WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

  На правах рукописи

Зубкова Наталия Васильевна

Биотехнологические аспекты  вирусной безопасности

препаратов иммуноглобулинов:

методология, производство, стандартизация

14.04.01- технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора

фармацевтических наук

Пермь - 2012

Работа выполнена  в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства  здравоохранения и социального развития Российской Федерации  и в филиале ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России в г. Нижний Новгород, «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Казьянин Александр Викторович

Официальные оппоненты:

Сульдин Александр Владимирович, доктор фармацевтических наук, профессор,

ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России, профессор кафедры фармацевтической технологии

Быстрицкий Леонид Дмитриевич, доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, профессор кафедры технологии производства лекарственных средств

Устинова Ольга Юрьевна,  доктор медицинских наук, ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», г. Пермь, заместитель директора по лечебной части 

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «25» ­­­­­декабря 2012 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России  по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России
по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации www.mon.gov.ru «24»сентября 2012 г., на сайте ПГФА www.pfa.ru  «24 » сентября 2012 г.

Автореферат разослан  «____»__________2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент  И.А.Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Плазма крови человека является источником более 100 различных белков и биологически активных соединений, часть которых получают промышленным способом и используют в качестве лечебных препаратов для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний  [WHO, 2007]. Глобальный рынок лекарственных препаратов из плазмы крови доноров за период с 2000 года увеличился в 2 раза и имеет постоянную тенденцию к росту. При этом производство препаратов иммуноглобулинов обеспечивает более 50% данного сегмента рынка и является движущей силой фракционирования плазмы крови в целом [http://marketpublishers.com/report/medicine_pharmaceuticals_biotechnology].

Потребность в препаратах иммуноглобулинов, особенно для внутривенного введения, постоянно растет. В России она удовлетворена только на 515%, а обеспеченность страны препаратами из плазмы крови доноров обычно рассматривается с позиций экономического развития и мобилизационной готовности страны [Селиванов Е.А.,2010]. Поэтому усовершенствование технологии производства отечественных препаратов иммуноглобулинов и более полное удовлетворение в них потребности здравоохранения это государственная проблема национальной безопасности и актуальность ее не вызывает сомнения.

Основным сырьем для получения препаратов иммуноглобулинов является плазма для фракционирования, представляющая собой жидкую часть крови из индивидуальных порций, отделенную от форменных элементов центрифугированием или методом плазмафереза в присутствии антикоагулянта, полученную от здоровых доноров, прошедших процедуру карантинизации, и предназначенную для объединения в производственный пул [European Pharmacopoeia//2008:0853; ФС 42-0091-02].  Являясь уникальной биологической субстанцией – живой тканью человеческого организма,  плазма крови доноров может содержать различные инфекционные агенты, наиболее опасными из которых признаны бактерии и вирусы.  В ходе технологической переработки бактериальное загрязнение легко устраняется, а вирусы, относящиеся к наноструктурам, могут проникать в полупродукты и готовые препараты.

В последние годы ухудшение эпидемической ситуации в отношении основных гемотрансмиссивных вирусов, появление новых инфекционных агентов обострили проблему вирусной безопасности препаратов из плазмы крови доноров [Голосова Т.В., Никитин В.К., 2003; Жибурт Е.Б., 2004; Карякин А.В., 2005; Оприщенко С.А., Захаров В.В., Русанов В.М., 2008]. Случаи инфицирования пациентов вирусом гепатита С (ВГС) после применения препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения привели к активизации исследований, направленных на разработку новых методологических и технологических подходов к повышению вирусной безопасности препаратов [Edwards C., 1987; Horowitz B. et al., 1993; Rabenau H. et. al., 1996; Biesert L., 1996; Uemura Y. et al., 1994; Yap P.L., 1996; Barin F., 2008; Ballow M., 2002; Dichtelmller H., 2009; Burnouf T. et al., 2004, 2007; Grner A., 2008]. В Европе, США и других странах мира под контролем Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) были разработаны и приняты к исполнению национальные директивы в области безопасности гемотрансфузий и производства препаратов из плазмы крови доноров [Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation No. R (95) 15; CPMP/BWP/269/95;  CPMP/BWP/268/95;  WHO Expert Committee on biological standardization, 2007; WHO Technical Report, Series № 924, Annex 4, 2004; DIRECTIVE 2002/98/EC].

В России нормативная база, регламентирующая работу в этой области, несовершенна и противоречива. Несмотря на то, что на технологическую переработку поступает плазма крови доноров, разрешенная для использования в лечебно-профилактических учреждениях, сущестует риск получения инфицированных донаций [Карякин А.В., 2005]. При этом производство лечебных препаратов ориентировано главным образом на метод спиртового фракционирования по Кону, а дополнительные стадии инактивации вирусов не используются или применяются устаревшие технологии. Не разработаны также методы валидации вирусинактивирующих стадий,  а главный упор делается на контроль готовых лекарственных форм, хотя диагностические наборы, предназначенные для этой цели, отсутствуют. 

Комплексные исследования в этой области позволят  повысить безопасность отечественных препаратов иммуноглобулинов, привести их качество в соответствие с рекомендациями ВОЗ и повысить конкурентоспособность на рынке лекарственных средств.

Цель работы – разработка методологической базы и технологических подходов к обеспечению вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов.

Задачи исследования:

  1. Определить закономерности выявления вирусных маркеров в индивидуальных образцах и пулах плазмы крови доноров и разработать научно-обоснованный алгоритм входного контроля вирусной безопасности сырья на предприятиях по фракционированию плазмы крови доноров.
  2. На примере стандартного образца содержания РНК ВГС разработать методологию создания стандартных образцов содержания нуклеиновых кислот (НК)  гемотрансмиссивных вирусов, необходимых для контроля качества генамплификационных методов исследования. 
  3. Создать  современную вирусбезопасную технологию производства иммуноглобулина G (IgG) человека для внутривенного введения.
  4. Разработать методологические основы валидации вирусинактивирующих и вирусэлиминирующих технологий.
  5. Разработать рекомендации по контролю вирусной безопасности готовых лекарственных форм препаратов иммуноглобулинов.

Научная новизна работы. Впервые в РФ применен комплексный подход к проблеме обеспечения вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов, направленный на повышение требований к качеству сырья, разработку современных технологий, валидацию методов вирусной инактивации и усовершенствование  методов контроля готовых препаратов.

Изучено распределение вирусной нагрузки и коэффициентов позитивности (КП) антител у доноров, инфицированных  ВГС и вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Установлено, что  отсутствует корреляция между концентрацией РНК ВГС и активностью антител к ВГС (анти-ВГС), концентрацией РНК ВИЧ и активностью антител к ВИЧ (анти-ВИЧ1,2), а также концентрацией ДНК вируса гепатита В (ВГВ) и поверхностного антигена ВГВ (НВsAg).

Выявлен высокий уровень распространенности парвовируса В19  (В19 V) среди доноров и установлена вероятность контаминации этим вирусом производственных пулов плазмы.

Создана вирусбезопасная технология производства препаратов иммуноглобулина G человека, включающая стадию удаления вирусов с помощью гидроксида алюминия и сольвент-детергентную (СД) обработку с использованием три-n-бутилфосфата (ТБФ) и натрия холата. Оптимизированы условия СД-обработки, разработан оригинальный способ очистки от вирусинактивирующих реагентов. Научная новизна исследований подтверждена патентами на изобретение (RU 2192279 и RU 2352358).

Разработана перспективная технология производства иммуноглобулина G, включающая стадию обработки каприлатом натрия, вирулицидная активность которого подтверждена экспериментально.

Впервые для инактивации вирусов апробированы алкилирующие соединения (карбоплатин, хлорамбуцил). На примере хлорамбуцила продемонстрировано усиление вирулицидного действия при использовании его с реагентами, разрыхляющими оболочку вирусов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана универсальная методика аттестации стандартных образцов содержания НК, основанная на параллельном тестировании Международного стандартного образца (МСО) и исследуемого препарата с последующей статистической обработкой данных методом параллельных линий, реализованным в виде программного модуля в среде Microsoft Excel. Разработан и утвержден отраслевой стандартный образец содержания РНК ВГС (ОСО РНК ВГС) 42-28-366 (1) -11(П).

Разработаны методы определения ТБФ и натрия холата в препаратах иммуноглобулинов и обоснованы предельно допустимые нормы их остаточного содержания.  Технология СД-обработки унифицирована и рекомендована для внедрения в процесс производства нормальных и специфических иммуноглобулинов для внутримышечного и внутривенного введения. 

Разработана методология валидации вирусинактивирующих и вирусэлиминирующих технологий с использованием модельных гемотрансмиссивных вирусов, включающая контаминацию объекта исследования, моделирование технологического процесса и определение уровня вирусной редукции по стадиям производства.

Экспериментально доказана нецелесообразность тестирования иммуноглобулинов на наличие HBsAg по причине иммунной нейтрализации последнего избытком специфических антител. В нормативной документации (НД) на препараты иммуноглобулинов рекомендовано тест на НВsAg заменить на определение антител к поверхностному антигену ВГВ (анти-НВs), при этом обоснована целесообразность повышения минимально допустимого уровня концентрации последних с 0,5 до 5 Международных единиц (МЕ) на 1 г иммуноглобулина.

Для количественного определения анти-НВs разработана оригинальная технология изготовления иммуноферментной тест-системы «МикрАт-НВs» (патент RU 2290642). Для определения антител к ВГС в препаратах иммуноглобулинов разработана иммуноферментная тест-система «ИФА-анти-ВГС».

Внедрение результатов работы. Разработаны и утверждены приказом №59-ОД от 21.07.2011 ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минсоцздравразвития России Методические рекомендации «Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства  препаратов из плазмы крови доноров». Процедура контроля плазмы для фракционирования, включающая тестирование минипулов плазмы методами иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) на маркеры ВГВ, ВГС и ВИЧ, внедрена в практику в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России (акт внедрения от  01.12.2011; акт внедрения от 19.08.2011) и утверждена в регламентах производства на лекарственные средства, получаемые из плазмы крови доноров (ПР № 01898718-10-09; ПР № 01898718-27-08; ПР № 01898718-28-11).

Технология СД-обработки иммуноглобулинов внедрена в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России (акт внедрения от  18.08.2010; акт внедрения от 21.05.2010). Разработана и утверждена в установленном порядке НД на «Имбиоглобулин»  (Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для инфузий, 50 мг/мл/ ЛС-000177). Стадия удаления вирусов с помощью гидроксида алюминия и СД-обработка включены в промышленный регламент производства (ПР № 01898718-28-11).

ОСО РНК ВГС 42-28-366 (1)-11(П) используется в учреждениях практического здравоохранения для оценки качества коммерческих диагностических наборов для выявления и количественного определения РНК ВГС (Акт внедрения «Сургутский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» от 16.11.2011 №2703, Сургут, Тюменской области; акт внедрения Бюджетное учреждение Чувашской Республики «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» от 28.08.2012 №01-10/379, Чебоксары).

Разработаны технические условия, промышленные регламенты и получены регистрационные документы на производство и реализацию следующих диагностических препаратов:

1. Набор реагентов «МикрАт-НВs» Тест-система иммуноферментная для определения антител к поверхностному антигену к вируса гепатита В / ФСР 2009/05914 от 07.07.2009.

2. Набор реагентов «ИФА-анти-ВГС» Тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу гепатита С / ФСР 2009/05264 от 24.03.2009. 

3.  Набор реагентов «СПЕКТР-4» Тест-система иммуноферментная для подтверждения положительных результатов при выявлении антител к вирусу гепатита С / ФСР 2009/05263 от 24.03.2009.

4.  Набор реагентов «ИФА-НВsAg» Тест-система иммуноферментная для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В / ФСР 2000/05265 от 15.03.2010.

Разработанные диагностические наборы используются в практическом здравоохранении.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Входной контроль вирусной безопасности плазмы для фракционирования обеспечивает снижение  риска вирусной контаминации сырья для изготовления лечебных препаратов крови.
  2. Аттестованные стандартные образцы содержания НК гемотрансмиссивных вирусов предназначены для стандартизации генамплификационных методов исследования и ратификации требований к вирусной безопасности плазмы для фракционирования.
  3. Технология производства препаратов иммуноглобулинов, включающая дополнительные стадии инактивации вирусов (обработка сольвент-детергентом или каприлатом натрия), обеспечивает получение безопасных препаратов, соответствующих по физико-химическим и биологическим показателям качества требованиям отечественных НД и Европейской фармакопее.
  4. Валидация технологических стадий инактивации и элиминации вирусов подтверждает адекватность технологических режимов и гарантирует безопасность готовых препаратов.
  5. Состав и биологические свойства иммуноглобулинов определяют специфику контроля готовых лекарственных форм на маркеры гемотрансмиссивных вирусов.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа соответствует основным направлениям научных исследований ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России (номер государственной регистрации темы: 01.9.50.007426) и ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России

Апробация работы. Материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы», С.-Петербург, 2003; на Российской научно-практической конференции с международным участием  «Вирусные гепатиты – проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики», Москва 2005, 2007, 2009; на Всероссийской конференции по вакцинологии «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006, 2008, 2010; на VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика», Москва, 2010; на  Всероссийских научно-практических конференциях в Уфе, 2004, Нижнем Новгороде, 2006, Кирове, 2010; на Международном конгрессе «Биотехнология – состояние и перспективы развития», Москва, 2012.

