tag-7

Аутологичная вакцина готовится индивидуально для пациента. Клеточная линия культивируется из клеток опухолевого узла. Для получения геномодифицированной вакцины использована стандартная методика трансфекции геном клеток человека и животных. Трансфекция геном tag-7 клеток меланомы человека выполнена в Институте биологии гена РАН. Уровень трансфекции, рассчитанный по числу содержащих плазмиды с геном tag-7 и окрашенных зеленым белком клеток, составил 50-60%. Уровень секреции белка tag-7 составил 30-50 нг на 106 клеток. Готовые вакцинные препараты проходили стандартное тестирование на отсутствие бактерий, вирусов, стерилизованы на гамма-установке «Стебель3А», разлиты в аликвоты по 500 тыс, 1 млн и 5 млн клеток соответственно начальной разовой дозе для человека. Изучение безопасности вакцины «Аутологичная/tag-7» выполнено в рамках пилотного клинического исследования у 8 больных с диссеминированной меланомой и раком почки. По результатам клинического исследования установлено, что вакцина «Аутологичная/tag-7» при многократном внутрикожном введении в диапазоне доз от 0,5 до 20 млн клеток не вызывает каких-либо лимитирующих побочных эффектов. Среди обратимых и кратковременных побочных эффектов отмечены маловыраженная пирогенность с повышением температуры тела до 38° С и локальная гиперемия по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) в течение первых суток после вакцинации. Вакцина не проявляет местно-раздражающего действия и не вызывает отсроченных побочных эффектов, в том числе аллергизирующего, анафилактогенного действия и других клинических проявлений токсичности. По критериям СTC вакцина соответствует 0–1 уровню токсичности. Выявлена положительная динамика экспрессии активационных маркеров и НК-клеток. Для проведения 2 фазы клинического изучения рекомендована начальная доза 10 млн клеток на пациента.

    1. Аллогенная клеточная вакцина, модифицированная геном tag-7

Основой для создания вакцины «Аллоген» стала клеточная линия меланомы человека mel P с транзиторным трансфицированием геном tag-7. Клеточная линия mel P (рис. 3) умеренно дифференцированная и характеризуется наличием полиморфных меланомных клеток, преимущественно веретенообразной и вытянутой удлиненной формы с четкими границами базофильной цитоплазмы и гипер- и нормохромными ядрами с одиночными нуклеолами.

Рис. 3. Цитограмма умеренно диференцированной клеточной
линии mel P. Окраска по методу Лейшмана. Увеличение х 100

  Клеточная линия mel P обладает стабиль-ными культуральными и морфологическими харак-теристиками. На поверхности всех клеток культи-вируемой клеточной линии выявляются дифферен-цировочные, опухолеассоциированные и антигены гистосовместимости.


Доклиническая оценка безвредности вакцины «Аллоген»

       Задача исследований заключалась в оценке токсикологических параметров при однократном внутрикожном, подкожном или внутрибрюшинном применении вакцины в дозах от 1,0 до 6,0 млн клеток, а также в прогнозе туморогенности по стандартной методике.        Проведенное доклиническое изучение показало, что вакцина «Аллоген» при внутрикожном, подкожном и внутрибрюшинном введении в дозах от 1,0 до 6,0 млн клеток безвредна по показателям общей токсичности и не проявляет туморогенности. Это позволило рекомендовать вакцину «Аллоген» для клинического изучения в начальной разовой дозе 1 млн клеток.

Клиническая оценка безвредности вакцины «Аллоген»

Лекарственная форма вакцины «Аллоген» представляет собой прозрачную бесцветную жидкость для внутрикожного применения. Готовый вакцинный препарат прошел стандартное тестирование на отсутствие каких-либо загрязнений, стерилизован на гамма-установке «Стебель3А», разлит в аликвоты по 1 и 5 млн клеток соответственно начальной разовой дозе для человека. Изучение безопасности вакцины «Аллоген» выполнено в рамках Протокола клинического исследования у больных диссеминированной меланомой, утвержденного МЗиСР (разрешение № 372 от 06.08.08 г.). Клиническое изучение безопасности вакцины «Аллоген», представляющей собой модифицированную клеточную меланомную линию, проведено у 14 больных с диссеминированной меланомой III–IV стадии. Все больные включены в Протокол после стандартного комбинированного лечения по поводу меланомы. На момент включения в клиническое исследование у всех пациентов отмечено прогрессирование заболевания и неэффективность предыдущей терапии. В результате установлено, что вакцина «Аллоген» не приводит к каким-либо лимитирующим побочным эффектам или осложнениям. Биохимические и клинические показатели крови оставались стабильными, а выявленные изменения соответствовали основному заболеванию. Иммунотоксических проявлений (аллергических и анафилактических реакций) не было отмечено ни у одного пациента. Степень выраженности отмеченного у больных в 1–2 сутки после вакцинации легкого гриппоподобного синдрома (повышение температуры тела с ознобом, локальная гипертемия) соответствует 0-1 степени токсичности по шкале токсичности (критерии CTC-NCIC).

По результатам иммунологического исследования у 8 из 14 пациентов (57%) на фоне вакцинации отмечено значительное (на 50%) увеличение гранзима В на CD16+ клетках. Увеличение этого маркера позволяет говорить об активирующем влиянии вакцины на иммунную систему пациентов.

У 2 из 14 пациентов (14%) отмечена стабилизация процесса (рис. 4).

Рисунок 4. УЗИ печени пациентки Т.Ж.И., получившей вакцину «Аллоген»

Таким образом, вакцина «Аллоген» при внутрикожном многократном введении в дозах от 5,0 до 40,0 млн клеток не проявляет лимитирующего побочного действия, оказывает активирующее влияние на иммунную систему и в ряде случаев вызывает стабилизацию у пациентов с прогрессирующим процессом.

Клеточная вакцина «Мелавак», модифицированная ГМ-КСФ

Основой для создания модифицированной генно-инженерной вакцины «Мелавак» стала клеточная линия меланомы человека mel Kor, стабильно трансфицированная геном ГМ-КСФ. Клеточная линия mel Kor (рис. 5) характеризуется наличием множественных плотных центров роста полиморфных меланомных клеток вытянутой, округлой и неправильной формы.

Рисунок. 5. Цитограмма низко-дифференцированной клеточной линии меланомы человека mel Kor, окраска по методу Лейшмана, увеличение х100.

Показано, что клеточная линия mel Kor обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. На поверхности всех клеток культивируемой клеточной линии выявляются дифферен-цировочные, опухолеассоциированные антигены; отсутствуют антигены гистосовместимости. От-сутствие антигенов гистосовместимости I и II класса, редко встречающаяся особенность мела-номных клеток, позволяет считать эту линию уникальной. Линия клеток передана на хранение в Специализированную коллекцию клеточных культур института Цитологии РАН.

