WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

1

На правах рукописи

Ворожейкин Сергей Борисович

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРОВ ПОДВИЖНЫХ ФАЗ НА РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ТСХ НА СИЛИКАГЕЛЕ

02.00.02. - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Саратов - 2012

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г.Чернышевского» Научный руководитель доктор химических наук, профессор Штыков Сергей Николаевич

Официальные оппоненты: Селеменев Владимир Федорович доктор химических наук, профессор, Воронежский государственный университет, заведующий кафедрой Барышева Светлана Владимировна кандидат химических наук, Энгельсский технологический институт Саратовского государственного технического университета, доцент

Ведущая организация: Самарский государственный университет

Защита состоится 25 мая 2012 года в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.07, созданного на базе ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского», 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, СГУ, корп.1, Институт химии.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского.

Автореферат разослан «23» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук Русанова Т.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Важная биохимическая роль и широкое применение аминокислот в фармацевтике, медицине, биотехнологии, пищевой промышленности, спортивной практике, широкий ассортимент выпускаемых на их основе коммерческих продуктов достаточно стандартного состава требуют разработки простых методов их разделения, идентификации и количественного определения в различных смесях. Одним из таких методов является тонкослойная хроматография. Несмотря на принадлежность к одному классу химических соединений, признаком которого является присутствие в молекулах -аминокислот одних и тех же функциональных групп, их химические и сорбционные свойства, вследствие различной природы и структуры основной части углеводородного остова молекулы, могут существенно различаться. В связи с этим аминокислоты подразделяют на несколько родственных групп.

Наиболее известна классификация, основанная на общей полярности молекулы, по которой аминокислоты делят на 4 группы: гидрофобные (неполярные), полярные, но незаряженные, полярные отрицательно заряженные и полярные положительно заряженные при рН 6-7 аминокислоты.

Такое разнообразие свойств аминокислот предполагает возможность регулирования эффективности и селективности их разделения с помощью различных по природе подвижных фаз (ПФ). Разделению аминокислот методом ТСХ посвящено большое количество публикаций, однако полной предсказуемости влияния природы различных модификаторов ПФ, в том числе мицеллярных подвижных фаз, до сих пор не имеется.

Цель: работы состояла в оценке влияния модификаторов водноорганических и водных подвижных фаз на хроматографическое разделение различных групп аминокислот методом ТСХ на силикагеле.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить влияние природы и концентрации гидрофобных нелокализующихся (дихлор-, трихлор-, тетрахлорметана) и локализующихся протонных (этанол) и апротонных (диметилформамид) модификаторов ПФ, на подвижность и разделение аминокислот на силикагеле;

- изучить влияние природы и концентрации поверхностно-активных веществ (ПАВ) различных типов (катионные, анионные и неионные) на подвижность аминокислот в водных ПФ на силикагеле;

- рассчитать количественные характеристики, характеризующие эффективность хроматографического разделения и разрешение хроматографических зон для всех исследованных подвижных фаз и сорбатов;

- выявить зависимость подвижности аминокислот от рН среды и ионной силы в мицеллярных подвижных фазах;

- оценить возможность практического применения изученных систем для разделения и определения аминокислот в реальных объектах.

Научная новизна работы:

- выявлены зависимости, характеризующие влияние концентрации и природы нелокализующихся хлоруглеводородных модификаторов, а также локализующихся модификаторов (этанола и диметилформамида) водноорганических ПФ на подвижность и хроматографическое разделение аминокислот различных групп методом ТСХ на силикагеле;

- установлены зависимости, характеризующие влияние концентрации и природы мицелл ПАВ в водной ПФ на подвижность и хроматографическое разделение различных групп аминокислот методом ТСХ на силикагеле;

- рассчитаны параметры, характеризующие эффективность и селективность хроматографического разделения аминокислот методом ТСХ на силикагеле в водно-органических и мицеллярных водных ПФ;

- найдены оптимальные условия разделения аминокислот, принадлежащих разным группам, в водно-органических и водных ПФ на основе динамических модификаторов и показана возможность применения в ТСХ всех видов ПФ для разделения и определения аминокислот.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют расширить возможности метода ТСХ на силикагеле при разделении аминокислот, используя для динамической модификации водно-органических ПФ локализующиеся и нелокализующиеся растворители различной природы, и ПАВ для водных ПФ.

Предложены методики разделения и полуколичественного определения аминокислот в трех коммерческих препаратах биологически-активных добавок «Фактор роста», «ВСАА» и «Элтацин».

На защиту выносятся:

- зависимости подвижности аминокислот от концентрации и природы модификаторов в водно-органических подвижных фазах, параметры эффективности и селективности их разделения на силикагеле;

- результаты влияния природы и концентрации ПАВ как модификаторов водных ПФ, кислотности среды и ионной силы раствора на подвижность аминокислот, параметры эффективности и селективности их хроматографирования в мицеллярных подвижных фазах;

- результаты применения водно-органических и мицеллярных ПФ для тестирования и количественного определения аминокислот в реальных объектах.

Личный вклад автора заключается в экспериментальном исследовании хроматографического поведения аминокислот в водно-органических и водных мицеллярных ПФ, выявлении концентрационных и других зависимостей их подвижностей, расчете параметров эффективности и селективности разделения, обработке, оформлении, обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций, выявлении направлений их практического применения.

Апробация работы. Основные результаты работы изложены на V Международной научной конференции «Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных регионов» (Элиста, 2006), VI-VIII Всероссийских конференциях молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов 2007, 2010, 2011), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), I Всероссийском симпозиуме с международным участием по поверхностноактивным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 8 работ в виде 1 статьи в журнале ВАК, 5 статей в сборниках и 2 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 1страницах машинописного текста включая введение, 4 главы, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 138 источника, приложение. В работе содержится 45 таблиц и 61 рисунок.

Благодарность. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю д.х.н., профессору Штыкову С.Н. за постоянное внимание к работе и участие в обсуждении результатов, а также Башко Е.С. за помощь при апробировании разработанных методик.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложена новизна, практическая значимость результатов и основные результаты выносимые на защиту.

