WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Вищук Олеся Сергеевна

Структура и противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России

02.00.10 – Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный консультант: д.х.н., профессор Звягинцева Татьяна Николаевна Соловьева Тамара Федоровна

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, заведующая лабораторией ЛМОАБИ Сорокина Ирина Васильевна д.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, снс

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится 28 мая 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу:

690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс:

(423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан “ 27 ” апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О.В.

Актуальность проблемы. Бурые водоросли морей Дальнего Востока России являются богатым, легко возобновляемым источником уникальных по структуре и свойствам полисахаридов (ламинаранов, альгиновых кислот и фукоиданов). В последние годы объектом интенсивного исследования стали сульфатированные полисахариды бурых водорослей – фукоиданы. Они представляют собой обширный класс биополимеров, содержание и структура которых варьирует в зависимости от вида водоросли, мест ее произрастания, сезона сбора и многих других факторов. Постоянно растущий интерес к этим полисахаридам объясняется их разнообразной биологической активностью, которая может быть использована при создании медицинских препаратов нового поколения.

В последние годы наблюдается стремительный рост числа публикаций, посвященных исследованию противоопухолевой активности фукоиданов. Показано, что данная активность фукоиданов возрастает с увеличением степени сульфатирования, однако информация о влиянии на противоопухолевую активность других структурных характеристик фукоиданов: положения сульфатных групп в моносахаридных остатках, их молекулярной массы, типа О-гликозидной связи между остатками фукозы и/или других моносахаридов в главной цепи, а также наличие неуглеводных заместителей, отсутствует.

Актуальным является выделение фукоиданов со стандартными структурными характеристиками и установление молекулярного механизма их противоопухолевого действия. Исследование фукоиданов, принадлежащих к разным структурным группам, позволит выявить закономерности проявления противоопухолевой активности в зависимости от их структурных особенностей.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН и при поддержке грантов РФФИ (проект № 09-04-00761-а) и ДВО РАН (проекты № 10-III-В-05-084, № 11-III-В-05-075).

Цель и задачи работы. Целью данной диссертационной работы является установление структуры фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России Saccharina cichorioides, Saccharina japonica, Fucus evanescens и Undaria pinnatifida и характеристика взаимосвязи структуры фукоиданов и их действия на различные типы раковых клеток человека.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) выделить и фракционировать фукоиданы из бурых водорослей морей Дальнего Востока России S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens и U. pinnatifida; 2) установить структуру фукоиданов; 3) исследовать противоопухолевую активность фукоиданов и молекулярный механизм их действия; 4) определить характер взаимосвязи структуры фукоиданов из бурых водорослей и их противоопухолевой активности.

Научная новизна работы. Из дальневосточных бурых водорослей S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens и U. pinnatifida были выделены и охарактеризованы новые фукоиданы, различающиеся между собой по моносахаридному составу, типу связей, степени сульфатирования и ацетилирования. Впервые показано, что сульфатированные полисахариды, синтезируемые этими видами водорослей, относятся к разным структурным типам фукоиданов.

Проведены исследования биологической активности фукоиданов in vitro. Изучено цитотоксическое действие фукоиданов на различные типы раковых клеток человека, их способность ингибировать неопластическую трансформацию нормальных эпидермальных клеток мыши JB6 Cl41, вызванную действием эпидермального фактора роста (EGF), и самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток человека.

Впервые установлена избирательность противоопухолевого действия фукоиданов, обусловленная их структурными характеристиками. Показано участие фукоидана в ингибировании EGF-индуцированной активации белков митоген-активируемого протеинкиназного каскада (МАРК каскада) в JB6 Cl41 клетках. Исследована способность фукоидана увеличивать антипролиферативную активность ресвератрола и усиливать апоптоз раковых клеток кишечника человека. Впервые показано, что молекулярный механизм данного действия связан с активацией инициаторных и эффекторных каспаз.

Практическая значимость работы. Охарактеризованы фукоиданы из широко распространенных и легко культивируемых дальневосточных видов бурых водорослей S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens и U. pinnatifida. Полученные данные подтверждают структурное многообразие фукоиданов. Показана перспективность использования исследованных фукоиданов для разработки средств профилактики и лечения онкологических заболеваний. Показана возможность применения фукоидана из F. evanescens для защиты кожи от действия УФ-облучения, а фукоидана из S.

cichorioides для усиления противоопухолевого действия ресвератрола, что может позволить снизить дозы токсичных противоопухолевых препаратов при разработке схем лечения онкологических пациентов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Фукоиданы из бурых водорослей S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens и U.

pinnatifida относятся к разным структурным типам.

2. Фукоиданы не проявляют цитотоксической активности к эпидермальным клеткам мыши JB6 Cl41 и ингибируют их EGF-индуцированную неопластическую трансформацию посредством подавления активации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), белков MAPК каскада и АP-1 комплекса.

3. Фукоиданы эффективно ингибируют самопроизвольное формирование и рост колоний клеток рака кишечника, молочной железы и меланомы человека. Фукоиданы различной структуры проявляют специфичность действия по отношению к определенному типу раковых клеток.

4. Высокосульфатированный -L-фукан из S. cichorioides увеличивает антипролиферативную активность ресвератрола и усиливает апоптоз раковых клеток кишечника человека, вызывая активацию инициаторных и эффекторных каспаз при совместном действии ресвератрола и фукоидана.

5. Существует взаимосвязь структуры фукоиданов и их противоопухолевого действия.