Вакцина «Мелавак» получена из клона клеток меланомы человека линии mel Kor. Линия стабильно трансфицирована геном ГМ-КСФ и имеет генетическую конструкцию – вектор pBK-CMV (Clon Tech, США) со встроенной к ДНК ГМ-КСФ человека. Количество секретируемого ГМ-КСФ – 84,0 нг / 1 млн клеток за 24 ч. Лекарственная форма вакцины «Мелавак» для внутрикожного применения представляет собой взвесь облученных клеток mеl Kor в питательной среде. Это – прозрачная бесцветная жидкость в эпендорфах, которые хранятся в дюаре с жидким азотом при температуре – 196 оС.

Доклиническое изучение вакцины «Мелавак»

Изучение безвредности проведено по показателям общей и местной токсичности с патоморфологическим контролем и с прогнозом онкогенных потенций. Вакцину «Мелавак» вводили животным внутрикожно и/или подкожно многократно в диапазоне доз от 0,5 до 10 млн клеток.

В результате исследований установлено, что вакцина «Мелавак» при внутрикожном и/или подкожном применении крысам (n=30) в суммарных дозах 1,03х107 или 10,3х107 кл/кг (концентрация 1х107 кл/мл) при внутрикожном ежедневном на протяжении 7 дней введении вызывает обратимую локальную гиперемию и самопроизвольно рассасывающиеся инфильтраты, а также обратимые общие осложнения в виде пирогенной реакции до 38 оС в течение суток и незначительную гепатомегалию с относительно низким виражом печеночных проб, расцененную как реакция на длительно секретируемый клетками вакцины ГМ-КСФ (до 8 мкг/кг/сутки в неделю на крысу). При однократном в/к введении в дозе 5х105 кл/кг однократно (n=3) или 3-кратно на 5-е, 14-е и 30-е сутки (n=12) у кроликов вакцина вызывает очаговую пигментацию, расцененную как возможную окраску ткани меланином из частично разрушенных тотальным облучением вакцинных клеток. На крысах (n=60) в суммарных дозах 1,03х107 и 10,3х107 кл/кг, превышающих предполагаемые дозы для человека в 10 и 100 раз (пересчет доз по стандартному методу Freireich), вакцина не показала выраженных и необратимых признаков «субхронической» токсичности. Прогноз туморогенности на мышах Balb/c nude (n=22) из разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН показал отсутствие онкогенных потенций у вакцины «Мелавак» при однократной подкожной имплантации в дозе 10 млн клеток с периодом наблюдения 9 нед. Контрольные клетки – меланома человека линии mel Kor – в течение 2 недель после имплантации в той же дозе вызывают развитие подкожных опухолей солидного строения, по морфологической картине соответствующих меланоме. Таким образом, вакцина «Мелавак» не имеет онкогенных потенций. Изучение иммунотоксичности вакцины «Мелавак» на морских свинках (n=40) с оценкой интенсивности реакции по Weigle (четырехплюсовая система) и реакции активной анафилаксии показала только слабую аллергогенность вакцины при внутрикожном применении. В связи с видоспецифичностью вакцины «Мелавак» развитие специфического противоопухолевого ответа при вакцинации человеческими опухолевыми клетками, трансфицированными геном ГМ-КСФ, выполнено на мышиных клетках В16F10, трансфицированных мышиным геном ГМ-КСФ. Показано, что аналогичная по основным биологическим параметрам мышиная вакцина  при адекватном режиме применения существенно в 1,5–2,0 раза снижает имплантационную способность меланомы В16, из клеток которой получена экспериментальная вакцина. Единственным осложнением вакцинации является локальная реакция, расцененная как РГЗТ. Таким образом, при доклиническом изучении вакцина «Мелавак» оценена как безопасная для человека и рекомендована для клинического изучения в начальной разовой дозе 10 млн клеток.

    1. Клиническое исследование вакцины «Мелавак»

Исследование выполнено с цельноклеточной вакциной «Мелавак», полученной из клеток меланомы человека линии mel Kor, стабильно трансфицированных геном ГМ-КСФ, инактивированных -излучением в дозе 100 Гр. Для проведения клинического изучения безопасности вакцины «Мелавак» у больных диссеминированной меланомой кожи разработан Протокол № 373, I фаза. Клиническое изучение безопасности вакцины «Мелавак» проведено у 10 больных с диссеминированной меланомой III–IV стадии. Все больные включены в Протокол после стандартного комбинированного лечения по поводу меланомы. На момент включения в клиническое исследование у всех пациентов отмечено прогрессирование заболевания и неэффективность предыдущей терапии. В результате установлено, что вакцина «Мелавак» не приводит к каким-либо лимитирующим побочным эффектам или осложнениям. Биохимические и клинические показатели крови оставались стабильными, а выявленные изменения были транзиторными и/или соответствовали основному заболеванию. Иммунотоксических проявлений (аллергических и анафилактических реакций) не было отмечено ни у одного пациента. Гриппоподобный синдром отсутствовал, локальная гиперемия была обратимой, проявлялась умеренно в зависимости от величины примененной дозы. Уровень токсичности соответствует 0–1 степени по шкале СТСАЕ v.3.0.  Таким образом, вакцина «Мелавак» при внутрикожном многократном введении в дозах от 10,0 до 60,0 млн клеток не проявляет лимитирующего побочного действия. На основании проведенных исследований для проведения 2 фазы клинического изучения рекомендована разовая доза 30 млн клеток.

Клеточная вакцина «Дендритная»

Вакцина «Дендритная» приготовлена на основе аутологичных дендритных клеток (ДК), нагруженных опухолевым лизатом in vitro. Для приготовления опухолевого лизата использовали аутологичный опухолевый операционный материал. ДК получали из мононуклеаров периферической крови пациентов, которые культивировали в присутствии цитокинов ГМ-КСФ и ИЛ-4. Созревание ДК индуцировали с использованием ФНО- и ПГЕ2 по разработанной в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН методике [Чкадуа Г.З., и соав., 2002]. О зрелости ДК свидетельствовал иммунофенотип: CD83+, CD80+, CD54+, CD86+ и HLA-DR+.

    1. Клиническое изучение вакцины «Дендритная»

Для проведения клинического исследования безопасности вакцины разработаны 2 протокола, утвержденных на Ученом совете НИИ КО РОНЦ (см. Приложение №3) и МЗиСР РФ (разрешение № 371 от 06.08.2008 г). В исследование включено 48 пациентов с диссеминированной меланомой в возрасте от 26 до 82 лет (в среднем 54 года.). Вакцину «Дендритная» вводили пациентам внутрикожно в несколько точек в однократных дозах от 1,0 до 5,0 млн клеток с кратностью введения 2–6 нед и, как правило, до прогрессирования заболевания. Больные были разделены на  группы.

Больные  (n=7) с регионарными и/или отдаленными метастазами на фоне прогрессирования заболевания при отсутствии ответа на предыдущее лечение  получали вакцину в качестве основного лечения (терапевтический режим).  Больные (n=41) после эффективного лечения (хирургического, химио- или иммуннотерапии) без клинических признаков заболевания получали вакцину в адъювантном режиме. При проведении вакцинации пациентов в 2-х группах (n=48) каких-либо выраженных побочных реакций не выявлено.

В течение первых суток после вакцинации в дозе 2,0 млн клеток наблюдали легкий гриппоподобный синдром, не требовавший симптоматической терапии и локальную реакцию, расцененную как РГЗТ. Клинические и биохимические показатели крови во время и после вакцинации оставались без динамики, как это было показано для вакцины «Аллоген», а обнаруженные изменения соответствовали прогрессированию заболевания. Аллергических или анафилактогенных реакций не отмечали. Вакцинация, как правило, не ухудшала качество жизни пациентов, большинство из которых вело активный образ жизни. Пациенты группы адъювантного режима во время лечения в полной мере сохраняли трудоспособность. Оценка токсичности соответствует 0–1 степени.

Мониторинг вакцинотерапии

    1. Исследование иммунологического статуса больных на фоне вакцинотерапии

25 пациентов, получавшие вакцину «Дендритная» в адъювантном режиме, были разделены на 2 группы: со временем до прогрессирования (ВДП) < 10 мес. (n=13) и с ВДП > 10 мес. (n=10). Оценка иммунологического статуса проведена до вакцинотерапии  (точка «0») и после третьей вакцинации (точка «3»). В качестве контроля взята группа здоровых доноров (n=10). У больных с ВДП > 10 мес. иммунный статус не отличался от здоровых доноров. Однако у больных с ВДП < 10 мес. имелись отклонения в показателях иммунного статуса. Так, обнаружено статистически значимое уменьшение CD3+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05) и CD4+ Т-лимфоцитов, уменьшение иммунорегуляторного индекса (ИРИ) (р < 0,01), увеличение количества НК-клеток (CD16) в два раза (р < 0,001), СD3+СD8+цитотоксических клеток (р < 0,01), СD3+СD16+ НК-клеток (р < 0,01) и СD3-СD16+ НК-клеток (р < 0,05). Таким образом, больные с ВДП < 10 мес. уже до вакцинации имели выраженные изменения в иммунном статусе, которые не изменились в процессе вакцинотерапии. Снижение уровня Т-клеток, СD4+ Т-клеток, ИРИ и повышение CD16+ НК-клеток можно считать неблагоприятными прогностическими факторами (табл.3).

Таблица 3. Иммунологический статус больных меланомой, получавших вакцину «Дендритная» в адъювантном режиме и у здоровых доноров

Антигены

Процент  антигенположительных клеток (Мср±m)

Здоровые

доноры

ВДП>10 мес

ВДП<10 мес

До вакцинации

После 3 вакцинации

До вакцинации

После 3 вакцинации

СD3

67,5±5,5

68,7±9,5

68,7±10,3

62,9±11,5*

60,8±6,5*

СD4

45,5±6,2

39,14±7,3

40,2±6,7

35±5,6***

31,8±4,7***

СD8

26,9±6

32,3±7,4

28,7±5,2

40,8±4,8

42,6±6,3

ИРИ

1,7±0,4

1,2±0,3

1,4±0,3

0,8±0,2

0,7±0,1

СD16

16,8±6

24,1±5,8

24±6,8

31,6±7,8***

32±7,7***

СD20

9,7±3,4

11,78±7,4

11,22±5,6

14,6±7,5

15,5±4,5

СD3+СD4+

43,1±7,3

38,5±7,3

39,78±6,5

34,3±5,4**

30±4,5**

СD3+СD8+

20,8±3,4

27,3±7,1

23,82±4,4

25,2±7,5

28,8±6,2

СD3-СD8+

6,1±3,5

5±2,6

5,1±2,6

15,5±7,4**

13,8±5,5**

СD4+СD8+

1,1±1,6

4,5±4,5

2,7±1,7

8,4±7,2

5,9±5,2

СD8+СD16+

7,4±3,5

6±2,7

6,3±2,9

15,7±6,5

13,3±5,8

СD3+СD16+

4,3±1,6

5,05±3,3

4,47±1,3

12,6±6,2**

12,8±6,4**

СD3-СD16+

12,5±5,2

19,14±6,9

19,5±7,4

18,9±6,3*

19,2±5*

Примечание: *различия достоверны, p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ** ИРИ- иммунорегуляторный индекс

Оценка иммунннного ответа на вакцинацию дендритными клетками методом ELISpot

Всего в данный анализ включено 17 больных. Было определено среднее число ИФН- продуцирующих клеток в каждой точке и проанализировано изменение числа клеток периферической крови, активирующихся в ответ на стимуляцию опухолевым лизатом. Среднее число клеток, продуцирующих ИФН-, до начала вакцинации составило 0,54 клетки на 100 000 лейкоцитов периферической крови. В процессе вакцинации наблюдалось уменьшение числа этих клеток, и лишь к 3 точке число ИФН-- продуцирующих клеток существенно возросло (до 2,23 клетки на 100 000 лейкоцитов).

Рисунок 6. Изменение числа клеток, продуцирующих ИФН-, в процессе вакцинации.

Таким образом, в процессе вакцинотерапии отмечено снижение, а затем рост числа ИФН- продуцирующих клеток.

Мониторинг реактивности кожи

В группе пациентов (n=8), получивших вакцину «Аллоген», изучены 16 биоптатов кожи подлопаточной области. ИГХ-исследования биоптатов кожи подлопаточной области до и после вакцинации в периваскулярных пространствах сосочкового слоя показали достоверное (р<0,05) увеличение количества маркеров Т-клеток CD3 и CD8, B-клеток – CD20 и НК-клеток – СD56. Периваскулярные пространства сетчатого слоя также характеризовались достоверным (р<0,05) увеличением количества CD3, CD8, CD14, CD56 -клеток. В окружении клеточного состава потовых желез отмечено достоверное (р<0,05) увеличение количества Т-клеток CD3, а для сальных желез отмечено достоверное (р<0,05) увеличение количества Т-клеток CD3 и CD8, а также НК-клеток – СD56.

    1. Исследование цитокинового профиля

В зависимости от режима введения (адъювантный, терапевтический) 62 пациента разделены на группы. Анализ ВДП, проведенный в группах больных, получавших вакцины аутологичную «Дендритная» и «Аллоген» в адъювантном и/или терапевтическом режимах, представлен в табл. 4.

Таблица 4. Время до прогрессирования при применении вакцин «Дендритная» и «Аллоген» в адъювантном и лечебном режимах

Режим применения

Группа, вакцина

n

Время до прогрессирования,

мес.

Адъювантный

1.«Дендритная»

16

46,31±4,79

2.«Дендритная»

25

9,64±1,25

Терапевтический

3.«Дендритная»

7

3,43±0,75

4. «Аллоген»

14

5,57±1,47

  p

<0,001

1–2;3;4

Из таблицы 4 видно, что у больных ВДП терапевтического режима при применении обеих вакцин «Дендритная» и «Аллоген» не превышало 5,57 мес. Больные меланомой  адъювантного режима на фоне применения вакцины «Дендритная» в разовых дозах 2–5 млн клеток разделены на 2 подгруппы по величине ВДП: >10 мес. и <10 мес. (табл. 4). Наиболее длительное время до прогрессирования получено у пациентов первой группы, получающих вакцину «Дендритная» в адъювантном режиме. Важно выяснить, почему у половины больных без признаков заболевания прогрессирование наступает до 10 мес. Для выяснения этого феномена проведен анализ основных цитокинов и биомаркеров. Исходный уровень цитокинов в адъювантной группе пациентов (n=41) был изменен до вакцинации (табл. 5) таким образом, что ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-10 были выше нормы, а ИФН- и ИЛ-12 – ниже нормы. В отдельных подгруппах с различным ВДП показатели практически не отличались от исходного значения, полученного во всей группе, кроме ИЛ-10 и ИЛ-4, где прослеживается тенденция к увеличению в  1,6 (9,29±1,73 против 6,99±1,94 пг/мл) и 1,3 раза (5,63±2,07 против 3,52±0,94 пг/мл). У пациентов на фоне исходно достоверно (р<0,001) повышенного уровня ИЛ-2 в процессе вакцинации при адьювантном режиме величина показателя остается без изменений, в терапевтическом режиме (вакцина «Аллоген») отмечено достоверное (р<0,01) увеличение средней величины ИЛ-2. Средний показатель исходного уровня ИЛ-12 достоверно (р<0,01) отличался в 1-й и 2-й от 3-й и 4-й групп.

Таблица 5. Исходный цитокиновый профиль у больных с различным ВДП

Режим лечения

Вакцина, группа

N

Содержание, пг/мл (M±m)

ИЛ-2

ИЛ-12

ИФН-

ИЛ-4

ИЛ-10

Адъювант-ный

«Дендритная»

1-я группа

16

19,69±

3,24*

78,56±

8,04

12,32±

2,97*

3,52±

0,94

6,99±

1,94

«Дендритная»

2-я группа

25

16,79±

2,47*

77,74±

7,84

12,17±

2,27*

5,63±

2,07

9,29±

1,73

Терапев-тический

«Дендритная»

3-я группа

7

12,21±

2,48*

138,16±

26,43

6,51±

2,45*

6,55±

2,76

5,63±

0,71

«Аллоген»

4-я группа

13

24,27±

4,14*

112,25±

9,68

34,43±

5,42

12,45±

2,59*

10,38±

2,86

Здоровые доноры

5-я группа

13

1,13±

0,11*

100,63±

9,8

39,12±

5,94

1,93±

0,62

4,89±

0,5

p

p<0,001

5-1;2;3;4

-

p<0,001

5-1;2;3

p<0,001

5-4

-

На этом фоне в процессе вакцинотерапии уровень ИЛ-12 возрастал достоверно (р<0,01) при адъювантной вакцинации «Дендритной» и терапевтической вакцинации «Аллоген» без достоверных изменений в других группах. Анализируя динамику исследуемого цитокина установлено, что изначально низкий уровень ИФН- в адъювантных группах (р<0,001) в ходе вакцинации не изменился. Изначально низкий уровень ИФН- (р<0,001) терапевтического режима вакцины «Дендритная» остался без динамики. Терапевтический режим вакцины «Аллоген», изначально приближающийся к норме, имел тенденцию к уменьшению. Исходно пациенты всех исследуемых групп имели в 3–4 раза более высокие значения ИЛ-4 по сравнению с группой здоровых доноров, особенно в группах терапевтического режима. Не обнаружено динамики на фоне вакцинотерапии. Изначально отмечена тенденция к повышению уровеня ИЛ-10 без последующей динамики (табл.6).

Таблица 6. Цитокиновый профиль больных меланомой в процессе адъювантного или терапевтического режимов применения вакцин «Дендритная» и «Аллоген

Режим лечения

Вакцина, группа

n

Содержание, пг/мл (M±m)

ИЛ-2

ИЛ-12

ИФН-

ИЛ-4

ИЛ-10

Адъюван-тный

«Дендритная»

1-я группа 

16

22,71±

4,07

82,28±

7,84

13,35±

3,44

2,45±

0,4

6,09±

1,36

«Дендритная»

2-я группа

25

15,56±

2,4

77,37±

8,43

12,04±

2,28

5,08±

1,67

8,77±

2,0

Терапев-тический

«Дендритная»

3-я группа

7

10,91±

3,19

138,02±23,26

6,5±

2,29

4,96±

,86

6,68±

1,67

«Аллоген»

4-я группа

13

32,42±

6,19

173,97±25,5

26,34±

3,48

8,12±1,19

8,04±

1,46

Исходный уровнь S100 в группе адъювантного лечения (n=41) практически не отличался от нормы, а у больных с диссеминированным процессом (n=25) был существенно повышен (табл. 7).

У больных меланомой изначально отмечался достоверно повышенный уровень СD44 (р<0,001), особенно в группах пациентов терапевтического режима. На фоне вакцинации в группах отмечается тенденция к сохранению уровня маркера, или  к увеличению такового (р<0,01) в 4-й группе.

Изначально в подгруппе адъювантного лечения (n=16) с ВДП > 30 мес. уровень S100 при лечении вакциной «Дендритная» приближался к норме. Во 2 подгруппе адъювантного режима (n=25) с ВДП < 10 мес на фоне исходно высокого значения маркера продолжалось его увеличение (табл.7). У больных терапевтических групп среднее значение S100 превышало донорское значение, но достоверно только в группе терапевтического режима вакцины «Аллоген» (р<0,05) и продолжало возрастать в процессе вакцинотерапии (достоверно для 2-й, 3-й и 4-й групп, р<0,001)).

Исходный уровень TGF при показаниях к адъювантному лечению (n=41) практически не отличался нормы, а у больных с диссеминированным процессом (n=20) снижен. При адьювантном лечении вакциной «Дендритная» уровень маркера оставался прежним, а при терапевтическом режиме имел тенденцию к повышению (табл. 7).

Таблица 7. Исходный профиль онкомаркеров у больных с различным ВДП

Режим лечения

Вакцина, группа

n

Содержание, пг/мл (M±m)

S-100 нг/мл

TGF

CD44 нг/мл

VEGF А2

Адъювантный

«Дендритная»

1-я группа 

16

55,93±

3,98

1205,56±

96,91

543,0±

80,96

191,27±

50,2

«Дендритная»

2-я группа

25

97,13±

9,99

1320,72±

126,02

531,64±

52,66

144,83±

27,4

Терапев-тический

«Дендритная»

3-я группа

7

167,71±

54,21

760,93±

159,11

708,0±

115,4

871,74±

370,56

«Аллоген»

4-я группа

13

223,25±

41,6

827,46±

97,82

1184,43±

31,75

123,43±

29,36

Здоровые доноры

5-я группа

13

69,4±

9,84

1218,58±

28,58

347,67±

20,54

74,93±

25,17

р

р<0,05

р<0,001

Исходный уровень CD44 при показаниях к адъювантному лечению (n=41) был в 1,5–1,6 раза выше нормы, а у больных с диссеминированным процессом (n=20) был в 2,0–3,4 раза выше нормы (табл. 7). На фоне вакцинации в группах отмечается тенденция к сохранению уровня маркера, а в терапевтических достоверно к увеличению такового (р<0,01).

Исходный уровень VEGF A2 при показаниях к адъювантному лечению (n=41) был в 2,0–2,5 раза выше нормы, а у больных с диссеминированным процессом (n=20) имелась тенденция к увеличению маркера от 2,0 до 11,8 раз. Таким образом, пациенты с меланомой по сравнению с группой здоровых доноров, имели изначально тенденцию высокого уровня среднего значения VEGF-A2, который на фоне вакцинотерапии имел тенденцию к незначительному понижению (табл. 8).

Таблица 8. Профиль онкомаркеров больных меланомой в процессе адъювантного или терапевтического режимов применения вакцин «Дендритная» и «Аллоген»

Режим лечения

Вакцина, группа

n

Содержание, нг/мл (M±m)

S100 нг/мл

TGF

CD44 нг/мл

VEGF А2

Адъюван-тный

«Дендритная»

1-я группа 

16

63,48±

6,4

1211,45±104,57

500,44±

31,26

180,23±

53,14

«Дендритная»

2-я группа

25

150,07±

16,27

1297,92±71,12

525,21±

51,24

132,91±

1,91

Терапев-тический

«Дендритная»

3-я группа

7

535,04±

224,53

1011,29±148,8

743,57±

120,62

732,58±

354,75

«Аллоген»

4-я группа

13

392,98±

110,89

983,39±121,05

1314,31±

160,2

117,7±

5,62

Стратегия противоопухолевой вакцинотерапии основана на  усилении или включении контроля над распространенным злокачественным процессом путем воздействия различных факторов на иммунную систему организма. Мобилизованные  клеточные и гуморальные иммунные реакции являются тем фактором, который выступает в качестве «инструмента» вакцинации. Неоднозначность результатов применения различных типов существующих в мире вакцин приводит к необходимости усовершенствовать стратегию создания вакцин.

Стратегия создания цельноклеточных вакцин подразумевает под собой ряд задач. Первым стратегическим шагом является получение клеточных линий, адаптированных к росту in vitro из образцов опухолевых (меланома) тканей человека, и их характеристика. В ходе данного исследования была проведена адаптация клеток к росту in vitro, выделенных из образцов опухолевой ткани. Получено 19 охарактеризованных стабильных клеточных линий, при кариологическом исследовании которых выявлены значительные хромосомные аномалии генетического аппарата клеток (до 11 на клетку) и различный набор хромосом (триплоидный, тетраплоидный, околодиплоидный). Клеточные линии были разделеные на три группы (высокодифференцированные, умеренно дифференцированные и низкодифференцированные). Умеренно дифференцированные и низкодифференцированные клеточные линии характеризовались большим объёмом кариологических нарушений и большей экспрессией раково-тестикулярных генов по сравнению с умеренно дифференцированными линиями. Проведенное иммунофенотипирование клеточных линий подтвердило меланомную природу полученных линий: отсутствие лимфоидных (CD3 и CD20) и экспрессия дифференцировочных меланомных маркеров (CD63, MelanA/MART1, HMB45). Исследование экспрессии антигенов гистосовместимости первого и второго класса выявили в одном случае полное их отсутствие на протяжении всех пассажей, а в других случаях – тенденцию к увеличению антигенов гистосовместимости второго класса. Исследование трансплантационного фенотипа (HLA-антигены I класса гистосовместимости) 19 клеточных линий выявило присутствие на клетках различных антигенов HLA. Проведенный анализ раково-тестикулярных антигенов и дифференцировочных генов выявил неоднородную картину, а так же продемонстрировал, что количество экспрессирующихся генов РТА и интенсивность их экспрессии коррелирует со степенью дедифференцировки клеток меланомы в клеточных линиях, полученных из метастазов. Полученные клеточные линии, учитывая их уникальность, хранятся в коллекции клеточных культур Института цитологии РАН в г.Санкт-Петербурге. Патентами на изобретение защищены 15 клеточных линий, из них 5 патентов вошли в 100 лучших изобретений России за 2010 г. На основе двух клеточных линий разработаны две противоопухолевые генно-инженерные вакцины, которые в настоящее время проходят клинические исследования. Знание иммунофенотипического профиля открывает возможность подбирать наиболее комплементарные линии для создания индивидуальных противоопухолевых вакцин из аллогенных клеток.

Дальнейшее совершенствование стратегии создания цельноклеточных противоопухолевых вакцин решало задачу оптимизации объема доклинического и клинического этапов изучения. В исследование вошли вакцины из клеток человека: аутологичные интактная «Дендритная» и модифицированная «Аутологичная/tag-7», аллогенные «Аллоген» и «Мелавак», а также сингенная для мышей «B16/F10-ГМ-КСФ». В результате было показано, что ни одна из вакцин не проявила клинических и морфологических признаков необратимой токсичности. Это послужило основанием для проведения их клинического изучения или третьего стратегического этапа.

Третьим стратегическим этапом является подготовка документации по клиническим исследованиям и их проведение. Анализ результатов клинического изучения проведен в 2 разделах. В первом оценена безопасность вакцин, различающихся антигенной специфичностью, т. е. аутологичных и аллогенных. Оказалось, что все вакцины, в т. ч. генно-инженерные, идентичны по отсутствию проявлений токсичности у пациентов. Таким образом, доклинический прогноз безопасности вакцин полностью оправдался. Вторым разделом этого этапа является иммунологический мониторинг. На фоне вакцинотерапии исследован цитокиновый профиль пациентов. Отмечено, что у пациентов с меланомой изначально имеется как профиль Т-клеточного ответа (Th1) с тенденцией повышенного IL-2 и тенденцией пониженного IFN-, так и гуморального ответа (Th2) более выраженного в у пациентов с наличием опухолевого процесса.

Важным фактом, позволяющем судить о взаимосвязи иммунологических механизмов иммунокоррекции и ингибирования опухолевого процесса под действием вакцины «Аллоген», является положительная динамика активирующих молекул (гранзим В на CD16+ клетках, экспрессия CD25 и ИФН- на CD4+ и CD8+ клетках) на фоне стабилизации у пациентов с прогрессирующим течением заболевания.

Изучение внутрикожной реакции на введение противоопухолевых вакцин показало увеличение количества иммуннокомпетентных клеток (лимфоидных, NK-клеток, дендритных) в участках кожи, незатронутых введением вакцины, что может свидетельствовать об активации иммунной системы организма не только в крови, но и в коже.

Исследование методом ELISpot иммунного ответа у больных меланомой, получающих иммунотерапию дендритноклеточными или генно-модифицированными вакцинами, выявило увеличение числа мононуклеарных клеток периферической крови, синтезирующих ИФН- в ответ на стимуляцию лизатом опухолевых клеток, использовавшихся для вакцинации, примерно у трети больных.

Таким образом, на основе созданной Коллекции клеточных линий меланомы человека, разработаны дендритноклеточная и генно-инженерные противоопухолевые вакцины. Проведенные доклинические и клинические исследования способствуют выработке стратегического направления противоопухолевой вакцинотерапии, тем самым повышая эффективность лечения онкологических больных.

ВЫВОДЫ

  1. Субстратом для производства цельноклеточных  противоопухолевых вакцин явились 19 клеточных линий меланомы, генерированных из метастатических узлов 68 пациентов; данные линии носили генетически обусловленные различия иммунного и онкофенотипа, коррелировавшими со степенью дифференцировки клеток. 
  2. Технология трансфицирования клеточных линий привнесенными новыми генами (tag-7 и ГМ-КСФ), совмещенная  с последующей технологией обработки дендритных клеток опухолевым лизатом (антигенной загрузкой), позволили создать и охарактеризовать по доклиническим  и клиническим показателям 4 цельноклеточные вакцины: 2 аутологичные («Дендритная» и  «Аутологичная/tag-7») и 2 аллогенные («Аллоген» и «Мелавак»).
  3. Разработанные вакцины показали себя безопасными в доклинических исследованиях. Вакцины не проявляют острой, хронической токсичности и туморогенности. В результате 1-й фазы клинического изучения по критериям безопасности и специфической активности для 2-й фазы изучения рекомендованы вакцины в разовых дозах: «Дендритная» 2-5 млн клеток; «Аутологичная/tag7» 10 –  20 млн клеток; «Аллоген» 5 –  40 млн клеток и «Мелавак» 1–  60 млн клеток.
  4. Побочные эффекты вакцинации пациентов с меланомой проявлялись в виде ранних кратковременных и обратимых осложнений: локальной гиперемии (64%), общей гипертермии (26%) .
  5. Исходный статус пациентов с меланомой независимо от распространенности процесса характеризуется достоверно повышенным маркером Т-клеточного ответа (Th1) по ИЛ-2 (р<0,001) и сниженным ИФН- (р<0,001); повышенным онкомаркером CD44 (р<0,001) и сниженным TGF в терапевтических группах (р<0,001) с последующим достоверным повышением ИЛ-12 (р<0,01) во время вакцинации.
  6. Проведение иммунологического мониторинга эффективности вакцин предусматривает контроль экспрессии активационных антигенов, оценку  гранзим содержащих и ИФН- продуцирующих клеток, определение цитокиного профиля и онкомаркеров сыворотки крови, НКТ-клеток.
  7. Стратегия создания цельноклеточных вакцин заключается в осуществлении последовательных действий: 1) получении стабильных перевиваемых клеточных линий; 2) детальной характеристики этих линий по генетическим и иммунологическим параметрам (с целью досконального определения опухолеассоциированных антигенов и аллелей антигенов гистосовместимости); 3) стабильной трансфекции клеток отобранными генами; 4) доклиническому изучению безопасности вакцин; 5) юридической валидации клинических исследований; 6) оценке клинической безопасности; 7) оценке индукции иммунного ответа при вакцинации.

Список работ, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК РФ

  1. Михайлова, И.Н. Клинические испытания аутологичной вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных геном tag-7. / И.Н. Михайлова, Л.В., Демидов, А.Ю Барышников., О.С Бурова., Л.Ф. Морозова, Г.Ю. Харкевич, Т.Н. Палкина., А.А. Козлов., А.А. Вайнсон., З.Г. Кадагидзе., Т.Н. Заботина., А.А. Буркова, М.Б. Дорошенко, С.А. Хатырев, Д.А. Носов, А.М. Гарин., С.А.Тюляндин, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев // Сибирский онкологический журнал. – 2005. – № 1 (13). – С. 23-27.
  2. Михайлова, И.Н. Клеточные линии меланомы – основа для создания противоопухолевых вакцин. / И.Н. Михайлова, М.И. Лукашина, А.Ю. Барышников, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, Т.Н. Палкина, А.А. Козлов, В.А. Голубева, Е.А. Черемушкин, М.Б. Дорошенко, Л.В. Демидов, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. – 2005. – № 7. – С. 37-40.
  3. Михайлова, И.Н. Первая фаза клинических испытаний противоопухолевой геномодифицированой вакцины. Оценка иммунного статуса. / И.Н. Михайлова, К.А. Барышников, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, А.Л. Смирнова, Н.Н. Петенко, И.А. Утяшев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2006. – Т.5, №3. – С. 51-54.
  4. Смирнова, А.В. Исследование роли экспрессии молекул HLA I и II классов в активации лимфоцитов / А.В. Смирнова, М.И. Лукашина, И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов, Е.В. Огородникова, Л.Ю. Арустумян, К.Д. Никитин, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – Т.6., № 1. –С. 8-14.
  5. Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия метастатической меланомы с использованием дендритных клеток: клиническое исследование I/II фазы / И.Н. Михайлова, Н.Н. Петенко, Г.З. Чкадуа, Л.Ю. Вишнякова, Е.В. Огородникова, Е.А. Черемушкин, К.С. Титов, С.А. Хатырев, Т.К. Харатишвили, К.А. Парсункова, М.Д. Алиев, А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов // Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 2 – С. 39-43.
  1. Михайлова, И.Н. Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. / И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, О.С. Бурова, В.А. Голубева, Л.Ф. Морозова, Е.С. Воронина, И.А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, С. Субраманиан, Т.Т. Кондратьева, Е.А. Черемушкин, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, Р.Ш. Бибилашвили // Сибирский онкологический журнал. – 2010. – № 1(37). – С. 29-39.
  2. Михайлова, И.Н. Внутрикожная клеточная реакция на фоне вакцинотерапии меланомы кожи. / И.Н. Михайлова, П.К. Иванов, Н.Н. Петенко, К.А. Барышников, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, Е.А. Черемушкин, С. Субраманиан, Г.З. Чкадуа, А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т.9, № 1. – С. 63-67.
  3. Михайлова, Т.В. Сравнение уровня экспрессии HSP70 на клеточных линиях меланомы. / Т.В. Михайлова, М.А. Барышникова, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т.9, № 1. – С. 43-47.
  4. Михайлова, И.Н. Динамика цитокинов у больных с диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии аллогенными опухолевыми клетками. / И.Н. Михайлова, К.А. Парсункова, И.В. Евсегнеева, Л.Б. Краснова, К.А. Барышников, Е.А. Черемушкин, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, А.В. Караулов, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. –Т.8, № 4. – C. 13-16.
  5. Михайлова, И.Н. Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов в первичной меланоме кожи человека. / И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, Я.В. Вишневская, И.А. Утяшев, В.А. Голубева, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, Е.А. Черемушкин, Т.Т. Кондратьева, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, Р.Ш. Бибилашвили // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. – 2010. –Т.21, № 2. – C. 52-65.
  6. Манина, И.В. Доклинические исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF. / И.В. Манина, Н.М. Перетолчина, Н.С. Сапрыкина, А.М. Козлов, И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – № 3. – С. 14-19.
  7. Манина, И.В. Перспективы применения антагониста Н2-гистаминовых рецепторов (Циметидина) в качестве адъюванта биотерапии для лечения меланомы. / И.В. Манина, Н.М. Перетолчина, Н.С. Сапрыкина, А.М. Козлов, И.Н. Михайлова, К.И. Жорданиа, А.Ю. Барышников // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2010. – № 4. – С. 10-17.
  8. Бармашов, А.Е., Оценка специфического противоопухолевого иммунитета методом ELISpot у больных, получающих вакцину «Мелавак». / А.Е. Бармашов, К.Д. Никитин, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, А.Н. Иншаков, К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. –Т.9, № 3. – С.37-40.
  9. Михайлова, И.Н. Метод ELISpot для оценки иммунного ответа на противоопухолевые вакцины на основе аутологичных дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом / И.Н. Михайлова, К.Д. Никитин, Н.Н. Петенко, И.А. Утяшев, К.А. Парсункова, М.А. Рубцова, Г.З. Чкадуа, К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т.9, №  4. – С. 55-60.
  10. Голубцова, Н.В. Изменение сывороточного содержания растворимых молекул НLA I класса, у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии. / Н.В. Голубцова, И.Н. Михайлова, В.В. Новиков, К.А. Барышников, Н.Б. Преснякова, Е.В. Огородникова, Н.Н. Петенко, К.А. Парсункова, О.С. Бурова, Г.З. Чкадуа, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т.9, № 3. – С. 41-45.
  11. Голубцова, Н.В. Прогностическое значение  сывороточных уровней растворимых молекул HLA I класса и антигена CD8 у больных диссеминированной меланомой. / Н.В. Голубцова, И.Н. Михайлова, В.В. Новиков, К.А. Парсункова И.В. Самойленко Н.Н. Петенко, Е.В. Огородникова В.Н. Тазаев, Е.А. Черемушкин, К.А. Барышников, Е.В. Коржевская, Н.Б. Преснякова, Г.З. Чкадуа, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т.9, №4. – С. 103-106.
  12. Mikhaylova, I.N. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines. / I.N. Mikhaylova, D.A. Kovalevsky, L.F. Morozova, V.A. Golubeva, E.A. Cheremushkin, M.I. Lukashina, E.S. Voronina, O.S. Burova, I.A. Utyashev, S.L. Kiselev, L.V. Demidov, R.Sh. Beabealashvilli, A.Y. Baryshnikov // Melanoma Res. – 2008. – Oct; 18(5):303-13, 11.

Патенты

  1. Патент на изобретение №2287575, РФ. «Клеточная линия mel P, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л..В., Палкина Т.Н., Козлов А.М., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В.; опубл. 20.11. 2006. Бюл. № 32.
  2. Патент на изобретение № 2287578, РФ. «Клеточная линия mel Kor, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л.В., Козлов А.М., Ларин C.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В.; опубл. 20.11. 2006. Бюл. № 32.
  3. Патент № 2287577, РФ. «Клеточная линия mel Il, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л.В., Лукашина М.И., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В.; опубл. 20.11. 2006. Бюл. № 32.
  4. Патент № 2287576, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Ibr, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю. Морозова Л.Ф., Бережной А.Е., Козлов А.М., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В.; опубл. 20.11. 2006. Бюл. № 32.
  5. Патент № 2360963, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Mtp, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 10.07. 2009. Бюл. № 19.
  6. Патент № 2363734, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Si, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 10.08. 2009. Бюл. № 22.
  7. Патент № 2364624, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Сher, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 20.08. 2009. Бюл. № 23.
  8. Патент № 2373280, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Gus, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф; опубл. 20.11. 2009. Бюл. № 32.
  9. Патент № 2373279, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Сh, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 20.11. 2009. Бюл. № 32.
  10. Патент № 2390556, РФ, 27 мая 2010. «Клеточная линия меланомы человека mel Z, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Самойленко И.В.; опубл. 27.05. 2010. Бюл. № 15.
  11. Патент № 2008151673, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Ksen, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Барышников К.А.;  опубл. 20.06. 2010. Бюл. № 17.        
  12. Патент № 2390557, РФ. 27 мая 2010. «Клеточная линия меланомы человека mel Bgf, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Самойленко И.В.;  опубл. 27.05. 2010. Бюл. № 15.
  13. Патент № 2402602, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Raс, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 27.10. 2010. Бюл. № 30.
  14. Патент № 2402603, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Me, используемая для получения противоопухолевых вакцин».  / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Барышников К.А.;  опубл. 27.10. 2010. Бюл. № 30.
  15. Патент № 2402604, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel H, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В. Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 27.10. 2010. Бюл. № 30.

Тезисы конференций, конгрессов и симпозиумов

  1. Михайлова, И.Н. Активная специфическая иммунотерапия меланомы и рака почки вакциной tag7. I фаза клинического изучения. / И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, А.М. Козлов, Л.В. Демидов, Г.Ю. Харкевич, С.А. Тюляндин, А.М. Гарин, Д.А. Носов, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, А.Ю. Барышников, Г.П. Георгиев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 17-20 марта 2002. Российский биотерапевтический журнал. – 2002. – Т.1, № 2. – С. 133.
  2. Михайлова, И.Н. Вакцина tag7. I фаза клинического изучения. / И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, А.М. Козлов, Л.В. Демидов, Г.Ю. Харкевич, С.А. Тюляндин, А.М. Гарин, Д.А. Носов, З.Г. Кадагидзе, А.А. Буркова, Т.Н. Заботина, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, А.Ю. Барышников, Г.П. Георгиев // I Всероссийская научно-практическая конференция «Биотерапия рака». Москва, 18-20 июня – 2002. – № 30. – С. 63-64.        
  3. Mikhaylova, I. Autologous tag7 modified anti-cancer vaccine: preliminary study of Phase. I clinical trial. / I. Mikhaylova, L. Morozova, O. Burova, T. Palkina, A. Kozlov, A. Wainson, Z. Kadagidze, T. Zabotina, S. Khatyrev, K. Jordania, D. Nosov, S. Tulandin, A. Garin, L. Demidov, A. Barishnikov, S. Kiselev, S. Larin, G. Georgiev // European Society of gene therapy. 11th Annual Congress, Edinburg, UK, November 14-17. – 2003. Abstract book. Р. 95.
  4. Бережной, А.Е. Получение стабильной линии клеток меланомы человека, секретирующей ГМ-КСФ. / А.Е. Бережной, С.С. Ларин, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Российский биотерапевтический журнал. – 2005. – №1. – С. 6.
  5. Михайлова, И.Н. Кариологические исследования клеточных линий меланомы кожи человека / И.Н. Михайлова, Е.С. Воронина, Н.М. Дышева, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, Е.А. Черемушкин, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 21-24 марта 2006. Российский биотерапевтический журнал. – 2006. – Т.5, № 1. – С. 5.
  6. Михайлова, И.Н. Клеточные линии меланомы. / И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, Л.Ф. Морозова, В.А. Голубева, Н.Н. Петенко, Е.А. Черемушкин, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев, Р.Ш. Бибилашвили // Материалы V Симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2006. – Т.5, № 4 – С. 15.
  7. Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия диссеминированной меланомы геномодифицированными клетками. / И.Н. Михайлова, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, Л.Ф. Морозова, И.А. Утяшев, Н.Н. Петенко, К.А. Барышников, П.В. Иванов, К.А. Парсункова, Е.А. Черемушкин, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы 15-ой Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» 22-26 мая 2006. Санкт-Петербург. Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». – 2006. – Т.10, № 2. – С.25.
  8. Mikhaylova, I.N. Gene modified tumor cell based vaccine therapy of advanced melanoma. / I.N. Mikhaylova, O.S. Burova, M.I. Lucashina, L.F. Morozova, U.A. Utyashev, N.N. Petenko, K.A. Barishnikov, P.V Ivanov, K.A. Parsunkova, E.A. Cheremushkin, L.V. Demidov, A.U. Barishnikov // 8th International Biological Therapy of Cancer, Dresden. – 2006. – June 21-24.
  9. Огородникова, М.В. Экспрессия маркеров апоптоза на клеточных линиях меланомы. / М.В. Огородникова, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин // Материалы VIII Всероссийского научного Форума с международным участием. Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге. 27-30 сентября – 2004. – С. 368-369.
  10. Mikhaylova, I.N. Autologous dendritic cell based of melanoma. / I.N. Mikhaylova, C.Z. Chkadua, A.A. Borunova, N.N. Petenko, K.A. Parsunkova, N.V. Balatskaya, E.A. Cheremushkin, K.S. Titov, B.K. Krasnova, Z.G. Kadagidze, L.V. Demidov, A.U. Barishnikov // 8-th International Biological Therapy of Cancer – 2006. – June 21-24. – Dresden.
  11. Михайлова, И.Н. Растворимая форма CD44 в сыворотке пациентов с диссеминированной меланомой кожи. Онкология сегодня. Успехи и перспективы. / И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов, Н.Н. Петенко, Г.З. Чкадуа, К.А. Парсункова, Л.Б. Краснова, С.Г. Кузьмин, Г.Н. Ворожцов, А.Ю. Барышников // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Труды КОД МЗ РТ. – Т. 9. – Казань. – 2006. – С. 166-167.
  12. Mikhaylova, I.N. Serum CD44 in advanced melanoma patients. / I.N. Mikhaylova, L.V. Demidov, N.N. Petenko, K.A. Parsunkova, N.V. Balatskaya, L.B. Krasnova, S.G. Kuzmin // 6-th ISREC Conference on Cancer Research. – 2006. – October 11-13. – Lausanne. – Switzerland.
  13. Парсункова, К.А. Динамика уровней ИЛ-2 и ИФН в сыворотке крови при диссеминированной меланоме. / Парсункова К.А., Михайлова И.Н., Краснова Л.Б., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н., Барышников А.Ю.//  Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва 24-26 марта 2007. – Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – С. 61.
  14. Парсункова, К.А. Динамика уровней цитокинов в сыворотке крови при диссеминированной меланоме./ К.А. Парсункова, И.Н. Михайлова, И.В. Евсегнеева, И.А. Гандурина, Л.Б. Краснова, С.Г. Кузьмин, Г.Н. Ворожцов, Н.Н. Петенко, А.Ю.  Барышников // Актуальные вопросы онкологии. Материалы научно-практической конференции с международным участием, 23-24 апреля 2007. – Элиста. – С. 30-31.
  15. Балацкая, Н.В. Состояние антиоксидантной системы у больных меланомой кожи. / Н.В. Балацкая, К.А. Парсункова, Н.А. Гольдина, И.А. Гандурина, Л.Б. Краснова, С.Г. Кузьмин, Г.Н. Ворожцов, Н.Н. Петенко, И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников // Актуальные вопросы онкологии. Материалы научно-практической конференции с международным участием, 23-24 апреля. – 2007. – Элиста. – С. 31-33.
  16. Михайлова, И.Н. Повышение экспрессии активационных маркеров и увеличение содержания лимфоцитов в коже при вакцинотерапии препаратом аллоген. / И.Н. Михайлова, К.А. Барышников, О.С. Бурова, П.К. Иванов // Тезисы IX Международной конференции молодых онкологов. – 2008. – С. 15.
  17. Ковалевский, Д.А. Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов при определении степени дифференцировки клеток меланомы кожи. / И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, В.А. Голубева, Е.С. Воронина, Е.А. Черемушкин, И.А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, Н.Н. Петенко, Т.Т. Кондратьева, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, Р.Ш. Бибилашвили, А.Ю. Барышников // Сборник статей международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". – 2009. – Пущино. – С. 55-58.
  18. Ковалевский, Д.А. Экспрессия раково-тестикулярных генов при определении дифференцировки клеток меланомы кожи. / Д.А. Ковалевский, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, В.А. Голубева, Е.С. Воронина, Е.А. Черемушкин, И.А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, Н.Н. Петенко, Т.Т. Кондратьева, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, Р.Ш. Бибилашвили, А.Ю. Барышников // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва 21-22 апреля 2009. Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – Т.8, № 2. – С. 64.
  19. Парсункова, К.А. Цитокиновый профиль на фоне вакцинотерапии у больных диссеминированной меланомой. / К.А. Парсункова, И.Н. Михайлова, Н.Н. Петенко, Г.З. Чкадуа, А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Опухоли кожи и мягких тканей». – 2009. – 3-4 сентября Санкт-Петербург. – С. 31-34.
  20. Парсункова, К.А. Сравнительный анализ содержания S100, CD44, TGF b2, VEGFA в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой на фоне вакцинотерапии. / К.А. Парсункова, И.Н. Михайлова, И.В. Евсегнеева, Н.Н. Петенко, А.В. Караулов, К.А. Барышников, А.Ю. Барышников, Г.З. Чкадуа, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, Г.Н. Ворожцов // Материалы VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». – 2009. – 10-11 ноября Москва. – С. 178-181.
  21. Манина, И.В. Экспериментальные исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF. / И.В. Манина, Н.С. Сапрыкина, А.М. Козлов, И.Н. Михайлова // Материалы Межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы». 27-30 сентября 2010. Санкт-Петербург Российский аллергологический журнал. – 2010. – №1 (1). – С. 176-177.
  22. Манина, И.В. Изучение применения методов комбинированной терапии меланомы кожи в эксперименте. / И.В. Манина, Н.С. Сапрыкина, Н.М. Перетолчина, И.Н. Михайлова, А.М. Козлов // Материалы XIV Российского онкологического конгресса. Москва 23-25 ноября 2010. – С. 256-257.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.