В главе 1 представлено обобщение и систематизация литературных данных по современным методам, способам и приемам разделения и определения аминокислот, показаны преимущества и недостатки каждого из методов. Более подробно описаны способы, подвижные и неподвижные фазы, применяемые при разделении аминокислот методом ТСХ в водноорганических и мицеллярных ПФ.

В главе 2 описаны реактивы и оборудование, использованные в работе.

Объектами исследований явились аминокислоты: валин (вал), лейцин (лей), изолейцин (иле), фенилаланин (фен), триптофан (три), а также метионин (мет) и пролин (про), которые можно отнести к гидрофобным (далее 3 группа), поскольку углеводородный радикал аминокислоты не содержит ионизируемых групп. Представителями незаряженных при рН 6-7 аминокислот, способных образовывать водородную связь с молекулами воды и спиртами, были глицин (гли), серин (сер), треонин (тре), цистеин (цис), аспарагин (асн) (далее группа). Гидрофильными двухзарядными анионами являлись аспарагиновая (асп), глутаминовая (глу) кислоты, а двухзарядными катионами – лизин (лиз), аргинин (арг), гистидин (гис) (далее 1 группа).

Хроматографирование проводили методом восходящей ТСХ в стандартных герметичных камерах производства ЗАО «Сорбполимер», г.

Краснодар. Использовали пластинки «Сорбфил» (сорбент силикагель СТХ-1А, зернение 5-17 мкм, толщина слоя 110 мкм, размер пластинки 100х100 мм), ЗАО «Сорбполимер». Детектирование и количественную обработку хроматограмм проводили на видеоденситометре “Сорбфил”, ЗАО «Сорбполимер». В качестве подвижных фаз использовали водные растворы поверхностно-активных веществ (ПАВ) и кислотные водно-органические смеси, содержащие дихлор-, трихлор- и тетрахлорметан, этанол и диметилформамид (ДМФА). Объем ПФ составлял 5 мл, объем наносимой пробы - 1 мкл. ПАВ содержали более 98 % основного вещества, а растворители имели квалификацию «чда» и «хч».

Для оценки эффективности и селективности процесса разделения исследуемых соединений в мицеллярных и водно-органических ПФ использовали следующие характеристики: число теоретических тарелок (N), высоту, эквивалентную теоретической тарелке (ВЭТТ) и коэффициент селективности (). В главах 3-4 приведены результаты экспериментальных исследований.

Хроматографическое поведение аминокислот на силикагеле в ПФ модификатор : этанол : ледяная уксусная кислота : вода Изучено влияние природы и концентрации динамических модификаторов в водно-органических ПФ на основе уксусной кислоты, этанола и воды на подвижность, эффективность и селективность хроматографирования 17 аминокислот. В качестве модификаторов использовали дихлор-, трихлор- и тетрахлорметан. Варьирование концентрации модификаторов в присутствии постоянной концентрации этанола позволило установить, что гидрофильные аминокислоты в данных ПФ почти не разделяются. Наилучшее разделение двух других групп аминокислот достигается при концентрации хлоруглеводородов равной 47% (табл. 1), что в целом соответствует данным, описанным в литературе для трихлорметана.

Таблица 1. Оптимальные концентрации хлорсодержащего модификатора ПФ для разделения аминокислот в присутствии этанола Модификатор CH2Cl2 CHCl3 CClОбъемная 28 36 47 56 62 28 36 47 56 62 28 36 47 56 доля % +/- +/- +/- +/- +/- 1 группа +/- + +/- + +/- + + 2 группа +/- + +/- + + + +/- + + 3 группа 1 группа- гидрофильные аминокислоты ( арг, лиз, асп, глу, гис) 2 группа - незаряженные аминокислоты (гли, тре, сер, цис, асн) 3 группа - гидрофобные аминокислоты (мет, вал, три, фен, лей, иле, про) + - означает полное разделение, а +/- - только частичное разделение в группе.

Для анализа полученных результатов нами рассчитаны параметры полярности смесей указанных трех типов ПФ по Снайдеру, численные значения которых представлены в таблице 2. Чем больше величина индекса, тем больше полярность четырехкомпонентной ПФ. Примеры полученных графических зависимостей подвижности от параметра Снайдера при 47% модификатора представлены на рисунке 1.

Из полученных результатов следует, что параметр силы растворителя (0), модификатора - хлорпроизводного метана - в такой многокомпонентной ПФ не определяет изменение подвижности аминокислот. Этот параметр отражает силу взаимодействия растворителя с поверхностью НФ и изменяется Таблица 2. Значения индексов полярности Снайдера ПФ с этанолом (Рсмеси) Процентное содержание модификатора в ПФ Модификатор 62% 56% 47% 36% 28% CHCl3 4,40 4,45 4,51 4,60 4,CH2Cl2 3,78 3,89 4,05 4,24 4,CCl4 2,85 3,06 3,35 3,70 3,Rf Rf 0,8 Мет Вал 0,Гли 0,Три Тре 0,Фен 0,Сер 0,4 Лей Асп 0,Иле 0,Про Р=3,35 Р=4,05 Р=4,51 Р=3,35 Р=4,05 Р=4,0 CCI4 CH2CI2 CHCI3 CCI4 CH2CI2 CHCIМодификатор Модификатор а б Рис. 1. Влияние полярности ПФ на подвижность (а) незаряженных, (б) гидрофобных аминокислот.

для силикагеля в ряду CH2Cl2CHCl3CCl4 : 0.320.260.11. Из рис.1 видно, что изменение величины Rf, не соответствует этой последовательности. В большей степени подвижность, как незаряженных, так и гидрофобных аминокислот зависит от обобщенной полярности ПФ по Снайдеру, которая также отражает полярность растворителя, но принимает во внимание его межмолекулярное взаимодействие с растворенной частицей. Следует заметить, что в этой же последовательности изменяется и полярность по Снайдеру самих модификаторов CHCl3CH2Cl2CCl4 : 4.13.11.6.