Личный вклад автора. Все приведенные в диссертации данные были получены под руководством и при личном участии автора на базе Нижегородского  филиала ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России. Исследования по валидации вирусинактивирующих технологий были выполнены на базе ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Н.П.Чумакова» РАМН и ГНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» Россельхозакадемии по программам, разработанным лично автором. Методы определения остаточного содержания трибутилфосфата и натрия холата разработаны при личном участии автора на базе НИИ молекулярной медицины Первого Московского государственного медицинского университета им.И.М.Сеченова.

Публикации. По  теме диссертации опубликовано  54 научные работы, в том числе 12 в изданиях, рекомендованных ВАК,  получено 3 патента РФ, разработаны и утверждены Методические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Работа иллюстрирована 39 таблицами, 29 рисунками. Библиография включает 287 источников, в том числе 71 – отечественный, 216 – зарубежные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач был разработан следующий дизайн исследований (рис. 1).

Рис.1. Дизайн исследований.

Основными объектами исследования были плазма крови доноров, осадки  (фракции плазмы II+III, II, III), полученные методом спиртового фракционирования, и готовые лекарственные препараты из плазмы крови доноров. Объем исследований указан в  табл. 1.

Таблица 1

Объем серологических и молекулярно-генетических исследований на маркеры гемотрансмиссивных вирусов

№ п/п

Наименование материала

Количество

образцов

Исследуемые маркеры

серологические

молекулярно-генетичекие

1

Плазма крови здоровых доноров, всего

81 594

1.1

-  «  -

7 4750

анти-ВГС

РНК ВГС

1.2

-  «  -

2 702

НВsAg, aнти-НВs, анти-НВс

ДНК ВГВ

1.3

-  «  -

1 000

анти-В19

ДНК В19 V

1.4

-  «  -

260

анти-ВГА

-

1.5

-  «  -

1 000

-

РНК ВГА

1.6

-  «  -

250

анти-HLTV1.2

-

1.7

-  «  -

1 632

-

РНК вируса лихорадки Западного Нила (ВЗН)

2

Плазма крови инфицированных доноров:

382

2.1

ВГС

185

анти-ВГС, антиВГС/НСсAg, КП анти-ВГС

РНК ВГС, концентрация РНК ВГС, генотипы ВГС

2.2

ВГВ

125

НВsAg, концен-трация НВsAg, анти-НВс

ДНК ВГВ, концентрация ДНК ВГВ

2.3

ВИЧ

72

анти-ВИЧ1,2,

КП анти-ВИЧ1,2

РНК ВИЧ, концент-рация РНК ВИЧ

3

Минипулы плазмы для фракционирования

(24+4 донации)

40 274

НВsAg, анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2

ДНК ВГВ, РНК ВГС, РНК ВИЧ (n=21 708)

4

Модельные пулы

(24+4 донации):

293

4.1

контаминированные ВГВ

96

НВsAg

ДНК ВГВ

4.2

контаминированные  ВГС

128

анти-ВГС

РНК ВГС

4.3

контаминированные  ВИЧ

69

анти-ВИЧ1,2

РНК ВИЧ

5

Производственные пулы (котловые загрузки)

572

НВsAg, анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2

ДНК ВГВ, РНК ВГС, РНК ВИЧ, РНК ВЗН (n=15)

Референс-материалы. Отраслевые стандартные образцы: ОСО НВsAg 42-28-311-03П; ОСО анти-ВГА 42-28-314-00. Международные стандартные образцы:  2-й Международный стандарт антител к НВsAg (анти-НВs), код 07/164; 3-й Международный стандарт РНК ВГС, код 06/100.

Раствор  иммуноглобулина получали  в Нижегородском филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России из плазмы крови здоровых доноров по промышленному регламенту  на «Имбиоглобулин».  Корректировали рН до 4,57,5 и концентрацию белка, добавляли стабилизатор. Раствор стерилизовали, используя мембранные шприцевые насадки Millex.

Готовые лекарственные формы иммуноглобулина (ФСП4201001316-01; ЛС-000177-171011) получали  в Нижегородском филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России.

Растворы для инактивации. СД-смесь готовили, используя ТБФ, натрия холат (Sigma-Aldrich)  и дистиллированную апирогенную воду (воду для инъекций). Указанные компоненты использовали в таких соотношениях, чтобы получить концентрацию ТБФ и натрия холата в смеси, необходимую для создания вирусинактивирующей дозы в растворе при разбавлении в 10 раз. Аналогично готовили раствор натрия каприлата (200 ммоль). Раствор гидроксида алюминия, содержащий 1,0-1,5 г Al2O3 в100 г суспензии, готовили в соответствии с промышленным регламентом производства.

Вируссодержащие материалы. Для моделирования вирусной контаминации in vitro использовали плазму крови доноров-носителей ВГВ, ВГС и ВИЧ.

Для экспериментального моделирования инфекции вируса гепатита В утят (ВГВУ) in vivo  использовали пул плазмы крови уток, инфицированных  ВГВУ (штамм «Уфа-04»). Титр вируса, выраженный в инфицирующих дозах, вызывающих развитие болезни у 50% зараженных экспериментальных животных (ID50), определяли по методу Рида и Менча [Reed L., Muench H, 1938]. Для опытов использовали концентрацию ВГВУ не менее 5,5 log10 ID50.

Для модельных опытов с возбудителем вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВВД-БС КРС)  использовали цитопатогенный штамм ВК-1.  Концентрация тест-вирусной суспензии составляла не менее 6,5 log10 тканевых цитопатогенных доз для 50% зараженных клеток (ТЦД50/мл).

Методы

Серологические маркеры (НВsAg, антитела к ядерному антигену вируса гепатита В (анти-НВc), ядерный антиген вируса гепатита С (НСсAg), анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2, антитела к вирусу гепатита А (анти-ВГА) в плазме крови выявляли методом ИФА с использованием наборов реагентов производства Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген», ООО «Диагностические системы», (Н.Новгород); ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск); «Био Рад» (Франция). Концентрацию антител к парвовирусу В19 (анти-В19) определяли с использованием количественных наборов «RIDASCREEN  Parvovirus IgG» и «RIDASCREEN  Parvovirus IgМ» (R-Biopharm AG, Германия). Антитела к антигенам Т-лифотропного вируса 1 и 2 типов  (анти-HTLV1,2) определяли с использованием диагностических наборов «ИммуноКомб II HLTV I&II» (ЗАО «Биоград», С.-Петербург). Концентрацию  НВsAg определяли в серии кратных разведений с использованием соответствующих референс-материалов с помощью метода параллельных линий в программе Microsoft Excel.

Активность антител (анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2) в положительных образцах определяли по КП, как отношение значения оптической плотности образца (ОПобр.) к критическому значению оптической плотности (ОПкрит).  Для проб, имеющих значение ОП более 2,0, готовили серию 10-кратных разведений,  определяя  КП с учетом фактора разведения.

Молекулярно-генетические маркеры вирусов  (РНК ВГС, ДНК ВГВ, РНК ВИЧ, ДНК В19 V) выявляли в ПЦР с использованием диагностических наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва), ЗАО «Вектор Бест» (Новосибирск), ООО «ДНК-технологии" (Москва).

Физико-химические свойства. Повреждения структуры IgG оценивали по изменению молекулярного состава, определяемого методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Белковый состав изучали методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ) с использованием  диагностического набора «Поли-ИЭФ» (Филиал ФГУП «НПО «Микроген», Нижний Новгород).

Содержание иммуноглобулинов класса А (IgA) и класса М (IgM) определяли с использованием диагностических наборов производства «Seramun Diagnostica GmbH» (Германия) и в реакции иммунодиффузии по Манчини.

Содержание подклассов IgG определяли методом ИФА с использованием диагностических наборов «Подклассы-IgG-ИФА-Бест» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).

Осмомолярность раствора иммуноглобулина определяли криоскопическим методом с использованием осмометра МТ-4 (НПП «Буревестник», С.-Петербург). Определение проводили по ГФ ХII, ч.1, с.78.)

Биологические свойства. Изменения функциональной активности IgG в области Fc-фрагментов оценивали по изменению  антикомплементарной активности [МУ 3.3.2.1063-01],  в области Fab-фрагментов по активности специфических антител. Содержание  противокоревых антител  определяли в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитарным диагностикумом (НИИЭМ им.Л.Пастера, С.-Петербург). Содержание  антиальфастафилолизина определяли в реакции нейтрализации с использованием токсина стафилококкового (ГУ НИИЭМ им. Н.И.Гамалеи, Москва) [ФСП  42-0504-4266-04].  Содержание анти-НВs определяли методом ИФА с коммерческими диагностикумами «MONOLISA ANTI HBS»  (БиоРад, Франция) и «МикрАт-НВs» (филиал ФГУП «НПО «Микроген», Нижний Новгород).

Остаточное содержание ТБФ и натрия холата определяли методом газовой хроматографии на газовом хроматографе Agilent Technologies 6890N с использованием капиллярной  колонки НР-5, 0,32, 0,25 мкм, 30 м. Разработка методов определения выполнена совместно со специалистами НИИ молекулярной медицины Первого Московского государственного медицинского университета им.И.М.Сеченова.

Модельное фракционирование осуществляли по модифицированному методу КонаОнклея в лабораторных условиях с использованием центрифуги «Optima L-90K» («Beckman Coulter», США). Полная технологическая схема производства препаратов иммуноглобулинов представлена на рис.2. 

 

Рис. 2. Технологическая схема получения IgG человека для внутривенного введения (1,2,3,4,5,6,7,8,9 точки отбора проб).

Моделирование технологического процесса. В растворы иммуноглобулина добавляли вируссодержащий материал в соотношении 1/101/20. Затем опытные пробы обрабатывали с целью удаления или инактивации вирусов, задавая параметры процесса: концентрацию белка, наличие или отсутствие стабилизатора, рН, температуру, продолжительность процесса. Затем отбирали пробы и тестировали на остаточную инфекционность. 

Для выполнения опытов  использовали оборудование и материалы, позволяющие максимально приблизить изучаемый процесс к условиям производства. Отрицательный (К-)  и положительный  (К+) контроли обрабатывали аналогично, но К- без добавления вируса, а К+ без добавления вирусинактивирующих агентов.

Уровень вирусной редукции оценивали по динамике изменения концентрации вирусов на стадиях технологического процесса. Для расчета использовали специальную шкалу логарифмического уменьшения вирусной нагрузки в начале и конце процесса [http//www.emea.europa.eu]:

R = log10

(V1 Т1)

(V2 Т2)

,
где R – фактор редукции; V1 – объем исходного материала, мл; V2 – объем материала после обработки, мл; Т1 – концентрация (титр) вируса в исходном материале; Т2 – концентрация (титр) вируса в материале после обработки.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel и STATISTICA 6.0. Описание количественных признаков по выборке проводилось с помощью среднего значения и его 95% доверительного интервала (confidence interval, CI). Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовали непараметрический критерий МаннаУитни. Статистически значимыми считались различия при р<0,05.  Для оценки корреляции между показателями в образцах плазмы рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs) [Гланц С., 1998].





Результаты исследований и их обсуждение

Распространенность и закономерности распределения маркеров ВГС, ВИЧ и ВГВ  у доноров

Исследование распространенности гемотрансмиссивных вирусов в популяции доноров, изучение закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров у инфицированных лиц необходимы для разработки обоснованного с научной и экономической точки зрения методологического подхода к организации контроля вирусной безопасности плазмы крови доноров, как объекта для трансфузий, так и сырья для получения лечебных препаратов.

Гетерогенность популяции ВГС, а также разнообразная конструкция диагностических наборов, для изготовления которых используют как рекомбинантные белки, так и синтетические пептиды, часто приводят к противоречивым результатам при скрининге донорской плазмы. В связи с этим проведено комплексное исследование образцов плазмы крови методами ИФА и ПЦР с использованием тест-систем разных производителей и исследована корреляция между активностью анти-ВГС, генотипами вируса и концентрацией РНК ВГС у доноров-вирусоносителей.

Всего исследовано 74 750 образцов донорской плазмы. Выявлено 185 донаций, содержащих маркеры ВГС. Дополнительное  исследование этих образцов с использованием иммуноферментных тест-систем трех производителей, включая набор «Монолиза ВГС Аг-Aт Ультра» для одновременного выявления НСсAg и анти-ВГС, показало, что 158 образцов (85,4% от количества инфицированных)  были положительными  во всех тестах, при этом в 128 образцах РНК ВГС выявлена, в 30 – не выявлена. В 26 образцах (14,1% от количества инфицированных)  обнаружены дискордантные  (несовпадающие у разных производителей иммуноферментных тест-систем) результаты. Характерно, что в этих образцах были выявлены низкие КП антител (менее 3), а в 2 образцах была обнаружена РНК ВГС в концентрации  1,0 х103  и 2,1х107. Наконец, была выявлена одна серонегативная плазма (0,5%), отрицательная при исследовании с использованием всех тест-системам, но имеющая  концентрацию вирусного генома 2,3х107 МЕ/мл. Это свидетельствовало, что плазма была получена от донора, находящегося в периоде «серологического окна».  Несмотря на высокую концентрацию РНК, что должно сопровождаться наличием в плазме  HCcAg, результат исследования этого образца  с помощью тест-системы «Монолиза ВГС Аг-Aт Ультра», предназначенной для одновременного выявления антител и антигена, также был отрицательным.

Концентрация РНК ВГС в положительных образцах колебалась от 5х102 до 7,5х107 МЕ/мл. Распределение концентраций РНК ВГС по частоте встречаемости, в том числе по двум основным генотипам, представлено на рис. 3,а.

В РНК ВГС-позитивных образцах активность специфических антител находилась в  диапазоне  от 2 до 19 235 КП и была достоверно выше, чем в РНК ВГС- негативных донациях, активность антител у которых находилась в пределах от 1 до 5078 КП  (р0,001). Выявлено также статистически значимое различие (р0,001) активности  антител у доноров, инфицированных  генотипом 1в  (12 КП 19355) по сравнению с таковой у доноров, инфицированных генотипом 3а (2 КП 8655). При этом между активностью анти-ВГС и концентрацией  вирусного генома в РНК ВГС-позитивных донациях корреляции не выявлено (рис. 3,б). 

а распределение концентраций РНК ВГС доноров-вирусоносителей по частоте встречаемости (n=128)

б связь между концентрацией РНК ВГС и КП анти-ВГС (n=128)

Рис. 3. Особенности распределения маркеров ВГС у инфицированных доноров.

Полученные данные подтверждают, что  для реципиентов плазмы и ее препаратов серьезную опасность представляют сероконверсионные донации и образцы с низкой активностью анти-ВГС, которые при обследовании доноров могут давать ложноотрицательные результаты.  Такая плазма может поступать в лечебные учреждения и на предприятия фракционирования как соответствующая требованиям безопасности. По результатам наших исследований частота выявления донаций, полученных в период «серологического окна», составляет 1 случай на 74 750 исследованных единиц плазмы. Частота встречаемости образцов  с низким уровнем  КП анти-ВГС, которые часто определяются как серонегативные, составляет 0,035% от общего числа обследованных доноров, при этом в 1 случае из 37375 такая плазма содержит РНК ВГС.

С целью изучения закономерностей выявления маркеров ВИЧ у доноров нами было исследовано 72 образца плазмы крови, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц. Показано, что 95,8% анти-ВИЧ-позитивных образцов содержали РНК ВИЧ, при этом  в 4 образцах (5,6% от общего количества исследованных образцов) концентрация РНК ВИЧ составляла менее 1000 копий/мл, в 5 образцах (6,9%) образцах – от 1000 до 5000 копий/мл, в 5 (6,9%) образцах – от 5000 до 10000 копий/мл и в 55 (76,4%) образцах – более 10000 копий/мл (1 копия ~1,75 МЕ). Корреляции между активностью анти-ВИЧ1,2 и концентрацией РНК ВИЧ не выявлено.

Следует отметить, что активность специфических антител у ВИЧ-инфицированных была достоверно выше, чем у ВГС-инфицированных доноров (р0,001): 409 КПанти-ВИЧ1,2 943 750  и 2 КПанти-ВГС 19235. Однако из-за отсутствия количественных стандартов  показатель КП анти-ВИЧ1,2 и анти-ВГС, представленный в наших исследованиях, относителен и складывается главным образом из уровня иммунного ответа, специфической активности диагностических наборов, а также способности эффективно выявлять вирусный маркер при разбавлении («dilution sensitivity»), что особенно важно при контроле плазмы для фракционирования [EMEA Workshop on the Plasma Master File//CPMP/BWP/1737/02].

На следующем этапе работы были изучены особенности распределения маркеров ВГВ у доноров: анти-НВc, анти-НВs, НВsAg и ДНК ВГВ, а также корреляция между концентрацией ДНК ВГВ и НВsAg у доноров-вирусоносителей. Для этого исследовали 2702 образца плазмы крови здоровых доноров и 125 образцов, отбракованных на станциях переливания крови по НВsAg и анти-НВс.

В первой группе выявлено 92 (3,4%) образца, содержащих анти-НВс, но не содержащих анти-НВs. При исследовании этих же  образцов методом ПЦР, в том числе с дополнительным ультрацентрифугированием, обеспечивающим предел обнаружения ДНК ВГВ на уровне 50 копий/мл (1,7 копий ~ 1 МЕ), вирусный геном не был выявлен.

Результаты исследований на НВsAg, анти-НВс, ДНК ВГВ  образцов второй группы разделили на несколько категорий. Для удобства статистической обработки концентрацию НВsAg и ДНК ВГВ представили в логарифмическом масштабе (табл.2).

Таблица 2

Распределение серологических и молекулярно-генетических маркеров ВГВ у инфицированных доноров (n=125)

№ п/п

Категория

n

Концентрация

НВsAg

(log10 нг/мл)

Концентрация ДНК ВГВ (log10 копий/мл)

Анти-НВс (+), n

Aнти-НВс

(-), n

М+m

диапазон

М+m

диапазон

1

НВsAg (-)

ДНК ВГВ (-)

16

-

-

-

-

10

6

2

НВsAg (+)

ДНК ВГВ (-)

13

0,75+1,26

От -1,04 до 4,13

-

-

11

2

3

НВsAg (+)

ДНК ВГВ (+/-)

12

1,83+0,89

От -1,70 до 3,75

-

Предел детекции

12

0

4

НВsAg (+)

ДНК ВГВ (+)

24

2,97+0,42

От 0,64 до 4,45

-

Предел детекции

24

0

5

НВsAg (+)

ДНК ВГВ (++)

60

3,59+0,20

От 1,39 до 5,04

3,89+0,19

От 2,47 до 8,44

60

0

Примечание. НВsAg (+) –результат положительный (предел детекции 0,05 нг/мл);

ДНК ВГВ (+/-) – результат положительный только при дополнительном концентрировании НК (предел детекции 50 копий/мл или 1,7 log10 копий/мл);

ДНК ВГВ (+) – результат положительный в качественном тесте (предел детекции 100 копий/мл или 2,0 log10 копий/мл);

ДНК ВГВ (++) - результат положительный в количественном тесте (предел детекции  более 300 копий/мл (2,5 log10 копий/мл).

Установлено, что в 36 из 96 ДНК ВГВ-позитивных образцов уровень вирусной нагрузки низкий, при этом концентрация НВsAg в этих образцах составляла от 4,3 нг/мл до 30 мкг/мл. Особенности распределения НВsAg и ДНК ВГВ у доноров-носителей представлены на рис.4,a и 4,б.

а связь между концентрацией НВsAg и ДНК ВГВ (n=96)

б распределение вирусной нагрузки у доноров-вирусоносителей (n=60)

Рис.4. Графическая иллюстрация особенностей распределения маркеров ВГВ у инфицированных доноров

Результаты генамплификационного тестирования НВsAg-позитивных образцов показали, что в образцах с низкой концентрацией антигена, составляющей менее 100 нг/мл (n=19), при стандартной процедуре тестирования ДНК ВГВ была выявлена только в 6 (31,5%) случаях, из них в 2  с концентрацией около  1000 копий/мл. При дополнительном концентрировании НК (31 000 g, 2 ч)  эффективность выявления ДНК ВГВ в образцах этой группы составила  57,9 %. В образцах с высокой  концентраций НВsAg, составляющей более 100 000 нг/мл (n=2), концентрация  ДНК ВГВ  не превышала 5000 копий/мл.

Таким образом, относительно высокая эффективность выявления НВsAg и низкая – ДНК ВГВ у инфицированных доноров свидетельствует о недостаточной чувствительности стандартной процедуры исследования методом ПЦР, особенно если тест выполняется в формате минипулов. Такой скрининг может быть направлен только на выявление классических форм острого гепатита В в период «серологического окна» или ранней сероконверсии, когда нарастание концентрации НВsAg и ДНК ВГВ происходит в линейной прогрессии. Эту особенность важно учитывать не только при контроле плазмы для фракционирования, но и при обследовании доноров на ДНК ВГВ, которое также осуществляется в формате минипулов.

Выявление маркеров «неактуальных» гемотрансмиссивных вирусов в плазме крови доноров

Вирусы без липидной оболочки, к которым относятся вирус гепатита А (ВГА) (семейство Picornaviridae) и парвовирус В19 (семейство Parvoviridae) – предмет особой обеспокоенности производителей препаратов крови. Эти вирусы  чрезвычайно устойчивы к химическим и физическим факторам инактивации [CPMP/BWP/295/95, WHO Technical Report, 2004]. Требует также внимания изучение распространенности на территории РФ некоторых экзотических вирусов, включая Т-лимфотропный вирус 1-го и 2-го типов (семейство Retroviridae) и вирус лихорадки Западного Нила (семейство Flaviviridae). Учитывая, что обследование доноров на эти вирусы не является обязательным,  уровень вирусной нагрузки в производственных пулах  может зависеть только от распространенности их  в популяции доноров, а риск заражения от  степени патогенности и устойчивости к вирусинактивирующим и вирусэлиминирующим процедурам.

Распространенность маркеров этих вирусов в популяции доноров Приволжского федерального округа представлена в табл. 3. Показано, что парвовирус В19 является наиболее распространенным контаминантом плазмы для фракционирования: виремия обнаружена в 1 % донаций, из них в 0,3% концентрация вирусного генома превышала установленный для доноров уровень инфекционности, равный 1,0х104 ГЭ/мл [www.fda.gov]. Наличие вируснейтрализующих антител класса  IgG во всех  ДНК - позитивных образцах, безусловно, является положительным фактором.  Средний уровень анти-В19 в ДНК-позитивных донациях составил 107,3 МЕ/мл (CI 95% 55,7158,9 МЕ/мл), и был достоверно выше, чем в ДНК-негативных образцах, а именно 27,5 МЕ/мл (CI 95% 19,635,4 МЕ/мл). 

Таблица 3

Распространенность маркеров «неактуальных» гемотрансмиссивных вирусов у доноров

Вирус

Характеристика

вируса (диаметр, оболочка, структура НК)

Исследуемый маркер

Частота выявлния у доноров, %

Диапазон концентраций

ВГА

Диаметр 2830 нм, без оболочки, ssRNA

Анти-ВГА

61,0

0,025 – 60,0 МЕ/мл

РНК ВГА

0,0

-

В19 V

Диаметр 1826 нм, без оболочки,

ssDNA

АнтиВ19/IgG

30,4

19,6-158,9 МЕ/мл

АнтиВ19/IgM

0,1

-

ДНК В19 V

1,0

103 – 106 ГЭ/мл

Т-лимфо-тропный вирус 1,2

Диаметр 5090 нм, липидная оболочка, диплоид, 2ssRNA

Анти-HTLV1.2

0,5

-

ВЗН

Диаметр 4050нм, липидная оболочка, ssRNA

РНК ВЗН

Не выявлен

-

Однако при пулировании плазмы происходит изменение соотношений уровня антител и концентрации вирусного генома. Поэтому вирусная безопасность плазмы для фракционирования в отношении парвовируса В19 – это актуальная проблема, которую производителям препаратов крови необходимо будет решить в ближайшее время.  Следует также обратить внимание на выявление у доноров антител к Т-лимфотропному вирусу 1-го и 2-го типов. В Службе крови должна присутствовать настороженность в отношении этой инфекции, а производители препаратов крови должны оценивать уровень безопасности лечебных препаратов с учетом полученных данных.

Относительно ВГА результаты наших исследований показали, что у доноров обнаружен высокий уровень иммунитета против этого вируса. Анти-ВГА выше защитного уровня были выявлены у 61% обследованных доноров в диапазоне концентраций от 25 мМе/мл до 60 МЕ/мл. У 28% лиц уровень антител не превышал 10 МЕ/мл, в 25 % он составлял 1120 МЕ/мл, в 23% 2130 МЕ/мл, в 13% 3140 МЕ/мл, в 11% 4160 МЕ/мл. Несмотря на то, что Приволжский федеральный округ не является благополучным по гепатиту А, вирусоносителей мы не выявили, в том числе и среди доноров с высоким титром антител.

Методологические подходы к повышению вирусной безопасности  плазмы для фракционирования

Первый этап безопасности плазмы для фракционирования обеспечивается при заготовке ее от доноров и включает отбор доноров, карантинизацию и исследование на маркеры вирусных инфекций в учреждениях Службы крови.  Обязательными тестами при заготовке плазмы крови от  доноров являются определение НВsAg, антител к ВГС, антител и антигена р24 к ВИЧ [ГОСТ Р 52249-2009]. 

Обследование доноров на РНК ВГС, РНК ВИЧ и ДНК ВГВ методом ПЦР, несмотря на утверждение приказа Минздравсоцразвития №261 от 6.06.2008, внедрено не повсеместно по причине отсутствия необходимого оборудования и относительно высокой стоимости  анализов. Как следствие, часть плазмы крови доноров, разрешенной к применению в РФ,  не исследовано методом ПЦР. Недостаточно эффективно также контролируется качество исследований методом ИФА. Это повышает риск поступления на переработку донаций, полученных в период «серологического окна», а также с ложноотрицательными результатами серологических тестов.

Поэтому организация производственного процесса, предполагающего пулирование плазмы от большого числа доноров,  требует разработки специальных методологических подходов к организации контроля вирусной безопасности плазмы для фракционирования. Наиболее распространенным является алгоритм контроля,  когда методом ИФА исследуют индивидуальные донации, а методом ПЦР минипулы плазмы. Однако такая форма контроля трудоемка и экономически не обоснована. Оптимальным для контроля сырья на предприятиях является тестирование минипулов плазмы методами ИФА и ПЦР.

Размер минипула, подлежащий входному контролю, обычно определяют производители, исходя из технологических особенностей производства. Однако  пулирование может снижать эффективность выявления вирусных маркеров в пулах плазмы. Поэтому в модельных опытах было изучено влияние размера минипула и чувствительности используемых диагностических наборов на эффективность выявления инфицированных образцов. Исследования выполнены для минипулов 24+4 донации. Для формирования модельных пулов было использовано 293 образца, положительных по ВГВ, ВГС или ВИЧ, имеющих случайное распределение серологических и молекулярно-генетических маркеров: 128 образцов с КПанти-ВГС от 2 до 19 235 и концентрацией РНК ВГС от 5 102 до 7,5 107 МЕ/мл; 69  образцов с КПанти-ВИЧ1,2 от 751 до 943 750 и концентрацией РНК ВИЧ от 5,7 102 до 4 107 копий/мл; 96 образцов с концентрацией НВsAg от 4,4 нг/мл до 110 мкг/мл и ДНК ВГВ  от 50 копий/мл до 2,8 108 копий/мл.

Модельные минипулы готовили в лабораторных условиях путем смешивания в равных объемах 1927 отрицательных образцов и  1 образца, положительного по ВГВ, ВГС или ВИЧ. Модельные пулы исследовали методами ИФА и ПЦР.

Эффективность выявления соответствующих маркеров оценивали как долю положительных результатов от общего количества исследованных  пулов. Результаты  представлены в табл. 4.

Таблица 4

Эффективность выявления маркеров ВГВ, ВГС и ВИЧ

в модельных минипулах плазмы

Вирусные маркеры

Количество модель-ных пулов

Результат исследования методами

ИФА

ПЦР в режиме реального времени

аналитическая чувствительность

эффектив-

ность вы-явления, %

аналитичес-кая чувстви-тельность

эффектив-

ность выявления, %

Анти-ВГС/

РНК ВГС

128

100% на контрольной панели

91,4

150200 МЕ/мл

96,4

-  «  -

-  «  -

-

-

100 МЕ/мл

98,3

-  «  -

-  «  -

-

-

10 МЕ/мл*

100,0

Анти-ВИЧ1,2/

РНК ВИЧ

69

100% на контрольной панели

100,0

200 МЕ/мл

93,4

-  «  -

-  «  -

-

-

20 МЕ/мл*

99,2

НВsAg/

ДНК ВГВ

96

0,05 нг/мл

93,8

100 копий/мл

60,4

-  «  -

-  «  -

-

-

15 копий/мл*

84,9

* Дополнительное концентрирование НК

Показано, что исследование минипулов методом ИФА на анти-ВИЧ1,2 позволяло эффективно выявлять инфицированные донации. При исследовании минипулов, контаминированных  анти-ВГС-позитивными образцами, эффективность обнаружения антител в них  составила 91,4%, при этом в модельных пулах, контаминированных положительными образцами с низкими КП  (КПанти-ВГС< 24), только 14,221,4%. Полученные результаты были закономерными и связаны с различиями в характере распределения КП антител при гепатите С и ВИЧ-инфекции.

При исследовании модельных пулов, контаминированных ВГВ-позитивными образцами, в 6 из 96 исследованных проб НВsAg не был выявлен, при этом исходная концентрация антигена в образцах, используемых для контаминации,  варьировала  от 4,4 до 57 нг/мл. Учитывая полученные данные, мы предположили, что, кроме фактора разбавления, причиной снижения эффективности выявления НВsAg в пулах плазмы было присутствие анти-НВs, которые нейтрализовали НВsAg, исключая его из реакционной смеси.

Эффективность выявления вирусного генома в пулах плазмы методом ПЦР нами была оценена для разных уровней аналитической чувствительности метода. Выявлена зависимость между эффективностью скрининга, чувствительностью диагностических наборов и размером минипула.

Полученные данные были использованы для определения остаточного риска контаминации производственных пулов плазмы. Расчеты выполнены с учетом следующих факторов: 1) особенностей распределения вирусных маркеров у инфицированных доноров;  2) вероятности поступления на предприятие серопозитивных вируссодержащих образцов; 3) вероятности получения донаций в период «серологического окна» (по данным собственных исследований и данным литературы [Stramer S.L. et al., 2011; Offergeld R, 2005]); 4) аналитической чувствительности используемых тестов. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Остаточный риск контаминации производственных пулов  (1000 донаций) ВГВ, ВГС и ВИЧ

Вирус

Вероятность поступления инфицированных донаций*, 1/n

Частота контаминации производственных пулов (1/n1) в случае, если

входной контроль не проводить

входной контроль в формате минипулов 24+4 донации

ИФА

ИФА/ПЦР

ВГВ

1/29 916

1/39

1/242

1/3031/709

ВГС

1/11 987

1/19

1/47

1/1656 и менее

ВИЧ

1/1 000 000 и менее

1/597

1/2308

1/4616 и менее

* С учетом донаций, полученных в период «серологического окна»

Подтверждено, что в случае формирования производственных  пулов только на основании результатов серологического обследования доноров, выполненного на этапе заготовки плазмы крови, риск контаминации их вирусами гепатитов будет высоким. При этом анти-ВГС  в таких пулах выявляться не будут, а концентрация РНК ВГС может достигать 106 МЕ/мл и более. Входной контроль методом ИФА снижает риск. Наиболее эффективным ИФА-тестирование минипулов оказалось для выявления ВИЧ-серопозитивных донаций, наименее эффективным для ВГС-серопозитивных донаций. Характерно, что дополнительное  ПЦР-тестирование минипулов на РНК ВГС снижало риск  контаминации производственных пулов в 35 раз и более, а аналогичный контроль на ДНК ВГВ только  в 1,22,9 раза.

К сожалению, сегодня нет четкого представления о том, какой риск является допустимым. В Европе и других развитых странах мира разработаны руководящие документы, определяющие требования к генамплификационному тестированию плазмы для фракционирования, согласно которым в минипуле должно быть обнаружено по крайней мере 10 000 МЕ/мл РНК ВИЧ и 5000 МЕ/мл РНК ВГС (при р<0,05) [http://www.who.int/bloodproducts/publications/WHO_TRS_924_A4.pdf; www.the-stationery-office.co.uk/nbs/rdbk2001/blood45.htm; http://www.pei.de].

С учетом рекомендаций ВОЗ, а также на основании полученных аналитических данных нами был разработан алгоритм входного контроля сырья для производства препаратов крови методами ИФА и ПЦР в формате минипулов, включающих 24+4 донации (рис.5).

*

Мультиплексные диагностические наборы (предел обнаружения РНК ВГС <100 МЕ/мл, РНК ВИЧ<менее 400 МЕ/мл, ДНК ВГВ<50 МЕ/мл).

Рис.5. Алгоритм контроля вирусной безопасности плазмы для фракционирования (на примере Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России).

Эффективность процедуры контроля подтверждена экспериментально. С момента ее внедрения на предприятии исследовано 572 производственных пула плазмы на анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2, НВsAg, а также РНК ВГС, РНК ВИЧ и ДНК ВГВ. Положительных результатов не выявлено, что соответствует требованиям Национального стандарта Российской Федерации ГОСТ Р 52249-2009.

В то же время полученные данные свидетельствуют, что при первичном обследовании доноров с целью признания пригодности плазмы крови для использования в лечебно-профилактических учреждениях, а также, если технологический процесс не включает эффективных стадий элиминации и инактивации вирусов,  специфика контроля должна быть следующей:

• ИФА-скрининг  проводить только в формате индивидуальных донаций.

• ПЦР-тестирование минипулов возможно только при минимальном размере пула, вплоть до проведения исследований в формате индивидуальных донаций.

Несмотря на высокую стоимость исследований, такой алгоритм контроля оправдан, поскольку необходимо учитывать тяжелые медико-социальные последствия инфицирования пациентов гемотрансмиссивными вирусами.

Практическим результатом работы стали разработка и утверждение Методических рекомендаций «Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства лечебных  препаратов из плазмы крови  доноров».  Разработан нормативный документ, в котором  определены обязательные тесты на вирусные маркеры, разработаны процедура минипулирования, позволяющая идентифицировать каждую инфицированную донацию, установлены требования к максимальному размеру минипулов и критерии обеспечения качества исследований. Документ  гармонизирован с требованиями Европейской фармакопеи, ГОСТ Р 52249-2009, Технического регламента «О требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии», утвержденного постановлением Правительства РФ №29 от 26.01.10, а также с рекомендациями ВОЗ и Европейского агентства медицинских продуктов.

Стандартизация генамплификационных методов исследования

ОСО РНК ВГС, предназначенный для стандартизации и контроля качества генамплификационных методов исследования, был получен путем разведения РНК ВГС-позитивной плазмы крови вирусоносителя (генотип 3a) плазмой крови здоровых доноров. Препарат разливали в дозе 0,5 мл с последующей лиофилизацией.  При контроле точности розлива весовым методом  коэффициент вариации составил 3,2 %, остаточная влажность–2 %.

Аттестацию ОСО относительно  МСО осуществляли следующим образом: готовили серию пятикратных разведений испытуемого и референс-препарата, каждое разведение готовили независимо друг от друга и тестировали в трех повторах методом ПЦР с определением концентрации РНК ВГС в соответствии с инструкцией по применению диагностического набора. Полученные аналитические данные для МСО  и ОСО подвергали совместной статистической обработке с помощью метода параллельных линий. Графики зависимости логарифма измеренного значения концентрации от логарифма дозы (титра) тестировали на линейность и параллельность, используя метод дисперсионного анализа. Затем определяли концентрацию РНК ВГС в ОСО на основе известной концентрации МСО, а также границы доверительного интервала (CI 95%) (табл. 6).

Таблица 6

Концентрация РНК ВГС в ОСО, рассчитанная относительно МСО методом параллельных линий (по четырем циклам исследований)

Цикл/титр

Концентрация РНК ВГС, log10 МЕ/мл (Xсред.+ s) (измеренные значения)

Концентрация РНК ВГС, log10 МЕ/мл

Разведение ОСО

Разведение МСО

в ОСО отно-сительно МСО

CI 95%

1:1

1:5

1:25

1:1

1:5

1:25

I

5,71±0,05

5,07±0,05

4,33±0,18

5,12±0,02

4,35±0,05

3,83±0,03

5,81

5,69-5,95

5,68±0,04

5,05±0,03

4,36±0,09

5,81

5,73-5,89

II

5,59±0,07

5,11±0,05

4,36±0,09

4,94±0,08

4,31±0,03

3,79±0,02

5,94

5,83-6,07

5,74±0,09

5,07±0,05

4,33±0,18

5,94

5,79-6,11

III

5,73±0,05

4,98±0,12

4,52±0,09

5,15±0,01

4,37±0,04

3,74±0,01

5,87

5,77-5,98

5,75±0,01

5,02±0,06

4,39±0,08

5,83

5,76-5,89

IV

5,97±0,06

5,37±0,05

4,53±0,26

5,37±0,01

4,74±0,10

3,86±0,04

5,81

5,64-5,99

Общее

5,74±0,12

5,10±0,13

4,4±0,14

5,14±0,17

4,44±0,19

3,81±0,05

5,86

5,79-5,92

Графики зависимости концентраций МСО и ОСО от логарифма дозы (титра) представлены на рис.6. В данном случае при построении графиков использованы результаты измерений по всем циклам. Подобные графики строились также при обработке данных каждого цикла измерений.

Рис.6.Графики зависимости концентрации РНК ВГС от титра в МСО и ОСО.

CРНК ВГС (log10 МЕ/мл) – измеренное значение концентрации РНК ВГС, (log10 МЕ/мл)

Разработанный препарат зарегистрирован в Реестре отраслевых стандартов (ОСО 42-28-366(1)-11П). Аттестованная характеристика содержания РНК ВГС в ОСО составила  7,2х105 МЕ/мл или 3,6х105 МЕ/флакон, что эквивалентно 5,86 lоg10 МЕ/мл или 5,56 lоg10 МЕ/флакон соответственно. Наличие линейности и  параллельности графиков для МСО и ОСО свидетельствовало, что исследуемые объекты имели одинаковую природу, содержали одно и то же активное вещество.

Расчеты методом параллельных линий выполнены с использованием модуля в программе  Microsoft Excel. Методологический подход может быть рекомендован для аттестации стандартных образцов второго уровня, включая контрольные или стандартные образцы предприятия, которые необходимы для  ежедневного мониторинга качества исследований. В Европейской фармакопее, например,  рекомендовано при исследовании производственных пулов тестироватьб контрольный образец с концентрацией РНК ВГС 100 МЕ/мл [Human Plasma for fractionation. (2008:2073) In.European Pharmacopoeia].

В целом стандартизация генамплификационных методов исследований направлена на снижение риска вирусной контаминации плазмы для фракционирования. Однако гарантировать безопасность готовых препаратов можно только в том случае, если при их изготовлении используются методы, позволяющие эффективно удалять и инактивировать вирусы.

       

Разработка вирусбезопасной технологии производства препаратов иммуноглобулинов

Новое поколение препаратов иммуноглобулина G для внутривенного введения на российском фармацевтическом рынке представлено, в основном, зарубежными производителями. Из отечественных препаратов применяется только «Имбиоглобулин», разработанный в Нижегородском филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России под руководством проф. В.В. Анастасиева  (2000). Этот препарат представляет собой высокоочищенный концентрат «нативных» молекул IgG, близких по структуре и свойствам к иммуноглобулинам, циркулирующим в крови. Удаление и инактивация вирусов при производстве «Имбиоглобулина» осуществляется главным образом в процессе спиртового фракционирования и при обработке гидроксидом алюминия. Однако эти технологические приемы не гарантируют полную безопасность продукта. Поэтому технологический процесс был усовершенствован и дополнен сольвент-детергентной стадией инактивации вирусов.

Оптимизацию условий вирусинактивирующей обработки осуществляли на основании изучения изменений физико-химических и биологических свойств IgG и вирулицидной активности используемых реагентов в диапазоне концентраций от 0,015% до 0,6% ТБФ и от 0,01% до 0,4% натрия холата. В результате нами был разработан следующий вариант СД-обработки: раствор IgG с концентрацией белка 4,56,5%, рН 6,57,5, стабилизированный глицином до концентрации 1%,  обрабатывали  стерильной СД- смесью в конечной концентрации 0,3% и 0,2% соответственно. Смесь выдерживали  в течение 6 ч при температуре от 30°С до 37°С. При сравнении физико-химических и биологических показателей качества СД-обработанного препарата с иммуноглобулином, не подвергнутым вирусинактивирующей обработке, достоверных различий не обнаружено.

Для очистки иммуноглобулина от реагентов использовали  оригинальный способ очистки (патент RU 2352358), включающий экстракцию  сольвента и детергента растительным  маслом с температурой затвердевания не ниже 8°С, например, маслом какао, специально обработанным с целью удаления вредных примесей. Стерильное масло какао добавляли в обработанный растворителем и детергентом иммуноглобулин до концентрации 510%. Смесь выдерживали при температуре 3745°С, постоянно перемешивая. Затем раствор охлаждали до 8°С и инкубировали в течение 1015 ч для затвердевания масла. В конце инкубации температуру раствора понижали до 1,52,5°С, что создавало благоприятные условия для удаления масла.  Окончательную очистку от вирусинактивирующих реагентов осуществляли  с помощью ультрафильтрации с одновременным снижением рН до 4,44,8. При апробации технологии в условиях производства часть серий препарата получали  без стадии масляной  экстракции, используя только ультрафильтрацию с увеличенной кратностью отмывки. Преимуществом варианта технологии без использования масла какао было упрощение технологического процесса. Контроль качества очистки от реагентов  оценивали методом газовой хроматографии.

Остаточное количество реагентов устанавливали на основании полученных аналитических данных, требований Европейской фармакопеи, сведений о токсичности реагентов и опыта зарубежных производителей: для ТБФ – не более 2 мкг/мл, для холата натрия – не более 100 мкг/мл.

Изучена стабильность физико-химических и биологических свойств СД-обработанного иммуноглобулина при хранении. Состав и свойства иммуноглобулина оставались стабильными в течение 2,5 года. Отсутствовала фрагментация препарата, не отмечено статистически значимого изменения содержания мономерной и димерной форм. Комплексная проверка серий препаратов по тестам, принятым Российским Фармакопейным Комитетом, позволила  установить, что они полностью соответствовали требованиям,  предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения.

Разработанный вариант СД-обработки может быть использован в технологии производства препаратов иммуноглобулинов как для внутривенного, так и для внутримышечного введения. Технология легко встраивается на разных стадиях технологического процесса, не требует дорогостоящего оборудования.

Однако механизм действия СД-реагентов ограничивает область применения этой технологии и не решает проблему безопасности препаратов в отношении вирусов без липидной оболочки. Поэтому были предприняты попытки поиска новых химических соединений с другим механизмом вирулицидного действия. Критерии выбора были следующими: вещества не должны денатурировать белки и вызывать канцерогенного или тератогенного эффектов, должны быть изучены с точки зрения фармакологических свойств и применяться в фармацевтической промышленности (табл. 7).

Таблица 7

Характеристика  химических веществ, используемых для инактивации вирусов

Наименование соединения

Группа

Использование в технологии лекарств

Каприлат натрия

Производное жирной кислоты, детергент

При производстве альбумина

Бензалкониум хлорид

Смесь алкилбензилдиметиламмония хлорида (С6 до С18), ПАВ

Консервант в готовых лекарственных формах

Карбоплатин

Комплексное соединение платины, алкилирующее вещество

Лекарственный препарат. Цитостатик

Хлорамбуцил

Производное бис--хлорэтиламина, алкилирующее вещество

Лекарственный препарат. Цитостатик

Механизм действия  каприлата натрия и бензалкониума хлорида заключается в связывании мембранных белков и разрушении липидной оболочки вирусов. Мишенью же нуклеофильных соединений, к которым относятся карбоплатин и хлорамбуцил, является геном вируса, и это делает эти вещества особенно перспективными для разработки новых технологий с расширенным спектром действия.

В модельных опытах  in vitro и in vivo,  а также на основании изучения физико-химических свойств IgG были определены дозы, обеспечивающие вирулицидный эффект, и оптимальные условия обработки. Результаты представлены в табл. 8.

Показано, что при использовании разных концентраций хлорамбуцила в водном растворе уровень редукции ВГС был невысоким. По-видимому, это связано с низкой растворимостью хлорамбуцила в воде. Предварительное растворение хлорамбуцила в димексиде или в ТБФ обеспечивало  повышение уровня редукции. 

Таблица 8

Вирусинактивирующие дозы и условия обработки IgG каприлатом натрия, бензалкониумом хлоридом, карбоплатином и хлорамбуцилом

Вещество/

изученный диапазон концентраций

Оптималь-ная кон-центрация в растворе IgG

Оптимальные условия обработки

Уровень редукции

белок

мг/мл

рН

t, C

время, ч

ВГС,

log10 РНК

ВГС

ВГВУ,

log10 ID50

Каприлат натрия/от 5 до 80 мМоль

10–40 ммоль

(1,66-6,64

  мг/мл)

20–70

4,0–5,0

18–37

1

3

5

Бензалкониум хло-рид/от 0,2 до 0,4 %

0,4%

(~ 4 мг/мл)

20+1

6,5–7,5

37

1

3

5

Карбоплатин/

от 2,5 до 30 мг/мл

10–30 мг/мл

10+1

4,0

37

24

2

-

Хлорамбуцил/

от 2,5 до 10 мг/мл

2,5–10,0 мг/мл

10+1

4,0–5,0

37

24

0,5

-

Хлорамбуцил+димексид

1мг/10мг на 1мл

1 мг/мл+

10 мг/мл

10+1

4,0–5,0

37

24

3,5

-

Хлорамбуцил+ТБФ

1мг/10 мг на 1 мл

1 мг/мл+

10 мг/мл

10+1

4,0–5,0

37

24

3,5

-

В целом сочетание хлорамбуцила с растворителями, особенно с ТБФ, который, как известно, широко используется в составе СД-смесей, а также самостоятельно для вирусинактивирующей обработки, является наиболее интересным технологическим решением. Воздействуя одновременно на оболочку и геном вируса, такая смесь может обеспечить более эффективную вирусную инактивацию  по сравнению с СД-обработкой. Детальное изучение эффективности этой технологии на модельных вирусах и оптимизация условий обработки должны стать предметом отдельного исследования.

Вирулицидный эффект бензалкониума хлорида был обнаружен только при концентрации последнего 4 мг/мл. Однако в этой дозе он вызывал агрегацию IgG. Содержание полимеров после вирусинактивирующей обработки увеличивалось до 15%. С целью уменьшения денатурации IgG был разработан вариант обработки при пониженной концентрации белка (20 мг/мл и менее) в присутствии стабилизатора глицина.  В этих условиях содержание мономерной фракции IgG до и после обработки  составило  90,4+5,9 и 91,1+4,8 %  соответственно (изменения статистически незначимы при р0,05).

Наилучшие результаты были получены в опытах с каприлатом натрия. В модельных опытах in vitro  c использованием плазмы, содержащей РНК ВГС, и in vivo на модели ВГВУ выявлена высокая вирулицидная активность каприлата в концентрации более 10ммоль. Выбраны оптимальные условия обработки раствора иммуноглобулина, позволяющие обеспечивать стабильный вирулицидный эффект и сохранять физико-химические и биологические свойства препарата: концентрация каприлата натрия 20 ммоль, рН раствора от 4,0 до 5,0, температура от 18 до 29° С. Изготовлено  12 лабораторных и 4 экспериментально-производственных серий препарата. Подтверждено соответствие полученных препаратов требованиям НД. Проводится наблюдение за их качеством в процессе хранения.

Результатом выполненной работы стала разработка технологических схем производства препаратов IgG,  дополненных сольвент-детергентной или каприлатной стадией инативации вирусов (рис.7). В качестве объекта сравнения  использована классическая технология с применением пепсина.

Рис.7. Схема получения иммуноглобулина  человека для внутривенного введения

Физико-химические и биологические свойства препаратов, полученных с использованием указанных технологических схем производства, представлены в табл. 9.

Таблица 9

Иммуноглобулин для в/в введения ФСП 4201001316-01

Имбиоглобулин СД

ФСП ЛС-000177-171011

Имбиоглобулин К (эксп.произ.серии)

Норма по НД

Фактические

  n=20

Норма по НД

Фактические

n=17

Фактические

  n=4

Прозрачность, ОП

ОП менее 0,05

0,021±0,006

ОП менее 0,05

0,017±0,004

0,003±0,002

Молекулярные параметры (%): полимеры (не более)/мономеры-димеры (не менее)/фрагменты (не более)

0/ 80,0/ 20,0

0,08±0,12

91,8±2,2

8,1±1,9

1,0/90,0/5,0

0,7±0,2

98,2±4,1

1,1±0,5

0,0±0,0

95,1±0,2

4,9±0,1

Фракционный состав:

- дуги преципитации в ИЭФ

не более 2

1-2 дуги

не более 2

1 дуга

1 дуга

Специфическая активность:

- антиальфастафилолизин (титр МЕ/мл)

- антитела к вирусу кори (титр МЕ/мл)

- антитела к HBsAg (МЕ/г)

- антитела к ВГА (анти-ВГА) (Ме/мл)

не менее 2

не менее 25

не нормируется

не нормируется

3,29±0,26

25,0±0,0

38,7±1,9

-

не менее 2

не менее 25

не менее 0,5

не нормируется

3,7±0,24

25,0±0,0

38,6±3,9

62,2±26,3

4,0±0,0

25,0±0,0

44,5±9,9

77,8±35,4

Антикомплементарная активность:  - единица СН50 на 1 мг IgG

не более 1 единицы

0,17±0,05

не более 1 единицы

0,26±0,16

0,47±1,05

Осмоляльность (ммоль/кг Н2О)

не нормируется

-

не менее 240

286,0±25,1

275,2±26,2

Содержание IgA, мг/мл

не нормируется

0,34±0,05

не нормируется

менее 0,1

менее 0,1

Содержание IgM, мг/мл

не нормируется

не нормируется

0,15±0,11

менее 0,05

Распределение подклассов IgG (%) (IgG1/IgG2/Ig3/IgG4)

не нормируется

50,7±1,4

38,5±1,3

7,4±0,2

3,4±0,2

не нормируется

48,4±1,2

41,1±1,6

7,1±0,3

3,3±0,2

50,0±3,1

41,3±1,8

5,7±0,8

3,0±0,5

Трибутилфосфат (мкг/мл)

отсутствует

-

менее 2,0

От 0 до 0,9

-

Натрия холат (мкг/мл)

отсутствует

-

менее 100,0

От 0 до 39,6

-

Пирогенность

Апирогенен

Апирогенен

Апирогенен

Апирогенен

Апирогенен

Токсичность

Нетоксичен

Нетоксичен

Нетоксичен

Нетоксичен

Нетоксичен

Сравнительная характеристика качества препаратов  иммуноглобулина G человека для внутривенного введения

Как  видно из данной таблицы, препараты иммуноглобулинов нового поколения, инактивированные СД-методом или каприлатом натрия, соответствовали требованиям нормативных документов, а по ряду показателей, например, по содержанию мономеров IgG и примесей IgA, превосходили качество иммуноглобулина, полученного по классической технологии с использованием пепсина.

Усовершенствованная технология производства по уровню безопасности соответствует критериям ВОЗ, она включает 3 дополнительные стадии вирусинактивирующей обработки: адсорбцию гидроксидом алюминия, инкубацию при кислом значении рН и обработку СД-методом или каприлатом натрия.

Следует отметить, что  СД- и каприлатный методы инактивации вирусов нами использованы в разных технологических схемах.  С целью совмещения этих методов в одной технологической схеме обработку каприлатом натрия мы проводили на стадии спиртового фракционирования, а сольвент-детергентом, как указано в технологической схеме. Это обеспечивало не только высокий уровень вирусной безопасности получаемого продукта, но и дополнительную очистку IgG от балластных белков.  Исследования в этом направлении планируется продолжить.

На следующем этапе необходимо было подтвердить эффективность разработанных технологических схем производства и их способность обеспечить надежный уровень безопасности полученных препаратов.

Валидация стадий элиминации и инактивации вирусов в производстве иммуноглобулина G человека для внутривенного введения

В РФ правила валидации вирусинактивирующих технологий не регламентированы.  В отношении плазмы крови для фракционирования и лекарственных средств, получаемых из донорской крови или плазмы, обычно применяют соответствующие  рекомендации ВОЗ  [WHO Technical Report, Series N924, 2004] и нормативные документы Европейского агенства по оценке медицинских продуктов  [CPMP/BWP/269/95; CPMP/BWP/268/95]. 

В настоящей работе был валидирован технологический процесс производства «Имбиоглобулина», включающий стадию спиртового фракционирования и дополнительные технологические приемы удаления и инактивации вирусов, а именно неспецифическую сорбцию вирусов гидроксидом алюминия и СД-обработку.

Известно, что в процессе спиртового фракционирования плазмы крови происходит перераспределение вирусов по фракциям, но данные об уровнях редукции противоречивы [Mitra G. et al., 1988; Kempf C. et al., 2007; Yei S. et al., 1992; Piszkiewicz D. et al., 1985; Wells MA, 1986]. Чтобы оценить этот процесс для наиболее опасного контаминанта, каким является ВГС, нами было выполнено модельное фракционирование контаминированной плазмы крови (рис.1, см. «Методы») и изучена динамика изменения концентрации РНК ВГС по стадиям технологического процесса. Уровень редукции рассчитывали с учетом изменения объемов продукта в ходе фракционирования, определяя общую вирусную нагрузку на каждой стадии процесса.

Показано, что на стадии получения осадка А (фракция II+Ш) уровень редукции РНК ВГС был невысоким и составил 0,95+0,21 log10 МЕ/мл (точки отбора проб 1 и 2,  см. «Методы», рис.1). Последующие стадии осаждения (точки отбора  3, 4, 5, см. «Методы», рис.1) приводили к перераспределению вирусов по стадиям процесса и в итоге  к снижению концентрации РНК ВГС в осадке В (точка отбора 9, см. «Методы», рис.1) более чем в 103 раз. Суммарный уровень вирусной редукции ВГС при получении очищенной фракции IgG составил по результатам наших исследований 4,11+0,18 log10 МЕ/мл. Аналогичные исследования, выполненные с плазмой крови, содержащей ДНК В19 V, показали, что многостадийный процесс производства иммуноглобулина обеспечивал снижение концентрации парвовируса В19 более чем в 105 раз 5,69 ± 0,23 log10 МЕ/мл..

Дополнительная обработка раствора IgG гелем гидроксида алюминия в дозе 20 мл на 1 л раствора приводила к снижению концентрации РНК ВГС в 102 раз, а при увеличении дозы геля до 150 мл – в 103 раз.

Таким образом, определение вирусного клиренса с помощью ПЦР является доступным и недорогим методом для оценки эффективности удаления вирусов, но, используя его, невозможно адекватно оценить эффективность инактивирующих технологий. Для этого необходимы методы, позволяющие оценивать жизнеспособность вирусных частиц.

Поэтому эффективность СД-обработки определяли в опытах in vivo, моделируя ВГВУ-инфекцию на  утятах, и в опытах in vitro на культуре клеток с  возбудителем  вирусной диареи (модель ВГС).

Результаты с ВГВУ  оценивали  двумя способами: вначале  в модельных опытах  in vitro путем  определения концентрации ДНК ВГВУ непосредственно в растворе иммуноглобулина до и после СД-обработки, затем в опытах  in vivo путем введения этих же растворов восприимчивым к инфекции утятам. Для каждой концентрации реагентов было использовано по три группы животных из 10 особей.

Как и следовало ожидать, в опытах in vitro не было выявлено статистически значимого снижения концентрации ДНК в обработанных растворах иммуноглобулина, в то время  как в опытах in vivо наблюдался выраженный вирулицидный эффект. Как показано на рис. 8, в группах утят, которым вводили контаминированный ВГВУ раствор иммуноглобулина, обработанный СД-смесью  в конечной концентрации 0,15% ТБФ и 0,1% натрия холата и выше (продолжительность инкубации 6 ч), не регистрировались случаи инфекции. Отмеченная в группах убыль утят по сравнению с исходным количеством (8–9 против 10) связана с естественным падежом их в период наблюдения.

Рис.8. Выявление ДНК ВГВУ в группах утят через 3 недели после внутрибрюшинного введения СД-обработанного IgG, содержащего до обработки 5 log10 ID50 ВГВУ (по три группы в каждом опыте)

Полученные результаты подтвердили высокую эффективность стадии СД-обработки иммуноглобулина  в отношении ВГВУ при концентрации ТБФ более 0,15% и натрия холата более 0,1% при температуре от 29 до 37С °С и длительности инкубации 6 ч. Уровень редукции ВГВУ в этих условиях составил более 5 log ID50. Отсутствие снижения концентрации ДНК ВГВУ в опытах in vitro связано с механизмом действия СД-смеси, которая, разрушая липидную оболочку вирусов, высвобождает ДНК и  фрагменты, не обладающие инфекционными свойствами.

При выполнении исследований с ВВД-БС КРС вначале оценивали цитотоксичность СД-смеси.  Для этого СД-смесь, разбавленную в питательной среде Игла МЕМ до конечных концентраций от 0,03% до 0,6% ТБФ и от 0,02% до 0,4% натрия холата, добавляли в лунки планшета с монослоем клеток коронарных сосудов теленка и культивировали при 36±1С  в СО2-инкубаторе в течение 3 сут. Затем анализировали морфологию и целостность монослоя клеток. В результате было установлено отсутствие токсичности СД-смесей во всех исследованных концентрациях.

Уровень вирусной редукции при СД-обработке определяли при концентрации ТБФ от 0,03% до 0,6%, натрия холата от 0,02% до 0,4%, инкубации смеси в течение 6 ч при температуре от 29  до 37С. Результаты наших исследований продемонстрировали, что даже при минимальной концентрации реагентов уровень редукции ВВД-БС КРС составил от 5,25+0,12 до 5,33+0,18 log10 ТЦД50/мл. Этого достаточно, чтобы признать стадию СД-обработки эффективной [WHO Technical Report, Series N924, 2004]. С увеличением концентрации ТБФ и натрия холата эффективность инактивации повышалась и по данным наших исследований составила более  6 log10 ТЦД50/мл. При этом условия обработки в исследованном диапазоне,  включая концентрацию белка, рН, температуру инкубации, практически не влияли на результат. 

Кинетику инактивации ВГВУ изучали для двух вариантов концентраций реагентов: 0,15% /0,3% ТБФ,  0,1% /0,2% натрия холата, а ВВД-БС КРС только для концентрации ТБФ 0,3%, а натрия холата 0,15%. Определяли долю инфицированных ВГВУ (%) особей в группах, получивших СД-обработанные препараты, или концентрацию ВВД-БС КРС в  растворах иммуноглобулина, инкубированных с СД-смесью в течение 1, 3 и 6 ч. Результаты исследований представлены на рис. 9 а, б.

Рис.9.  Кинетика инактивации ВГВУ и ВВД-БС КРС при СД-обработке иммуноглобулина

Таким образом, экспериментально подтверждена эффективность  СД-обработки IgG при следующих условиях:  концентрация ТБФ 0,3%, натрия холата 0,2%, температура инкубации от 29 до 37 С,  концентрация белка в растворе от 4,5% до 5,5 %, рН от 6,5 до 7,5. Требуемый уровень редукции (более 4 log10) был достигнут в течение 3 ч инкубации. По истечении этого времени препарат считают вирусинактивированным и в соответствии с рекомендациями ВОЗ перемещают в так называемую «безопасную зону», свободную от вирусов.  Дальнейшая инкубация раствора с СД-смесью усиливала эффект и гарантировала дополнительную безопасность полученных препаратов, по крайней мере, в отношении ВГВ и ВГС.

Валидационные исследования с адекватным моделированием технологического процесса впервые были выполнены в РФ. Подтверждена эффективность технологии производства IgG для внутривенного введения и определен суммарный уровень вирусной редукции, который составил более 11 порядков, что существенно выше, чем возможный уровень вирусной нагрузки в производственном пуле (табл.10).

Таблица 10

Уровень редукции патогенных и модельных гемотрансмиссивных вирусов при производстве IgG человека для внутривенного введения

Шаги снижения вирусной нагрузки

ВГС

ВГВУ

ВВД-БС КРС

Спиртовое фракционирование

>4,0

-

-

Обработка гидроокисью алюминия

>2,0

-

-

СД-обработка

-

> 5,0

>6,0

Суммарный уровень редукции

> 11,0

В целом первый отечественный опыт по валидации нового технологического процесса с использованием разных типов патогенных и модельных гемотрансмиссивных  вирусов и способов их детекции,  может быть полезен при разработке соответствующих нормативных документов, необходимых для повышения вирусной безопасности препаратов из плазмы крови доноров. Разработка и внедрение в РФ обязательных требований к подтверждению эффективности вирусной инактивации, гармонизированных с международными директивами, позволят повысить уровень вирусной безопасности отечественных препаратов из плазмы крови человека.

Контроль вирусной безопасности  готовых лекарственных форм  иммуноглобулинов

В РФ в соответствии с требованиями НД  контроль иммуноглобулинов на НВsAg, анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2 является обязательным, при этом условия проведения тестов не определены. В то же время, некоторые показатели качества, например, уровень анти-НВs, в отечественных препаратах не определяют. Не оценена также роль молекулярно-генетических тестов для контроля готовых лекарственных форм. Обсуждению этой проблемы и посвящена последняя глава диссертации.

Препараты иммуноглобулинов представляют собой концентрат антител различной специфичности, при этом уровень анти-НВs нормируется Европейской фармакопей и составляет не менее 0,5 МЕ/г IgG [Human Normal immunoglobulin 2007:0338 In. Eur. Ph. 6st ed.].  В связи с этим  целесообразность тестирования препаратов иммуноглобулинов на НВsAg нами была подвергнута сомнению. Даже в случае контаминации иммуноглобулинов антигеном существует возможность нейтрализации последнего специфическими антителами. Необходимо было определить уровень связывания (нейтрализации) НВsAg специфическими антителами и оценить какой реальный вклад в повышение вирусной безопасности может внести контроль иммуноглобулинов методами  ИФА и ПЦР.

Вируснейтрализующая способность анти-НВs изучена в опытах in vitro с использованием разведений ОСО НВsAg и раствора IgG. Показано, что 1 МЕ анти-НВs связывал  не менее 50 нг НВsAg до неопределяемого методом ИФА уровня. Аналогичные результаты были получены в модельных опытах с плазмой крови донора-вирусоносителя, которую добавляли в определенных соотношениях к препаратам иммуноглобулинов. Результаты опытов показали, что уровень нейтрализации в расчете на 1 МЕ анти-НВs составил  34,6+0,9 нг через 2 ч инкубации и 70,7+1,8 нг НВsAg через 24 ч инкубации при температуре 37°С. При этом было выявлено, что нейтрализация НВsAg специфическими антителами не оказывала влияния на способность метода ПЦР выявлять ДНК ВГВ.

Полученные данные показали,  что обязательный контроль препаратов иммуноглобулинов на НВsAg не является информативным. В НД на препараты иммуноглобулинов представляется целесообразным заменить этот тест на контроль уровня анти-НВs.

Для определения концентрации специфических антител в препаратах иммуноглобулинов нами была разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения анти-НВs «МикрАТ-НВs», в основу которой положен принцип одностадийного прямого ИФА с использованием реагентов на основе НВsАg, выделенного из плазмы крови вирусоносителей. Предел обнаружения анти-НВs при использовании тест-системы составил 8+2 МЕ/л.

В период с 2003 по 2010 г. c использованием разработанной тест-системы  нами было исследовано  725 серий препаратов иммуноглобулина G человека для внутривенного введения. Средние значения концентраций специфических антител  составили от 12,6 ± 3,5 до 60,2 ± 16,9 МЕ/г иммуноглобулина. При оценке данных было обнаружено заметное увеличение концентрации анти-НВs в препаратах иммуноглобулинов после 2004 г. Возможно, это связано с достижением донорского возраста лицами, массовая вакцинация которых осуществлялась в школах и других учебных заведениях страны в середине 90-х годов.

Полученные данные свидетельствовали, что уровень анти-HBs в препаратах иммуноглобулинов целесообразно увеличить, и установить минимальный предел 5 МЕ на 1 г иммуноглобулина.

Для дополнительной гарантии безопасности препараты иммуноглобулинов рекомендуется исследовать на ДНК ВГВ. Однако  следует учитывать, что метод ПЦР не различает живой вирус, поэтому может быть рекомендован только для препаратов, не подвергающихся стадии дополнительной инактивации вирусов в процессе производства [CPMP/BWP/269/95].

На следующем этапе работы нами была оценена чувствительность и специфичность метода ИФА для определения анти-ВГС в препаратах иммуноглобулинов. Показано, что при исследовании их на диагностических наборах, предназначенных только для плазмы крови,  частота выявления неспецифических (ложноположительных) реакций составляла от 1,4 до 4,3% на разных тест-системах. Поэтому нами была разработана иммуноферментная тест-система «ИФА-анти-ВГС», предназначенная для контроля иммуноглобулинов и других препаратов крови.  Специфичность и чувствительность диагностических наборов были обеспечена благодаря оптимизации условий сорбции иммунологических планшет антигенами ВГС (синтетическими и рекомбинантными) и разработке оригинального состава раствора для разведения исследуемых проб. Оптимальный уровень разведения иммуноглобулинов был установлен на основании результатов тестирования препаратов иммуноглобулинов, полученных в  лабораторных условиях из пулов плазмы крови доноров, контаминированных анти-ВГС-позитивными образцами с разным уровнем активности антител (КП от 1,00 до 3,49). Препараты исследовали без разведения или в разведении в 5, 20, 100 и 200 раз. Анализируя полученные данные,  мы определили, что для контроля иммуноглобулинов методом ИФА с использованием диагностических наборов «ИФА-анти-ВГС» оптимальным будет разбавление препаратов IgG  до концентрации белка 5-10 мг/мл, что приблизительно равно нормальному содержанию IgG в плазме крови человека.


Выводы

  1. На основании изучения закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров гемотрансмиссивых вирусов в индивидуальных донациях и пулах плазмы разработан научно–обоснованный алгоритм входного контроля безопасности сырья на предприятиях по переработке плазмы крови доноров,  гарантирующий безопасность производственных пулов плазмы. Утверждены Методические рекомендации «Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров», в которых регламентирована процедура минипулирования, установлен максимальный размер минипулов и требования к обеспечению качества исследований. Разработанный алгоритм контроля вирусной безопасности сырья внедрен в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП «НПО Микроген» Минздравсоцразвития России.
  2. Разработан и утвержден Отраслевой стандартный образец содержания РНК ВГС (ОСО 42-28-366(1)-11П). Разработана методология аттестации стандартных образцов содержания НК вирусов относительно Международных стандартов, основанная на статистической обработке данных с помощью метода параллельных линий. В программе Microsoft Excel создан модуль для выполнения расчетов.
  3. Разработан и внедрен в производство препарат иммуноглобулина человека для внутривенного введения нового поколения, инактивированный сольвент-детергентным методом, по показателям качества и безопасности соответствующий требованиям отечественных НД и Европейской фармакопеи. Разработана и утверждена в установленном порядке НД на «Имбиоглобулин»  (Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для инфузий, 50 мг/мл/ ЛС-000177).
  4. Создана перспективная технология производства иммуноглобулина человека для внутривенного введения с применением каприлата натрия, вирулицидная активность которого в концентрации более 10 ммоль подтверждена экспериментально. Для усиления вирулицидного эффекта предложено совмещать обработку каприлатом натрия и сольвент-детергентом в одном технологическом цикле.
  5. Разработана методология валидации технологических стадий инактивации и элиминации вирусов. Эффективность элиминации вирусов рекомендуется определять  с использованием метода ПЦР с количественной детекцией результатов, эффективность инактивации вирусов – в опытах in vivo на восприимчивых животных или в опытах in vitro на культурах клеток.
  6. Экспериментально доказана нецелесообразность обязательного тестирования иммуноглобулинов на содержание НВsAg по причине иммунной нейтрализации антигена специфическими антителами.
  7. Для количественного определения анти-НВs в сыворотке/плазме крови и препаратах иммуноглобулинов разработана и внедрена в производство иммуноферментная тест-система «МикрАт-НВs», защищенная патентом РФ ФСР 2009/05914 от 07.07.2009). Разработана и внедрена в производство тест-система «ИФА-анти-ВГС», валидированная для исследования препаратов крови, включая иммуноглобулины (ФСР 2009/05264 от 24.03.2009).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. Рекомендовать включить парвовирус В19 в перечень актуальных для РФ вирусных инфекций и внедрить скрининговое исследование донорской плазмы с целью исключения донаций с высокой концентрацией ДНК В19 V.
  2. При регистрации новых препаратов из плазмы крови доноров и при внесении изменений в действующие технологические процессы в обязательном порядке  подтверждать экспериментально и документировать эффективность технологических стадий удаления и инактивации вирусов.
  3. Исключить тест на НВsAg в нормативной документации на препараты иммуноглобулинов и заменить его на определение антител к НВsAg. Обоснована целесообразность повышения минимально допустимого уровня анти-НВs с 0,5 до 5 МЕ/г иммуноглобулина.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные  в изданиях, рекомендованных ВАК

  1. Зубкова, Н.В. Эффективность тепловой инактивации вирусов в производстве внутривенного иммуноглобулина/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, В.Н.Мазепа, К.А. Орлова// Вестник службы крови России.- 2002. - №1.- С.31-33.
  2. Зубкова, Н.В. Оценка специфичности и чувствительности метода ИФА для определения анти-ВИЧ-1,2 в препаратах внутривенного иммуноглобулина/ Н.В.Зубкова, С.В. Зубов, М.А.Моисеева// Вестник службы крови России.- 2006.- №4.- С.31-33.
  3. Зубкова, Н.В. Нейтрализация поверхностного антигена вируса гепатита В препаратами иммуноглобулинов/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, М.А.Моисеева, С.В. Зубов// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-2006.-№ 2.-С.60-65.
  4. Зубкова, Н.В. Организация входного контроля пулов плазмы для фракционирования на маркеры вирусных гепатитов В и С/ Н.В. Зубкова, Е.В.Филатова, В.В.Анастасиев, М.А.Моисеева// Вестник новых медицинских технологий.- 2007.- №4.- С.100-102.
  5. Зубкова, Н.В. Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулинов/Н.В.Зубкова (обзор литературы)// Гематология и трансфузиология. - 2010.-№2.-С. 39-44.
  6. Зубкова, Н.В. Серологические и молекулярно-генетические маркеры вируса гепатита С  у инфицированных доноров/ Н.В.Зубкова, Е.В.Филатова, С.В.Зубов//Вопросы вирусологии.-2010.-№5.-С.34-36.
  7. Филатова, Е.В. Выявление маркеров парвовируса В19 в образцах крови доноров/ Е.В. Филатова, Н.В. Зубкова, Н.А. Новикова, Л.Н. Голицына, К.В.Кузнецов//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2010.- №5.- С. 67-70.        
  8. Филатова, Е.В. Оценка изменения  концентрации ДНК парвовируса В19 при модельном фракционировании плазмы крови доноров/ Е.В. Филатова, Н.В. Зубкова, Т.В. Короткова, С.А. Гальговская, В.В. Анастасиев //Гематология и трансфузиология.- 2011.-№3.- C.10-14.
  9. Зубкова, Н.В. Оценка роли серологических и молекулярно-генетических методов при выявлении маркеров вируса гепатита В в плазме крови доноров/Н.В.Зубкова, М.А.Моисеева, С.В.Зубов, Е.В.Филатова//Вестник службы крови России. – 2011. - №3. – С.5-9.
  10. Зубкова, Н.В. Разработка и аттестация национального лиофилизированного отраслевого стандарта содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК ВГС)/Н.В.Зубкова, Р.А.Волкова, Е.В.Филатова, Е.В.Эльберт,  Е.В.Силин,  А.К. Лобастова,  И.В. Красильников//Вестник Службы крови России.-2012.-№1.- С.41-44.
  11. Зубкова, Н.В. Алгоритм входного контроля вирусной безопасности плазмы при производстве лечебных препаратов из плазмы крови доноров/Н.В.Зубкова, А.В. Казьянин, А.М. Николаева, Л.К. Лаптева, Е.В. Силин//Гематология и трансфузиология.- №1.- 2012. – С. 9-13.
  12. Филатова, Е.В. Оценка безопасности производства препаратов альбумина в отношении парвовируса В19/ Е.В.Филатова, Н.В.Зубкова, Т.В.Короткова, С.А.Гальговская//Вестник Нижегородского университета им.Н.И.Лобачевского.-2012.-№1(1).- С.106-109.

Патенты

  1. Анастасиев В.В. Способ получения иммуноглобулинового препарата/ В.В.Анастасиев, Т.Б.Змачинская, Т.А.Крайнова , Н.В.Зубкова// Патент №2192279 от 07.09.2000. http//www.emea.europa.eu
  2. Моисеева М.А. Тест-система для количественного определения анти-НВs в биологическом образце/ М.А.Моисеева, С.В.Зубов, Н.В.Зубкова// Патент RU 2290642 от 27.12.2006.  http//www.emea.europa.eu
  3. Зубкова Н.В. Способ приготовления вирусинактивированных растворов иммуноглобулинов»/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, Т.В.Короткова// Патент RU 2352358 от 20.04.09/ http//www.emea.europa.eu 

Методические рекомендации и пособия 

  1. Зубкова, Н.В. Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров/Н.В.Зубкова, Л.К.Лаптева, Р.А.Волкова, А.В.Казьянин, И.С.Горлова,  Н.В.Шалунова, М.С.Воробьева, Е.В.Филатова, Н.А.Спиридонова, А.Б.Перевозчиков//Методические рекомендации. Утверждены ФГБУ «ГИСК им.Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России №59-ОД от 21.07. 2011.

Статьи, опубликованные  в сборниках научных трудов и других центральных и региональных журналах

  1. Зубкова, Н.В. Применение сольвент-детергентного метода для инактивации вирусов при получении иммуноглобулина// Проблемы гематологии и переливания крови.- 2001.- №3.- С.51.
  2. Зубкова, Н.В. Эффективность методов тепловой инактивации в производстве внутривенного иммуноглобулина/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, К.А. Орлова// Мир вирусных гепатитов.-2002.-№1.- С.3-7.
  3. Зубкова, Н.В. Методы инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулиновых препаратов/ Зубкова Н.В., Анастасиев В.В.// Новое в трансфузиологии. – Вып.33.- 2002.- С.52-59.
  4. Зубкова, Н.В. Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулина/Н.В.Зубкова, О.В.Миловидова// Сб. «Здоровье населения Нижегородской области», Итоги региональной программы, Н.Новгород.- 2002.- С.123-128.
  5. Зубкова, Н.В. Использование иммуноферментной тест-системы «ИмБио анти-НВs» для количественного определения антител к вирусу гепатита В/ Н.В.Зубкова, С.В.Зубов, М.А.Моисеева //Мир вирусных гепатитов.- 2003.- № 9.- С.9-13.
  6. Зубкова, Н.В. О возможности отбора сырья для производства специфического иммуноглобулина против гепатита А/ Н.В. Зубкова, Н.А.Спиридонова, Е.В. Филатова, С.В.Зубов//Мир вирусных гепатитов.- 2009.-№1.- С.23-25

Опубликованные научные сообщения и тезисы научных докладов

  1. Зубкова, Н.В. Влияние солей на стабильность иммуноглобулина при пастеризации/ В.В.Анастасиев, Н.В.Зубкова, Т.А.Крайнова, Т.Б.Змачинская// Russian Journal of Immunology. -1999.-т.4, №1.- P.70.
  2. Zubkova,  N.V. The use of the method of polimerase chain reaction for an estimation of efficacy of virus inactivation in model experiment/N.V.Zubkova, V.N. Mazepa, K.A.Orlova//  Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems.- 2000.– V.4, №1.- P.175.
  3. Zubkova, N.V. Anti-HBs content in the intravenous Immunoglobulin preparation at different viruses inactivation methods/ N.V. Zubkova  N.V., M.A. Moiseyeva //  Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. - 2002. – т.6, №1.- С.189.
  4. Моисеева, М.А. Оценка специфического иммунитета против гепатита В у персонала, работающего с кровью/ М.А.Моисеева, Н.В. Зубкова, С.В.Зубов//Тезисы докладов II научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». Новосибирск, 2002.- С.43.
  5. Зубкова, Н.В. Разработка ИФА-тест-системы для количественного определения анти-HBs в сыворотке крови и препаратах иммуноглобулинов/ Н.В.Зубкова, С.В.Зубов, М.А.Моисеева// Тезисы докладов международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы». С.-Пб., 2003.-  С.12-13.
  6. Моисеева, М.А. Определение антител к поверхностному антигену вируса гепатита В в препаратах иммуноглобулинов/ М.А.Моисеева, Н.В.Зубкова// Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых от 27 февраля 2004 г.: Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии.- Уфа, 2004 г.- С.235-236.
  7. Зубкова, Н.В. Проблема вирусной безопасности препаратов из плазмы крови: входной и выходной производственный контроль на маркеры вирусных гепатитов/ Н.В.Зубкова, Н.А.Спиридонова, М.А.Моисеева//Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых от 27 февраля 2004 г.: Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии.- Уфа, 2004.-С.238-240.
  8. Моисеева, М.А. Выявление маркеров парентеральных вирусных гепатитов среди различных групп детей Нижегородской области/ М.А.Моисеева, Н.В.Зубкова, С.В.Зубов// Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний. Мат. конф., посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ 28-29 октября 2004 г., Н.Новгород.- С.38-43.
  9. Худякова, Н.Е. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения суммарных антител к вирусу иммунодефицита 1-го и 2-го типов/ Н.Е.Худякова, С.В.Зубов, Н.В.Зубкова//Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний. Мат. конф., посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ 28-29 октября 2004 г., Н.Новгород.- С.173-177.
  10. Моисеева, М.А. Определение маркеров гемотрансмиссивных инфекций в препаратах крови/ М.А. Моисеева, Н.В.Зубкова, Н.А.Спиридонова, С.В.Зубов// VI Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты – проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов.- М., 24-26 мая 2005г..-С.212-214.
  11. Зубкова, Н.В. Определение уровня нейтрализации поверхностного антигена вируса гепатита В специфическими антителами/ Н.В.Зубкова, М.А.Моисеева, С.В.Зубов, В.В.Анастасиев// VI Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты – проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов.- М., 24-26 мая 2005г.-С.116-118.
  12. Зубов, С.В. Распределение концентрации HBsAg в плазме крови доноров-вирусоносителей/ С.В.Зубов, Н.И.Егорова, М.А.Моисеева М.А., Н.В. Зубкова, К.В. Кузнецов // VI Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты – проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов.- М., 24-26 мая 2005.-С.118-120.
  13. Зубкова, Н.В. Распределение концентраций антител к вирусу гепатита А у доноров/ Н.В.Зубкова, Н.А.Спиридонова// Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н.Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний».- Н.Новгород.- 2006.- С.216-217.
  14. Моисеева, М.А. Особенности выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (НВsAg) в пулах плазмы для фракционирования/ М.А.Моисеева, Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, С.В.Зубов// Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н.Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний».- Н.Новгород.- 2006.- С.197-198.
  15. Зубкова, Н.В. Основы вирусбезопасной технологии производства иммуноглобулиновых препаратов/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, Т.В. Короткова, Е.В.Филатова// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней».- С.43.
  16. Зубкова, Н.В. Определение антител к вирусу иммунодефицита человека в препаратах иммуноглобулинов/ Н.В.Зубкова, С.В.Зубов, М.А.Моисеева// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней».- С.44.
  17. Филатова, Е.В. Опыт организации входного контроля отдельных фракций плазмы на ВИЧ и гепатит С/ Е.В.Филатова, Н.В.Зубкова, И.В.Губанов, Ю.К.Пискарева, Л.М.Ефремова// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней».- С.113.
  18. Зубкова, Н.В. Распределение РНК вируса гепатита С при фракционировании инфицированной плазмы/ Н.В.Зубкова, Е.В.Филатова, Л.М.Ефремова, С.В.Зубов// Материалы VII Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты –эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика»: Тезисы докладов.- М., 29-31 мая 2007г.-С.30-31.
  19. Зубкова, Н.В. Эффективность элиминации вирусов при использовании фильтров CUNO ZETA PLUS серии VR в технологии производства препаратов из плазмы крови/ Н.В.Зубкова, М.Ю.Фирсова// Материалы VII Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты –эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика»: Тезисы докладов.- М., 29-31 мая 2007г.-С.31-32
  20. Филатова, Е.В. Параллельное скринирование минипулов плазмы для фракционирования методом ИФА и ПЦР на маркеры вирусного гепатита С/ Е.В.Филатова, Н.В.Зубкова//Материалы VII Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты –эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика»: Тезисы докладов.- М., 29-31 мая 2007г.-С.74-75.
  21. Зубкова, Н.В. Влияние химических вирусинактивирующих реагентов на свойства препаратов внутривенного иммуноглобулина/ Н.В.Зубкова, М.Ю.Фирсова, Н.Е.Худякова, О.В.Миловидова//Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008». Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 11-12 ноября 2008 г.- С.56.
  22. Худякова, Н.Е. Микрометод для определения показателя цветности в плазме для фракционирования/ Н.Е.Худякова, Е.Н.Шарапова, С.В.Зубов, Н.В.Зубкова//Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008». Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 11-12 ноября 2008 г.- С.121.
  23. Филатова, Е.В. Выбор оптимальных диагностических подходов для контроля плазмы на маркеры вируса гепатита С/Филатова Е.В., Зубкова Н.В., Моисеева М.А.//Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008». Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 11-12 ноября 2008 г.- С.119.
  24. Зубкова, Н.В. Использование in vivo модели инфекции вируса гепатита В уток для оценки эффективности инактивации вирусов при сольвент-детергентной обработке иммуноглобулинов/ Н.В.Зубкова, К.К.Кюрегян// Материалы VIII Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты –эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика»: Тезисы докладов.- М., 26-28 мая 2009 г.- С.41.
  25. Моисеева, М.А. Содержание антител к поверхностному антигену вируса гепатита В в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения/ М.А.Моисеева, Е.В.Филатова, Н.В.Зубкова, С.В.Зубов//  Материалы VIII Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты –эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика»: Тезисы докладов.- М., 26-28 мая 2009 г.-С.17.
  26. Зубкова, Н.В. Химические методы инактивации вирусов в препаратах иммуноглобулинов/ Н.В. Зубкова, М.Ю.Фирсова, Н.Е.Худякова,  Т.Б.Змачинская, С.А.Гальговская, К.К.Кюрегян//Материалы Юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика Блохиной И.Н. Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения».- Нижний Новгород, 2009 г. – С.349-352.
  27. Анастасиев, В.В. Разработка нового отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения с сольвент-детергентной стадией инактивации вирусов/ В.В.Анастасиев, Т.В.Короткова, Н.В.Зубкова, И.П.Мулина, О.В.Миловидова, Л.М.Ефремова, Е.В.Евдокимова//Материалы Юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика Блохиной И.Н. Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения».- Нижний Новгород, 2009. – С.326-329.
  28. Филатова, Е.В. Результаты тестирования сыворотки крови доноров на ДНК парвовируса В19/ Е.В.Филатова, Н.В.Зубкова  //Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России» «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины»: Тезисы докладов.- 2010. Киров, 6-7 октября 2010 г. – С.96-97.
  29. Зубкова, Н.В. Обеспечение вирусной безопасности препаратов из плазмы крови человека/Н.В.Зубкова// Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России» «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины»: Тезисы докладов.- 2010. Киров, 6-7 октября 2010 г. – С.120-121
  30. Зубкова, Н.В. Валидация вирусинактивирующих технологий с помощью  in vivo модели инфекции вируса гепатита В уток (ВГВУ)/ Н.В.Зубкова, М.Ю.Фирсова, О.В.Миловидова, К.К.Кюрегян, И.В.Красильников, А.К.Лобастова// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010». «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 9-10 ноября 2010 г.- С.51.
  31. Короткова, Т.В. Разработка концентрированных форм вирусбезопасных препаратов иммуноглобулинов/ Т.В.Короткова, В.В.Анастасиев, С.А.Гальговская, Н.В.Зубкова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010». «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 9-10 ноября 2010 г.- С.60.
  32. Филатова, Е.В. Организация входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства лечебных препаратов из плазмы крови доноров

/ Филатова Е.В., Зубкова Н.В., Горлова И.С., Спиридонова Н.А., Казьянин А.В., Перевозчиков А.Б., Волкова Р.А., Воробьева М.С., Лаптева Л.К., Шалунова Н.В. Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010, т.V, с.105-106.

  1. Зубкова, Н.В. Особенности выявления маркеров вируса гепатита В в плазме крови инфицированных доноров/ Н.В.Зубкова, М.А.Моисеева, С.В.Зубов, Е.В. Филатова//Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010, т.1, С.332-335.
  2. Филатова, Е.В. Оценка частоты контаминации производственных пулов плазмы для фракционирования парвовирусом В19/ Е.В.Филатова, Н.В.Зубкова// Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010, т.1, С.353-355.
  3. Волкова, Р.А. Разработка лиофилизированной формы стандартного образца содержания РНК вируса гепатита С/ Р.А.Волкова, Е.В.Эльберт, В.Г.Петухов, Н.В.Шалунова, Н.В.Зубкова, Е.В.Филатова, Е.В.Силин // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика -2010», Москва, 2010, т.IV, С.356-357.
  4. Зубкова, Н.В. Валидация технологических стадий по элиминации и инактивации вирусов при производстве внутривенного иммуноглобулина G человека/Н.В.Зубкова, И.В.Красильников, А.К.Лобастова, А.В.Казьянин, Л.К.Лаптева, К.К.Кюрегян, Т.И.Глотова / Материалы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», Москва, 2012.

Зубкова Наталия Васильевна (Россия)

Биотехнологические аспекты вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов: методология, производство, стандартизация

Работа посвящена актуальной проблеме – повышению вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов и охватывает все ее аспекты: обеспечение безопасности плазмы для фракционирования,  стандартизацию исследований на маркеры гемотрансмиссивных вирусов, разработку современных технологий производства и их валидацию, контроль качества готовых лекарственных форм.  На основании изучения закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров в индивидуальных донациях и пулах плазмы разработан научно-обоснованный алгоритм входного контроля плазмы для фракционирования, обеспечивающий безопасность производственных пулов плазмы на уровне международных стандартов. Разработана современная технология производства препарата иммуноглобулина G для внутривенного введения, включающая валидированные стадии инактивации вирусов. Доказано, что препараты, полученные по этой технологии, превосходят по ряду показателей качества препараты иммуноглобулина, полученные по традиционной технологии с использованием гидролитических ферментов. Разработаны рекомендации и диагностические наборы для контроля вирусной безопасности готовых  препаратов.

Biotechnological aspects of virus safety of immunoglobulin preparations: methodology, production, standardization

This work is devoted to the relevant issue - to increase viral safety of immunoglobulin preparations and it covers all aspects of it: providing of plasma safety for fractionation, standardization of researches on markers of blood-borne viruses, development of modern production technologies and their validation, quality control of the finished products. The effective and scientifically-proved algorithm of plasma control for fractionation is developed by results of studying of the patterns of serological and molecular-genetic markers identification in individual donations and plasma pools. It provides safety of manufacturing plasma pools according to the international standards. The modern technology is developed to produce the intravenous immunoglobulin G preparation including additional stages of viruses’ inactivation which efficiency has been confirmed experimentally. It is proved that the preparations obtained by this technology are superior in some indicators of quality to immunoglobulin preparations obtained by the traditional technology with the enzymatic digestion. Recommendations and diagnostic kits for the control of viral safety of the immunoglobulin medicines have been developed.

Автор выражает признательность и благодарность за сотрудничество, и помощь в работе заместителю директора по науке ''Пермское НПО ''Биомед'' д.б.н., профессору Николаевой А.М.; д.б.н., профессору Красильникову И.В.;  заместителю начальника управления науки и инновационного развития ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России Лобастовой А.К.; директору Нижегородского филиала ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России Полякову В.И., а также сотрудникам филиала: заместителю директора по науке д.б.н., профессору Анастасиеву В.В., начальнику цеха гамма-глобулинов, к.м.н. Коротковой Т.В., ведущим специалистам цеха гамма-глобулинов и цеха диагностических препаратов; директору ООО «Биометрика» Силину Е.В.; директору «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН д.м.н., профессору Михайлову М.И., заведующей лабораторией вирусологии, д.б.н., профессору Глотовой Т.И. 

Список сокращений

CI - confidence interval (доверительный интервал)

ВЗН – вирус лихорадки Западного Нила

GMP – стандарт Good Manufacturing Practice (надлежащая производственная практика)

ВИЧ – вирус иммунодефицита человека

HLTV1.2 – Т-лимфортопный вирус 1 и 2 типа (Т-клеточного лейкоза)

ДНК – дезоксирибонулеиновая кислота

НВsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В

ИФА – иммуноферментный анализ;

B19 V – парвовирус В19

КП - коэффициент позитивности;

ID50 - средняя инфицирующая доза, которая вызывает развитие болезни у 50% зараженных экспериментальных животных

МЕ – Международная единица

IgG – иммуноглобулин человека класса G

МСО – Международный стандартный образец

IgА – иммуноглобулин человека  класса А

НД – нормативный документ

IgМ – иммуноглобулин человека  класса М

НК- нуклеиновая кислота

Анти-ВГА – антитела к вирусу гепатита А

ОП – оптическая плотность

Анти-ВГС- антитела к вирусу гепатита С

ОСО – отраслевой стандартный образец

Анти-ВИЧ1,2 – антитела к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типов

ПЦР – полимеразная цепная реакция

Анти-НВs – антитела к НВsAg

РНК – рибонуклеиновая кислота

Анти-НВс – антитела к ядерному антигену вируса гепатита В

СД - сольвент-детергентный

ВВД-БС КРС  - возбудитель вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота

ТБФ – три-n-бутилфосфат

ВГВ - вирус гепатита В

ТЦД50/мл – тканевая цитопатогенная доза для 50% зараженных клеток

ВГВУ – вирус гепатита В утят

ФСП – фармакопейная статья предприятия

ВГС – вирус гепатита С






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.