WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ________________________________________________________________________________

На правах рукописи

ШЕВЕЛЕВ Сергей Дмитриевич

УСТАНОВЛЕНИЕ СТРОЕНИЯ О-АНТИГЕНОВ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ, СОДЕРЖАЩИХ НОНУЛОЗОНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ДРУГИЕ НЕОБЫЧНЫЕ КОМПОНЕНТЫ

02.00.10 – Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов ФГБУН Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН Научные руководители: доктор химических наук, профессор Книрель Юрий Александрович кандидат химических наук Перепелов Андрей Вячеславович

Официальные оппоненты: Усов Анатолий Иванович доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН Тульская Елена Михайловна доктор биологических наук, старший научный сотрудник Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: ГНЦ «Институт иммунологии» Федерального медикобиологического агентства России

Защита диссертации состоится «__» декабря 2012 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.222.01 при ФГБУН Институте органической химии им Н.Д. Зелинского РАН по адреcу: 119991, г. Москва, Ленинский проспект, д. 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН.

Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak2.ed.gov.ru.

Автореферат разослан «__» ноября 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Родиновская Л.А.

доктор химических наук АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ И ЦЕЛЬ РАБОТЫ Важным компонентом клеточной оболочки грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС). Он удерживается на внешней мембране с помощью липидного якоря (липида А), а его О-специфическая полисахаридная цепь (ОПС), построенная из повторяющихся олигосахаридных звеньев и называемая О-антигеном, направлена в сторону окружающей среды. Серологически отличимые типы микроорганизмов продуцируют О-антигены со своей уникальной структурой, и, соответственно, серотип (иммуноспецифичность) микроорганизма тесно связан с хемотипом (составом и строением) ОПС. О-Антигены широко используются для серотипирования штаммов бактерий и серодиагностики. Интерес к ним обусловлен также их ролью в патогенезе инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями.



Изучение структуры и путей биосинтеза бактериальных углеводов является актуальной задачей современной биоорганической химии и гликобиологии. Оно позволяет решать целый ряд фундаментальных проблем микробиологии и иммунологии, как то: выяснять взаимосвязь между строением и функцией структурных компонентов бактериальной клеточной стенки, устанавливать механизмы иммунного ответа, прослеживать эволюционные пути формирования у микроорганизмов разнообразных антигенных структур. Знание строения О-антигенов имеет большое практическое значение для классификации бактерий, необходимой для эпидемиологического мониторинга, разработки новых диагностических препаратов и искусственных вакцин. Важную роль играет функциональный анализ генов биосинтеза О-антигенов, расположенных в хромосомных генных кластерах. Он позволяет выявить уникальные для данного серотипа гены, на основе которых создаются современные методы молекулярной диагностики и которые могут служить мишенями для целевой терапии инфекционных заболеваний.

Кишечная палочка (Esсherichia coli), относящаяся к грамотрицательным бактериям семейства Enterobacteriaceae (энтеробактериям), обычно встречается в нижней части кишечника теплокровных животных. Большинство штаммов E. coli не только являются безвредными, но и приносят пользу организму хозяина, предотвращая развитие патогенных микроорганизмов в кишечнике. В то же время известны вирулентные штаммы этих бактерий, которые могут вызывать гастроэнтериты, воспаления мочеполовой системы и менингит у новорожденных. Наиболее опасны вероцитотоксин (токсин Шига)-продуцирующие штаммы, вызывающие геморрагические колиты и гемолитический уремический синдром, такие как E. coli O157 и О104, а также исследованный в настоящей работе серотип O145. Штамм E. coli O104 вызвал вспышку энтероколита в Северной Европе в 2011 г., унесшую жизни по меньшей мере 22 человек.

Кишечная палочка отличается большим разнообразием О-антигенных форм, которое рассматривается как один из факторов, способствующих адаптации бактерий в различных экологических нишах. Штаммы E. coli объединяются в 186 O-серогрупп, основанных на сероспецифичности О-антигенов, и некоторые из серогрупп разделены на подгруппы. Хотя строение О-антигенов E. coli интенсивно изучается на протяжении последних пятидесяти лет, к началу нашей работы были установлены структуры лишь немногим более половины всех известных О-антигенных форм.

Данная работа направлена на установление строения ранее неисследованных О-антигенов E. coli, а также других важных генетически родственных энтеробактерий – возбудителей сальмонеллеза (Salmonella enterica). Ее целью было также определение функций генов биосинтеза изученных О-антигенов путем анализа секвенированных генных кластеров с учетом полученных структурных данных. Эта часть работы была выполнена совместно с китайскими партнерами - генетиками из лаборатории функциональной геномики микробов Колледжа ТЕДА Нанкайского университета (г. Тянь-дзинь, КНР).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Научная новизна полученных результатов заключается в установлении структур ОПС десяти О-серогрупп кишечной палочки (О29, О49, O108, О109, О118, О130, O145, О150, О1и О161) и уточнении структур ОПС двух серогрупп (O119 и O123), определенных ранее с ошибками. Обнаружено родство трех изученных О-антигенов E. coli с О-антигенами сальмонелл, установлена структура одного из них (S. enterica O58) и уточнена структура другого (S. enterica O48). В составе изученных О-антигенов обнаружены моносахариды, редко встречающиеся в бактериальных полисахаридах, в том числе необычные высшие моносахариды, относящиеся к классу 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезоксинон-2-улозоновых кислот. Одна из них - 8-эпилегионаминовая кислота - впервые выделена в свободном виде и надежно идентифицирована сравнением с заведомым синтетическим образцом. Впервые в О-антигенах найдено 7-N-аланильное производное другого представителя этого класса - легионаминовой кислоты, а также 4-N-[(S)-3-гидроксибутаноильное] производное 4-амино4,6-дидезокси-D-глюкозы.

На основании установленных структур ОПС и анализа секвенированных генных кластеров предположительно определены функции генов, кодирующих ферменты биосинтеза исследованных О-антигенов, в том числе охарактеризованы ранее неизвестные гены, участвующие в синтезе 8-эпилегионаминовой кислоты и N-ацетимидоильной группы.

Полученные данные позволили сделать выводы о путях формирования генных кластеров О-антигенов в ходе эволюции энтеробактерий.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Результаты, полученные в ходе выполнения данного исследования, имеют практическое значение. Данные о структуре О-антигенов представляют собой молекулярную основу серологической классификации штаммов кишечной палочки, необходимой для серодиагностики и эпидемиологического мониторинга. Результаты функционального анализа генов биосинтеза О-антигенов могут быть использованы для разработки метода типирования клинических и природных изолятов E. coli с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и служить молекулярными мишенями для целевой терапии инфекций, вызываемых патогенными штаммами.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ Результаты диссертационной работы были представлены на двух российских и четырех международных конференциях: I Молодежная конференция ИОХ РАН, Москва, 2005 г.; 18th International Symposium on Glycoconjugates, Florence, Italy, 2005; 13th European Carbohydrate Symposium, Bratislava, Slovakia, 2005; 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Hyytil, Finland, 2010; IV Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 2011 г.; FASEB Summer Research Conference Microbial Polysaccharides of Medical, Agricultural and Industrial Importance, Carefree, Arizona, USA, 2011. Полученные данные опубликованы в 12 статьях, включая один обзор, в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА Автор лично проводил выделение, очистку, модификации и расщепление полисахаридов, все химические анализы, интерпретацию спектров ЯМР и масс-спектров. Он также участвовал в функциональном анализе генов биосинтеза изученных О-антигенов.

Выводы работы основаны на данных, полученных автором лично или при его непосредственном участии в совместных исследованиях с соавторами, перечисленными в списке публикаций по теме диссертации. Все статьи по работе подготовлены при непосредственном участии автора.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертация изложена на 111 страницах и включает 19 таблиц и 38 рисунков. Работа состоит из введения, литературного обзора, глав «Результаты» и «Обсуждение результатов», экспериментальной части, выводов и списка литературы, состоящего из 150 наименований.

Названия секций и шифры соединений в автореферате соответствуют главе «Результаты» диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Общие подходы к структурному анализу полисахаридов Липополисахариды получали водно-фенольной экстракцией сухих бактериальных клеток и расщепляли мягким кислотным гидролизом 2% AcOH при 100 °С по кислотолабильной связи остатка кетодезоксиоктоновой кислоты, соединяющей липид А и углеводную часть ЛПС. Осадок липида А отделяли центрифугированием и водорастворимый материал фракционировали гель-хроматографией на колонке с гелем Sephadex G-50 Superfine, получая ОПС или, в случае присутствия нонулозоновых кислот c кислотолабильными гликозидными связями, олигосахарид, соответствующий повторяющемуся звену ОПС. Для структурного исследования кислотолабильных ОПС расщепление ЛПС проводили кислотным гидролизом в более мягких условиях при pH 4,2 или O-дезацилировали ЛПС в мягких щелочных условиях обработкой 12% NH4OH при 37 °С или 50 °С.

Основным подходом к установлению строения ОПС было сочетание традиционных химических методов анализа и спектроскопии ЯМР. К первым относятся определение моносахаридного состава и абсолютных конфигураций моносахаридов методом ГЖХ ацетатов полиолов и ацетилированных гликозидов с (S)-2-октанолом, полученных после полного кислотного гидролиза и алкоголиза полисахаридов, соответственно. Аминокомпоненты (аминосахара и аминокислоты) идентифицировали с помощью аминокислотного анализатора.

Абсолютные конфигурации кислот неуглеводного ряда (аминокислот, 3-гидроксимасляной кислоты, глицериновой кислоты, полученной окислением глицерина) определяли методом ГЖХ ацетилированных или трифторацетилированных (S)-2-октиловых эфиров. В некоторых случаях структуру и конфигурацию необычных моносахаридов устанавливали без их выделения в индивидуальном виде с помощью спектроскопии ЯМР, используя известные закономерности, связывающие абсолютные конфигурации моносахаридов с химическими сдвигами С ЯМР в дисахаридных фрагментах. В ряде случаев для определения типов замещения моносахаридов использовался метод метилирования, включающий идентификацию частично метилированных ацетатов полиолов с помощью ГЖХ/масс-спектрометрии.

1 13 Анализ с помощью одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР на ядрах Н, С и P включал: 1) предварительную характеристику состава ОПС с помощью одномерной спектроскопии, 2) отнесение сигналов в спектрах с использованием двумерных корреляционных экспериментов 1H,1H COSY, TOCSY и 1H,13C HSQC (в некоторых случаях также 1H,13C HMQCTOCSY), 3) определение конфигураций гликозидных связей и размеров моносахаридных циклов по величинам констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) вицинальных протонов, 4) выяснение мест гликозилирования и присоединения неуглеводных заместителей по характерным изменениям химических сдвигов С ЯМР; для локализации фосфатных групп использовался также эксперимент H,31P HMBC и 5) установление последовательности моносахаридов с помощью методик, основанных на ядерных эффектах Оверхаузера (двумерные эксперименты NOESY или ROESY) и выявляющих пространственную сближенность протонов соседних моносахаридных остатков; для некоторых полисахаридов с этой целью использовался также эксперимент H,13C HMBC, показывающий корреляции протонов и атомов углерода, разделенных гликозидной связью. Последний метод применялся также для локализации необычных N-ацильных групп аминосахаров наряду со спектроскопией ЯМР в смеси H2O/D2O, позволяющей детектировать NH-протоны аминосахаров и выявлять их корреляции с CH-протонами N-ацильных групп. При необходимости применялись химические модификации ОПС, такие как О-дезацетилирование действием 12% NH4OH и дефосфорилирование обработкой 48% HF, с последующим сравнительным ЯМР-спектроскопическим анализом исходного и модифицированного полисахаридов.





В ряде сложных случаев необходимым оказалось также проведение избирательного расщепления ОПС для получения необычных производных моносахаридов или олигосахаридных фрагментов. С этой целью применялись сольволиз трифторметансульфокислотой, распад по Смиту и дефосфорилирование действием 48% HF, как описано ниже при рассмотрении структур соответствующих ОПС. Продукты расщепления выделяли гель-проникающей хроматографией на колонке с гелем TSK HW-40, их строение устанавливали методами спектроскопии ЯМР, как описано выше, и подтверждали определением молекулярной массы с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением.

2. О-Антигены, содержащие нонулозоновые кислоты В составе изученных ОПС обнаружены и идентифицированы N-ацильные производные трех нонулозоновых кислот – 5-амино-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновой (нейраминовой, Neu), 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-D-глицеро-D-галакто- и -L-глицероD-галакто-нон-2-улозоновой (легионаминовой, Leg, и 8-эпилегионаминовой, 8eLeg, соответственно), имеющие следующее строение:

2.1. Установление структуры ОПС E. coli O145 и уточнение структуры ОПС S. enterica O48, содержащих нейраминовую кислоту При мягкой кислотной деградации ЛПС из E. coli O145 ОПС произошло расщепление ОПС и образовался олигосахарид 1. Моносахаридный анализ 1 выявил присутствие D-GlcN и 2-амино-2,6-дидезокси-L-галактозы (2-амино-2-дезокси-L-фукозы, FucN). Дальнейшее исследование показало, что 1 содержит также производное нейраминовой кислоты, которая не обнаруживалась при анализе ГЖХ ацетатов полиолов из-за ее полного разрушения при кислотном гидролизе ОПС. По данным спектров 1H и 13C ЯМР 1 включает две N-ацетильные группы (Ac) и одну N-ацетимидоильную группу (Am) (характерные сигналы NAc: СH3 при H 1,98 и 2,06 м.д., C 23,7 м.д., C=O при 174,7 и 175,2 м.д.; NAm: СH3 при H 2,30 м.д., C 20,5 м.д., C=N при 167,7 м.д.).

Анализ с помощью двумерной спектроскопии ЯМР (COSY, TOCSY) выявил по одной спиновой системе для GlcN, FucN и Neu, и, таким образом, 1 является трисахаридом.

С использованием экспериментов ROESY и H,13C HSQC установлена структура 1, включая размеры циклов и положения замещения моносахаридов, их последовательность и конфигурации гликозидных связей. Сравнение спектров ЯМР трисахарида 1 с описанными в литературе данными для FucNAm и FucNAc показало, что N-ацетимидоильная группа в присоединена к остатку FucN, и, следовательно, два другие аминосахара несут N-ацетильные группы. Структура 1 как трисахарида -L-FucpNAm-(13)--D-GlcpNAc-(14)-Neu5Ac подтверждена определением молекулярной массы методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Этот трисахарид, образовавшийся в результате расщепления ОПС по кислотолабильным гликозидным связям Neu5Ac, соответствует повторяющемуся звену ОПС.

Для определения конфигурации гликозидной связи Neu5Ac в ОПС и способа соединения повторяющихся звеньев друг с другом было проведено О-дезацилирование ЛПС в мягких щелочных условиях действием 12% NH4OH при 37 °С. Спектры ЯМР выявили структурную гетерогенность полученного полимера, вызванную частичным удалением N-ацетимидоильной группы и ее частичным превращением в N-ацетильную группу. Дезацилирование ЛПС в более жестких условиях при 50 °С привело к полисахариду, содержащему только одно производное фукозамина - FucNAc. Структурный анализ модифицированного полисахарида с помощью двумерной спектроскопии ЯМР, проведенный аналогично описанному выше для трисахариду 1, позволил установить строение ОПС E. coli O145:

4)--Neup5Ac-(23)--L-FucpNAm-(13)--D-GlcpNAc-(1 Изученный ОПС обладает существенным структурным сходством с ОПС S. enterica O48, который согласно опубликованным данным отличается только присутствием остатка FucNAc вместо остатка FucNAm и О-ацетилированием остатка Neu5Ac (Gamian et al. // Eur. J.

Biochem. 2000, 267, 3160-3166). Проведенный нами анализ показал, что FucNAc в этом ОПС идентифицирован ошибочно и на самом деле он, также как и ОПС E. coli O145, содержит FucNAm. Следовательно, ОПС S. enterica O48 имеет следующую уточненную структуру:

4)--Neup5Ac7,9OAc-(23)--L-FucpNAm-(13)--D-GlcpNAc-(1 2.2. Структура ОПС E. coli O161, содержащего легионаминовую кислоту Как и в случае E. coli O145, при мягком кислотном гидролизе ЛПС E. coli O1полимерного продукта не образовалось, и был выделен олигосахарид 2. Как показало последующее исследование, деполимеризация ОПС была вызвана присутствием производного легионаминовой кислоты с кислотолабильной гликозидной связью. По данным химических анализов и спектра 13С ЯМР (рис. 1A) в состав олигосахарида 2 входили также D-GlcN, D-глюкуроновая кислота (D-GlcA) и D-аланин (D-Ala). Cтруктура 2 как трисахарида -D-GlcpA-(13)--D-GlcpNAc-(18)-Legp5Ac7(D-Ala) была установлена с помощью двумерной спектроскопии ЯМР аналогично трисахариду 1.

Рис. 1. Cпектры 13С ЯМР трисахарида 2 (A) и О-дезацилированного ЛПС (B) из E. coli O161.

A – Ala, GA – GlcA, GN – GlcN, L – Leg. Различные химические сдвиги сигналов L6 и GA4 в двух спектрах отвечают -конфигурации Leg и терминальному положению GlcA в 2 и -конфигурации Leg и замещению GlcA в положение 4 в ОПС, соответственно.

Структура Leg следовала из спектра C ЯМР, который содержал характеристичные сигналы для кето-группы (С-2), дезокси-групп (C-3 и C-9), атомов углерода, связанных с атомами азота (C-5 и C-7) и кислорода (C-4, C-6 и C-8). Положение дезокси-групп CH2 и CHв Leg подтверждалось химическими сдвигами и характером спин-спинового расщепления сигналов H-3 и H-9 и соседних протонов. Конфигурация Leg определена на основании следующих данных:

1. Относительно большие КССВ J3ax,4, J4,5 и J5,6 ~10-12 Гц указывали на пиранозную форму цикла с аксиальной ориентацией H-4, H-5 и H-6; следовательно, фрагмент C-4–C-имеет ксило-конфигурацию.

2. Положение сигнала C-6 при 70,2 м.д. характерно для арабино-конфигурации фрагмента C-6–C-8 нонулозоновых кислот с ксило-конфигурацией фрагмента C-4–C-6 и, таким образом, свидетельствует о D-глицеро-D-галакто- или L-глицеро-D-галактоконфигурации (в сравнении с литературными данными 70,9, 72,9, 77,3, и 76,0 м.д. для D-глицеро-D-галакто-, L-глицеро-D-галакто-, D-глицеро-L-альтро- и L-глицеро-L-альтроизомеров, имеющих арабино-, ксило-, ликсо- и рибо-конфигурацию фрагмента C-6–C-8, соответственно).

3. эритро-Конфигурация фрагмента C-7–C-8 следовала из пространственной близости протонов H-9 и H-7, а также протонов H-8 и H-6, которая выявлена в двумерном эксперименте ROESY. Такое расположение протонов характерно для легионаминовой кислоты, имеющей D-глицеро-D-галакто-конфигурацию, тогда как корреляция между протонами H-9 и H-указывала бы на трео-конфигурацию фрагмента C-7–C-8, отвечающую 8-эпилегионаминовой кислоте с L-глицеро-D-галакто-конфигурацией.

4. Относительно большое сильнопольное смещение сигнала C-9 Leg от 20,4 м.д. к 17,м.д., вызванное гликозилированием Leg остатком -D-GlcNAc в положение 8, подтверждало D-конфигурацию C-8 и, следовательно, D-глицеро-D-галакто-конфигурацию Leg. Такая же конфигурация была установлена для легионаминовой кислоты в ранее исследованных полисахаридах бактерий и подтверждена выделением Leg5Ac7Ac в свободном виде и ее сравнением с заведомым синтетическим образцом.

Положение N-ацильных заместителей – ацетильных групп и остатка аланина – определяли по данным спектров ЯМР для раствора трисахарида 2 в смеси H2O/D2O (9:1). С помощью эксперимента TOCSY были отнесены сигналы трех NH-протонов: NH-5 и NH-7 Leg и NH-2 GlcN. Эксперимент ROESY выявил корреляционные пики протонов NH-2 GlcN и NH-5 Leg с протонами NAc групп, определяющие положения ацетилирования, а кросс-пик между NH-7 Leg и H-2 Ala указывал на присоединение остатка аланина к N-7 Leg.

Следовательно, в состав 2 входит 5-N-ацетил-7-N-(D-аланил)легионаминовая кислота.

Сравнение данных спектров ЯМР трисахарида 2, соответствующего повторяющемуся звену ОПС, и полисахарида, полученного О-дезацилированием ЛПС 12% NH4OH (его спектр С ЯМР показан на рис. 1B), позволило установить замещение GlcA в положение 4 и -конфигурацию гликозидной связи Leg. Таким образом, ОПС E. coli O161 имеет следующую уникальную структуру:

8)--Legp5Ac7(D-Ala)-(24)--D-GlcpA-(13)--D-GlcpNAc-(1 2.3. Структура ОПС E. coli O108, содержащего 8-эпилегионаминовую кислоту.

Из-за присутствия в ОПС производного 8-эпилегионаминовой кислоты (8eLeg) с кислотолабильной гликозидной связью расщепление ЛПС E. coli O108 в стандартных условиях гидролиза 2% уксусной кислотой сопровождалось деполимеризацией ОПС.

Деградация в более щадящих кислотных условиях при рН 4,2 позволила получить высокомолекулярный ОПС. Моносахаридный анализ показал присутствие в его составе D-Gal, D-GlcN и L-FucN. Спектры ЯМР показали, что ОПС имеет тетрасахаридное повторяющееся звено, включающее кроме перечисленных выше моносахаридов также производное 8eLeg, и что все аминосахара N-ацетилированы. Анализ с помощью двумерной спектроскопии ЯМР позволил установить следующую, также уникальную структуру ОПС E. coli O108:

4)--8eLegp5Ac7Ac-(16)--D-Galp-(13)--L-FucpNAc-(13)--D-GlcpNAc-(1 8-Эпилегионаминовая кислота была идентифицирована аналогично легионаминовой кислоте путем детального анализа спектров ЯМР. Так, большие величины КССВ J3ax,4, J4,5 и J5,6 ~10 Гц свидетельствовали об аксиальной ориентации протонов H-4, H-5 и H-6 и, таким образом, о ксило-конфигурации фрагмента С-4–С-6. Небольшие величины КССВ J6,7 ~2 Гц и J7,8 ~6 Гц указывали на трео-конфигурацию фрагментов C-6–C-7 и C-7–C-8. Относительно большая разница (~0,9 м.д.) между химическими сдвигами протонов H-3ax и H-3eq указывала на аксиальное положение карбоксильной группы и, следовательно, на -конфигурацию гликозидной связи 8eLeg. Абсолютная конфигурация 8eLeg следовала из относительно небольшой величины (4,1 м.д.) -эффекта гликозилирования остатком -D-GlcNAc на С-остатка 8eLeg5Ac7Ac и относительно большой отрицательной величины (-3,4 м.д.) -эффекта гликозилирования на С-3, характерных для L-глицеро-D-галакто-конфигурации.

Здесь следует отметить, что разница между параметрами спектров ЯМР различных изомеров нонулозоновых кислот сопоставима с отклонениями от значений для одного изомера, вызываемыми различными по природе соседними моносахаридами и N-ацильными заместителями в полисахариде. В связи с этим полная уверенность в том, что в природе действительно существуют два эпимера по С-8, а не только один D-эпимер – легионаминовая кислота, могла быть достигнута только в результате выделения производного 8eLeg в свободном виде. Это впервые было осуществлено в настоящей работе с помощью трех последовательных деградаций по Смиту ОПС E. coli О108 (схема 1). Каждая из стадий включала периодатное окисление, боргидридное восстановление и мягкий кислотный гидролиз при pH 4,2 (i), а затем проводился кислотный гидролиз 2% уксусной кислотой при 100 °С (ii) полученного гликозида с этиленгликолем 3. Выделение 8eLeg5Ac7Ac непосредственно из ОПС невозможно, так как при мягком кислотном гидролизе не расщепляется гликозидная связь между GlcNAc и 8eLeg5Ac7Ac, а в более жестких условиях 1 сама кислота 8eLeg5Ac7Ac полностью разрушается. Сравнение спектров H и C ЯМР выделенной 8eLeg5Ac7Ac и заведомого синтетического образца однозначно продемонстрировало ее L-глицеро-D-галакто-конфигурацию.

Схема 1. Выделение ди-N-ацетил-8-эпилегионаминовой кислоты из ОПС E. coli О108.

3. Фосфорилированные О-антигены 3.1. Структура ОПС E. coli O29 и О130, содержащих фосфат глицерина Моносахаридный анализ выявил присутствие Glc, Gal, GlcN и FucN в составе ОПС E. coli O29. Cпектр Р ЯМР показал наличие одной монофосфатной группы (сигнал при 1,43 м.д.). Дефосфорилирование ОПС 48% НF привело к увеличению содержания глюкозы в гидролизате (соотношения моносахаридов изменилось от 1,1:1:0,9:0,7 до 1,8:1:0,7:0,6, соответственно), что указывало на присутствие в ОПС двух остатков глюкозы, один из которых фосфорилирован. ЯМР-спектроскопическое исследование позволило установить структуру как олигосахарида 4, полученного дефосфорилированием ОПС:

-D-Glcp-(16)--D-Galp -D-Glcp-(14)--L-FucpNAc-(13)--D-GlcpNAc-(13)-D-Gro, так и ОПС E. coli O29:

-D-Glcp-(16)--D-Galp 3)-D-Gro-1-P-(O6)--D-Glcp-(14)--L-FucpNAc-(13)--D-GlcpNAc-(1 Этот ОПС содержит глицерофосфат (D-Gro-1-P) в основной цепи и, таким образом, построен по типу глицеринтейхоевых кислот, больше характерных для грамположительных бактерий Второй ОПС, в состав которого входит глицерофосфат, обнаружен у Е. coli О130.

Компонентами этого ОПС являются D-Glc, D-Gal и D-GalNAc. Глицерофосфат входит в боковую цепь ОПС, и поэтому при его дефосфорилировании получен модифицированный полисахарид того же состава, что и исходный ОПС. С помощью спектроскопии ЯМР установлены следующие структуры дефосфорилированного полисахарида:

-D-GalpNAc 4)--D-Galp-(16)--D-Glcp-(13)--D-GalpNAc-(1 и исходного ОПС Е. coli О130:

Gro-2-P-(O4)--D-GalpNAc 4)--D-Galp-(16)--D-Glcp-(13)--D-GalpNAc-(1 3.2. Структура ОПС E. coli O118 и О151, содержащих фосфат рибита Моносахаридный анализ показал, что ОПС E. coli O118 и O151 имеют одинаковый состав и содержат D-Gal, D-GlcN и FucN. В спектрах Р ЯМР обоих ОПС присутствовал сигнал фосфатной группы при 1,30 м.д. После дефосфорилирования в гидролизате обнаружен также рибит. В спектрах 1H ЯМР и 13С ЯМР (рис. 2A,B) присутствовали характерные сигналы N-ацетимидоильной группы (H-2 при 2,26 м.д., C-1 и C-2 при 167,5-167,7 и 20,5-20,6 м.д., соответственно). Ее положение на остатке FucN и N-ацетилирование остатка GlcN установлено на основании корреляций протонов CH3 ацильных групп с NH-протонами аминосахаров, выявленных при съемке двумерного спектра ROESY в смеси H2O/D2O.

Рис. 2. Cпектры 13С ЯМР ОПС E. coli O118 (A) и O151 (B). F – FucN, G – GlcN, R – Rib-ol.

Различные химические сдвиги сигналов R3 и R2 в двух спектрах указывают на замещение остатка рибита в положение 3 или 2 в ОПС E. coli O118 и O151 соответственно.

С помощью двумерной спектроскопии ЯМР установлены следующие близкородственные структуры обоих ОПС, построенных по типу рибиттейхоевых кислот:

E. coli О13)-D-Rib-ol-5-P-(O6)--D-Galp-(13)--L-FucpNAm-(13)--D-GlcpNAc-(1 E. coli О1 -D-GlcpNAc 2)-D-Rib-ol-5-P-(O6)--D-Galp-(13)--L-FucpNAm-(13)--D-GlcpNAc-(1 Эти ОПС отличаются друг от друга только местом замещения остатка рибита (в положение 3 или 2) и присутствием бокового остатка D-GlcNAc в ОПС E. coli О151.

Сходную линейную структуру, совпадающую со структурой основной цепи ОПС E. coli О151, имеет ОПС S. enterica O47, изученный независимо от данной работы (А. В. Перепелов и др. // Биохимия 2009, 74, 416-420):

2)-D-Rib-ol-5-P-(O6)--D-Galp-(13)--L-FucpNAm-(13)--D-GlcpNAc-(1 4. Другие О-антигены 4.1. Структура ОПС E. coli О150, содержащего 2-ацетамидо-2-дезокси4-[(S)-1-карбоксиэтил]-D-глюкозу В ОПС E. coli О150 идентифицированы D-Glc, L-Rha и D-GlcN. Судя по присутствию в спектрах ЯМР характерных сигналов молочной кислоты (H-2 и H-3 при 4,45 и 1,29 м.д., С-1 и С-3 при 179,4 и 18,8 м.д. соответственно), в состав ОПС входит также гликолактиловая кислота – простой эфир моносахарида с молочной кислотой (lac).

Двумерный эксперимент ROESY выявил пространственную сближенность протонов H-молочной кислоты и H-4 остатка GlcNAc и тем самым продемонстрировал присутствие в ОПС остатка GlcNAc4lac. Этот моносахарид был выделен в индивидуальном виде сольволизом ОПС действием безводной трифторметансульфокислоты и идентифицирован как (S)-изомер 1 по молочной кислоте D-GlcNAc4(Slac) сравнением данных спектров H и С ЯМР и удельного оптического вращения с данными для заведомых синтетических образцов (R)- и (S)-изомеров.

Структура, установленная методами ЯМР-спектроскопии, была подтверждена распадом ОПС по Смиту, который привел к гликозиду трисахарида 5 с остатком глицеринового альдегида в качестве агликона -L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(13)--D-GlcpNAc4(Slac)(12)-Gro-al. На основании полученных данных сделан вывод о том, что ОПС Е. соli О1имеет следующую структуру:

3)--D-GlcpNAc4(Slac)-(12)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 -D-Glcp 4.2. Установление структур ОПС E. coli O49 и S. enteriсa O58 и уточнение структуры ОПС E. coli О123, содержащих производные 4-амино-4,6-дидезокси-D-глюкозы (4-амино-4-дезокси-D-хиновозы, D-Qui4N) В составе ОПС E. coli O49 обнаружены L-Rha, D-GlcN и D-GalN. Четвертый компонент ОПС - производное Qui4N - не удалось идентифицировать с помощью химического анализа, поскольку Qui4N полностью разрушался в условиях кислотного гидролиза. Его структура и абсолютная конфигурация, а также присутствие на нем (S)-3-гидроксибутаноильной группы (SHb) в качестве N-ацильного заместителя были определены методами спектроскопии ЯМР.

С помощью этого же подхода была установлена следующая структура ОПС Е. соli О(курсивом показано нестехиометрическое содержание О-ацетильной группы, составляющее ~30%):

2)--D-Quip4N(SHb)-(14)--D-GalpNAc-(14)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc6OAc-(1 Другим ОПС кишечной палочки, содержащим производное Qui4N, является О-антиген E. coli O123, для которого была установлена следующая структура (степень О-ацетилирования остатка GlcNAc также составляет ~30%) (Clark et al. // J. Med. Microbiol.

2009, 58, 884-894):

3)--D-Quip4N(L-Ala-Ac)-(16)--D-GlcpNAc-(13)--L-QuipN(SHb)-(13)--D-GlcpNAc6OAc-(1 В нашей работе эта структура была уточнена. Так, анализ ГЖХ ацетилированных (S)-2-октигликозидов привел к идентификации D-аланина, и, таким образом, абсолютная конфигурация этой кислоты в ОПС должна быть исправлена на D, а ЯМР-спектроскопическое исследование показало, что должно быть изменено также распределение N-ацильных заместителей аминосахаров. Локализация обеих N-ацильных групп [D-аланильной и (S)-3гидроксибутаноильной] на одном, а не на разных моносахаридах подтверждена серией трех последовательных распадов ОПС по Смиту (i), которая привела к гликозиду производного Qui4N 6 (схема 2).

Таким образом, c учетом уточнений ОПС E. coli O123 имеет следующую структуру:

3)--D-Quip4N(D-Ala-SHb)-(16)--D-GlcpNAc-(13)--L-QuipNAc-(13)--D-GlcpNAc6OAc-(1 Сходная структура установлена нами для ОПС S. enterica O58, единственное отличие которого от ОПС E. coli O123 заключается в отсутствии О-ацетильной группы на остатке GlcNAc:

3)--D-Quip4N(D-Ala-SHb)-(16)--D-GlcpNAc-(13)--L-QuipNAc-(13)--D-GlcpNAc-(1 Схема 2. Выделение гликозида 4-[(S)-3-гидроксибутаноил]амино-4,6-дидезокси-D-глюкозы из ОПС E. coli O123.

4.3. Установление структуры ОПС E. coli O109 и уточнение структуры ОПС E. coli О119, содержащих производные 2,3-диамино-2,3,6-тридезокси-L-маннозы (2,3-диамино-2,3-дидезокси-L-рамнозы, L-RhaN3N) Моносахаридный анализ показал, что в состав ОПС E. сoli O109 входят 6-дезоксиL-талоза (6dTal), D-Glc и D-GlcNAc. С помощью спектроскопии ЯМР идентифицирован еще один компонент этого ОПС – редко встречающийся в природе диаминосахар 2,3-диацетамидо-2,3-дидезокси-L-рамноза. Он не выявлялся при анализе ГЖХ ацетатов полиолов из-за низкой летучести его производного, однако ГЖХ ацетилированных (S)-2-октилгликозидов позволила определить его абсолютную конфигурацию. Структура ОПС была установлена с помощью двумерной спектроскопии ЯМР без применения избирательного расщепления. В ОПС присутствуют O-ацетильные группы, положение которых было установлено по характерному смещению в слабое поле сигналов протонов при ацетоксилированных атомах углерода: H2 6dTal и H4 RhaNAc3NAc.

Таким образом, ОПС E. сoli O109 имеет следующую структуру:

-L-RhapNAc3NAc4Ac 4)--D-Glcp-(13)--L-6dTalp2Ac-(13)--D-GlcpNAc-(1 Другое производное RhaN3N – 2-ацетамидо-3-формамидо-2,3,6-тридезоксиманноза (RhaNAс3NFo) – было обнаружено ранее в составе ОПС E. сoli O119 (Anderson et al. // Carbohydr. Res. 1992, 237, 249-262). На основе анализа межзвеньевых ядерных эффектов Оверхаузера этому моносахариду была приписана D-конфигурация. Сравнительный анализ генных кластеров биосинтеза О-антигенов E. coli O109 и E. сoli O119 показал высокую степень гомологии генов синтеза RhaN3N, что указывало на вероятную идентичную абсолютную конфигурацию этого моносахарида в ОПС обеих бактерий. В связи с этим мы провели повторное исследование ОПС E. сoli O119 и с помощью анализа ГЖХ ацетилированных (S)-2-октилгликозидов установили, что на самом деле RhaN3N представлен в нем L-формой, то есть, как и ожидалось на основании генетических данных, этот моносахарид имеет такую же абсолютную конфигурацию, как в ОПС E. сoli O109.

На основании этих данных ОПС E. coli O119 имеет следующую уточненную структуру:

-L-RhapNAc3NFo 2)--D-Manp-(13)--D-Galp-(14)--L-Rhap-(13)--D-GlcpNAc-(1 5. Особенности состава и строения изученных О-антигенов: обобщение В составе всех исследованных О-антигенов E. coli обнаружены редко встречающиеся моносахариды, такие как нонулозоновые кислоты (нейраминовая, легионаминовая, 8-эпилегионаминовая), гликолактиловая кислота и 6-дезоксиаминосахара с необычными N-ацильными заместителями. Различные производные нейраминовой кислоты – сиаловые кислоты – широко распространены в природе как компоненты гликолипидов (ганглиозидов) и гликопротеинов животных, однако в полисахаридах бактерий этот моносахарид находят относительно редко и только в N-ацетилированной форме. Кроме указанных выше О-антигенов, Neu5Ac обнаружена в О-антигенах ряда энтеробактерий, включая четыре другие серогруппы E. coli, нескольких штаммов Vibrio cholerae и Shewanella alga, а также в некоторых капсульных полисахаридах E. coli и менингококков (Neisseria meningitidis).

Легионаминовая кислота впервые обнаружена в ОПС бактерии Legionella pneumophila, давшей ей название, и позднее в полисахаридах Acinetobacter baumannii, Vibrio parahaemolyticus и Vibrio salmonicida, а в настоящей работе впервые в энтеробактериях у E. coli O161. Если ранее в ЛПС были найдены N-ацетильные, N-ацетимидоильные и N-[(S)-3-гидроксибутаноильные] производные Leg, то в настоящей работе обнаружено N-(D-аланильное) производное, которое прежде как компонент О-антигенов описано не было.

8-Эпилегионаминовая кислота, найденная впервые в О-антигене Pseudomonas aeruginosa O13, была обнаружена также в нескольких энтеробактериальных полисахаридах, включая Оантигены E. coli O61 и в настоящей работе E. coli O108, а также у морской бактерии Shewanella putrefaciens.

Моносахарид, относящийся к гликолактиловым кислотам, – простой эфир D-GlcNAc с (S)-молочной кислотой, идентифицирован в О-антигене Е. соli О150. Он является регио- и стереоизомером N-ацетилмурамовой кислоты – компонента пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных бактерий. Кроме Е. соli О150, D-GlcNAc4(Slac) и его (R)-изомер по молочной кислоте находили только в О-антигенах бактерий рода Proteus. В четырех исследованных О-антигенах присутствуют фосфатные группы, вводящие в полисахариды глицерин (Е. соli О29 и О130) и рибит (Е. соli О108 и О151). При этом О-антигены всех серогрупп, кроме О130, содержат фосфат полиола в основной цепи, то есть построены аналогично тейхоевым кислотам, характерным для грамположительных бактерий, тогда как у грамотрицательных бактерий полимеры такого типа встречаются редко.

Для одного из найденных в ОПС 6-дезоксиаминосахаров – D-Qui4N – характерно присутствие на атоме азота необычных N-ацильных заместителей, среди которых встречаются такие группы как формил, малонил, сукцинил, N-ацетилглицил, N-ацетиласпартил, N-[(R)-3-гидроксибутаноил]-L-аланил, 2,4-дигидрокси-3,3,4-триметил-5-оксопролил и др.

Однако N-[(S)-3-гидроксибутаноильное] и N-[(S)-3-гидроксибутаноил]-D-аланильное производные D-Qui4N обнаружены нами в составе ОПС Е. соli О49 и О123 и S. enterica Oвпервые. Другой необычный 6-дезоксиаминосахар – L-RhaN3N – в одном из изученных нами О-антигенов (Е. соli О109) ди-N-ацетилирован, а в другом (Е. соli О119) несет ацетильную группу при N-2 и формильную группу при N-3. Кроме Е. соli этот моносахарид находили только в одном из О-антигенов Proteus penneri. Более распространенный 6-дезоксиаминосахар L-FucN найден как в обычной N-ацетилированной форме (Е. соli О29 и О108), так и несущим N-ацетимидоильную группу (Е. соli О108, О145 и О161). L-FucNAm идентифицирован нами также в О-антигене S. enterica О47, тогда как раньше предполагалось, что в его состав входит L-FucNAc. N-Ацетимидоильная группа обладает основными свойствами и нейтрализует заряд кислотных компонентов, входящих в повторяющееся звено наряду с FucNAm (Neu в Е. соli О145, фосфатная группа в Е. соli О118 и О151), придавая ОПС цвиттерионный характер.

Присутствие в ОПС необычных компонентов потребовало поиска индивидуальных подходов к их идентификации и структурному анализу содержащих их полисахаридов. Так, высокомолекулярные ОПС, включающие нонулозоновые кислоты с кислотолабильными гликозидными связями, не могли быть получены стандартным методом - кислотной деградацией ЛПС разбавленной уксусной кислотой, так как в этих условиях происходила их деполимеризация. Для преодоления этой трудности использовались два альтернативных подхода – гидролиз буферным раствором при более высоком значении pH или мягкое щелочное О-дезацилирование ЛПС. Далее, нонулозоновые кислоты и некоторые другие моносахариды (например, Qui4N) не могли быть идентифицированы при обычном моносахаридном анализе из-за кислотолабильности самих сахаров. Для определения их строения применялась спектроскопия ЯМР полисахаридов или полученных из них олигосахаридов с использованием закономерностей, установленных в ходе проводившихся ранее структурных исследований углеводов, содержащих эти или аналогичные моносахариды.

Полученные данные о строении О-антигенов являются существенным вкладом в создание химической основы для классификации штаммов E. coli. Большинство установленных структур являются уникальными среди О-антигенов E. coli, что свидетельствует об обоснованности отнесения исследованных штаммов в отдельные О-серогруппы. Серологическое различие между серогруппами О118 и О151, имеющими родственные по структуре О-антигены, очевидно обусловлено присутствием бокового остатка GlcNAc в О-антигене E. coli О151. Действительно, известно, что моносахариды, находящиеся в боковых цепях разветвленных полисахаридов и на невосстанавливающем конце основной цепи наиболее доступны для взаимодействия с антителами и вносят наибольший вклад в иммуноспецифичность бактерий. При этом концевыми часто являются редко встречающиеся и уникальные моносахариды, как это имеет место и в изученных О-антигенах E. coli, что ведет к максимальной диверсификация антигенных структур, позволяя бактериям избегать защитного действия иммунной системы.

6. Функциональный анализ генных кластеров О-антигенов Анализ секвенированных генных кластеров О-антигенов выполнялся совместно с китайскими партнерами путем сравнения с нуклеотидными и предсказанными аминокислотными последовательностями, представленными в доступной базе данных GenBank, с использованием онлайновой программы BLAST и учитывая полученные данные о строении О-антигенов. Анализ выявил присутствие в кластерах всех генов, необходимых для биосинтеза изученных ОПС, в том числе а) генов для синтеза нуклеотид-активированных предшественников необычных компонентов ОПС, б) генов гликозилтрансфераз, последовательно переносящих моносахариды на растущее повторяющееся звено, сборка которого происходит на липидном носителе на цитоплазматической стороне внутренней мембраны, и в) генов процессинга О-антигена, которые кодируют флиппазу и полимеразу, предназначенные для переноса повторяющегося звена через мембрану и соединения звеньев в полисахаридную цепь, соответственно. Анализ показал также, что первым моносахаридом повторяющихся звеньев, с переноса которого на липидный носитель начинается синтез О-антигена, является N-ацетил-D-гексозамин – D-GlcNAc или D-GalNAc.

Особый интерес представляет обнаружение в генных кластерах О-антигенов Е. coli O1и О108 генов биосинтеза производных легионаминовой и 8-эпилегионаминовой кислот. Гены первого имеют высокую степень гомологии с генами, кодирующими ферменты известного пути биосинтеза ди-N-ацетиллегионаминовой кислоты и катализирующие также другие аналогичные биохимические реакции. Это указывает на то, что 7-N-аланильное производное легионаминовой кислоты синтезируется по такому же пути, что и Leg5Ac7Ac, а единственное структурное различие между моносахаридами обусловлено измененной субстратной специфичностью ацилтрансферазы, переносящей ацетильный или аланильный остаток на аминогруппу в положении 7. В генном кластере О-антигена E. coli О108 найдены семь генов пути биосинтеза ди-N-ацетил-8-эпилегионаминовой кислоты, предсказанные функции которых сходны с функциями генов биосинтетического пути производных Leg. Путь биосинтеза 8eLeg5Ac7Ac до сих пор остается невыясненным, но, учитывая сходство ее строения со строением Leg5Ac7Ac и полученные генетические данные, можно предположить, что биосинтез 8eLeg5Ac7Ac протекает по сходному пути, показанному на схеме 3.

В дальнейшем этот путь должен получить биохимическое подтверждение.

В генных кластерах всех О-антигенов, содержащих L-FucNAm, как изученных в настоящей работе (E. coli O108, O145, O151, S. enterica O47 и О48), так и содержащихся в базе данных, присутствует одинаковый оперон, включающий ген гликозилтрансферазы wbuB, переносящий FucNAm на остаток GlcNAc с образованием общего фрагмента -L-FucpNAm(13)-D-GlcpNAс, три гена пути синтеза FucNAc fnlABC, ген аминотрансферазы WbuX, которая превращает N-ацетильную группу в N-ацетимидоильную, два гена, имеющие высокую степень гомологии с генами hisF и hisH, а также ген wbuC с неизвестной функцией (рис. 3). Гены hisF и hisH кодируют белки, один из которых высвобождает аммиак из глутамата, а второй транспортирует его по внутримолекулярному каналу. Их предположительная функция – обеспечение синтеза N-ацетимидоильной группы при отсутствии или недостаточном содержании аммиака в окружающей среде. Остальные гены кластеров специфичны для различных структур О-антигенов, что указывает на образование новых генных кластеров по пути горизонтального переноса оперона FucNAm от бактерии, где он сформировался впервые, к другим бактериям.

Схема 3. Предполагаемый путь биосинтеза 8eLeg5Ac7Ac и ее нуклеотид-активированного производного CMP-8eLeg5Ac7Ac у E. coli O108. ФЕП – фосфоенолпируват, Ac-CoA – ацетилкоэнзим А, CMP – цитидинмонофосфат, CTP – цитидинтрифосфат, UDP – уридиндифосфат, Pi, PPi – неорганический фосфат, дифосфат. Orf1-Orf6, Orf8 – ферменты, номера которых соответствуют порядковым номерам генов в генном кластере О-антигена.

Генные кластеры структурно родственных О-антигенов E. coli и S. enterica организованы одинаково (рис. 3), и соответствующие гены обладают высокой степенью гомологии, что свидетельствует о том, что эти кластеры сформировались у эволюционного предшественника этих двух родов бактерий. В большинстве случаев они не претерпели изменений после дивергенции двух родов, а наблюдающиеся небольшие структурные различия между О-антигенами, связанные с О-ацетилированием или боковым гликозилированием, появились за счет приобретения внекластерных генов, кодирующих О-ацетилтрансферазы или гликозилтрансферазы. В одном из рассмотренных случаев (E. coli О118, О151 и S. enterica О47) наблюдается полиморфизм гена полимеразы, возникший в ходе эволюции бактерий. Его результатом является диверсификация структур О-антигенов за счет различия в типе связи между повторяющимися звеньями, определяемом специфичностью полимеразы.

Рис. 3. Организация генных кластеров и гомология генов биосинтеза структурно родственных О-антигенов E. coli и S. enterica. Гомология соответствующих генов E. coli О118 и О1составляет около 100%. Гены синтеза моносахаридных предшественников, гены гликозилтрансфераз и гены процессинга показаны светло-серым, темно-серым и черным цветом соответственно. Оперон синтеза и переноса L-FucNAm взят в прямоугольную рамку.

Вверху показаны базовые структуры О-антигенов, синтезируемые генами, входящими в кластеры.

У всех изученных бактерий гены процессинга wzx и wzy, обнаруженные в генных кластерах О-антигенов и кодирующие полимеразу и флиппазу, соответственно, оказались высокоспецифичными для каждого серотипа E. coli, что подтверждено ПЦР-тестированием соответствующих праймеров, проведенным китайскими партнерами. Таким образом, на основе этих генов может быть создан высокоспецифичный и высокочувствительный метод ПЦР-диагностики инфекций, вызываемых кишечной палочкой. Гены wzx и wzy и кодируемые ими белки могут служить также молекулярными мишенями для целевой терапии этих заболеваний.

ВЫВОДЫ 1. Установлены новые структуры О-специфических полисахаридов (О-антигенов) десяти серогрупп кишечной палочки (Esherichia coli) и одной серогруппы сальмонелл (Salmonella enterica) и уточнены ранее предложенные структуры полисахаридов двух серогрупп E. coli и одной серогруппы S. enterica. Эти данные вносят существенный вклад в создание химической основы для классификации штаммов энтеробактерий по О-антигенам, необходимой для серодиагностики и эпидемиологического мониторинга.

2. В составе изученных полисахаридов обнаружены редко встречающиеся у бактерий моносахариды, такие как нонулозоновые кислоты (нейраминовая, легионаминовая и 8-эпилегионаминовая), гликолактиловая кислота - простой эфир N-ацетилглюкозамина с (S)-молочной кислотой, необычные N-ацильные производные 6-дезоксиаминосахаров и диаминосахар 2,3-диамино-2,3-дидезокси-L-рамноза. Впервые производное 8-эпилегионаминовой кислоты выделено в свободном виде и идентифицировано сравнением с заведомым синтетическим образцом.

3. С использованием данных о строении полисахаридов определены предположительные функции генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза исследованных О-антигенов, включая пути синтеза предшественников нонулозоновых кислот. Выявлена генетическая основа родства О-антигенов E. coli и S. enterica и формирования наблюдающегося разнообразия их структур. Полученные данные могут быть использованы для разработки метода молекулярного типирования клинических и природных изолятов кишечной палочки, а также ПЦР-диагностики и целевой терапии инфекций, вызываемых патогенными штаммами этой бактерии.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

Обзор 1. Y. A. Knirel, S. D. Shevelev, A. V. Perepelov / Higher aldulosonic acids: components of bacterial glycans // Mendeleev Commun. 2011, 21, 173-182.

Экспериментальные статьи 2. L. Feng, S. N. Senchenkova, J. Tao, A. S. Shashkov, B. Liu, S. D. Shevelev, P. Reeves, J. Xu, Y. A. Knirel, L. Wang / Structural and genetic characterization of enterohaemorrhagic Escherichia coli O145 O antigen and development of an O145 serogroup-specific PCR assay // J. Bacteriol.

2005, 187, 758-764.

3. A. V. Perepelov, Q. Wang, S. N. Senchenkova, S. D. Shevelev, G. Zhao, A. S. Shashkov, L. Feng, Y. A. Knirel, L. Wang / Structure of a teichoic-acid like O-polysaccharide of Escherichia coli O29 // Carbohydr. Res. 2006, 341, 2176-2180.

4. А. В. Перепелов, Б. Лю, С. Н. Сенченкова, С. Д. Шевелев, В. Ванг, А. С. Шашков, Л. Фенг, Л. Ванг, Ю. А. Книрель. Структура глицерофосфатсодержащего O-специфического полисахарида Escherichia coli O130. Биоорган. химия 2007, 33, 64-68.

5. A. V. Perepelov, W. Han, S. N. Senchenkova, S. D. Shevelev, A. S. Shashkov, L. Feng, Y. Liu, Y.

A. Knirel, L. Wang / Structure of the O-polysaccharide of Escherichia coli O150 containing 2-acetamido-4-O-[(S)-1-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucose // Carbohydr. Res. 2007, 342, 648-652.

6. А. В. Перепелов, К. Ванг, С. Н. Сенченкова, С. Д. Шевелев, А. С. Шашков, Л. Фенг, Ю. А.

Книрель, Л. Ванг / Структура и характеристика генного кластера О-антигена Escherichia coli O49, содержащего 4,6-дидезокси-4-[(S)-3-гидроксибутаноиламино]-D-глюкозу // Биохимия 2008, 73, 498-503.

7. Y. A. Knirel, S. N. Senchenkova, A. S. Shashkov, A. V. Perepelov, S. D. Shevelev, B. Liu, L.

Feng, L. Wang / First isolation and identification of a derivative of 5,7-diamino-3,5,7,9-tetradeoxyL-glycero-D-galacto-non-2-ulosonic (8-epilegionaminic) acid // Adv. Sci. Lett. 2009, 2, 384-387.

8. А. В. Перепелов, Б. Лю, С. Н. Сенченкова, А. С. Шашков, С. Д. Шевелев, Л. Фенг, Л. Ванг, Ю. А. Книрель / Структура О-антигена и характеристика кластера генов биосинтеза О-антигена Escherichia coli O108, содержащего 5,7-диацетамидо-3,5,7,9-тетрадезоксиL-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновую (8-эпилегионаминовую) кислоту // Биохимия 2010, 75, 27-33.

9. X. Li, A. V. Perepelov, Q. Wang, S. N. Senchenkova, B. Liu, S. D. Shevelev, X. Guo, A. S. Shashkov, W. Chen, L. Wang, Y. A. Knirel / Structural and genetic characterization of the O-antigen of Escherichia coli O161 containing a derivative of a higher acidic diamino sugar, legionaminic acid // Carbohydr. Res. 2010, 345, 1581-1587.

10. B. Liu, A. V. Perepelov, D. Guo, S. D. Shevelev, S. N. Senchenkova, L. Feng, A. S. Shashkov, L. Wang, Y. A. Knirel / Structural and genetic relationships between the O-antigens of Escherichia coli O118 and O151 // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2010, 60, 199-207.

11. A. V. Perepelov, B. Liu, S. D. Shevelev, S. N. Senchenkova, A. S. Shashkov, L. Feng, Y. A. Knirel, L. Wang / Relatedness of the O-polysaccharide structures of Escherichia coli O123 and Salmonella enterica O58, both containing 4,6-dideoxy-4-{N-(S)-3-hydroxybutanoyl]D-alanyl}amino-D-glucose; revision of the E. coli O123 O-polysaccharide structure // Carbohydr.

Res. 2010, 345, 825-829.

12. A. V. Perepelov, Z. Ni, Q. Wang, S. D. Shevelev, S. N. Senchenkova, A. S. Shashkov, L. Wang, Y. A. Knirel / Structure and gene cluster of the O-antigen of Escherichia coli O109; chemical and genetic evidences of the presence of L-RhaN3N derivatives in the O-antigens of E. coli O109 and O119 // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2011, 61, 47-53.

Тезисы докладов 13. С. Д. Шевелев, А. В. Перепелов, С. Н. Сенченкова, А. С. Шашков / Структурные исследования липополисахаридов бактерии Escherichia coli – от строения к биосинтезу О-антигенов // I Молодежная конференция ИОХ РАН, Москва, 31 марта – 1 апреля 2005 г.

Сборник тезисов докладов. М: МАКС Пресс, 2005, c. 136-138.

14. S. D. Shevelev, L. Feng, Q. Wang, B. Liu, L. Wang / Chemical and genetic studies of the O-antigens of Shigella boydii and their relationship to the O-antigens of Escherichia coli // 18th International Symposium on Glycoconjugates, Florence, Italy, 4-9 September 2005. P212.

15. A. V. Perepelov, S. D. Shevelev, S. N. Senchenkova, A. S. Shaskov, Y. A. Knirel, L. Feng, Q. Wang, B. Liu, L. Wang / New structures of the O-antigens of Escherichia coli O29, O130 and O1related to Shigella dysenteriae // 13th European Carbohydrate Symposium, Bratislava, Slovakia, 21-August 2005. OP69.

16. S. N. Senchenkova, A. V. Perepelov, S. D. Shevelev, A. S. Shashkov, Y. A. Knirel, B. Liu, L. Feng, L. Wang / The completed Salmonella enterica O-antigen structure elucidation // 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, 19-22 September 2010, Hyytil, Finland.

17. Ю. А. Книрель, А. В. Перепелов, С. Н. Сенченкова, С. Д. Шевелев, А. С. Шашков, Б. Лю, Л. Фенг, Л. Ванг / Структурно-генетическое исследование О-антигенов энтеробактерий // IV Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 14-сентября 2011 г. Сборник тезисов докладов, c. 9-10.

18. Y. A. Knirel, A. V. Perepelov, S. N. Senchenkova, S. D. Shevelev, A. S. Shashkov, B. Liu, L. Feng, L. Wang / Structure, genetics and evolution of variation of the O-antigens of closely related enterobacteria Salmonella enterica and Escherichia coli // FASEB Summer Research Conference “Microbial Polysaccharides of Medical, Agricultural and Industrial Importance”, Carefree, Arizona, USA, June 5-10, 2011.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.