Таким образом, полярность всей ПФ в нашем случае зависит от природы введенного модификатора (см. табл. 2), т.к. остальные компоненты ПФ остаются неизменными. Видно, что чем больше полярность системы растворителей, образующих ПФ, тем меньше Rf аминокислот, т.е. тем сильнее аминокислоты удерживаются неподвижной фазой. Отсутствие линейной зависимости подвижности от числа атомов хлора в молекуле углеводорода объясняется тем, что хлороформ является в бльшей степени протонодонором, чем его гомологи, и может сильнее взаимодействовать как с поверхностью силикагеля, так и аминокислотами.

При варьировании концентрации хлорсодержащего модификатора в ПФ обнаружена обратная тенденция. Уменьшение его содержания и, в связи с этим, увеличение общей полярности ПФ, вследствие возрастания относительной концентрации высокополярных компонентов - этанола, воды и уксусной кислоты - увеличивает подвижность исследуемых аминокислот за счет усиления межмолекулярных взаимодействий между указанными протонсодержащими компонентами и аминокислотами в объеме ПФ. Таким образом, введение нелокализующихся хлоруглеводородов позволяет, повидимому, изменять состояние поверхности силикагеля и её взаимодействие с другими компонентами ПФ и аминокислотами. В пользу этого свидетельствует также тот факт, что чем больше концентрация модификатора во всех ПФ, тем меньше время элюирования.

Можно отметить также, что чем больше гидрофобность хлоруглеводорода и аминокислот и меньше полярность ПФ, тем выше подвижность сорбатов. Оба факта свидетельствуют о том, что в таких ПФ на удерживание в большей степени влияет, по-видимому, взаимодействие с НФ полярных групп аминокислот, а не их гидрофобность. Интересно, что индекс полярности Снайдера для хлороформа при изменении его концентрации в указанных пределах меняется мало (см. табл.2), а подвижность (Rf) растет существенно. Для ди- и тетрахлорметана, наоборот, индекс полярности меняется существенно, а Rf, наоборот, незначительно. Величина Rf (или угол наклона концентрационной зависимости), кроме пролина (а для тетрахлорметана лейцина и изолейцина), практически не зависит от природы аминокислоты. Хотя все 3 модификатора принадлежат к одной группе нелокализующихся на силикагеле растворителей, хлороформ имеет наибольший индекс полярности и, кроме того, является протонодонором, т.е.

наиболее сильно может изменять поверхность силикагеля и её взаимодействие с аминокислотами. Кроме того, хлороформ и дихлорметан принадлежат к VIII и V группам растворителей по Снайдеру, соответственно. В VIII группе селективность обусловлена в основном протонодонорными, а в V - дипольными свойствами растворителя в треугольнике селективности Снайдера.

Расчет методом наименьших квадратов зависимости подвижности аминокислот от концентрации модификатора в интервале 36-62% в системах с этанолом показал, что в основном они имеют линейный характер (табл.3), хотя в ряде случаев эта линейность соблюдается в более узком интервале концентраций модификатора. Анализ зависимостей подвижности аминокислот от их молекулярной массы показал, что при её увеличении примерно до 140, подвижность аминокислот растет, а далее практически не изменяется.

Установленные зависимости позволяют сделать заключение, что для лучшего разделения аминокислот в их смеси следует использовать элюент с хлористым метиленом в концентрации 47-56 % от общего объема исходного элюента, поскольку в этих условиях достигается наибольшая эффективность процесса хроматографирования (рис.2). Рассчитаны параметры эффективности Таблица 3. Уравнения линейных зависимостей подвижности аминокислот в системах с этанолом в интервале концентраций модификатора 36 – 62% Модификатор АК CHCl3 R2 CH2Cl2 RАсп -0,006х+0,388 0,9Гис - 0,002х + 0,188 0,9Гли -0,013х + 0,787 0,906 -0,010х+0,667 0,9Тре -0, 018х + 1,09 0,905 -0,013х+0,848 0,9Цис - 0, 013х + 0,853 0,969 -0,011х+0,813 0,9Асн -0,012х+0,760 0,9Мет -0, 019х + 1,28 0,962 -0,009х+0,844 0,9Вал -0, 018х + 1,21 0,949 -0,008х+0,741 0,9Три -0,012х+1,01 0,9Фен -0, 017х + 1,27 0,952 -0,013х+1,08 0,9Лей -0, 019х + 1,31 0,9Иле -0,0104х+0,909 0,9Про -0,0080х+0,583 0,9Таблица 4. Параметры эффективности и селективности разделения аминокислот при различных концентрациях хлористого метилена с этанолом 36% 47% АК H10-2 H10-Rf N10-2 мкм N10-2 мкм Rf Гли 0,21 6,9 - 0,35 0,22 6,9 - 0,Тре 0,42 2,5 20 0,45 0,62 2,5 7,0,Сер 0,71 3,6 19 0,39 0,82 3,6 8,0,Асн 0,52 4,1 20 0,31 0,33 4,1 6,0,Мет 0,71 2,1 0,51 9,1 0,65 4,1 5,2 Вал 0,66 3,1 0,88 7,2 0,59 3,5 8,7 5,Три 0,77 7,2 0,51 10 0,72 8,9 4,7 5,Фен 0,74 6,1 0,61 13 0,69 5,4 6,4 8,Лей 0,71 5,8 0,72 9,6 0,64 6,3 6,6 4,Иле 0,64 3,8 0,82 8,7 0,55 4,1 7,5 7,Про 0,43 1,6 2,1 - 0,39 1,6 2,1 - Параметр селективности незаряженных АК рассчитан по отношению к глицину.

Параметр селективности гидрофобных АК рассчитан по отношению к пролину.

и селективности разделения аминокислот при различных концентрациях хлоруглеводородов в ПФ с этанолом; пример расчета приведен в таблице 4.

а б Рис. 2. Разделение гидрофобных аминокислот в ПФ: хлористый метилен : этанол : уксусная кислота : вода. а - 47%, б - 56% CH2CI2. Слева направо: метионин, валин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин, пролин.

Хроматографическое поведение аминокислот на силикагеле в ПФ модификатор : ДМФА : ледяная уксусная кислота : вода Поскольку изменение природы модификаторов позволяет регулировать элюирующую силу и селективность разделения также за счет эффектов локализации растворителя на сорбенте и образования водородных связей нами сделана попытка заменить локализующийся протонодонорный компонент ПФ этанол на основный протонакцепторный ДМФА. Оптимальные ПФ в системе модификатор : ДМФА : ледяная уксусная кислота : вода в соотношении х : 4,: 1,3 : 0,6. для разделения аминокислот приведены в таблице 4. Таким образом, протонный растворитель этанол, способный образовывать водородные связи как с силанольными, так и силоксановыми группами силикагеля и с разделяемыми аминокислотами, был заменен на апротонный ДМФА, не способный взаимодействовать с силоксановыми группами и имеющий другой характер взаимодействия с силанольными группами и аминокислотами.

Таблица 4. Оптимальные концентрации хлорсодержащего модификатора ПФ для разделения аминокислот в присутствии ДМФА CH2Cl2 CHCl3 CCl% модификатора 28 36 47 56 62 28 36 47 56 62 28 36 47 56 1 группа + + + + + + + + + +/- 2 группа +/- + + + + +/- + + +/- 3 группа +/- +/- +/- +/- Рассчитанные значения индексов полярности по Снайдеру приведены в таблице 5. Видно, что такие ПФ более полярны, чем ПФ с этанолом и с уменьшением концентрации модификатора полярность растет значительнее.

Таблица 5. Значения индексов полярности Снайдера ПФ с ДМФА (Рсмеси).

Процентное содержание модификатора в системе Модификатор 62% 56% 47% 36% 28% CHCl3 4,96 5,11 5,30 5,54 5,CH2Cl2 4,34 4,55 4,83 5,18 5,CCl4 3,41 3,72 4,13 4,64 5,Сравнение таблиц 4 и 1 и анализ данных показывают, что поведение аминокислот в присутствии апротонного ДМФА изменилось:

- стало возможным разделение полярных аминокислот 1 группы и невозможно гидрофобных аминокислот 3 группы;

- количество вариантов систем растворителей для разделения 1-2 групп увеличилось;

- разделение аминокислот 1-2 групп стало возможным при более низких концентрациях хлорсодержащих модификаторов;

- вследствие увеличения общей полярности ПФ с ДМФА, по сравнению с аналогичными ПФ на основе этанола, возросла общая подвижность аминокислот;

- при замене этанола на ДМФА уменьшилась ВЭТТ. Чем меньше концентрация ДМФА, тем больше разница в ВЭТТ. Например, при разделении незаряженных аминокислот в присутствии хлороформа и концентрации ДМФА 36% значения ВЭТТ в 2-8 раз меньше, чем в присутствии этанола.

Пример хроматограмм для гидрофильных аминокислот дан на рис.3.

а б в Рис. 3. Разделение гидрофильных аминокислот в ПФ: 36% модификатора : ДМФА :

уксусная кислота : вода. а – CCI4, б – CHCI3, в – CH2CI2. Слева направо: аргинин, лизин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, гистидин.

Так же как и для систем с этанолом, при увеличении полярности ПФ в результате изменения природы хлоруглеводородного модификатора подвижность аминокислот уменьшается, т.е. растет их конкуренция с компонентами ПФ при сорбции на силикагеле. Для гидрофильных аминокислот этот эффект незначителен, а для незаряженных более выражен, особенно при большой концентрации модификатора (рис.4).

Влияние полярности системы при изменении концентрации модификатора на подвижность аминокислот также соответствует тенденции, найденной для этанола: с увеличением концентрации модификатора и уменьшением полярности ПФ подвижность аминокислот уменьшается (рис.5, 6). Таким образом, при высокой концентрации нелокализующегося хлоруглеводорода, как и в случае этанола, проявляется его экранирующая роль и аминокислота слабее сорбируется на неподвижной фазе. Как видно из рис. 6, в диапазоне концентраций хлороформа (и других хлоруглеводородов) от 28% до 47% улучшаются эффективность и селективность разделения: исчезают так называемые "хвосты", пятна становятся более компактными.

Rf Rf 0,Арг Гли 0,0,Лиз Тре Асп 0,Сер 0,Глу Асп 0,0,2 Гис Р=5,01 Р=5,43 Р=5,0,CCI4 CH2CI2 CHCI28% 36% 47% Концентрация Концентрация Рис. 4. Влияние полярности ПФ, Рис. 5. Динамика значений Rf содержащей разные модификаторы, на гидрофильных аминокислот при подвижность незаряженных аминокислот. изменении концентрации CCI4 в ПФ, содержащей ДМФА.

Рис. 6. Влияние концентрации CHCI3 (28%-47%) на разделение гидрофильных аминокислот.

Как и с этанолом, при увеличении концентрации модификатора длительность элюирования уменьшается. В целом же, процесс элюирования, в системах с ДМФА, более длителен во времени, по сравнению с элюированием в ПФ с этанолом. Зависимости подвижности аминокислот в случае ДМФА в интервале концентраций хлоруглеводорода 36 – 62% также имеют линейный характер (табл. 6). Пример расчета параметров эффективности и селективности в ПФ, содержащей ДМФА приведен в таблице 7.

Таблица 6. Уравнения зависимостей подвижности аминокислот в ПФ с ДМФА в интервале концентраций модификатора 36 – 62%.

Модификатор Аминокислота CHCl3 R2 CH2Cl2 R-0,005х + 0,313 0,944 -0,005х + 0,302 0,9Арг - - -0,002х + 0,134 0,9Лиз -0,012х + 0,716 0,928 -0,011х + 0,713 0,9Асп -0,016х + 0,980 0,983 -0,011х + 0,818 0,9Глу - - -0,004х + 0,279 0,9Гис -0,014х + 0,815 0,983 -0,012х + 0,771 0,9Гли -0,018х + 1,06 0,929 -0,017х + 1,12 0,9Тре -0,013х + 0,795 0,963 -0,015х + 0,983 0,9Сер -0,013х + 0,777 0,931 -0,012х + 0,745 0,9Асн -0,025х + 1,62 0,988 -0,023х + 1,71 0,9Мет -0,023х + 1,49 0,989 -0,021х + 1,54 0,9Вал -0,026х + 1,65 0,946 -0,024х + 1,76 0,9Три -0,024х + 1,60 0,952 -0,021х + 1,68 0.9Фен -0,024х + 1,60 0,988 -0,023х + 1,77 0,9Лей -0,025х + 1,64 0,988 -0,022х + 1,68 0,9Иле -0,018х + 1,11 0,971 -0,018х + 1,26 0,9Про У хлороформа линейная зависимость исследовалась в интервале 36-60% Основываясь на результатах, полученных для водно-органических ПФ, следует отметить, что общая полярность ПФ зависит от природы введенного модификатора; чем больше эта полярность, тем меньше подвижность аминокислот, а следовательно, тем сильнее аминокислоты удерживаются неподвижной фазой. Варьируя же концентрацию модификатора, можно менять поверхность силикагеля, создавая, тем самым, оптимальные условия для хроматографического разделения аминокислот разных групп.

Таблица 7. Параметры эффективности и селективности разделения аминокислот в присутствии хлористого метилена и ДМФА.

28% 36% 47% АК Rf N10-2 H10-2 N10-2 H10-2 N10-2 H10-2 Rf Rf мкм мкм мкм Арг 0,39 1,4 1,1 5,7 0,26 0,44 2,3 8,5 0,19 0,87 0,81 5,Лиз 0,15 0,41 1,9 6,3 0,11 0,25 0,19 5,3 0,11 0,31 1,1 7, Асп 0,61 2,8 1,2 6,7 0,64 1,8 1,3 6,2 0,43 0,75 1,7 9,Глу 0,71 8,2 0,52 6,2 0,71 6,9 0,47 4,3 0,53 3,2 0,63 8,Гис 0,11 0,41 3,1 0,11 0,31 3,6 0,16 0,41 1,Гли 0,52 1,4 2,6 0,47 1,2 2,1 0,37 0,94 1,Тре 0,71 9,7 0,41 8,1 0,66 7,7 0,41 7,3 0,49 8,2 0,23 5,Сер 0,60 8,6 0,38 3,6 0,56 6,6 0,38 3,6 0,53 3,6 0,53 6,Цис 0,55 7,7 0,55 4,2 0,52 6,7 0,57 4,1 0,47 5,9 0,61 5,Асн 0,47 6,2 0,65 5,4 0,41 6,3 0,41 6,3 0,37 2,3 0,67 4,Параметр селективности гидрофильных АК рассчитан по отношению к гистидину.

Параметр селективности незаряженных АК рассчитан по отношению к глицину.

Замена протонодонорного растворителя этанола на апротонный ДМФА позволила ещё больше расширить вариабельность ПФ и улучшить эффективность хроматографического процесса. Полученные данные позволяют сделать вывод, что системы с этанолом и ДМФА дополняют друг друга и позволяют подобрать оптимальную ПФ для каждого конкретного объекта, содержащего те или иные группы аминокислот.

Хроматографическое поведение аминокислот в мицеллярных подвижных фазах Как следует из анализа литературных данных число работ, посвященных применению мицеллярных подвижных фаз (МПФ) для разделения аминокислот, не более десяти, причем практически во всех используют обращенные НФ. Нами поставлена цель оценить возможность применения МПФ для разделения аминокислот на полярном силикагеле. Для достижения данной цели, изучали влияние следующих факторов:

- природы ПАВ;

- концентрации ПАВ;

- величины ионной силы раствора в МПФ, позволяющей регулировать взаимодействие аминокислоты с мицеллой;

- кислотности среды, позволяющей регулировать химическую форму аминокислоты в растворе.

1. Влияние анионного ПАВ – ДДС.

Изучено влияние водных растворов ионных и мицеллярных концентраций анионного поверхностно-активного вещества (АПАВ) – додецилсульфата натрия (ДДС) на разделение аминокислот. Установлено, что величина Rf нейтральных аминокислот в присутствии мицелл ДДС близка к единице, т.е. их разделение практически невозможно, поэтому далее хроматографическое поведение аминокислот этой группы не рассматривается.

Гидрофильные аминокислоты разделяются хорошо, а гидрофобные можно разделить лишь частично при более низкой концентрации ДДС (рис. 7).

Влияние концентрации ДДС на подвижность гидрофильных аминокислот, параметры эффективности и селективность показано в таблице 8.

а б Рис 7. Разделение гидрофильных аминокислот в МПФ на основе 0,02 М ДДС (а) и гидрофобных аминокислот в МПФ на основе 0,005 М ДДС (б).

Установлено, что использование в качестве ПФ мицеллярного водного раствора ДДС обуславливает наличие на хроматограмме двойного фронта элюента, что соответствует литературным данным: первый фронт содержит главным образом воду и растворенные в ней ионы ДДС, а второй – воду и мицеллы ПАВ. С увеличением концентрации ДДС второй фронт постепенно ближается с первым. Показано, что аминокислоты – аргинин и лизин всегда находятся во втором фронте, поэтому изменение концентрации ДДС позволяет влиять на их подвижность. На примере этих двух аминокислот показано, что увеличение концентрации ДДС в ПФ сопровождается несколькими эффектами:

- увеличением подвижности обеих аминокислот, переносимых мицеллами;

- увеличением расстояния между их хроматографическими зонами (рис.8);

- бльшим удерживанием неподвижной фазой более гидрофобного лизина.

Следует отметить, что бльшее удерживание более гидрофобного лизина соответствует общей тенденции мицеллярной ТСХ и объясняется гидрофобизацией силикагеля при динамической адсорбции ДДС на поверхности сорбента. Установлено что, наилучшее разделение аминокислот возможно в интервале концентраций ДДС - 0,02-0,04 М.

Рис. 8. Влияние концентрации ДДС в ПФ на подвижность 1-лизин, 2аргинин.

Ионная сила, создаваемая добавлением хлорида натрия, также сильно влияет на хроматографическое поведение аргинина и лизина. В диссертации представлены вычисленные нами значения параметров эффективности и селективности хроматографирования аминокислот при варьировании мицеллярной концентрации ПАВ и ионной силы раствора. Увеличение концентрации электролита в растворе «высаливает» аминокислоты из водной среды в менее полярное мицеллярное окружение, т.е. увеличивает их солюбилизацию мицеллами ПАВ - переносчиками аминокислот. Следствием этого должно быть уменьшение сорбции аминокислот на неподвижной фазе и увеличение их подвижности в МПФ, что и наблюдалось в эксперименте.

Графически влияние ионной силы раствора на примере гидрофильных аргинина и лизина показано на рис. 9а. Действие ионной силы уменьшается с увеличением мицеллярной концентрации ДДС, поскольку этот фактор также улучшает солюбилизацию аналита. Установлено, что применять концентрации электролита более чем 0.13 М не рекомендуется, так как происходит размывание хроматографических зон.

Проверка влияния величины рН подвижной фазы вызвана большим числом основных и кислотных групп в молекулах аминокислот, способствующих реализации в растворе нескольких химических форм с разными сорбционными и солюбилизационными свойствами. Наиболее существенно рН влияет только на подвижность аргинина и лизина (рис 9б). С увеличением рН подвижность аминокислот уменьшается, что связано с диссоциацией карбоксильных групп (перегиб кривых примерно соответствует рКдис в мицеллах ДДС) и отталкиванием анионов сорбатов от одноименно заряженной мицеллы ДДС.

Видно также, что растет Rf (эффект дифференцирования), что является положительным фактором, однако из-за одновременного увеличения размеров пятен (уменьшения эффективности) использовать щелочную среду не рекомендуется. При низких значениях рН зоны аргинина и лизина более узкие и вытянуты вдоль основания пластинки. Зависимость времени элюирования гидрофильных и гидрофобных аминокислот от концентрации ДДС одинаковая: с её повышением время элюирования возрастает в 2-3 раза.

Rf Rf 0,0,ДДС 0,0,0,021 М ДДС Аргинин 0,0,0,027 М Лизин ДДС 0,0,0,033 М 0,0,0,01 0,02 0,рН 2,6 5,2 Ионная сила а б Рис 9. Влияние ионной силы раствора на подвижность аргинина (а) и рН на подвижность аргинина и лизина (б).

2. Влияние катионного ПАВ - ЦПХ. Аналогичные исследования выполнены в ПФ с катионным ПАВ (КПАВ) - цетилпиридиний хлоридом (ЦПХ). Частичное разделение нейтральных и гидрофобных аминокислот происходит только при достаточно высоких мицеллярных концентрациях ЦПХ (рис.10). Гидрофильные аминокислоты удалось разделить при концентрации ЦПХ 0,002 М. Следует отметить, что подвижность аспарагиновой и глутаминовой кислот, при данной концентрации, достаточна высокая, а аргинина и лизина, наоборот, низкая (см. рис. 10). По видимому, это связано с взаимным отталкиванием положительно заряженных полярных молекул аминокислот и катионных мицелл ПАВ.

Небольшой дифференцирующий эффект для гидрофильных аминокислот получен при введении в ПФ, содержащую ЦПХ, 0.4-0.5 М электролита (Рис.11а). Возможно, это объясняется усилением солюбилизации аминокислот и увеличивается подвижность аргинина и лизина.

Сильное влияние на разделение аминокислот оказывает кислотность ПФ (рис.11б). В целом ход этой зависимости соответствует интервалам рН, смены одной химической формы аминокислоты в другую. Видно, что в щелочной среде происходит резкое снижение Rf аргинина и лизина, поскольку в растворе начинают преобладать анионные формы аминокислот, которые, вероятно, сильнее взаимодействуют с положительно заряженной поверхностью сорбента за счет образования бислоя КПАВ.

Нейтральные аминокислоты частично делятся во всем интервале рН среды. Но наилучшее разделение наблюдается в щелочной среде. Данный факт объясняется тем, что нейтральные аминокислоты так же, как и гидрофильные, приобретают в данных условиях отрицательный заряд.

3. Влияние неионного ПАВ - Тритон Х-100. Аналогичные исследования для всех аминокислот выполнены в ПФ с неионным поверхностно-активным веществом (НПАВ) - Тритон Х-100 (ТХ-100).

а б Рис. 10. Разделение гидрофильных аминокислот в МПФ на основе 0,002 М. ЦПХ (а) и гидрофобных аминокислот в МПФ на основе 0,005 М ЦПХ (б).

Как видно из рис.12а в МПФ на основе ТХ-100 удалось разделить три представителя из пяти гидрофильных аминокислот - лизин, гистидин и глутаминовую кислоту и 5 гидрофобных аминокислот из семи (рис.12б).

Солюбилизация гидрофобных аминокислот нейтральными мицеллами происходит, по-видимому, за счет преимущественно гидрофобных взаимодействий.

Рассмотрено также влияние ионной силы раствора на разделение аминокислот. Как и для других МПФ, с увеличением ионной силы раствора существенно растет, в основном, подвижность лизина и аргинина (рис. 13а), для гистидина этот рост не превышает 0.1 ед. Rf, а для двух других аминокислот, идущих с фронтом растворителя, изменения практически отсутствуют.

Rf Rf 0,0,0,0,Аргинин Аргинин Лизин 0,0,Лизин 0,0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 2 4 6 8 10 рН Ионная сила а б Рис. 11. Влияние ионной силы (а) и рН среды (б) на подвижность аргинина и лизина в ПФ, содержащей 0,03 М ЦПХ.

а б Рис. 12. Разделение гидрофильных (а), слева направо: лизин, глутаминовая кислота, гистидин; и гидрофобных (б) аминокислот (слева направо: метионин, валин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин, пролин) в МПФ на основе 0,005 М ТХ-100.

Необходимо отметить, что модификация данной МПФ за счет введения хлорида натрия, позволила разделить 4 гидрофильные аминокислоты, например при ионной силе 0,1. Введение электролита в ПФ с ТХ-100, позволило выявить две закономерности для гидрофильных аминокислот - аргинина и лизина: во-первых, большую насыщенность окраски пятен аргинина и лизина с повышением ионной силы раствора, вероятно, за счет всаливания аминокислот в мицеллу и улучшения их реакции в мицеллярном нанореакторе с нингидрином; во-вторых, увеличение подвижности сорбатов, за счет гидрофобизации неионным ПАВ гидрофильной поверхности силикагеля при его адсорбции на поверхности.