Наличие 13-связанных сульфатированных остатков -L-фукозы необходимо для ингибирования EGF-индуцированной неопластической трансформации нормальных клеток мыши и роста колоний раковых клеток кишечника человека;

сульфатированный и частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 13- и 14-связанных остатков -L-фукозы ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека; для ингибирования процессов роста колоний рака молочной железы человека необходимо присутствие в молекуле фукоидана большого количества остатков сульфатированной и частично ацетилированной галактозы и фукозы, соединенных 13- и/или 14-О-гликозидными связями.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на 3rd Annual Korea-Russian Bio Joint Forum «The Natural Products Industrialization and Application», Gangneung, 2011; на научно-практической конференции «Биологически активные вещества: Фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Украина, 2011; на Международном симпозиуме «Bioprosp», Норвегия, 2011; на 9th International Marine Biotechnology Conference (IMBC 2010), Китай, 2010; на 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology», Новосибирск, 2010; на XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2009.

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ и 10 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН 28 марта 2012 г.

Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературы по теме исследования, проведено планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Литературный обзор», «Результаты и их обсуждение», «Экспериментальная часть», «Выводы», «Список литературы», включающий 1наименований, и приложения, где приведены спектры ИК-, С-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Диссертация изложена на 124 страницах. Результаты представлены в 10 таблицах и иллюстрированы 26 рисунками.

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н.

Звягинцевой Т.Н. Автор благодарит к.х.н. Ермакову С.П. и Шевченко Н.М. за консультации и помощь в работе, к.х.н. Исакова В.В. за получение ЯМР спектров, к.ф.м.н. Глазунова В.П. за получение ИК спектров и всех сотрудников ЛХФ ТИБОХ ДВО РАН.

Сокращения и условные обозначения. L – фракция ламинарана, PM – фракция полиманнурованной кислоты, F - фракция фукоидана, EGF – эпидермальный фактор роста, EGFR – рецептор эпидермального фактора роста, ERK – киназа, регулирующая внеклеточные сигналы, JNK - Jun N-концевая киназа, MAPK – митоген-активируемые протеинкиназы, MMPs – матриксные металлопротеиназы ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Главное внимание в настоящем исследовании уделено установлению структуры фукоиданов из 4 видов бурых водорослей морей Дальнего Востока России, исследованию их способности препятствовать возникновению и развитию рака и изучению взаимосвязи структуры фукоиданов и их противоопухолевой активности.

1. Выделение и фракционирование фукоиданов из бурых водорослей Выделение полисахаридов из бурых водорослей S. cichorioides, S. japonica, F.

evanescens и U. pinnatifida проводили по модифицированной схеме комплексной переработки водорослей, разработанной в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, (Рис. 1).

Рисунок 1 - Схема выделения полисахаридов из бурых водорослей S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens, U. pinnatifida.

L – фракции ламинарана PM - фракция полиманнуронана F - фракции фукоидана В результате экстракции водорослей S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens и U.

pinnatifida (0,1 N HCl, 60°С), были получены фракции водорастворимых полисахаридов ScE, SjE, FeE и UpE, наибольшее содержание которых было в F. evanescens (5,3 %), наименьшее – в U. pinnatifida (2,8 %). Для отделения фукоиданов от полиманнуроновых кислот и ламинаранов, использовали анионообменную хроматографию на DEAEцеллюлозе.

В результате разделения полисахаридов фракции ScE получили сульфатированные полисахариды ScF1 и SсF2. Показано, что водоросль S. cichorioides синтезирует два разных структурных типа фукоиданов, различающихся по моносахаридному составу и степени сульфатирования (рис. 2, табл. 1) A4NaCl, M 3 ScF2,Рисунок 2 – Анионообменная 1,хроматография (DEAE-целлюлоза) полисахаридов фракции ScE из 1,ScF1 S. cichorioides 0,0, 0 100 200 300 400 500 6NaCl/H O, мл Таблица 1 - Характеристики полисахаридов, полученных при анионообменной хроматографии фракции ScE из S. cichorioides Выход** Моносахаридный состав, Фрак- Mw*** Содержание****, % % мольные % ция* кДа Углеводов SO3Na- Fuc Gal Man Xyl Rha Glc ScF1 1,0 н.о. 55 21 95,0 0 5,0 0 0 ScF2 2,2 540 30 39 100,0 0 0 0 0 * - ScF1 - фракция полисахаридов, элюированных 1 М NaCl ScF2 - фракция полисахаридов, элюированных 1,5 М NaCl ** - процент от веса сухой обезжиренной водоросли *** - Mw, установленные методом ВЭЖХ. Стандарты: пуллуланы «Shodex Standard P-82» и голубой декстран «Amersham» **** - процент от навески полисахарида н.о. - не определен В результате разделения фракции FeE получили фракцию FeL и фракции сульфатированных полисахаридов FeF1 и FeF2 (рис. 3). Анализ моносахаридного состава показал, что полисахарид FeL содержал глюкозу и минорные количества маннозы (табл. 2). Для установления структуры полисахарида FeL использовали метод С-ЯМР-спекроскопии. В 13С-ЯМР спектре полисахарида FeL были обнаружены сигналы 101,6 м.д., 74,0 м.д., 84,7 м.д., 68,6 м.д., 77,0 м.д., 61,6 м.д., характерные для 13связанных остатков -D-глюкопиранозы. Сигнал с хим. сдвигом 176,5 м.д.

соответствовал С6 остатка полиманнуроновой кислоты. Таким образом, полисахарид фракции FeL представлял собой 13--D-глюкан (ламинаран), также в ней содержалось незначительное количество полиманнуроновой кислоты.

Фракция FeF1 имела гетерогенную моносахаридную композицию, тогда как фракция FeF2 представляла собой сульфатированный фукан, содержащий минорные количества галактозы и ксилозы (табл. 2).

NaCl, M А4FeFРисунок 3 – Анионообменная 1,5 хроматография полисахаридов 1,FeFфракции FeE из F. evanescens FeL 0,0,0 100 200 300 400 5 NaCl/H2O, мл Таблица 2 - Характеристики полисахаридов, полученных при анионообменной хроматографии фракции FeE из F. evanescens Моносахаридный состав, Выход** Содержание****, % Фрак- Mw*** мольные % % ция* кДа Fuc Gal Man Xyl Rha Glc Углеводов SO3Na- FeL 1,0 н.о. 72 н.о. 0 0 3,0 0 0 97,FeF1 1,4 н.о. 58 15 79,0 0 15,0 4,0 2,0 FeF2 3,2 430 55 27 94,0 3,0 1,0 2,0 0 * - FeL - фракция полисахаридов, элюированных 0,04 M NaCl FeF1- фракция полисахаридов, элюированных 0,95 M NaCl FeF2 - фракция полисахаридов, элюированных 1,5 M NaCl **- процент от веса сухой обезжиренной водоросли *** - Mw, установленные методом ВЭЖХ. Стандарты: пуллуланы «Shodex Standard P-82» и голубой декстран «Amersham» **** - процент от навески полисахарида н.о. – не определен В результате разделения фракции SjE получили полисахариды SjL, SjF1 и SjF(рис. 4, табл. 3). Фракция SjL содержала большое количество глюкозы после гидролиза полисахарида В С-ЯМР спектре полисахарида SjL присутствовали сигналы с химическими сдвигами 101,3 м.д., 73,6 м.д., 85,2 м.д., 68,8 м.д., 77,3 м.д., 61,4 м.д., характерные для 13-связанных остатков -D-глюкопиранозы и имелись дополнительные сигналы с химическими сдвигами 104,1 м.д., 74,0 м.д, 76,2 м.д., 69,м.д., 75,3 м.д., 69,4 м.д., свидетельствующие о присутствие 16-связанных остатков D-глюкопиранозы. Следовательно, полисахарид SjL являлся 13;16--D-глюканом.

Полисахарид SjF1 являлся сульфатированным полисахаридом с гетерогенным составом: помимо большого количества фукозы, галактозы и маннозы, он содержал минорные количества других моносахаридов. Фракция SjF2 отличалась высоким содержанием фукозы, галактозы и незначительным содержанием ксилозы и рамнозы.

Данный сульфатированный полисахарид являлся галактофуканом (табл. 3).

NaCl, M A49SjFРисунок 4 – Анионообменная 3,Хроматография полисахаридов 3 1,фракции SjE из S. japonica 2,SjF1,0,Sj 0,0 100 200 300 400 500 6 NaCl/H2O, мл Таблица 3 - Характеристики полисахаридов, полученных при анионообменной хроматографии фракции SjE из S. japonica Моносахаридный состав, Выход**, Содержание****, % Фрак- Mw*** мольные % % ция* кДа Fuc Gal Man Xyl Rha Glc Углеводов SO3Na- 3,0 4,0 4,5 0,5 1,0 87,SjL 0,4 н.о. 58 н.о.

53,0 29,0 15,0 1,3 1,7 SjF1 0,8 н.о. 76 60,0 35,0 0 2,0 3,0 SjF2 3,0 310 56 * - SjL - фракция полисахаридов, элюированных 0,04 M NaCl SjF1- фракция полисахаридов, элюированных 0,9 M NaCl SjF2 - фракция полисахаридов, элюированных 1,4 M NaCl **- процент от веса сухой обезжиренной водоросли *** - Mw, установленные методом ВЭЖХ. Стандарты: пуллуланы «Shodex Standard P-82» и голубой декстран «Amersham» **** - процент от навески полисахарида н.о. - не определен В результате разделения фракции UpE получили полисахариды UpPM, UpF1 и UpF2, представляющие собой полиманнуроновую кислоту, сульфатированный полисахарид с гетерогенным составом и сульфатированный галактофукан, соответственно (рис. 5, табл. 4).

NaCl, M А4UpF2 Рисунок 5 – Анионообменная 2,хроматография полисахаридов 1,фракции UpE из U. pinnatifida 1,UpPM UpF0,0, 0 100 200 300 400 500 6NaCl/H2O, мл Таблица 4 - Характеристики полисахаридов, полученных при анионообменной хроматографии фракции UpE из U. pinnatifida Моносахаридный состав, Выход**, Содержание****, % Фрак- Mw*** мольные % % ция* кДа Fuc Gal Man Xyl Rha Glc Углеводов SO3Na- UpPM 0,5 н.о. 65 н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

UpF1 1,1 н.о. 56 14 59,0 30,0 8,0 2,0 0 1,UpF2 1,8 760 54 29 51,0 48,0 1,0 0 0 * - UpPM - фракция полисахаридов, элюированных 0,25 M NaCl UpF1- фракция полисахаридов, элюированных 0,9 M NaCl UpF2 - фракция полисахаридов, элюированных 1,4 M NaCl **- процент от веса сухой обезжиренной водоросли *** - Mw, установленные методом ВЭЖХ. Стандарты: пуллуланы «Shodex Standard P-82» и голубой декстран «Amersham» **** - процент от навески полисахарида н.о. - не определен Таким образом, анализ полученных данных позволил отнести исследуемые полисахариды к ламинаранам, полиманнуроновым кислотам, фуканам и галактофуканам. Показано, что отдельный вид бурой водоросли может синтезировать различные структурные типы фукоиданов. Водоросли, принадлежащие к одному семейству Laminariaceae, также синтезируют различные структурные типы фукоиданов.

Так, фукоидан из бурой водоросли S. cichorioides является -L-фуканом, а основной тип фукоидана из бурой водоросли S. japonica - галактофукан. Было подтверждено, что фукоиданы являются видоспецифичными полисахаридами бурых водорослей.

2. Установление структуры выделенных фукоиданов Для установления структуры были выбраны наименее гетерогенные по моносахаридному составу фракции ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2, которые имели максимальный выход. Показано, что исследуемые полисахариды различались между собой по степени сульфатирования: наиболее сульфатированным был фукоидан из S.

cichorioides (ScF2), содержащий 39 % сульфатов; наименее - из S. japonica (SjF2) - 23 % сульфатных групп (табл. 1, 2, 3, 4).

Молекулярная масса фукоиданов бурых водорослей S. cichorioides (ScF2), F.

evanescens (FeF2), S. japonica (SjF2) и U. pinnatifida (UpF2) была определена методом ВЭЖХ на последовательно соединенных колонках Shodex Asahipak GS-520 HQ и GS-6HQ, и составила 540, 430, 310 и 760 кДа, соответственно (табл. 1, 2, 3, 4). В качестве стандартов использовали пуллуланы Shodex Standard P-82 («Showa Denko», Япония) с молекулярными массами от 180 до 667000 Да и голубой декстран («Amersham», Швеция).

Положение сульфатных групп в фукоиданах устанавливали с помощью метода ИКспектроскопии. Показано, что сульфатные группы в фукоидане ScF2 из S. cichorioides находились преимущественно в аксиальном положении при C4 (интенсивная полоса поглощения 851 см-1) и меньшее их число - в экваториальном положении при С2 (полоса поглощения 830 см-1) остатков фукозы. В фукоидане FeF2 из бурой водоросли F.

evanescens, напротив, преобладающим положением сульфатных групп являлось экваториальное при С2 (полоса поглощения 823 см-1) остатков фукозы. В галактофукане SjF2 из S. japonica сульфатные группы находились преимущественно в экваториальном положении при С2 (полоса поглощения 823 см-1), небольшое количество сульфатов находилось в аксиальном положении при С4 остатков фукозы и/или галактозы (полоса поглощения 836 см-1). В галактофукане UpF2 из U. pinnatifida сульфатные группы находились, в основном, в экваториальном положении при С2 фукозы и/или галактозы (полоса поглощения 829 см-1), а также в аксиальном положении при С4 фукозы и/или галактозы (полоса поглощения 849 см-1).

Структурные особенности фукоиданов бурых водорослей были проанализированы 13 методом С-ЯМР спектроскопии. В С-ЯМР спектре фукоидана ScF2 из бурой водоросли S. cichorioides были интерпретированы сигналы углеродных атомов CH3групп фукопиранозы (около 16,3-16,5 м.д.) и C1 (99,5-100 м.д.); а область сигналов С2 - С5 остатков фукозы была плохо разрешена. После сольволитического десульфатирования фукоидана ScF2 степень сульфатирования снизилась на 30 % (десульфатированный полисахарид содержал 9 % сульфатных групп). В области резонанса аномерных атомов углерода присутствовали сигналы с химическими сдвигами 96,6 м.д., 67,9 м.д., 76,3 м.д., 69,7 м.д., 67,8 м.д.,16,3-16,5 м.д., характерные для 13-связанных остатков -L-фукопиранозы. Наиболее интенсивные сигналы в двумерных COSY, TOCSY и NOESY спектрах были идентифицированы как принадлежащие остаткам -L-фукопиранозы. Для более детального структурного анализа фукоидана ScF2 был применен метод масс-спектрометрии, который позволяет устанавливать тип гликозидных связей в олигомерах полисахаридов, положение сульфатных групп и минорных элементов. В условиях автогидролиза, впервые примененного нами для деградации фукоидана ScF2, были получены сульфатированные фукоолигосахариды с максимальной степенью полимеризации (n) до 7. Результаты анализа сульфатированной -L-фукозы и фукоолигосахаридов с n = 2-показали, что фрагменты полисахарида содержали 2- и 4-сульфатированные 13связанные остатки -L-фукопиранозы в качестве преобладающей структурной единицы.

Согласно литературным данным, фукоиданы из бурой водоросли S. cichorioides в качестве главного моносахаридного компонента содержат фукозу, содержание других моносахаридов незначительно. В нашем случае мы выделили высокосульфатированный фукоидан со структурой аналогичной структуруре фукоидана, описанной в работе (Zvyagintseva T. and et.al, 2003).

В 13С-ЯМР спектре фукоидана FeF2 из бурой водоросли F. evanescens наблюдали характерные сигналы для CH3-групп (около 16,6 м.д.) и C1 остатка -L-фукопиранозы (99,9 – 101,3 м.д.), а также сигналы, указывающие на присутствие ацетильных групп (21,7 м.д., СН3; 175,9 м.д., С=О) в полисахариде. C помощью масс-спектрометрии установлено, что фукоидан FeF2 построен из остатков фукозы, связанных 14-Огликозидными связями. Поскольку в фукоидане FeF2 сульфатирование при С3 остатка -L-фукопиранозы не было обнаружено, был сделан вывод о присутствии некоторого количества 13-связанных остатков -L-фукопиранозы. Полученные данные находятся в соответствии с результатами предыдущих исследований (Bilan M. and et.al, 2002).

В С-ЯМР спектре галактофукана SjF2 имелись сигналы С1 (103,7 м.д.), характерные для -D-галактопиранозы и менее интенсивный сигнал при С6 (62,0 м.д.), указывающий на присутствие свободной CH2OH группы в остатке D-галактопиранозы, а также сигналы (21,7 м.д., СН3; 175,9 м.д., С=О), характерные для ацетильных групп в полисахариде. Интенсивный сигнал в области 69,7 – 70,2 м.д., соответствовал Состатков галактозы, связанных 16-О-гликозидными связями. Аномерные сигналы С(99,5 – 101,7 м.д.) и С6 (16,5 м.д.), область сигналов С2 – С5 (65,0 – 83,0 м.д.) свидетельствовали о наличии 13-О-гликозидной связи между остатками -Lфукопиранозы.

В спектре галактофукана UpF2 из U. pinnatifida были обнаружены сигналы с химическими сдвигами 103,6 – 104,8 м.д. и интенсивный сигнал с химическим сдвигом 62,0 м.д., характерные для С1 атомов остатков -D-галактопиранозы и С6 свободной CH2OH группы в остатке D-галактопиранозы, соответственно.

Рисунок 6 - Фрагменты структуры фукоиданов из бурых водорослей S. cichorioides (А), F. evanescens (Б) U. pinnatifida (B) S. japonica (Г) Согласно литературным данным галактофукан из U. pinnatifida имеет блочное строение: блоки построены из остатков фукозы и галактозы [Skriptsova A. and et.al, 2010]. Аномерные сигналы С1 (97,0 – 102,7 м.д.), С6 (16,4 – 16,9 м.д.) и интенсивный сигнал С2 (67,7 м.д.) указывали на присутствие 13- и 14-связанных остатков -Lфукопиранозы и -D-галактопиранозы. Сигналы с химическими сдвигами 21,7 м.д. и 175,9 м.д. указывали на присутствие ацетильных групп в полисахариде.

Установлено, что выделенные фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 относятся к разным структурным группам. Фукоидан ScF2 из S. cichorioides содержал главную цепь из 13-связанных остатков -L-фукопиранозы, сульфатированной по С2 и С4 остатков фукозы (I группа) (рис. 6 А). Фукоидан FeF2 из бурой водоросли F. evanescens состоял из 13- и 14-связанных остатков -L-фукопиранозы, частично ацетилированных и сульфатированых преимущественно по положению С2, и менее по С4 (II группа) (рис. Б). Сопоставление полученных данных с литературными позволило предположить, что фукоидан из бурой водоросли S. japonica является галактофуканом, построенным из 13-связанных остатков -L-фукопиранозы с ответвлениями от основной цепи в виде 16-связанных остатков -D-галактозы, сульфатированных по положениям С2 и менее С4, а также частично ацетилированных по свободным положениям (III группа) (рис. 6 Г).

Фукоидан из U. pinnatifida также представлял собой галактофукан, главная цепь которого состояла из 13- и 14-связанных остатков -L-фукопиранозы и -Dгалактозы, сульфатированных по положениям С2 и реже С4 и частично ацетилированных по свободным положениям (III группа) (рис. 6 В). Кроме того, в фукоидане из S. japonica СН2ОН группа остатков галактозы была замещена, а в галактофукане из U. pinnatifida оставалась практически свободной.

3. Противоопухолевая активность фукоиданов из бурых водорослей морей Дальнего Востока России 3.1 Цитотоксическая активность фукоиданов Фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 не проявляли цитотоксической активности по отношению к нормальным эпидермальным клеткам мыши JB6 Cl41 в концентрациях до 400 мкг/мл. Аналогичные результаты были получены при исследовании цитотоксичности фукоиданов по отношению к клеткам рака кишечника HT-29, DLD-1 и меланомы человека SK-MEL-28 и SK-MEL-5. Наблюдался незначительный цитотоксический эффект исследуемых фукоиданов по отношению к линиям клеток рака кишечника HCT 116, рака молочной железы T-47D и к клеткам меланомы человека RPMI-7951. Все выделенные фукоиданы (до 400 мкг/мл) не вызывали гибели 50% исследованных клеток в течение ч, то есть являлись нетоксичным, либо проявляли слабо выраженную токсичность.

Цитотоксическая активность фукоиданов, различающихся по строению главной цепи, моносахаридному составу, положению сульфатов и степени сульфатирования по отношению к различным типам клеток проанализирована впервые.

3.2 Действие фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток Показано, что фукоиданы из бурых водорослей незначительно влияли на пролиферацию раковых клеток кишечника человека HCT 116 (рис. 7 А), HT-29 и DLD-(данные не показаны) в концентрации до 200 мкг/мл.

Фукоидан ScF2 ингибировал пролиферацию раковых клеток молочной железы T47D (рис. 7 Б) и меланомы человека SK-MEL-28, SK-MEL-5 и RPMI-7951 (рис. 7 В, Г, Д) на 10 % - 15 % по сравнению с контролем. Степень ингибирования роста клеток молочной железы и меланомы человека галактофуканом SjF2 составила менее 30 % (рис. 7 Б, В, Г, Д).

Фукоидан FeF2 обладал более выраженным действием: ингибировал пролиферацию клеток меланомы человека SK-MEL-28, SK-MEL-5 и RPMI-7951 на 38 %, 43 % и 46 %, соответственно (рис. 7 В, Г, Д), тогда как степень ингибирования роста раковых клеток молочной железы T-47D не превышала 15 % по сравнению с контрольными клетками (рис. 7 Б). Напротив, галактофукан UpF2 из U. pinnatifida проявлял высокую антипролиферативную активность по отношению к клеткам T-47D (степень ингибирования составила 60 %) и был менее активен по отношению к SK-MEL28, SK-MEL-5 и RPMI-7951 клеткам (степень ингибирования – 34 %, 34 % и 35 %, соответственно).

Рисунок 7 - Выживаемость HCT 116 (A), T-47D (Б), SK-MEL-28 (В), SK-MEL-5 (Г) и RPMI7951 (Д) клеток, обработанных фукоиданами из бурых водорослей S. cichorioides (ScF2), S. japonica (SjF2), F. evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2) Показано, что все исследованные фукоиданы практически не ингибировали рост раковых клеток кишечника человека, но были более эффективны по отношению к опухолевым клеткам молочной железы и меланомы человека, то есть проявляли специфичность действия. Наибольшим влиянием на пролиферацию клеток Т-47D обладал галактофукан из U. pinnatifida, тогда как галактофукан из S. japonica незначительно ингибировал рост данных клеток; на пролиферацию клеток меланомы человека эффективно действовал 13;14--L-фукан из F. evanescens, а 13--Lфукан из S. cichorioides не влиял на данный процесс. Необходимо отметить, что влияние фукоиданов на пролиферацию каждого типа клеток связано с индивидуальными структурными характеристиками фукоиданов.

3.3 Действие фукоиданов бурых водорослей на неопластическую трансформацию клеток, вызванную действием эпидермального фактора роста Cогласно литературным данным, процессы неопластической трансформации клеток в мягком агаре in vitro можно коррелировать с процессами возникновения злокачественных новообразований in vivo (Combes R. et.al., 1999). Эпидермальные клетки мыши JB6 Cl41 (без обработки эпидермальным фактором роста (EGF), контроль) не образовывали колонии в мягком агаре, тогда как под действием EGF (1 нг/мл) происходила их трансформация и, как следствие, образование колоний (20колоний/8000 клеток). Установлено, что исследуемые фукоиданы в концентрации мкг/мл ингибировали неопластическую трансформацию JB6 Cl41 клеток, индуцированную EGF. Фукоидан ScF2 из S. cichorioides ингибировал трансформацию клеток на 65 % по сравнению с контролем, а обработка клеток фукоиданами SjF2, FeFи UpF2 из S. japonica, U. pinnatifida и F. evanescens приводила к снижению количества трансформированных клеток на 39 %, 55 % и 35 %, соответственно (рис. 8).

Рисунок 8 - Действие фукоиданов из бурых водорослей S. cichorioides (ScF2), S. japonica (SjF2), F.

evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2) на EGF-индуцированную неопластическую трансформацию эпидермальных клеток мыши JB6 Cl 3.3.1. Молекулярный механизм канцерпревентивного действия фукоидана из S.

cichorioides Для изучения молекулярного механизма действия был выбран фукоидан ScF2 из бурой водоросли S. cichorioides, поскольку он ингибировал EGF – индуцированную неопластическую трансформацию JB6 Cl41 клеток в наибольшей степени по сравнению с фукоиданами из S. japonica, F.evanescens и U. pinnatifida (рис. 8).

С помощью метода вестерн-блоттинг показано, что фукоидан в концентрации мкг/мл эффективно ингибировал фосфорилирование рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и белка MEK 1/2, индуцированное EGF, а в концентрации 1мкг/мл практически полностью блокировал их фосфорилирование (рис. 9). Важно отметить, что обработка клеток фукоиданом в сочетании с EGF не приводила к изменению экспрессии белков EGFR и MEK 1/2.

Рисунок 9 - Действие фукоидана из S. cichorioides (ScF2) на EGF -индуцированную активацию EGFR, MEK 1/2, ERKs, и JNKs Фукоидан ScF2 также эффективно ингибировал фосфорилирование протеинкиназ ERK 1/2 и JNK 1/2, вызванное действием EGF, а также следующих за ними в MAPK каскаде p-90RSK и c-jun. Экспрессия анализируемых белков оставалась постоянной (рис.

9).

Известно, что повышение уровня экспрессии онкобелков с-jun, c-fos и AP-комплекса играет решающую роль в процессах трансформации нормальных клеток в опухолевые. Установлено, что фукоидан в концентрации 10 мкг/мл подавлял активность онкобелков с-fos, c-jun и AP-1 комплекса, активированные EGF, на 40 %, 43 % и 65 %, соответственно (рис. 10).

Рисунок 10 - Действие фукоидана из S. cichorioides (ScF2) на активацию онкобелков c-fos, c-jun и AP-комплекса Полученные результаты представляют несомненный интерес, поскольку фукоиданы бурых водорослей, ингибирующие активацию EGFR, MAPK и AP-комплекса, являются перспективными средствами для предотвращения клеточной трансформации и, как следствие, возникновение рака.

3.4 Действие фукоиданов бурых водорослей на самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток Исследование действия фукоиданов ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 (50 мкг/мл) из бурых водорослей S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens и U. pinnatifida на самопроизвольное формирование и рост колоний клеток рака кишечника человека показало, что они ингибировали данный процесс в различной степени. Фукоидан ScF2 из S. cichorioides оказался наиболее эффективным при обработке опухолевых клеток кишечника человека. Он ингибировал формирование и рост колоний HCT 116, HT 29 и DLD-1 клеток на 29 %, 44 % и 76 %, соответственно (рис. 11 А, Б, В). Наиболее выраженное противоопухолевое действие для фукоидана ScF2 обнаружено на модели DLD-1 клеток: он снижал не только количество колоний опухолевых клеток, но и значительно уменьшал их размеры (рис. 11 Г).

Рисунок 11 - Действие фукоиданов из бурых водорослей S. cichorioides (ScF2), S. japonica (SjF2), F. evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2) на формирование и рост колоний клеток рака кишечника человека HCT 116 (А), HT-29 (Б) и DLD-1 (В, Г) Галактофуканы UpF2 и SjF2 из бурых водорослей U. pinnatifida и S. japonica оказались наиболее эффективными на модели раковых клеток молочной железы (рис.

12 Г). Галактофуканы UpF2 и SjF2 ингибировали формирование и рост колоний T-47D клеток на 75 % и 64 %, соответственно, тогда как фукоиданы ScF2 и FeF2 ингибировали данный процесс на 18 % и 30 %, соответственно.

Рисунок 12 - Действие фукоиданов из S. cichorioides (ScF2), F. evanescens (FeF2), S. japonica (SjF2), U. pinnatifida (UpF2) на формирование и рост колоний клеток меланомы SK-MEL-28 (А), SK-MEL-(Б), RPMI-7951 (В) и опухолевых клеток молочной железы человека T-47D (Г) Фукоидан FeF2 из F. evanescens обладал наиболее сильным ингибирующим действием на клетках меланомы человека, он угнетал рост колоний SK-MEL-28, SKMEL-5 и RPMI – 7951 на 66 %, 54 % и 51 %, соответственно (рис. 12 А, Б, В).

3.4.1 Действие фукоидана из бурой водоросли F. evanescens на УФиндуцированную активацию матриксных металлопротеиназ Известно, что одним из факторов возникновения меланомы у человека является чрезмерное ультрафиолетовое облучение (УФ-облучение) кожи. Установлено, что экспрессия матриксной металлопротеиназы - 1 (ММР-1) – играет важную роль в процессе метастазирования меланомы, опухолей легких и молочной железы человека.

Фукоидан FeF2 из F. evanescens проявлял наиболее выраженное ингибирующее действие на пролиферацию и формирование колоний клеток меланомы человека (рис.

7, 12), поэтому мы исследовали его способность подавлять экспрессию MMP-1, вызываемую УФ-облучением.

Фукоидан FeF2 (10 мкг/мл и 100 мкг/мл) ингибировал активацию MMP-1, индуцированную УФ-облучением (15 мДж/см2) на 40 % и 48 %, соответственно (рис. А). Действие фукоидана на уровень экспрессии гена, кодирующего MMP-1, было исследовано с помощью ПЦР анализа. Фукоидан (10 и 100 мкг/мл) эффективно ингибировал экспрессию этого гена (степень ингибирования составила 27 % и 59 %, соответственно) (рис. 13 Б).

Под действием УФ-облучения происходило фосфорилирование протеинкиназ ERK 1/2, JNK 1/2, p38, тогда как обработка клеток фукоиданом (100 мкг/мл) приводила к значительному снижению активности данных белков (рис. 13 В).

Рисунок 13 - Действие фукоидана из F. evanescens (FeF2) на УФ-индуцированную активацию MMP-1 (A), экспрессию мРНК (Б) и фосфорилирование MAPK (В) Впервые показано, что фукоидан из F. evanescens способен предотвращать УФиндуцированную экспрессию ММР-1 на транскрипционном и трансляционном уровнях, изменяя активность клеточных белков МАРК сигнального каскада. Как результат, фукоидан из бурой водоросли F. evanescens может быть потенциальным терапевтическим средством для предотвращения возникновения меланомы кожи под действием УФ-облучения и использоваться как активная составляющая в лечебной и лечебно-профилактической косметике.

3.5 Проапоптопическое действие фукоидана из бурой водоросли S. cichorioides Перспективным направлением лечения злокачественных опухолей является поиск и разработка нетоксичных противоопухолевых препаратов на основе субстанций природного происхождения, способных индуцировать апоптоз опухолей на разных стадиях их развития. Известно, что антипролиферативное действие веществ часто связано с реализацией программы апоптоза опухолевых клеток. Поскольку фукоидан ScF2 из S. cichorioides не обладал цитотоксической активностью (до 400 мкг/мл) и не влиял на пролиферацию раковых клеток кишечника человека HCT 116 (рис. 7 А), мы исследовали его способность увеличивать противоопухолевую активность ресвератрола и усиливать апоптоз HCT 116 клеток, индуцированный данным препаратом.

Использование ресвератрола в качестве противоопухолевого агента во многом сдерживается его высокой токсичностью по отношению, как к опухолевым, так и нормальным клеткам. Следовательно, изучение возможного синергического противоопухолевого действия ресвератрола (в нетоксичных концентрациях) и фукоидана ScF2 представляет большой интерес для повышения эффективности лечения злокачественных новообразований.

При исследовании цитотоксической активности ресвератрола была определена его концентрация, при которой погибало 50 % раковых клеток кишечника HCT 116 (IC50 = мкМ). Показано, что ресвератрол в нетоксических дозах (40 мкМ) подавлял пролиферацию HCT 116 клеток на 34 %, 40 % и 71 % после инкубации клеток с веществом в течение 24, 48 и 72 ч, соответственно (рис. 14 А). Действие ресвератрола (24 ч) усиливалось при добавлении фукоидана ScF2 (100, 200 и 300 мкг/мл) на 13 %, % и 22 %, соответственно (рис. 14 Б). Таким образом, в данном случае имел место синергизм действия при совместном введении двух веществ.

Рисунок 14 - Действие ресвератрола (Res) (А) и совместное действие ресвератрола (Res) и фукоидана (ScF2) из S. cichorioides (Б) на пролиферацию опухолевых клеток кишечника человека HCT 1Установлен молекулярный механизм реализации апоптоза опухолевых клеток HCT 116 при совместной обработки ресвератролом и фукоиданом. Показано, что добавленные отдельно ресвератрол (40 мкМ) и фукоидан ScF2 (300 мкг/мл) не индуцировали активацию каспаз в HCT 116 клетках, тогда как при совместном их введении наблюдается синергический эффект (рис. 15).

Рисунок 15 - Совместное действие ресвератрола (Res) и фукоидана из S. cichorioides (ScF2) на активацию каспазы 9, 7, 3 и расщепление каспаз 7 и Показано, что происходила активация каспазы 9, и, как следствие, активация каспаз 3 и 7. Стоит отметить, что активация каспаз усиливалась с увеличением концентрации фукоидана ScF2 (рис. 15). Наибольшее расщепление каспаз 7 и 3 (cleaved caspase 7, 3) наблюдалась в клетках, обработанных ресвератролом (40 мкМ) и ScF(300 мкг/мл).

Данные, свидетельствующие о способности фукоидана из S. cichorioides (ScF2) усиливать апоптоз HCT 116 клеток, индуцированный ресвератролом, были подтверждены методом проточной цитофлюориметрии c окрашиванием аннексиномV/PI (рис. 16).

Ресвератрол, 40 мкM Ресвератрол, 0 мкM Ресвератрол, 40 мкM Фукоидан, 100 мкг/мл Фукоидан, 0 мкг/мл Фукоидан, 0 мкг/мл 104 104 1100 100 1100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 1FL1-H FL1-H FL1-H Ресвератрол, 40 мкM Ресвератрол, 40 мкM 52% Фукоидан, 200 мкг/мл Фукоидан, 300 мкг/мл * 43% 104 1* 30% 28% * * 9% 6% 100 1Ресвератрол, 40 мкM - - + + + + 100 101 102 103 104 100 101 102 103 1Фукоидан, мкг/мл - 300 - 100 200 3FL1-H FL1-H Рисунок 16 – Совместное действие ресвератрола и фукоидана из S. cichorioides (ScF2) на индукцию апоптоза опухолевых клеток кишечника человека HCT 1При обработке НСТ 116 клеток ресвератролом (40 мкМ) и фукоиданом ScF2 (100, 200, 300 мкг/мл) наблюдалось существенное повышение числа апоптотических клеток (до 52%), тогда как в контрольных образцах количество апоптопических клеток не превышало 20 %.

Таким образом, фукоидан ScF2 из S. cichorioides самостоятельно не влиял на пролиферацию опухолевых клеток кишечника человека, но усиливал их апоптоз, индуцированный ресвератролом, что может привести к снижению действующей дозы ресвератрола и соответственно снизить его побочные действия на организм человека.

Cравнительный анализ противоопухолевой активности фукоиданов из дальневосточных бурых водорослей, имеющих разную структуру, позволил определить структурные элементы фукоиданов, необходимые для проявления данной активности на разных моделях раковых клеток. Предположительно, наличие 13-связанных сульфатированных остатков -L-фукозы необходимо для ингибирования EGFиндуцированной неопластической трансформации нормальных клеток мыши и роста колоний раковых клеток кишечника человека; сульфатированный и частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 13- и 14-связанных остатков -Lфукозы ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека; для ингибирования процессов роста колоний рака молочной железы человека необходимо присутствие в молекуле фукоидана большого количества остатков сульфатированной и частично ацетилированной галактозы и фукозы, соединенных 13- и/или 14-Огликозидными связями.

Выводы 1. Установлено, что фукоиданы из бурых водорослей Saccharina cichorioides, S.

japonica, Fucus evanescens и Undaria pinnatifida различаются между собой по моносахаридному составу, степени сульфатирования и ацетилирования.

Фукоидан из S. cichorioides представляет собой высокосульфатированный 13-L-фукан; фукоидан из F. evanescens состоит из 13- и 14-связанных остатков -L-фукозы, сульфатированных по С2 и менее по С4, и ацетилированных по свободным положениям.

2. Галактофуканы из S. japonica и U. pinnatifida построены из 13-связанных и 13- и 14-связанных остатков -L-фукозы и -D-галактозы, сульфатированных по положениям С2 и менее С4, соответственно, а также частично ацетилированных по свободным положениям.

3. Показано, что фукоиданы не токсичны по отношению к эпидермальным клеткам мыши JB6 Cl41 и ингибируют их EGF-индуцированную неопластическую трансформацию.

4. Определено, что фукоидан из S. cichorioides блокирует EGF-индуцированную трансформацию JB6 Cl41 клеток посредством ингибирования активации EGFR, протеинкиназ MAPК каскада и АP-1 комплекса.

5. Показано, что фукоиданы незначительно влияют на пролиферацию раковых клеток человека, но эффективно ингибируют самопроизвольное формирование и рост колоний клеток рака кишечника, молочной железы и меланомы человека.

Установлена избирательность противоопухолевого действия фукоиданов, обусловленная их структурными характеристиками.

6. Фукоидан из F. evanescens подавляет УФ-индуцированную экспрессию MMP-1, мРНК и MAPK в клетках меланомы человека.

7. Показано, что высокосульфатированный -L-фукан из S. cichorioides усиливает антипролиферативное действие ресвератрола и апоптоз раковых клеток кишечника человека, индуцированный ресвератролом. Показано, что молекулярный механизм реализации апоптоза связан с активацией инициаторных и эффекторных каспаз при совместном действии ресвератрола и фукоидана.

8. Установлена взаимосвязь структурных элементов фукоиданов и их противоопухолевого действия. Показано, что наличие 13-связанных сульфатированных остатков -L-фукозы необходимо для ингибирования EGFиндуцированной трансформации нормальных клеток и роста колоний раковых клеток кишечника человека; сульфатированный и частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 13- и 14-связанных остатков -L-фукозы ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека; для ингибирования процессов роста колоний рака молочной железы человека необходимо присутствие в молекуле фукоидана большого количества остатков сульфатированной и частично ацетилированной галактозы и фукозы, соединенных 13- и/или 14-О-гликозидными связями.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Vishchuk O., Tarbeeva D., Ermakova S., Zvyagintseva T. Structural characteristics and biological activity of fucoidans from brown algae Alaria sp. and Saccharina japonica of different reproductive status // Chem. Biodiversity. - 2012. - Vol. 9. - P. 817 – 82. Anastyuk S., Shevchenko N., Ermakova S., Vishchuk O., Nazarenko E., Dmitrenok P., Zvyagintseva T. Anticancer activity in vitro of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens and its low molecular fragments, structurally characterized by tandem mass-spectrometry // Carbohydr. Polymers. - 2012. - Vol. 87, N 1. - P. 186-194.

3. Vishchuk O., Ermakova S., Zvyagintseva T. Sulfated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics and antitumor activity // Carbohydr. Res. - 2011. - Vol. 345, N 17. - P.

2769-274. Ku M., Jung J., Lee M., