WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

НИКИТИНА

Людмила Валериевна

ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

РАКА ЖЕЛУДКА

И

ПРЕДШЕСТВУЮЩИХ ПОРАЖЕНИЙ

14.03.09 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2012

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования»  Минзравсоцразвития России

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор медицинских наук, профессор Шабалова Ирина Петровна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Полонская

Наталия Юрьевна

Доктор медицинских наук, ГБУЗ «Городская поликлиника № 117 Департамента здравоохранения г. Москвы», заведующая Централизованной межрайонной многопрофильной КДЛ

Шапиро

Наум Абрамович

Доктор медицинских наук, профессор,  Центральная клиническая больница № 1 ОАО «РЖД», руководитель цитологической лаборатории

Ведущая организация:

ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздравсоцразвития России, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «16» мая 2012 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д 208.071.04 при ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минзравсоцразвития России по адресу: 123995, г. Москва,  ул. Баррикадная, д. 2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО РМАПО Минзравсоцразвития России по адресу 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д.19.

Автореферат разослан «13» апреля  2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Луговская С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

По данным агентства по изучению рака IARC (International Agency for Research on Cancer) рак желудка (РЖ) по заболеваемости среди всей онкологической патологии занимает четвёртое место, а по смертности – второе (GLOBOCAN 2008, Lyon: IARC Press, 2008).

В нашей стране при высоком уровне заболеваемости только 5-10% новообразований желудка диагностируется на ранних стадиях. Удельный вес запущенных форм рака на протяжении многих лет составляет 22-25% без тенденции к снижению (Кашкин С.В, 2002; Тазалов В.А., Коваленко В.Л., 2006; Минздравсоцразвития РФ (Статистические материалы), 2011). Высокий уровень заболеваемости РЖ в России, преобладание случаев заболевания, выявленных в стадии распространенной опухоли, и как следствие неблагоприятные результаты лечения и прогноз определяют важность и необходимость своевременной диагностики РЖ. В связи с этим одним из важнейших направлений онкологической науки и практики является разработка концепции диагностики рака и этапов, предшествующих развитию злокачественных образований. Согласно Международной классификации опухолей желудка (WHO histological>

Гистологическое исследование считают «золотым стандартом» морфологической диагностики, однако и этот метод может давать ложноотрицательные результаты (Валенкевич Л.Н., Яхонтова О.И, 2006; Черняховская Н.Е., Андреев В.Г., Черепянцев Д.П., Поваляев А.В., 2008).

Цитологическое исследование также является полноценным методом морфологической верификации диагноза, но его не всегда включают в стандарт обследования больных с заболеваниями желудка. Возможно, это связано с недостаточной информированностью о возможностях цитологической диагностики врачей, выполняющих эндоскопическое исследование.

Кроме того, существуют определенные ограничения цитологического метода, обусловленные способом получения материала, локализацией патологического очага, особенностями его гистологического строения, а также способностью врача-цитолога интерпретировать клеточный состав цитологического препарата.

Разработка и внедрение новых диагностических технологий позволяет улучшить качество морфологической диагностики (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2005; Шимчук С.Ф., 2005; Шапиро Н.А., Шибанова А.И., Елеубаева Ж.Б., 2011; Волченко Н.Н., Славнова Е.Н., Сухарев С.С., 2011). Большое значение в диагностике рака и предшествующих поражений приобретают молекулярно-биологические исследования, активно изучаются молекулярные маркеры, играющие роль в канцерогенезе (эпидермальный фактор роста, c-met, k-sam, цитокератины,  ki-ras, p53, Bcl-2, COX-2, EPO-R, beta-catenin, E-cadherin, c-erbB-2 (HER-2/neu), CEA) и возможности определения их экспрессии в гистологических препаратах (Slesak B., Harlozinska A., 1998; Limaye A. et al., 2003; Sereno M. et al., 2006). Прогностическая значимость экспрессии онкопротеина c-erbB-2 (Her-2/neu) у пациентов с заболеванием желудка неоднозначна, однако есть  результаты исследований, которые  показали эффективность таргетной терапии при гиперэкспрессии c-erbB-2 (Her-2/neu) (Hohler T. et al., 2010; Bang Y.J. et al., 2010; Albarello L., Pecciarini L., Doglioni C., 2011). Результаты определения CEA – раково-эмбрионального антигена (РЭА) на биоптатах показали их незначительную диагностическую значимость в диагностике рака желудка (Пасечников В.Д., Чуков С.З., Котелевец С.М., 2003).

Данных литературы по применению онкопротеинов c-erbB-2 (Her-2/neu) и CEA (РЭА) на цитологическом материале из слизистой оболочки желудка (СОЖ) в литературе мы не встретили. Возможно, это связано со сложностями выполнения иммуноцитохимических исследований на традиционных цитологических препаратах.

Перспективной технологией, позволяющей расширить возможности использования иммуноцитохимических реакций, является жидкостная цитология (ЖЦ). В силу распределения материала на предметном стекле в виде монослоя снижается количество неполноценных мазков, а также ложноотрицательных результатов цитологического исследования. (Poller D. N., Stelow E. B., Yiangou C., 2008;  Beerman H. et al., 2009).

Использование тонкослойных микропрепаратов для иммуноцитохимических исследований (ИЦХИ) обладает рядом преимуществ перед традиционными мазками. Однако в доступной литературе мы не нашли сведений о ЖЦ на материале гастробиопсий.

Одним из новых направлений в клинической цитологии является метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ позволяет изучить структуру и разнообразные свойства поверхностей с разрешением порядка нескольких нанометров за несколько минут. При использовании АСМ получают трёхмерное изображение клеток и макромолекул на их поверхности. Методом АСМ можно исследовать как рутинные цитологические мазки, так и жидкостные монослойные препараты (Кирпичников М.П.,  2006; Яковлева В.А. с соавт., 2007; Chernoff D.A., 2008).

Другое направление, способное оптимизировать цитологическую диагностику – информационные технологии,  позволяющие правильно решить диагностические задачи, благодаря использованию опыт и базу знаний в определенной области (Никитаев В.Г., Бердникович Е.Ю., 2007; Касоян К.Т., 2005; Джангирова Т.В.,  2005; Toliva J., et al. 2006). Разработка этих направлений в применении к цитологической диагностике заболеваний желудка представляется весьма актуальной.

Цель исследования. Повышение эффективности цитологической диагностики рака желудка и предшествующих поражений на основе внедрения компьютерных программ, применения жидкостной цитологии, молекулярных технологий и атомно-силовой микроскопии.

Задачи исследования

  1. Сопоставление результатов цитологического и гистологического исследований биопсийного материала, анализ причин ошибочно поставленных диагнозов.
  2. Создание базы данных изображений цитологических препаратов при заболеваниях желудка.
  3. Выделение цитологических признаков рака желудка и предшествующих поражений для создания компьютерной интерактивной программы.
  4. Разработка технологических заданий и модулей для создания информационной системы поддержки принятия решений в цитологической диагностике поражений слизистой оболочки желудка.
  5. Оценка диагностической эффективности применения разработанной компьютерной системы с привлечением специалистов с разным опытом работы в цитологии.
  6. Изучение возможностей использования жидкостной цитологии и иммуноцитохимического методов на материале гастробиопсий.
  7. Анализ результатов применения АСМ в дифференциальной диагностике заболеваний желудка.

Научная новизна

  • На основе создания базы изображений и информационных модулей разработана компьютерная программа, обладающая свойствами интерактивного учебного пособия и компьютерного атласа по цитологической диагностике заболеваний желудка.
  • Определена эффективность использования интерактивных программ в диагностике рака желудка и предшествующих поражений.
  • Разработана методика приготовления препаратов методом жидкостной цитологии из материала со слизистой оболочки желудка.
  • Выявлена целесообразность использования молекулярных маркёров на цитологическом материале из биоптата слизистой оболочки желудка. 
  • Установлена эффективность применения атомно-силовой микроскопии на материале гастробиопсий.

Основные положения, выносимые на защиту

  • Совместное применение цитологического и гистологического исследований позволяет оптимизировать цитологическую диагностику поражений СОЖ.
  • Информационная система поддержки принятия решения способна улучшить цитологическую диагностику заболеваний желудка, может применяться для обучения и повышения профессиональных навыков врачей-цитологов.
  • Применение иммуноцитохимического исследования и АСМ даёт дополнительную информацию при доброкачественных и злокачественных поражениях желудка.

Практическая значимость работы

  • Цитологическое исследование мазков-отпечатков с биоптатов СОЖ позволяет получить дополнительную диагностическую информацию и повысить эффективность морфологического исследования при заболеваниях желудка. Эффективность исследования в выявлении рака желудка двумя морфологическими методами (гистологическим и цитологическим) с учетом повторных биопсий значительно повышается, на нашем материале она составила 97,9%.
  • Разработанная интерактивная программа может использоваться как в обучении, так и в самостоятельной работе и диагностике, позволяет повысить эффективность цитологического исследования при заболеваниях желудка.
  • Препараты, приготовленные методом жидкостной цитологии из биоптатов СОЖ, можно применять для ИЦХИ. Установлено значение определения c-erbB-2 (Her-2/neu) и CEACAM6 (РЭА) на материале из слизистой оболочки желудка.
  • Получена возможность дополнительной дифференциально-диагностической информации при применении метода АСМ.

Реализация результатов исследования

Результаты работы включены в материалы лекций, практических и семинарских занятий по  теме «Цитологическая диагностика по материалу гастроскопий» на кафедре ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России (г. Москва), кафедру клинической лабораторной диагностики КГБОУ ДПО ИПКСЗ МЗ Хабаровского края (г. Хабаровск). Результаты исследований внедрены в практику работы ГБУЗ «КДЦ № 2 ДЗМ».

Апробация диссертации

Апробация диссертации проведена на совместной научной конференции кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития, сотрудников ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена», ГКБ им. С.П. Боткина, ГУБЗ «Консультативно-диагностического центра № 2 ДЗМ», ГУ «Онкологического диспансера № 2» города Москвы 02.02.2012 г.

Результаты диссертации доложены на VIII съезде клинических цитологов России (г. Уфа, 2009 г.), Всероссийской конференции «Лабораторные технологии при организации медицинской помощи» (г. Москва, 26-27 мая 2010 г.), научно-практической конференции «Высокие технологии и модернизация в лабораторной медицине» (г. Москва, 29-30 марта 2011 г.), Евразийском форуме по диагностике злокачественных новообразований (г. Киев, 9-10 июня 2011 г.), IX всероссийском съезде клинических цитологов (г. Казань, 19-21 ноября 2011 г.).

Публикации результатов исследования

По материалам диссертации  опубликовано 8 печатных работ, изданных в отечественной (7) и зарубежной (1) печати, из них 1 работа в издании, рекомендуемом ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицы, иллюстрирована 37 рисунками и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиографический указатель содержит 321 источника литературы (143 отечественных и 173 зарубежных публикаций).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали биопсийный материал, полученный при эндоскопическом исследовании от пациентов в КГБУЗ «Краевая клиническая больница № 1» им. профессора С.И. Сергеева, г.Хабаровска, (главный врач С.С. Пудовиков); МУЗ «Центральная районная больница» г. Николаевска-на-Амуре (главный врач Г.С. Абугов), ДВМОЦ ФМБА России, г. Николаевска-на-Амуре, (главный врач Г.Ю. Верёвкин); ГУБЗ «Консультативно-диагностического центра № 2 ДЗМ», г. Москвы, (главный врач Б.М. Прощенский); ГУ «Онкологического диспансера № 2», г. Москвы, (главный врач к.м.н. А.Ю. Федотов).

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России (заведующий, д.м.н., профессор В.В. Долгов) (табл. 1).

Таблица 1

Разделы диссертационной работы

Раздел диссертационной (научной) работы

Число пациентов

Число исследований

Оценка эффективности цитологического исследования материала биопсии в диагностике рака желудка

574

745

Создание системы поддержки принятия решений при цитологической диагностике заболеваний желудка

186

1979

Метод ЖЦ и ИЦХИ

75

171

Метод АСМ в цитологической диагностике поражений желудка

30

900

Всего

865

3795

Атомно-силовую микроскопию проводили на базе ФГУ Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена. Работа по данному разделу выполнена в рамках Госконтракта № 16.513.11.3069 «Разработка научных основ исследования объёмной ультраструктуры клеток средствами АСМ для уточнения диагноза и выработки плана лечения на различных этапах развития рака и других патологических состояний».

Материал биопсии в морфологической диагностике

Для изучения информативности цитологического метода проведен ретроспективный анализ результатов 745 цитологических исследований отпечатков из материала, полученного при биопсии желудка у 574 пациентов. Мазки-отпечатки готовили из всех фрагментов, полученных с помощью щипцовой биопсии при фиброгастродуоденоскопии (ФГДС); после высушивания на воздухе мазки окрашивали по методу Романовского-Гимзы. Цитологические препараты классифицировали как отрицательные, подозрительные, позитивные по наличию рака и неинформативные. Цитологический диагноз сравнивали с результатом гистологического исследования биоптатов.

Материал и методы для создания системы поддержки принятия решений по цитологической диагностике заболеваний желудка

В основу создания компьютерной системы поддержки принятия решений (СППР) положены результаты цитологического и гистологического исследования  материала, полученного при ФГДС с помощью щипцовой биопсии у 186 пациентов. 

Микрофотографии цитологических препаратов получали с помощью программно-аппаратного комплекса, состоящего из компьютера и системы ввода изображений. Для каждого из 186 пациентов с различными поражениями желудка было введено в компьютер от 10 до 28 цитологических изображений при разном увеличении (табл. 2).

Каждое наблюдение отнесено к одному из 20 типов цитологического заключения, использованных в базе данных. Нозологические формы для базы были взяты с учетом существующей гистологической классификации ВОЗ.

Таблица 2

Доброкачественные и злокачественные поражения СОЖ, введенные в базу данных компьютерной информационной системы

Характер патологического процесса

Число наблюдений

Число изображений

Доброкачественные поражения

69

699

Предшествующие поражения

47

429

Злокачественные поражения

70

851

ВСЕГО

186

1979

Иммуноцитохимическое исследование на основе

жидкостной цитологии

Сравнивали качество препаратов, приготовленных традиционным методом и методом ЖЦ, пригодность их для ИЦХИ. Материал для исследования был получен у 75 пациентов с помощью прицельной щипцовой биопсии. С биоптатов делали мазки-отпечатки на стекло для традиционного цитологического исследования.  У 40 больных помимо биоптата брали соскобы щёткой. У 21 пациента материал со щетки наносили на предметное стекло для цитологического исследования (традиционный способ приготовления цитологических препаратов со щетки). У 19 пациентов полученный материал со щётки смывали в стабилизирующий раствор для ЖЦ. У 35 пациентов брали второй биоптат из того же патологического очага и помещали его в стабилизирующий раствор.

Для фиксации, хранения, транспортировки клеточного материала и приготовления монослойных препаратов методом ЖЦ использовали стабилизирующий раствор «CYTO-FAST Solution» фирмы HOSPITEX DIAGNOSTICS. Стабилизирующий раствор разливали в пробирки типа «Ependorff» по 0,8 мл на каждый образец. Монослойные цитологические препараты готовили с помощью цитоцентрифуги Cytospin 4. Клеточный материал в объеме 100 мкл помещали в камеру для образца и центрифугировали 5 минут при скорости вращения ротора 1000 об/мин. Для оценки адекватности полученного материала один монослойный препарат окрашивали по Папаниколау. Критерием отбора монослойных препаратов для проведения иммуноцитохимического исследования было наличие в каждом из них клеток эпителия желудка в достаточном количестве (минимум 100 клеток) и их монослойное расположение. При соответствии препаратов данным критериям на оставшихся неокрашенных стеклах проводили ИЦХИ.

Для ИЦХИ использовали готовые антитела c-erbB-2/HER2, CEACAM6 (РЭА) и систему визуализации Super Sensitive Polymer-HRP фирмы BIO CARE MEDICAL. ИЦХИ были проведены у 35 пациентов по соответствующему протоколу.

Метод атомно-силовой микроскопии в цитологической диагностике поражений желудка

Для АСМ использовали мазки-отпечатки с биоптатов слизистой оболочки желудка у 30 пациентов с различными поражениями желудка (гастрит, аденома и рак желудка), по 10 наблюдений каждой нозологической формы. Мазки окрашивали по методу Романовского-Гимзы.

Изображения для морфометрических исследований вводили в компьютер при помощи исследовательского комплекса «Интегра» производства ЗАО «НТ-МДТ», г. Зеленоград, Россия, состоящего из атомно-силового микроскопа и компьютера с программным обеспечением. Набор параметров для измерения (в нм) включал: высоту цитоплазмы, высоту ядра,  отношение высоты ядра и высоты цитоплазмы,  высоту ядрышка, отношение высоты ядрышка над ядром к высоте ядра.

В каждом наблюдении для получения достоверных статистических данных измеряли не менее 30 клеток СОЖ.

Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с помощью программы «Excel-7.0». Полученные цифровые данные о поверхности клетки при АСМ обрабатывали с помощью программ, входящих в состав программного комплекса Интегра. Различия между сравниваемыми величинами считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка эффективности цитологического исследования материала биопсии в выявления рака желудка

Несовпадение результатов цитологического и гистологического исследования биоптатов отмечено в 24,2% наблюдений, 36% из которых было связано с неинформативным гистологическим материалом (табл. 3). Если гистологическое заключение было положительным или отрицательным  по злокачественному поражению, то в большинстве наблюдений его расценивали как окончательный морфологический диагноз. Если гистологический материал был неинформативным или отрицательным по раку при цитологическом диагнозе РЖ, у части пациентов выполняли  повторные гастроскопии.