Rf 0,Rf 0,0,0,0,Аргинин Аргинин 0,Лизин 0,6 Лизин 0,0,0,4 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 2 4 6 8 10 рН Ионная сила а б Рис. 13. Влияние ионной силы (а) и рН (б) на подвижность аргинина и лизина в ПФ на основе 0,03 М ТХ-100.

Зависимость подвижности от кислотности среды в МПФ на основе ТХ100 имеет тот же характер, как и для КПАВ, объясняемый протеканием в растворе кислотно-основных реакций. На подвижность гидрофобных аминокислот кислотность среды практически не влияет. Разделить нейтральные аминокислоты, варьируя рН среды не удалось, по-видимому, изза их плохой солюбилизации в мицеллах Тритон Х-100.

Резюмируя полученные данные по всем мицеллярным ПФ, можно сделать следующие выводы:

- хорошее разделение гидрофильных аминокислот происходит в МПФ, содержащей 0,002 М водный раствор ЦПХ, оно несколько лучше в МПФ, содержащей 0,02 М водный раствор ДДС; концентрации этих ПАВ в обоих случаях примерно в 2 раза превышают ККМ, т.е. в растворе присутствуют сферические мицеллы, что согласуются с тенденциями в ТСХ, известными для других классов соединений; основная проблема в обеих МПФ – разделение глутаминовой и аспарагиновой кислот; в 0,005 М растворе ТХ-100 возможно разделение трех гидрофильных аминокислот;

- гидрофобные аминокислоты частично разделяются во всех трех видах МПФ ДДС, ЦПХ и Тритон Х-100, при примерно одинаковой концентрации ПАВ, равной 0,005 М;

- при увеличении концентрации ПАВ, в большинстве случаев число теоретических тарелок увеличивается, а ВЭТТ - уменьшается, т.е.

эффективность разделения улучшается;

- незаряженные аминокислоты частично можно разделить в МПФ на основе ЦПХ при концентрации 0,06 М;

- на разделение аминокислот сильное влияние оказывает рН среды и ионная сила раствора;

- зависимость длительности процесса элюирования от концентрации ДДС, для гидрофильных и гидрофобных аминокислот одинаковая: с повышением концентрации ДДС время элюирования растет; увеличение концентрации ЦПХ и ТХ-100 практически не влияет на длительность процесса элюирования;

- с увеличением молекулярной массы гидрофильных аминокислот подвижность во всех МПФ уменьшается, а для нейтральных и гидрофобных, наоборот, возрастает.

Практическое применение метода ТСХ в мицеллярных подвижных фазах и на основе органических компонентов В выбранных оптимальных условиях проведено разделение аминокислот в трех объектах: "Фактор роста", "Элтацин", "ВСАА 1000". Данные препараты повышают толерантность организма к физическим нагрузкам и увеличивают мышечную массу. Примеры хроматограмм, иллюстрирующих разделение аминокислот в выбранных объектах, представлены на рис.14-15. Результаты количественного определения аминокислот в исследуемых объектах статистически обработаны. Для выявление выбросов в полученных выборочных совокупностях результатов определения аминокислот в коммерческих препаратах БАДов использовали рекомендованный в ГОСТ ИСО/МЭК 5725-2000 критерий Граббса (Р = 0.95). После отбрасывания выпадающих результатов для каждой ПФ вычисляли дисперсию и рассчитывали F-критерий для пары водно-органическая ПФ/мицеллярная ПФ (Р = 0.95) и сравнивали полученную величину с табличной. Если FэкспFтабл, дисперсии принимали однородными, а результаты равноточными. Наличие систематических погрешностей между средними значениями, полученными при использовании водно-органических и мицеллярных ПФ оценивали по tкритерию. Обобщенные результаты вычислений представлены в таблице 8.

а б Рис. 14. Разделение гидрофильных аминокислот в ПФ на основе 0.03 М ДДС (а);

слева - направо: арг, лиз, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, гис. Цифры - аминокислоты, разделенные в БАДе "Фактор роста": 1-арг, 2-лиз, 3- орнитин; и (б) аминокислот в объектах "Фактор роста":1-арг; 2-лиз; 3-орнитин; объекте "Элтацин": 1-глу;

2-гли; 3-цис; "ВСАА-1000": 1-лей; 2-иле; 3-вал ПФ: 47% CH2CI2:ДМФА: CH3COOH: вода.

а б Рис. 15. Разделение гидрофобных (а) аминокислот; слева-направо: метионин, валин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин, пролин. Цифрами обозначены аминокислоты, разделенные в БАДе "ВСАА1000": 1- лей; 2- иле; 3- вал и незаряженных (б) слеванаправо: гли, тре, сер, цис, асн и глу. Цифры - аминокислоты, разделенные в БАДе "Элтацин": 1-глу, 2-гли, 3-цис. ПФ: 36% CHCI3:ДМФА:CH3COOH: вода.

Таблица 8. Метрологические параметры определения аминокислот в БАДах с помощью водно-органических и мицеллярных ПФ (P=0,95) Ам. __ F F t t Объект n ПФ S2 S к-та m, мг эксп. табл. эксп. табл.

8 в-о* 94,6 3,51 1,5,07 3,6 4,58 2,15 ДДС 88,3 17,8 4,ЦПХ 86,9 35,6 5,97 10,1 4,74 2,21 4,6 ТХ-100 89,3 41,3 6,43 11,8 4,74 1,41 4,8 в-о 17,7 0,83 0,11,3 3,6 4,1 2,15 ДДС 21,2 9,36 3,6 ЦПХ 21,2 5,34 2,31 6,4 4,74 2,55 4,6 ТХ-100 20,0 31 5,57 37,8 4,74 0,71 4,15 в-о 128 16,5 4,7,09 19,38 1,37 2,6 ЦПХ 117 2,33 1,15 в-о 130 33,1 5,1,09 19,35 0,746 2,6 ЦПХ 125 30,3 5,7 в-о 178 19,0 4,1,31 4,76 0,006 2,4 ЦПХ 178 24,9 4,8 ТХ-100 177 70 8,37 3,69 4,53 0,14 2,7 в-о 184 64 8,1,02 8,94 0,51 2,4 ЦПХ 186 63 7,8 ТХ-100 184 26,8 5,18 2,39 6,16 0,105 2, в-о* - водно-органические ПФ.

Аргинин "Фактор Роста" "ВСАА 1000" "Элтацин" Лей-Иле Вал Глу Гли Лизин ВЫВОДЫ:

1. Изучено влияние нелокализующихся ди-, три- и тетрахлорметана и локализующихся протонодонорного (этанол) и протоноакцепторного (диметилформамид) растворителей на хроматографическую подвижность аминокислот, относящихся к полярным, неполярным и гидрофобным группам.

Показано, что на их подвижность влияет полярность по Снайдеру четырехкомпонентной системы растворителей, образующей ПФ; чем она больше в ряду CHCl3CH2Cl2CCl4, тем меньше Rf аминокислот, т.е. тем сильнее они удерживаются неподвижной фазой. Эта тенденция сильнее выражена для ПФ, содержащей в качестве второго модификатора этанол.

Уменьшение концентрации хлорсодержащего модификатора, также увеличивающего полярность ПФ, увеличивает подвижность аминокислот за счет усиления межмолекулярных взаимодействий между полярными компонентами ПФ и аминокислотами.

2. Получены уравнения количественных зависимостей подвижности от концентрации ди-, три- и тетрахлорметана в ПФ, содержащих этанол и ДМФА, рассчитаны параметры эффективности и селективности хроматографического процесса для каждого вида водно-органических ПФ. Показано, что замена протонодонорного этанола на апротонный ДМФА позволяет расширить возможности ПФ и улучшить эффективность хроматографического процесса.

Сделан вывод, что системы с этанолом и ДМФА дополняют друг друга и позволяют подобрать оптимальную ПФ для каждого конкретного объекта, содержащего те или иные группы аминокислот.

3. Изучено влияние природы и концентрации поверхностно-активных веществ как модификаторов подвижной фазы на разделение аминокислот на силикагеле. Показано, что модификация водной ПФ анионными (ДДС) и катионными (ЦПХ) ПАВ позволяют хорошо разделять гидрофильные аминокислоты при концентрации ПАВ в 2 раза превышающей критическую концентрацию их мицеллообразования, что согласуются с тенденциями мицеллярной ТСХ. В ПФ на основе 0,005 М ТХ-100 возможно разделение трех гидрофильных аминокислот. Гидрофобные и незаряженные аминокислоты разделяются во всех трех видах МПФ частично. Рост концентрации ПАВ в МПФ в большинстве случаев увеличивает число теоретических тарелок и уменьшает ВЭТТ. Впервые показано, что варьирование ионной силы раствора и рН среды позволяет дополнительно влиять на подвижность, эффективность и селективность разделения в МПФ.

4. С использованием полученных результатов проанализированы коммерческих препарата биологически-активных добавок «Фактор роста», «ВСАА» и «Элтацин», содержащие аминокислоты. Установлено, что как водно-органические, так и мицеллярные ПФ позволяют тестировать указанные препараты на присутствие аминокислот и количественно определять эти аминокислоты методом ТСХ с применением денситометрических измерений интенсивности окрашенных зон. Показано, что содержание аминокислот в препаратах в целом соответствует заявленному в паспорте.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Ворожейкин С.Б., Башко Е.С., Штыков С.Н. Тонкослойная хроматография аминокислот в мицеллярных подвижных фазах на силикагеле // Сорбционные и хроматогр. процессы. 2011. Т.11. № 6. С.840-847.

2. Башко Е.С., Ворожейкин С.Б., Перфилова О.А., Штыков С.Н. Влияние додецилсульфата натрия на хроматографическое поведение аргинина и лизина на прямой фазе ТСХ // Современные проблемы теорет. и эксп. химии: Межвуз.

сборник науч. трудов VIII Всерос конф. молодых ученых с международ.

участием. – Саратов: Изд-во «КУБиК», 2011. – С. 141-143.

3. Ворожейкин С.Б., Башко Е.С., Штыков С.Н. Влияние хлористого метилена на хроматографическое поведение гидрофобных аминокислот на прямой фазе // Современные проблемы теорет. и эксп. химии: Межвуз. сборник науч.

трудов VII Всерос конф. молодых ученых с международ. участием. – Саратов:

Изд-во «КУБиК», 2010. – С. 202-204.

4. Ворожейкин С.Б., Штыков С.Н. Влияние хлороформа и хлористого метилена на хроматографическое поведение аминокислот в ТСХ // Современные проблемы теорет. и эксп. химии: Межвуз. сборник науч. трудов VI Всерос конф. молодых ученых с международ. участием. – Саратов: Изд-во «Научная книга», 2007. – С. 180-183.

5. Ворожейкин С.Б., Башко Е.С., Перфилова О.А., Штыков С.Н. Влияние мицелл ПАВ на разделение аминокислот на силикагеле методом тонкослойной хроматографии // От коллоидных систем к нанохимии. Сб. тез. докл. I Всерос.

симп. по поверхностно-активным веществам (с международ. участием). – Казань, 2011. С.132.

6. Ворожейкин С.Б., Штыков С.Н. Закономерности удерживания аминокислот в тонком слое силикагеля при варьировании донорно-акцепторных и гидрофобных свойств компонентов подвижной фазы // Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез: Матер. Всерос. конф. 26 сент-окт. 2010. – Краснодар, 2010. С. 202.

7. Ворожейкин С.Б., Ворожейкина С.С. Аминокислоты: основные достижения методов их анализа и разделения // Вестник института комплексных исследований аридных территорий. Элиста. 2008. № 2. С.163-168.

8. Ворожейкин С.Б., Романов О.Е. Влияние различных концентраций хлороформа на подвижность аминокислот // Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных регионов: Матер. пятой международ. заочной науч. конф. Секция химии.

Элиста, 7-8 дек. 2006. С.125-127.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.