WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Зеня Екатерина Николаевна

АНАЛИЗ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ КОМПОЗИЦИИ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И ЛИГНАНОВ СЕМЯН ЛЬНА

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук

Москва – 2012 г.

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

кандидат фарм. наук, доцент       Савватеев Алексей Михайлович

Официальные оппоненты:

Харитонов Юрий Яковлевич, доктор хим. наук, профессор, зав. кафедрой аналит., физической и коллоидной химии Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Воскобойникова Инна Васильевна, кандидат фарм. наук, вед. науч. сотрудник отдела экспериментальной и клинической фармакологии НИЦ медицины, химии и технологии ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии

Ведущая организация: ОАО "Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ"

Защита состоится "___"___________ 2012 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан  "___"____________________2012 г.

Ученый секретарь,

доктор фарм. наук, профессор                               Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. В настоящее время острой проблемой является рост заболеваний, объединяемых в группу метаболического синдрома – атеросклероза, ишемической болезни сердца, сахарного диабета 2-го типа и др. Необходимость коррекции таких патологических состояний обусловливает актуальность поиска рациональной фармакотерапии. В данном направлении большую известность приобрели флавоноиды – природные вещества, обладающие широким спектром фармакологического действия. На протяжении многих лет на кафедре органической химии в содружестве с другими научными учреждениями ведутся работы по созданию флавоноидсодержащих фитопрепаратов. Одним из них является получаемый из древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы Гмелина (Larix Gmelinii Rupr.) флавоноидный продукт «Дигидрокверцетин» – сырье для производства биологически активных добавок к пище (далее – продукт «Дигидрокверцетин») – с доминирующим содержанием индивидуального вещества дигидрокверцетина, обладающего антиоксидантным и ангиопротекторным действием.

Банк присущих дигидрокверцетину фундаментальных фармакологических свойств обеспечивает ему базисный статус для создания на его основе композиций с другими компонентами с целью оптимизации определенных видов фармакологического действия. В этом отношении наряду с флавоноидами большой интерес представляют природные фенольные соединения – лигнаны. Одним из источников лигнанов, в частности, секоизоларицирезинола диглюкозида, являются семена льна обыкновенного Linum usitatissimum L. Известно, что секоизоларицирезинола диглюкозид обладает противоатеросклеротическим, противодиабетическим, гиполипидемическим, антихолестеринемическим действием, что в целом способствует нормализации показателей липидного профиля. Фармакологическое исследование экстракта семян льна, содержащего более 40% секоизоларицирезинола диглюкозида, выявило эндотелийпротекторные свойства, а также антитромбогенное и антитромбоцитарное действие, выразившееся в улучшении реологических показателей крови и структурно-функционального статуса эритроцитов. Композиция этого экстракта с продуктом «Дигидрокверцетин» обладает гиполипидемическим действием (НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН).

Появление новых композиций сложного состава ставит задачу поиска оптимальных путей их фармацевтического анализа.



Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью обоснования оптимального состава композиции продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна и разработки методологического подхода к анализу и созданию валидированных методик для стандартизации рекомендованной композиции.

Цель исследования. Цель настоящей работы состояла в определении оптимальных по антирадикальной активности соотношений действующих веществ – дигидрокверцетина и секоизоларицирезинола диглюкозида – в составе новой двухкомпонентной композиции продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна, разработке единого методологического подхода к анализу и стандартизации выбранной композиции, а также в изучении химического состава экстракта семян льна.

Задачи исследования.

  1. Обосновать подбор оптимального соотношения дигидрокверцетина и секоизоларицирезинола диглюкозида для создания новой композиции продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна, обладающей ценными фармакологическими свойствами.
  2. Оценить антирадикальную активность продукта «Дигидрокверцетин», экстракта семян льна и их композиций, различных по соотношению действующих веществ – дигидрокверцетина и секоизоларицирезинола диглюкозида.
  3. Разработать методику хроматографического анализа композиции продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна с учетом специфичности состава.
  4. Валидировать предлагаемую методику в соответствии с принятыми валидационными характеристиками.
  5. Провести исследование химического состава экстракта семян льна.

Научная новизна. Дана оценка антирадикальной активности продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна, охарактеризованная показателями IC50, TEAC и длительностью индукционного периода.

Получены кинетические кривые развития радикал-катионов ABTS•+ в присутствии продукта «Дигидрокверцетин», экстракта семян льна и их композиций, охарактеризована степень и скорость, с которой исследуемые объекты восстанавливают данные радикал-катионы.

В результате скрининга антирадикальной активности ряда композиций, различных по мольным соотношениям действующих веществ, установлено, что суммарный эффект антирадикальной активности продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна при их одновременном присутствии зависит от количественных соотношений дигидрокверцетина и секоизоларицирезинола диглюкозида в композиции. Кинетическим методом установлено, что при равных мольных соотношениях действующих веществ, а также при превалирующем содержании секоизоларицирезинола диглюкозида происходит синергизм антирадикальных свойств.

Определены оптимальные хроматографические условия, разработана и оптимизирована по основным хроматографическим параметрам селективная и воспроизводимая методика одновременного качественного и количественного анализа дигидрокверцетина и секоизоларицирезинола диглюкозида в композиции методом ВЭЖХ.

Качественно проанализирован химический состав экстракта семян льна. Установлено, что помимо секоизоларицирезинола диглюкозида в его составе присутствуют также лигнаны матаирезинол, секоизоларицирезинол и ларицирезинола диглюкозид. Определены основные вещества, входящие в состав экстракта семян льна.

Разработан способ количественного анализа полисахаридов в экстракте семян льна.

Практическая значимость. На основании полученных экспериментальных данных композиция продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна при массовом соотношении действующих веществ 1:1 может быть рекомендована для получения биологически активной добавки к пище, обладающей антирадикальным и гиполипидемическим действием.

Разработанная селективная методика качественного и количественного анализа композиции на базе ВЭЖХ внедрена в учебный курс «Физико-химические методы исследования органических соединений» на кафедре органической химии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Методика анализа методом ВЭЖХ может быть использована в целях стандартизации композиции.

Основные положения, выносимые на защиту.

  • Характеристика антирадикальной активности продукта «Дигидрокверцетин», экстракта семян льна и их композиций.
  • Результаты изучения кинетических зависимостей проявления антирадикальных свойств продукта «Дигидрокверцетин», экстракта семян льна и их композиций.
  • Результаты изучения хроматографических характеристик состава композиции продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна.
  • Оптимальные хроматографические параметры ВЭЖХ для одновременного анализа дигидрокверцетина и секоизоларицирезинола диглюкозида в композиции продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна.
  • Результаты валидации методики стандартизации композиции методом ВЭЖХ.
  • Результаты качественного анализа химического состава экстракта семян льна.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2009), на XVII и XIX Российском национальном конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2010, 2012), на 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование 2010. Научные основы создания новых лекарственных средств» (Воронеж, 2010), на VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010).

Личный вклад автора. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки целей и задач, их экспериментальной реализации до аналитической и статистической обработки, научного обоснования, обобщения полученных результатов и рекомендаций по их внедрению.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательской программы ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема включена в план научных исследований кафедры органической химии «Разработка способов анализа и стандартизации флавоноидсодержащих лекарственных средств, изучение их антиоксидантной активности и фармакокинетики».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 в изданиях, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах и состоит из введения, обзора литературы, двух глав, отражающих собственные экспериментальные данные автора, выводов, списка литературы и приложения. Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в 29 таблицах, проиллюстрированы 34 рисунками и 12 схемами. Библиографический список включает 222 источника литературы, их них 63 отечественных и 159 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Исходными объектами настоящего исследования служили продукт «Дигидрокверцетин» (компонент I), экстракт семян льна (компонент II) и композиции этих компонентов.

Компонент I является сырьем для производства биологически активных добавок к пище производства ООО «Флавир», Россия (ТУ 9354-001-49446523-04, свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.1876.2.05 от 25.02.2005 г.). Основным действующим веществом является дигидрокверцетин (ДГК), содержание которого не менее 88%. Используемый в работе компонент I охарактеризован нами методом ВЭЖХ (Р=0,95): ДГК 92,01±0,32%; дигидрокемпферол 0,67±0,05%; нарингенин 0,28±0,03%; кверцетин 2,21±0,11%.

Компонент II представляет собой экстракт семян льна обыкновенного Linum usitatissimum L. производства AlaLife, Китай (сертификат партии SDG07120901), содержащий не менее 40% секоизоларицирезинола диглюкозида (СДГ). Содержание лигнанов в экстракте было охарактеризовано нами методом ВЭЖХ: СДГ 42,08±0,10%, матаирезинол 1,02±0,23%.

Стандартные вещества: дигидрокверцетин ГСО (ФС 42-0162-06, ООО «Флавир»), секоизоларицирезинола диглюкозид (Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.), феруловая кислота, п-кумаровая кислота, синаповая кислота, нарингенин, кверцетина дигидрат, дигидрокемпферол (Sigma), тролокс (Acros).

Используемые в работе аналитические методы: ВЭЖХ (хроматограф ProStar 230 c УФ-детектором ProStar 325, Varian, CША); спектроскопия в УФ и видимой областях (UV-Vis спектрофотометр Cary 1C, Varian); ЯМР 1Н спектроскопия (ЯМР-спектрометр Jeol «JNM-ECX 400»); газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (газовый хроматограф Agilent 6890; для идентификации использовались библиотеки масс-спектров NIST 05, Wiley); ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (тандемный масс-спектрометр высокого разрешения с орбитальной ионной ловушкой LTQ Orbitrap Velos, оснащенный внешним источником ионизации типа «электроспрей» и насосом Accela 1250).

Определение антирадикальной активности исследуемых объектов

Основные биологически активные вещества исследуемых объектов ДГК и СДГ , являясь фенольными соединениями, потенциально обладают антирадикальными свойствами. В этом отношении достаточно всесторонне изучен ДГК. Разработанный отечественный фитопрепарат Диквертин®, содержащий не менее 90% ДГК, принадлежит к группе антиоксидантных лекарственных средств. Для СДГ известны литературные данные о наличии противоатеросклеротических, противодиабетических, гиполипидемических, антихолестеринемических свойств.

С15H12O7

C32H46O16

Mr 304,25

Дигидрокверцетин

Mr 686,70

Секоизоларицирезинола диглюкозид

Объединение этих двух действующих веществ в одной композиции может привести к взаимному обогащению фармакологического действия. Первичным критерием для характеристики антиоксидантных свойств композиции был избран показатель антирадикальной активности. На основании этого показателя можно произвести подбор количественного соотношения компонентов I и II, не приводящего к снижению антирадикальной активности (АРА) каждого из них и соответствующего их суммарному эффекту. Оценку АРА проводили двумя способами – кинетическим и деколоризационным – c использованием радикал-катионов [2,2/-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты)] диаммониевой соли (ABTS•+).

Оценка АРА компонентов I и II кинетическим способом. Спектрофотометрический кинетический метод оценки АРА основан на ингибировании накопления радикал-катионов ABTS•+, генерируемых при окислении ABTS водным раствором пероксидисульфата калия в присутствии исследуемых объектов. В качестве измеряемых величин оценивали индукционный период (ИП) как время задержки образования характерных для радикал-катиона полос поглощения в области 600-900 нм в присутствии исследуемого объекта.





В анализируемых условиях субстрат окисления ABTS берется в избытке по отношению к концентрациям испытуемых объектов, введение которых вызывало появление ИП. Продолжительность ИП возрастала с увеличением концентрации ингибитора окисления (рис. 1).

Добавление в инкубационную смесь растворов компонента I или компонента II вызывало появление ИП, затем наблюдался плавный переход горизонтальной части кинетической кривой в наклонную, в течение которого происходил рост скорости образования ABTS•+ до определенного максимума, после чего промежуток возрастания сменялся убыванием. Касательную к наклонной части кинетической кривой проводили в точке максимальной скорости развития ABTS•+ Vmax, которая предположительно является моментом полного расходования ингибитора окисления. Кинетические кривые и определение продолжительности ИП () представлены на рис. 2.

В результате исследования получили линейные зависимости величин продолжительности ИП от концентрации добавляемого компонента в растворе вида y=bx+a (для компонента II b=0,768; a=7,518), характеризующиеся высоким коэффициентом корреляции r (от 0,9935 для компонента II до 0,9947 для компонента I). Воспроизводимость методики оценивали по степени совпадения результатов измерений ИП на примере трех молярных концентраций СДГ. Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости данных эксперимента; относительная погрешность измерений не превышает 0,93 % (табл. 1). Для сравнительного анализа получены данные по удельной ингибирующей концентрации (IC) и значениям TEAC (табл. 3).

Оценка АРА компонентов I и II деколоризационным способом. Данный спектрофотометрический метод оценки АРА основан на подавлении исследуемыми объектами предварительно генерированных радикал-катионов ABTS•+.

Для компонентов I и II получили линейные зависимости степени ингибирования ABTS•+ в интервале 20-60% от концентрации образца в растворе вида y= bx+a (b =5,938; a=1,130 для компонента II), характеризующиеся высоким коэффициентом корреляции (от 0,9871 для компонента I до 0,9977 для компонента II). Данные эксперимента обладают удовлетворительной воспроизводимостью; относительная погрешность измерений не превышает 0,42 % (табл. 2).

АРА каждого из исследованных объектов охарактеризована показателями IC50, ТЕАС20-60% и ТЕАСIC50 (табл. 3). Для расчета величин IC50 в полученные уравнения линейных зависимостей процента ингибирования ABTS•+ от концентрации объекта (в пересчете на 92% содержание ДГК и 42% содержание СДГ в компонентах I и II соответственно) подставляли значение степени ингибирования 50%. Расчетные величины TEAC20-60% получены как среднее значение для всего диапазона ингибирования радикал-катионов ABTS•+. С целью проведения сравнительного анализа рассчитаны также значения TEACIC50 для концентраций IC50.

Величина АРА компонента II в несколько раз ниже таковой компонента I.

Pис. 1. Кинетические кривые развития ABTS•+ в отсутствие (кривая 1) и при добавлении 40, 80, 120 мкл (кривые 2, 3 и 4 соответственно) раствора компонента II в метаноле с концентрацией СДГ 0,809 мкмоль/л (инкубационная смесь в растворе фосфатного солевого буфера). Ось абсцисс – время после введения пероксидисульфата калия (t, мин), ось ординат – оптическая плотность инкубационного раствора.

а

б

Рис. 2. Кинетические кривые образования ABTS•+ в присутствии компонента I (а) и компонента II (б); – продолжительность ИП; Vmax – точка максимальной скорости развития ABTS•+. Ось абсцисс – время после введения пероксидисульфата калия (t, мин), ось ординат – оптическая плотность инкубационного раствора.

Таблица 1. Оценка воспроизводимости ИП на примере компонента II

ССДГ, мкмоль/л*

n

S

x±x, мин

, %

12,24

6

0,372

7,43±0,63

0,22

24,49

6

0,794

20,1±1,34

0,46

36,73

6

1,617

39,0±2,73

0,93

*в пересчете на 42% содержание секоизоларицирезинола диглюкозида

Таблица 2. Оценка воспроизводимости степени ингибирования ABTS•+ компонентом II

С, мг/л*

n

S

x±x, %

, %

3,59

6

0,972

22,11±0,800

0,40

6,67

6

0,908

41,38±0,747

0,37

9,74

6

1,040

58,65±0,855

0,42

*в пересчете на 42% содержание секоизоларицирезинола диглюкозида

Таблица 3. Характеристика АРА исследуемых объектов для их массовых концентраций

Наименование

IC (мг/л)/мин*

TEAC*

IC50 (мг/л)

ТЕАС20-60%

ТЕАСIC50

«Дигидрокверцетин»

0,65±0,18

5,41±0,14

1,22±0,11

9,69±0,60

8,03±0,72

Экстракт семян льна

2,08±0,32

1,68±0,78

8,23±0,16

1,32±0,04

1,18±0,02

*данные, полученные кинетическим способом

       Полученные результаты измерения обоими методами позволяют оценить степень и скорость, с которой исследуемые объекты восстанавливают радикал-катионы ABTS•+. Так, значения ТЕАС компонента I, полученные кинетическим методом, значительно ниже по сравнению с таковыми деколоризационного метода, что, по-видимому, объясняется более низкой АРА продуктов, образующихся в результате окисления исходного антиоксиданта. Напротив, близкие значения ТЕАС компонента II, полученные обоими методами, свидетельствуют об одинаковых путях проявления им АРА, независимо от концентрации радикал-катионов ABTS•+ и продуктов окисления антиоксиданта.

       Значения ТЕАС компонента II (1,68) сопоставимы с таковыми для глутатиона восстановленного (1,62), рутина (2,75), -токоферола (2,83), что позволяет рассматривать экстракт семян льна как перспективный ингибитор процессов свободнорадикального окисления.

       Оценка АРА композиционных составов компонентов I и II деколоризационным способом. Методом, основанном на подавлении антиоксидантом предварительно генерированных радикал-катионов ABTS•+, исследовали АРА композиций в диапазоне пяти мольных соотношений ДГК:СДГ (от 10:1 до 1:10 в пересчете на содержание ДГК 92% и содержание СДГ 42% в компонентах I и II соответственно). Полученные в ходе эксперимента значения для каждой из исследованных композиций были аппроксимированы уравнениями прямых, на основании которых рассчитывались значения IC50 ДГК и СДГ. В данных модельных условиях для всех исследованных композиций обнаружено отрицательное отклонение от аддитивной величины АРА компонентов, значение которого зависело от количественных соотношений ДГК и СДГ. Максимально этот эффект проявлялся для мольного соотношения ДГК:СДГ 1:10 (–43,67±3,70%), после чего снижался по мере уменьшения мольной доли СДГ в композиции, постепенно выходя на плато порядка –20% с композиции 1:1 (табл. 4).

Таблица 4. Степень отклонения АРА композиций «Дигидрокверцетин»-экстракт семян льна от аддитивной суммы вкладов  компонентов (деколоризационный метод)

Мольное соотношение ДГК:СДГ

Массовое соотношение ДГК:СДГ

ТЕАСIC50

Антагонизм, %

1:10

1:23

5,19±0,93

–43,67±3,70

1:5

1:11

5,94±0,87

–35,53±2,77

1:1

1:2

7,37±0,93

–19,93±0,97

5:1

2:1

7,26±0,27

–21,13±3,41

10:1

4:1

7,67±0,47

–16,70±3,67

Полученные данные свидетельствуют, что сочетание компонентов I и II в композициях с равным мольным соотношением ДГК и СДГ и с преобладающим содержанием ДГК не приводит к существенному снижению АРА ДГК. Показатель ТЕАСIC50 подобных композиций характеризуется более высокими значениями по сравнению с ТЕАСIC50 таких природных антиоксидантных объектов как пикногенол (4,88±0,19), рутин (4,52±0,15), аскорбиновая кислота (4,06±0,06), глутатион (3,75±0,07), -токоферол (1,83±0,02). Параллельно проводимые фармакологические исследования (проф. М.Б. Плотников) показали выраженное гиполипидемическое действие композиции с массовым соотношением ДГК:СДГ 1:1.

Оценка АРА композиционных состав компонентов I и II кинетическим способом. Исходя из данных, полученных деколоризационным методом, и результатов фармакологических исследований для дальнейшей оценки АРА были выбраны композиции с мольным соотношением ДГК:СДГ 1:1, 2:1, 5:1. Перед измерением ИП исследуемых композиций измеряли ИП растворов компонента I и II в метаноле (ИП1 и ИП2 соответственно) при тех же конечных концентрациях, что и в исследуемой композиционной смеси. Сравнивая рассчитанную аддитивную сумму ИП компонентов I и II и экспериментально наблюдаемый ИП композиции (ИП1+2) можно сделать вывод о наличии синергизма или антагонизма. Как было показано ранее, в данных модельных условиях компоненты I и II не являются «быстрореагирующими» ингибиторами, так как их добавление в инкубационную смесь приводило к плавному переходу горизонтальной части кинетической кривой в наклонную (рис. 2). Аналогичную картину наблюдали для исследуемых композиций (рис. 3).

Рис. 3. Кинетические кривые развития ABTS•+ в присутствии компонента I (кривая 1), компонента II (кривая 2) с молярной концентрацией ДГК и СДГ 0,025 мкмоль/мл соответственно, и их композиций в тех же концентрациях (кривая 3). Ось абсцисс – время после введения пероксидисульфата калия (t, мин), ось ординат – оптическая плотность инкубационного раствора.

Для всех исследуемых композиций выявлен эффект синергизма, возрастающий с уменьшением молярной концентрации ДГК в композиции (табл. 5). По-видимому, это является следствием взаимодействия находящихся в растворе молекул, входящих в состав компонента II, с окисленными формами ДГК, в результате которого происходит полное или частичное восстановление последнего. Ранее установлено, что АРА компонента I более чем в три раза превосходит таковую компонента II (табл. 3). Из этого можно предположить, что молекулы веществ компонента II, пошедшие на восстановление окисленного производного ДГК, в конечном итоге, опосредованно подавляют большее количество радикал-катионов ABTS•+ – это может являться основой синергетического антирадикального действия компонентов I и II.

Таблица 5. Характеристика антирадикального действия композиции «Дигидрокверцетин»-экстракт семян льна (кинетический метод)

Мольное соотношение ДГК:СДГ

Массовое соотношение

ДГК:СДГ

n

ИП1

ИП2

ИП1+2

Расчетная аддитивная сумма ИП

Синергизм, %

1:1

1:2

3

61,32±0,43

31,50±3,87

122,84±3,82

92,82±4,30

24,44±1,12

2:1

1:1

3

13,21±0,35

5,33±0,54

23,78±0,25

18,54±0,89

22,04±0,29

5:1

2:1

3

31,50±3,87

5,33±0,54

41,49±5,02

36,83±4,41

11,23±0,10

Разработка методики анализа композиции компонентов I и II

В качестве аналитического метода был выбран метод ВЭЖХ, который позволяет разделить вещества в ходе анализа с одновременным качественным и количественным их определением.

На стадии оптимизации пробоподготовки с целью освобождения анализируемой композиции от нежелательных примесей оценена возможность применения жидкостной экстракции с использованием различных по полярности растворителей. Для освобождения композиции от высших жирных кислот и липидов проводилась предварительная обработка компонента II гексаном. В качестве оптимального экстрагента ДГК и СДГ был выбран метанол.

Разработка условий ВЭЖХ анализа включала выбор способа детектирования, состава неподвижной и подвижной фаз и режима элюирования.

Спектр поглощения ДГК в метаноле в области длин волн от 230 до 380 нм характеризуется наличием полосы с минимумом при 247±2 нм и максимумом при 290±2 нм, имеющей плечо при 320-327 нм. Спектр СДГ в аналогичной области длин волн имеет максимум полосы поглощения при 280±2 нм и минимум при 255±2 нм. На основе анализа спектров поглощения ДГК и СДГ в качестве аналитической была предложена длина волны 280 нм. Соотношения интенсивностей полос поглощения ДГК и СДГ при этой длине волны составляют 3:1.

Общим в структуре флавоноидных и лигнановых составляющих исследуемой композиции является наличие малополярной ароматической углеводородной основы, имеющей в качестве заместителей полярные функциональные группы. Такой тип химического строения предполагает использование обращенно-фазового варианта ВЭЖХ.

Разработка состава подвижной фазы (ПФ) включала выбор органического компонента и кислотного модификатора. Задача данного этапа исследования состояла в поиске таких хроматограческих условий, которые позволили бы разделить пики ДГК и СДГ как основных определяемых веществ и исключить вложение в пики ДГК и СДГ соизвлекаемых соединений, входящих в состав композиции. Использование в качестве элюента ацетонитрила и водных растворов уксусной кислоты в изократическом режиме элюирования не позволило оптимизировать хроматографический процесс разделения ДГК и СДГ. Применение градиентного режима элюирования также не привело к положительному результату. При использовании метанола в качестве органического компонента происходило удовлетворительное разделение пиков ДГК и СДГ (критерий разделения пиков RS не менее 1,1) (табл. 6).

Таблица 6. Выбор органического компонента и условий разгонки

Время разгонки,

мин

Органический компонент

Кислотный модификатор (1% уксусная кислота)

Вывод

Ацетонитрил

Метанол

50

От 10 до 90%

-

От 90 до 10%

Нет разделения пиков СДГ и ДГК (Rs=0,1)

26

От 10 до 90%

-

От 90 до 10%

Скорость разгонки, мл/мин*

Нет разделения пиков СДГ и ДГК (Rs0,2)

0,5

1

2

60

От 15 до 55%

-

От 85 до 45%

Нет разделения пиков СДГ и ДГК (Rs=0,1)

40

От 10 до 90%

10%

От 80 до 0%

Двойной пик СДГ

26

От 10 до 90%

10%

От 80 до 0%

Двойной пик СДГ

25

От 20 до 70%

10%

От 70 до 0%

Двойной пик СДГ

30

От 10 до 90%

10%

От 80 до 0%

Двойной пик СДГ

60

-

От 15 до 55%

От 85 до 45%

Rs пиков ДГК и веществ компонента II = 0

20

-

От 25 до 80%

От 75 до 20%

Условия пригодны для анализа композиции

*другие эксперименты проводились при скорости разгонки 1 мл/мин

При поиске лучших параметров удерживания изучено влияние величины рН ПФ и типа кислотного модификатора на эффективность, разрешающую способность и размывание хроматографической зоны. При выборе кислотного модификатора ПФ опробованы растворы уксусной и ортофосфорной кислот. Применение в качестве кислотного модификатора уксусной кислоты не позволяет оптимизировать хроматографический процесс для каждого из определяемых компонентов. При использовании ортофосфорной кислоты удается достичь оптимальных значений коэффициента ёмкости k` (не менее 1,46). Критерий разделения пиков ДГК и СДГ не менее 2,8. В оптимальном диапазоне значений также находятся значения коэффициента асимметрии пиков As (от 0,97 до 1,10) и селективности (от 0,80 до 1,24). Максимальное значение эффективности хроматографической колонки (50 000 т.т. по пику ДГК) , k` (2,66 по пику СДГ) и RS (3,2)  предопределили выбор 0,02% ортофосфорной кислоты в качестве кислотного модификатора ПФ.

При выборе типа неподвижной фазы изучены параметры разделения на октил- и октадецилсилановом сорбентах. Установлено, что длина привитого углеводородного радикала сорбента не оказывает существенного влияния на характер хроматограммы. Однако, расчет хроматографических параметров показал, что при использовании колонки с октадецилсилановым сорбентом происходит более эффективное разделение ДГК и СДГ и достигается лучшая воспроизводимость площадей пиков.

Найдены оптимальные условия хроматографического анализа: колонка с октадецилсилановым  сорбентом (Luna 100А; 250x4,6 мм; 5 мкм), фаза А – метанол, фаза Б – 0,02% раствор ортофосфорной кислоты в воде. В начальный момент времени соотношение А:Б – 25:75 об.%; после 15 мин разгонки – 80:20 об.%. Температура колонки 20 °С. Все хроматографические параметры находятся в оптимальном диапазоне, что свидетельствует о высокой селективности хроматографического процесса.

Идентификация ДГК и СДГ в композиции была осуществлена методом внешнего стандарта и методом добавок. Порядок выхода анализируемых веществ композиции в условиях обращенно-фазовой хроматографии согласуется с их химическим строением: время удерживания СДГ меньше времени удерживания ДГК (рис. 4).

Валидация методики анализа композиции компонентов I и II

Валидация разработанной методики проведена по следующим характеристикам: специфичность, пригодность аналитической системы, линейность, правильность, сходимость.

Специфичность методики доказана анализом исследуемой композиции на разных длинах волн (от 220 до 360 нм) и анализом модельных смесей стандартов. Установлено, что на хроматограммах отсутствуют пики, мешающие определению ДГК и СДГ (рис. 4).

Процесс пробоподготовки был оптимизирован таким образом, чтобы нерастворимые в подвижной фазе компоненты экстракта семян льна не попадали в анализируемый раствор. Пики соизвлекаемых соединений, входящих в состав компонентов I и II, не мешают анализу основных определяемых веществ (критерий разделения пиков RS > 1).  Хроматограммы, иллюстрирующие селективность определения ДГК и СДГ в исследуемой композиции, представлены на рис. 4.

Рис. 4. Хроматограммы исследуемых объектов. А – композиция компонентов I и II; Б – компонент II; В – компонент I. Порядок выхода веществ на хроматограмме А: секоизоларицирезинола диглюкозид (9,76 мин), дигидрокверцетин (10,63 мин).

Пригодность аналитической системы оценивалась хроматографическими параметрами, характеризующими надёжность анализа в заданных условиях его проведения (табл. 7). Метрологические характеристики рассчитывали по данным трех повторных измерений модельных смесей (n=9) уровня вероятности 0,95 в соответствии с методикой, рекомендованной ГФ XII.

Таблица 7. Пригодность хроматографической системы

Секоизоларицирезинола диглюкозид

Степень разделе-ния пиков,

RS

Селектив-ность,

Дигидрокверцетин

Эффективность хроматографичес-кой колонки, т.т.

Коэффици-ент емкости,

k`

Относительное стандартное отклонение площади пика, %

Коэффици-ент асимметрии пика

Эффективность хроматографической колонки, т.т.

Коэффициент емкости

k`

Относительное стандартное отклонение площади пика, %

Коэффициент асимметрии пика

41514

2,15

2,34

0,96

3,2

0,8

52234

2,66

1,57

0,99

Эффективность хроматографической колонки по пику СДГ не менее 40000, по пику ДГК – не менее 50000 теоретических тарелок. Удовлетворительными являются значения параметров селективности α=0,8; разрешающей способности RS (не менее 2,7), служащие мерой качества разделения; воспроизводимости – относительное стандартное отклонение площади пиков менее 2,4%. Коэффициенты асимметрии пиков близки к 1. Таким образом, хроматографическая система является пригодной и характеризуется высокой эффективностью.

Линейность хроматографической методики исследовалась на модельных смесях в интервале от 70–130% заложенного содержания ДГК и СДГ в композиции. Зависимость аналитического сигнала (условных единиц площади пика) от содержания анализируемых веществ (в г) описана уравнением регрессии y = bx+a (b=1476393414, a=2008080 для ДГК; b=103415799, a=154385 для СДГ). Согласно полученным результатам, все линейные зависимости характеризуются высоким коэффициентом корреляции (R>0,99) и соблюдается линейная зависимость между величинами площадей хроматографических пиков и содержанием ДГК и СДГ в интервале 70–130% декларируемой величины. Этот интервал можно определить как аналитическую область методики.

Правильность методики установлена по результатам анализа модельных смесей и с использованием стандартных образцов для 3 повторных измерений 7 аналитических концентраций (табл. 8). Методика обладает удовлетворительной правильностью. Средний процент регенерации для ДГК составляет 99,6%, для СДГ – 100,3%. Все полученные данные находятся в интервале 99,3 – 100,5%.

Сходимость методики оценивалась исследованиями повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости результатов анализа модельных смесей (табл. 9). Полученные данные характеризуют удовлетворительную воспроизводимость данной методики: относительная ошибка среднего результата определения ДГК составляет 1,24%, СДГ – 1,84 %.

Таблица 8. Правильность методики

Количество определяемых веществ в % от заложенного в композиции

Состав модельной смеси, г

Найдено*, г

Регенерация*, %

ДГК

СДГ

ДГК

СДГ

ДГК

СДГ

70

0,02587

0,02970

0,02584

0,02984

99,9

100,5

80

0,03001

0,03370

0,02991

0,03387

99,7

100,5

90

0,03364

0,03795

0,03330

0,03790

99,0

99,9

100

0,03724

0,04230

0,03699

0,04220

99,3

99,8

110

0,04067

0,04647

0,04051

0,04668

99,6

100,4

120

0,04432

0,05062

0,04439

0,05071

100,2

100,2

130

0,04803

0,05479

0,04774

0,05507

99,4

100,5

*среднее из трех измерений        

Таблица 9. Сходимость методики

хi, мг

n

хср.±Δхср.

S

εср

Р, f

хi, мг

n

хср.±Δхср.

S

εср

По дигидрокверцетину

По секоизоларицирезинола диглюкозиду

37,4; 38,2; 38,1; 38,8 38,2; 39,2; 38,5; 37,5; 37,8

9

38,183±1,417

0,601

1,24

2,36

42,2; 41,8; 41,2; 40,7; 40,1; 43,4; 41,7; 40,8; 41,6

9

41,500±2,288

0,969

1,84

Исследование химического состава экстракта семян льна

В литературе достаточно полно охарактеризован состав продукта «Дигидрокверцетин». Данные о химическом составе экстракта семян льна ограничиваются указанием на содержание в нем СДГ не менее 40%.

Для более полной регистрации компонентов экстракта семян льна был применен метод хромато-масс-спектрометрии с времяпролётным масс-анализатором – сочетание газовой хроматографии с масс-спектрометрией (ГХ-МС). Установлено, что при температуре ниже 290 °С экстракт семян льна не хроматографируется; при 290 °С на хроматограмме наблюдалось лишь небольшое число пиков, характеризующихся невысокими значениями аналитического сигнала, что связано с низкой летучестью исследуемых веществ. Для улучшения газохроматографических свойств определение компонентов экстракта семян льна проводили в виде их триметилсилильных производных, что обеспечило возможность регистрации более полного масс-спектра экстракта. В качестве реагента для дериватизации использовали бис(триметилсилил)трифторацетамид. Общий вид хроматографического профиля силилированных производных при 209 С представлен  на рис. 5.

Под воздействием электронного удара и высокой температуры ряд компонентов экстракта семян льна подвергается химическим превращениям. Появление на хроматограмме таких веществ, как моноацилглицерины, глицерин, высшие жирные кислоты связано, по-видимому, с гидролизом триацилглицеринов и глицерофосфолипидов, а 2-(N,N-диметиламино)этанол, 1,3-дигидроксипропанон могут быть результатом деструкции или окисления продуктов гидролиза. Метиловые эфиры кислот и метилгликозиды, вероятно, образовались в результате взаимодействия карбоновых кислот и моносахаридов с метанолом, используемым в качестве растворителя на одной из стадий пробоподготовки. Моносахариды, дисахариды могут быть как результатом гидролиза полисахаридов и гликозидов лигнанов и фенолокислот, так и входить в экстракт семян льна в индивидуальном виде.

Идентификация 4-винилфенола, 4-винил-2-метоксифенола, 4-винил-2,6-диметоксифенола и матаирезинола была дополнительно осуществлена методом внешних стандартов. Установлено, что матаирезинол не подвергается химическим превращениям в условиях эксперимента, а 4-винилфенол, 4-винил-2-метоксифенол, 4-винил-2,6-диметоксифенол являются результатом декарбоксилирования соответствующих фенолокислот, как это представлено ниже:

R = R1 = H – п-кумаровая кислота

R = OCH3, R1 = H – феруловая кислота

R = R1 = OCH3 – синаповая кислота

3-Гидрокси-3-метилпентандиовая кислота является структурным компонентом олигомера, в виде которого СДГ входит в состав семян льна.

       Методом внешних стандартов доказано, что СДГ в указанных условиях анализа не хроматографируется.

Рис. 5. Хроматограмма экстракта семян льна после дериватизации бис(триметилсилил)трифторацетамидом, полученная с помощью метода ГХ-МС. В скобках указана степень совпадения с библиотечным масс-спектром.

       Исследование химического состава экстракта семян льна было дополнено результатами анализа с использованием метода ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией с электрораспылительной ионизацией (ВЭЖХ-МС/МС). Разделение компонентов экстракта семян льна осуществляли на колонке Hypersil GOLD aQ, заполненной октадецилсилановым сорбентом (150 2,1 мм, 3 мкм). Скорость потока подвижной фазы 0,5 мл/мин при температуре 30 °С. Условия разгонки: градиентный режим элюирования, фаза А – ацетонитрил, фаза Б – 1% раствор муравьиной кислоты в воде, фаза В – вода. В начальный момент времени соотношение А:Б:В = 5:90:5 об.%, после 15 мин разгонки – 90:5:5 об.%.

       Фрагментацию компонентов экстракта семян льна изучали в режиме регистрации положительно заряженных молекулярных ионов [М+Н]+, при котором также образуются ионы аддуктов с натрием. При найденных условиях происходит удовлетворительное разделение пиков определяемых веществ (рис. 6). В результате анализа было установлено, что в состав экстракта семян льна входят глюкозиды феруловой и п-кумаровой кислот (пики 5 и 6 соответственно), диглюкозид ларицирезинола (пик 7). Обнаружен СДГ, этерифицированный 3-гидрокси-3-метилпентандиовой кислотой и глюкозидом п-кумаровой кислоты (пик 3). Известно, что данное соединение является фрагментом макромолекулы, в виде которой СДГ входит в состав семян льна. Мажорный лигнан СДГ представлен смесью диастереомеров с преобладающим содержанием правовращающего стереоизомера (пики 8 и 9). Идентификация пиков, времена удерживания и содержание компонентов экстракта семян льна в процентах по абсолютной калибровке представлены в табл. 10.

Рис. 6. Хроматограмма экстракта семян льна, полученная с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС. Номера пиков на хроматограмме соответствуют номерам веществ, представленных в табл. 10.

Таблица 10. Результаты анализа химического состава экстракта семян льна методом ВЭЖХ-МС/МС

№ пика

Время  удерживания, мин

[M+Na]+

Соединение,

время удерживания, мин

Содержание по абсолютной калибровке, %

1

0,92

365,10

Сахароза

20,16

2, 4

4,04; 4,42

467,17

Олигосахариды (глюкоксиланы),

7,76

3

4,25

1161,6

2,89

5

4,75

348,64

2,42

6

4,96

379,10

2,15

7

5,34

707,25

6,16

8

5,52

709,27

СДГ (+)

38,71

9

5,71

СДГ (–)

15,90

       Идентификация пиков на хроматограмме ВЭЖХ композиции компонентов I и II. Идентификация пиков на хроматограмме, полученной методом ВЭЖХ, осуществлена методом внешних стандартов. Помимо идентифицированных ранее пиков ДГК и СДГ также были определены пики родственных дигидрокверцетину флавоноидных соединений – дигидрокемпферола и нарингенина; и лигнана матаирезинола. В данных условиях содержащиеся в компоненте II фенолокислоты хроматографируются, но идентифицировать соответствующие пики на хроматограмме не удалось. Причиной этого, по-видимому, явился тот факт, что фенолокислоты в компоненте II представлены в виде гликозидов.

С целью определения не идентифицированных гликозидов веществ, хроматографирующихся в данных условиях, был проведен гидролиз компонента II. Образец компонента II растворяли в 1 М хлороводородной кислоте и кипятили в течение 3 ч. Поскольку в данных условиях, наряду с гидролизом гликозидов, могут происходить химические превращения образующихся агликонов, аналогичный эксперимент параллельно проводили со стандартными образцами феруловой и п-кумаровой кислот. Контроль за ходом реакции осуществляли при помощи метода ВЭЖХ. На хроматограммах исследуемых объектов наблюдали постепенное исчезновение пиков со временами удерживания 6,16; 6,69; 7,95; 9,76 мин и появление новых пиков. Пики со временами удерживания 4,84 и 12,38 мин, обнаруженные на хроматограмме гидролизата, соответствуют продуктам химических превращений феруловой и п-кумаровой кислот. Реакция сопровождалась выпадением красно-коричневого осадка, нерастворимого в воде и хорошо растворимого в метаноле. На хроматограмме гидролизата этому веществу соответствует наиболее интенсивный пик со временем удерживания 16,15 мин. Методом ЯМР 1Н установлено, что данный осадок представляет собой секоизоларицирезинол, пик которого также наблюдается на хроматограмме компонента II. Таким образом, хроматографический анализ показал наличие в компоненте II производных феруловой и п-кумаровой кислот, лигнанов матаирезинола и секоизоларицирезинола. Идентификация пиков на хроматограмме композиции компонентов I и II показана на рис. 7.

Рис. 7. Идентификация пиков на хроматограмме ВЭЖХ композиции компонентов I и II. 1 – СДГ (9,76 мин); 2 – ДГК (10,63 мин); 3 – дигидрокемпферол (11,07 мин); 4 – нарингенин (12,27 мин); 5 – матаирезинол (13,93 мин); 6 –секоизоларицирезинол (16,15 мин).

Количественное определение полисахаридов в экстракте семян льна. В работе использован модифицированный антроновый метод Дрейвуда для спектрофотометрического определения полисахаридов в пересчете на ксилозу.

Экстракт семян льна после обработки гексаном экстрагировали метанолом, к сухому остатку добавляли раствор антрона в серной кислоте и нагревали на кипящей водяной бане. Спектры поглощения продуктов взаимодействия полисахаридов семян льна и ксилозы с антроном в этаноле обладают общим максимумом при длине волны 424±2 нм, которая была выбрана в качестве аналитической.

Концентрацию полисахаридов в пересчете на ксилозу определяли с помощью предварительно построенного градуировочного графика в системе координат концентрация ксилозы в этаноле (мг/мл) – оптическая плотность. Установлено, что содержание полисахаридов в экстракте семян льна составляет 2,19 %.

Правильность методики установлена по результатам анализа модельных смесей полисахаридов с ксилозой для 3 повторных измерений 7 различных концентраций. Среднее значение регенерации для ксилозы составляет 100,2%. Все полученные данные находятся в интервале 99,3 – 100,9%, что свидетельствует об удовлетворительной точности методики.

Воспроизводимость методики оценивали по повторяемости результатов анализа полисахаридов экстракта семян льна. Относительная ошибка в пересчете на ксилозу составляет 2,08%, что характеризует удовлетворительную воспроизводимость данной методики.

ВЫВОДЫ

  1. Определена антирадикальная активность композиций флавоноидного продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна в эквивалентах тролокса ТЕАС и концентрации, ингибирующей 50% свободных радикалов, IC50. Антирадикальная активность продукта «Дигидрокверцетин» (ТЕАС 5,41±0,14) более, чем в три раза, превышает таковую экстракта семян льна (ТЕАС 1,68±0,78).
  2. Получена оценка антирадикальной активности пяти композиций флавоноидного продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна при мольном соотношении ДГК:СДГ 10:1, 5:1; 1:1; 1:5; 1:10 деколоризационным способом. Для большинства композиций обнаружен эффект антагонизма, величина которого зависит от количественных соотношений компонентов и минимальна в случае композиции ДГК:СДГ 1:1 (–19,93±0,97%).
  1. Получены кинетические кривые развития радикал-катионов АВТS•+ в присутствии флавоноидного продукта «Дигидрокверцетин», экстракта семян льна и их композиций с мольным соотношением ДГК:СДГ 5:1, 2:1 и 1:1. По характеру кинетических кривых охарактеризованы степень и скорость, с которой исследованные объекты восстанавливают радикал-катионы.
  2. Осуществлена оценка антирадикальной активности трех композиций флавоноидного продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна при мольном соотношении ДГК:СДГ 5:1, 2:1, 1:1 кинетическим способом. Для всех композиций обнаружен эффект синергизма, возрастающий с увеличением молярной концентрации СДГ в композиции. Максимальный эффект составляет 24,44±1,12% для композиции ДГК:СДГ 1:1. Предложенный в качестве оптимального состав ДГК:СДГ 1:1 показал положительный результат в параллельном исследовании гиполипидемической активности.
  3. На основании метода ВЭЖХ разработана и оптимизирована по основным хроматографическим параметрам методика одновременного качественного и количественного определения ДГК и СДГ в композиции флавоноидного продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна. Оптимальным является обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ с градиентным режимом элюирования. В предлагаемых хроматографических условиях эффективность колонки по пику ДГК составила не менее 50000 т.т., по пику СДГ – не менее 40000 т.т., степень разделения всех пиков не ниже 2,5, фактор симметрии близок к единице. Относительное стандартное отклонение площади пика ДГК 1,57%; СДГ – 2,34%. Все хроматографические параметры находятся в оптимальном диапазоне.
  4. Изучен комплекс валидационных характеристик методики анализа ДГК и СДГ в композиции флавоноидного продукта «Дигидрокверцетин» и экстракта семян льна методом ВЭЖХ. Показана пригодность хроматографической системы, установлены специфичность, линейность в аналитической области ±30% по отношению к введенному содержанию определяемых веществ в композиции, сходимость и правильность методики.
  5. Методами ГХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС и ВЭЖХ установлено, что в состав экстракта семян льна входят триацилглицерины, фосфолипиды, высшие жирные кислоты (пальмитиновая, олеиновая, линоленовая), фенолокислоты (феруловая, п-кумаровая, синаповая), полисахариды, стерины (в частности, -ситостерин), лигнаны (секоизоларицирезинола диглюкозид, секоизоларицирезинол, матаирезинол, ларицирезинола диглюкозид), 3-гидрокси-3-метилпентандиовая кислота.
  6. Методом ВЭЖХ осуществлена количественная оценка содержания лигнанов в экстракте семян льна: секоизоларицирезинола диглюкозид – 42,08±0,10%, матаирезинол – 1,02±0,23%.
  7. Спектрофотометрическим методом с применением модифицированной методики Дрейвуда количественно определено содержание полисахаридов в экстракте семян льна равное 2,19% (в пересчёте на ксилозу). Примененная методика обладает удовлетворительным уровнем правильности и воспроизводимости (относительная ошибка определения не превышает 2,08%).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Андриуцэ Е.Н., Савватеев А.М., Тюкавкина Н.А., Белобородов В.Л. Количественный анализ методом ВЭЖХ композиции дигидрокверцетина и лигнанового экстракта семян льна // Материалы VII Международного симпозиума по фенольным соединениям. М. – 2009. – С. 17 – 18.
  2. Андриуцэ Е.Н., Ильясов И.Р., Савватеев А.М., Белобородов В.Л., Тюкавкина Н.А. Оценка антирадикальной активности экстракта семян льна и его композиций с дигидрокверцетином // Материалы XVII Национального конгресса «Человек и лекарство». М. – 2010. – С. 566.
  3. Андриуцэ Е.Н., Савватеев А.М., Тюкавкина Н.А., Белобородов В.Л. Анализ композиции экстракта семян льна и дигидрокверцетина // Материалы IV Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010». Воронеж. – 2010. – С. 31 – 33.
  4. Андриуцэ Е.Н., Ильясов И.Р., Тюкавкина Н.А., Белобородов В.Л., Савватеев А.М. Оценка деколоризационным методом антирадикальной активности экстракта семян льна и его композиций с дигидрокверцетином. // Материалы VII Международной конференции «Биоантиоксидант». М. – 2010. – С. 23 – 25.
  5. Зеня Е.Н., Ильясов И.Р., Тюкавкина Н.А., Савватеев А.М., Белобородов В.Л. Оценка антирадикальных свойств экстракта семян льна и его композиций с дигидрокверцетином // Бутлеровские сообщения. – 2012. – Т. 29. – № 1. – С. 62 – 67.
  6. Зеня Е.Н., Савватеев А.М., Тюкавкина Н.А., Белобородов В.Л. Разработка методики качественного и количественного определения компонентов композиции дигидрокверцетина и экстракта семян льна // Фармация. – 2012. – № 1. – С. 16 – 19.
  7. Зеня Е.Н., Савватеев А.М., Тюкавкина Н.А., Белобородов В.Л. Валидация методики качественного и количественного определения компонентов композиции дигидрокверцетина и экстракта семян льна // Фармация. – 2012. – № 3. – С. 14 – 17.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.