Таблица 3

Сопоставление гистологического и цитологического исследований по раку желудка

Гистологическое заключение

Цитологическое заключение

Отрицательное

Положительное

Неинформативный материал

Всего

Отрицательное

327

9

23

359

Положительное

48

108

17

173

Неинформативный материал

26

6

10

42

Всего

401

123

50

574

При повторной гастроскопии, выполненной у 21 из 82 пациентов с неинформативным материалом, у 11 человек диагностирован рак желудка, у 9 дано отрицательное по раку заключение и у одного получен неинформативный материал. Повторное исследование выполнено также у 21 из 48 пациентов с положительными по раку цитологическими заключениями и отрицательными  гистологическими. У 12 из них выявлен рак, у 5 дано отрицательное по раку заключение, у 4 установлен цитологический диагноз рака.

Если гистологический диагноз, установленный при повторных гастробиопсиях, считать окончательным, то чувствительность цитологического исследования в выявлении РЖ при первичном однократном эндоскопическом исследовании составила 92,3%, специфичность – 87,2%, доля ложноположительных цитологических диагнозов – 12,8%, а доля ложноотрицательных – 7,7%, чувствительность гистологического метода  в выявлении РЖ – 78%, доля ложноотрицательных результатов – 4,1%. При сочетании цитологического и гистологического исследования чувствительность повысилась до 92,5%, специфичность до 99,7%, эффективность выявления РЖ составила 97,9%.

Таким образом, цитологическое исследование отпечатков с биоптатов желудка позволяет повысить эффективность в выявлении РЖ. Морфологическое заключение о неинформативном материале или «описательный» ответ гистолога, а также отрицательное по раку гистологическое заключение у больных с цитологическим диагнозом рака, подозрения на рак или дисплазии является показанием к повторному эндоскопическому исследованию с более тщательным выбором участков для биопсий.

Создание системы поддержки принятия решений при цитологической диагностике заболеваний желудка

На основании опыта работы и анализа литературы были выделены критерии изменений в клетках при различных патологических состояниях желудка. С учётом этих критериев разработан словарь морфологических признаков для составления компьютерной программы. Словарь включает 12 признаков опухолей и неопухолевых заболеваний желудка. Признаки отражают характеристику структур по форме и расположению клеток, тип клеток, размер и форму клеток и ядер, наличие или отсутствие атипии, фон препарата, наличие Helicobacter pylori.

На основе разработки технологических заданий и модулей были созданы следующие режимы СППР:

  • Режим редактирования – добавления – удаления случаев заболеваний и изображений к ним.
  • Режим просмотра информации по содержащимся в базе данных случаям заболеваний.
  • Аналитическая система.

С помощью СППР можно осуществлять последовательный просмотр всех изображений из базы данных, поиск изображений по заданным параметрам (морфологическим признакам, нозологическим формам или по их комбинациям), просмотр результатов поиска по заданному набору признаков.

В СППР предусмотрен режим  просмотра изображения с увеличением выбранного участка. Это удобно в случае, когда необходимо детально рассмотреть какой-то участок, объект или клетку (рис. 1).

Рис. 1. Окно просмотра изображения  с увеличением выбранного участка.

Рис. 2. Разметка выбранного признака.

Для решения проблемы распознавания и правильного толкования цитологических признаков нами был разработан графический модуль для нанесения разметки на изображения, поясняющей указанные признаки (рис. 2). При выборе в описании какого-либо клеточного элемента или критерия цитологической диагностики появляется значок, акцентирующий внимание на конкретном признаке изображения. В СППР разработана аналитическая система, которая позволяет производить поиск по всем нозологическим формам.

СППР позволяет рассчитать наличие морфологического признака для одной или нескольких нозологических форм, помогает проанализировать присутствие признака или группы признаков при доброкачественном, злокачественном или пограничном поражениях желудка. Результат выводится в виде таблицы, где частота признака представлена в процентах и отсортирована по убыванию: от самого частого при данной нозологической форме до редкого. В программу заложена функция, которая позволяет провести анализ по всем морфологическим критериям, которые есть в СППР.

В апробации разработанной нами программы участвовали 23 врача с различным стажем работы в клинической цитологии, проходившие обучение на курсах повышения квалификации на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России.

Для оценки эффективности работы компьютерной программы использовали цитологические препараты, изображения которых не присутствовали в базе данных  (10 наблюдений).

Результаты цитологического исследования до и после работы с СППР оценивали в сравнении с экспертными цитологическими заключениями и референтными гистологическими диагнозами. Установлено, что программа способна помочь в установлении верного цитологического заключения (рис. 3).

Рис. 3. Изменение цитологических заключений после работы с СППР: 1 – совпадение с экспертным заключением; 2 – неполное, неточное заключение; 3 – несовпадение с экспертным заключением; 4 – затруднение в постановке диагноза.

До работы с СППР в 108 наблюдениях из 230 результаты совпали с диагнозом эксперта, у 122 отмечено несовпадение результатов. После работы с программой число совпадений диагнозов увеличилось до 177 наблюдений, а число неправильных заключений уменьшилось до 53. До работы с СППР по 33 препаратам врачи затруднялись с постановкой цитологического диагноза, после – заключение было установлено во всех наблюдениях.

Таким образом, после работы с СППР результаты цитологического исследования улучшились на 61,3%, остались без динамики в 33,48% и ухудшение результата цитологической диагностики отмечено в 5,22% (р<0,001). Улучшение результатов исследования было максимальным при кишечной метаплазии и аденокарциноме: на 25,2% и 24,3% соответственно (р<0,0001). У врачей без опыта работы с материалом гастробиопсий или со стажем до 1 года диагностика улучшилась на 61,67%, у более опытных коллег на 45%, отрицательная динамика в цитологических заключениях отмечена в  5,83% и 3,1% соответственно (р<0,001).

Метод жидкостной цитологии и иммуноцитохимическое исследование

Нами было проанализировано качество цитологического материала, полученного с помощью отпечатков с биоптата и взятого эндоскопического щёткой (табл. 4).

Таблица 4

Сравнение качества цитологического материала со слизистой оболочки желудка, полученного различными методами

Метод получения цитологического препарата

Неинформативный материал

Информативный материал

Всего

Традиционный метод - мазок со щётки на предметное стекло

20

1

21

Методы ЖЦ

- смыв со щётки в раствор  «Cytoscreen»

17

2

19

- смыв с биоптата в раствор «Cytoscreen»

21

-

21

- гомогенизация биоптата в растворе «Cytoscreen»

-

35

35

Мазки-отпечатки с биоптата

-

75

75

ВСЕГО

58

113

171

В 37 из 40 наблюдений материал, полученный с помощью щетки, был неинформативным: в цитологических препаратах присутствовали только клетки плоского эпителия обычного строения или с дегенеративными изменениями, кокковая флора, неизмененные эритроциты и единичные клетки покровно-ямочного эпителия. При традиционном приготовлении препаратов (материал со щетки переносили сразу на стекло) неинформативный материал был получен в 20 наблюдениях, при использовании ЖЦ (клеточный материал смывали со щетки в стабилизирующий раствор) – в 17. Цитологические препараты, полученные при помощи эндоскопической щетки и приготовленные как традиционным методом, так и методом ЖЦ, не отвечали искомым требованиям; достоверных различий между эффективностью методов не установлено (р>0,05). Мазки-отпечатки с биоптата оказались более информативными, чем соскобы взятые щеткой независимо от их дальнейшей обработки (р<0,001).

На следующем этапе работы предпринята попытка разработать оптимальный метод использования биоптата из СОЖ для ЖЦ. Было выбрано два возможных способа использования биоптата. У 21 пациента биоптат помещали в стабилизирующий раствор и с поверхности перед погружением в формалин смывали клетки с поверхности биоптата путём перемешивания, затем погружали в формалин для последующего гистологического исследования.  У 35 пациентов биоптат помещали в стабилизирующий раствор и гомогенизировали его путем растирания. Далее из полученной суспензии готовили препараты методом ЖЦ.

При смыве клеточного материала с биоптата в стабилизирующий раствор во всех во всех наблюдениях был получен неинформативный материал. Во всех наблюдениях, в которых выполняли гомогенизацию биоптата, получен полноценный материал. Различие между двумя способами обработки биоптата статистически достоверное (р<0,001).Таким образом, препараты, приготовленные методом ЖЦ после гомогенизации биоптата, оказались наиболее пригодными для ИЦХИ.

В связи с тем, что удовлетворительные монослойные препараты удалось получить только при гомогенизации биоптата 35 пациентов, ИЦХИ проводили только у этих пациентов (рисунок 4, 5, табл. 5).

Рис.4. Аденокарцинома с участками слизистого рака. Мембраная экспрессия c-erbB-2 (Her-2/neu) , х1000.

Рис.5. Тубуловорсинчатая аденома с малигнизацией. Клетки покровно-ямочного эпителия с положительной цитоплазменной реакцией на CEACAM6-ИЦХ, х1000.

Таблица 5

Результаты иммуноцитохимического исследования цитологического материала из биоптата слизистой оболочки желудка

Гистология

Цитология

экспрессия

c-erbB-2 (Her-2/neu)

экспрессия

CEACAM6

Число наблюдений

-

+

++

+++

-

+

++

+++

Доброкачествен. поражения

Доброкачествен. поражения

7

-

2

-

3

2

3

1

9

Предшествующ. поражения

Предшествующие поражения с кишечной метаплазией

7

9

1

-

4

3

8

2

17

Дисплазия, рак

Дисплазия, рак

1

-

7

1

-

-

1

8

9

Всего

15

9

10

1

7

5

12

11

35

- нет экспрессии (отсутствие экспрессии или экспрессия в <5% клеток)

+ слабая экспрессия (экспрессия в 6-25% клеток)

++ умеренная экспрессия (экспрессия 26-75% клеток)

+++ выраженная экспрессия (экспрессия в >75% клеток)

Исходя из полученных нами данных, порогом чувствительности экспрессии c-erbB-2 (Her-2/neu) в диагностике дисплазии и рака желудка можно считать наличие умеренной экспрессии, порогом чувствительности CEACAM6 - выраженной экспрессии.

Следовательно, умеренная и выраженная экспрессия может рассматриваться как маркёр возможной тяжёлой дисплазии, рака или как начальный этап неопластического процесса.

Цитологическая диагностика поражений желудка

методом атомно-силовой микроскопии

Проведены морфометрические измерения характеристик клеток покровно-ямочного эпителия (ПЯЭ) на изображениях цитологических препаратов мазков отпечатков с биоптата слизистой оболочки желудка, полученных методом АСМ в 30 наблюдениях: 10 - доброкачественных поражений желудка (хронический гастрит разной этиологии), (рис. 6), 10 – предшествующей патологии (аденома) (рис. 7) и 10 – злокачественных поражений (аденокарцинома, перстневидноклеточный рак) (рис. 8).

А.

Б.


Рис. 6. Хронический гастрит.  А – АСМ изображение. Б – Изображение с цитологического препарата, структура из клеток покровно-ямочного эпителия с дегенеративными изменениями. Окрашивание по Романовскому-Гимза, х 1000.

А.

Б.

Рис. 7.  Аденома желудка. А - АСМ изображение клеток.

Б – Веерообразная структура из клеток, характерная для аденомы. Окрашивание по Романовскому-Гимза, х 1000.

А.

Б.

Рис. 8. Перстневидноклеточный рак. А - АСМ изображение клетки перстневидноклеточного рака. Б – Клетки рака перстневидной формы. Окрашивание по Романовскому-Гимза, х 1000.

Определён набор значений из 5 морфометрических характеристик для клеток при гастрите, аденоме и раке, даны количественные характеристики (таблица 6).

Таблица 6

Параметры клеток при раке желудка, полипе желудка и гастрите, полученные методом АСМ

Вид клетки

Высота цитоплазмы над подложкой, нм

Высота ядра над подложкой, нм

Соотношение высоты ядра и  цитоплазмы

Высота ядрышка над подложкой

Отношение высоты ядрышка над ядром к высоте ядра над подложкой

Клетки рака желудка

395±12

736±15

2,49±0,07*

1196±22

0,73±0,03

Клетки аденомы

319±8

508±14

1,57±0,01

295±1

0,176±0,003

Клетки при гастрите

243±4

470±5

2,08±0,02*

*- р<0,05

При гастрите в клетках эпителия хорошо определялась сглаженность микрорельефа ядер, контуры ядра и цитоплазмы ровные. В клетках рака отмечали грубый микрорельеф поверхности ядер, ядрышки хорошо просматривались в виде локальных возвышений над поверхностью ядра, ядерно-цитоплазменное соотношение было сдвинуто в сторону ядра, контуры ядра и цитоплазмы неровные. Для клеток рака по сравнению с нормальным эпителием СОЖ характерно статистически значимо увеличение соотношения высоты ядра и цитоплазмы. Данные поазатели могут служить объективным дополнительным критерием верификации раковых и доброкачественных клеток в дифференциальной диагностике поражений СОЖ.

Выводы

  1. Эффективность морфологической диагностики рака и предшествующих поражений желудка при сочетании гистологического и цитологического исследования с учетом повторных биопсий составила  97,9%. Расхождение результатов двух морфологических методов при первичном  обследовании больных выявлено в 24,2% наблюдений. Установлено, что 36% несовпадений связано с неинформативным гистологическим материалом, 4,1% с ложноотрицательным по раку гистологическим заключением.
  2. Разработанная компьютерная система поддержки принятия решений обладает свойствами интерактивного учебно-диагностического пособия и компьютерного атласа по цитологической диагностике заболеваний желудка.
  3. Использование системы поддержки принятия решения позволяет выделять основные морфологические признаки при доброкачественном, злокачественном или пограничных состояниях, рассчитывать вероятность верификации патологического процесса по выбранным признакам, осуществлять поиск изображений по заданным параметрам, правильно интерпретировать признаки или их сочетание.
  4. Установлена эффективность использования системы поддержки принятия решений в цитологической диагностике рака и предшествующих поражений желудка. В 61,3% наблюдений (p<0,001) диагноз изменился на правильный или был уточнен характер патологического процесса; изменение диагноза на неправильный отмечено лишь в 5,22% (р<0,001). Улучшение результатов исследования было максимальным при кишечной метаплазии и аденокарциноме: на 25,2% и 24,3% соответственно (р<0,0001).
  5. Приготовление препаратов для иммуноцитохимического исследования методом жидкостной цитологии после гомогенизации биоптата в стабилизирующем растворе позволяет получить материал с максимальной по сравнению с другими методами диагностической информативностью (p<0,001).
  6. Выявлена высокая информативность определения молекулярных онкомаркёров при иммуноцитохимическом исследовании клеточного биопсийного материала слизистой оболочки желудка: умеренная или выраженная экспрессия  c-erbB-2 (Her-2/neu) при аденокарциноме и тяжелой дисплазии и менее специфичная экспрессия CEACAM6, отмеченная как при раке желудка, так и при выраженной пролиферации эпителия и других предшествующих поражениях.
  7. Метод атомно-силовой микроскопии позволяет получить дополнительную дифференциально-диагностическую морфометрическую информацию. Для клеток рака, по сравнению с нормальным покровно-ямочным эпителием, характерно статистически значимое увеличение соотношения высоты ядра и цитоплазмы (р<0,05).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Информационная система в цитологической диагностике поражений органов пищеварительной системы / И.П. Шабалова, Т.В. Джангирова,  Л.В Никитина, В.Г. Никитаев, Е.Ю. Бердникович, А.Н. Проничев, Н.С. Таврина  // Сборник научных трудов. -  Научная сессия МИФИ-2007. Том-1., С. 273.
  2. Интерактивная информационная система в цитологической диагностике заболеваний желудка, толстой и прямой кишки / И.П. Шабалова, Т.В. Джангирова, К.Т. Касоян, С.Г. Дзуцева, Л.В. Никитина // Новости клинической цитологии. – 2009. - т.13 №3-4. – С. 56.
  3. Interactive computerized systems in cytopathlogy: teaching and practice /  I. Shabalova, V. Dolgov, N. Petrovichev, V. Nekitajev, E. Berdnikovich, A. Pronichev, T. Dzangirova, K. Kasojan,  L. Nikitina, S. Dzutseva // Acta Cytologica. – 2010. -  Vol. 54 - № 3. - P. 527. 
  4. Рак желудка: факторы риска, диагностики рака и предшествующих поражений / Л.В. Никитина // Дальневосточный медицинский журнал.-  2010. - №1.   С. 122-127. 
  5. Жидкостная цитология с использованием молекулярных исследований / И.П. Шабалова, Г.Н. Минкина, Т.В. Джангирова, О.Ю. Шипулина, Е.С. Суховская, Л.В. Никитина, Д.О. Козлов // Евразийский         форум по диагностике злокачественных новообразований: Тезисы докладов. – Киев, 2011. – С. 17
  6. Оценка методов приготовления цитологических препаратов из гастробиопсийного материала / В.И. Зюкина, Н.А. Грановская, А.В. Борисов, Л.В. Никитина // Новости клинической цитологии России: 2011. -  т.15, №1-2.– С .58-59.        
  7. Жидкостная цитология: возможности, ограничения, перспективы /  И.П. Шабалова, К.Т. Касоян, Т.В. Джангирова, Е.В. Суховская, Л.В. Никитина, Д.О. Козлов // Новости клинической цитологии России:, 2011. -.15 №1-2. – С. 76-77.        
  8. Значение цитологического исследования материала биопсии для выявления рака желудка / И.П. Шабалова, Л.В. Никитина // Лаборатория. – 2011. - №4. – С. 6-8.        

Список сокращений

АСМ

атомно-силовая микроскопия

ЖЦ

жидкостная цитология

ПЯЭ

покровно-ямочный эпителий

РЖ

рак желудка

РЭА

раково-эмбриональный антиген

СОЖ

слизистая оболочка желудка

СППР

система поддержки принятия решений

ФГДС

фиброгастродуоденоскопия

IARC

International Agency for Research on Cancer


Подписано в печать: 11.04.2012

Объем: 1,0 усл. п.л.

Тираж: 100 экз. Заказ № 100

Отпечатано в типографии «Реглет»

119526, г. Москва, Страстной бульвар, д. 6, стр. 1

(495) 978-43-34; www.reglet.ru






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.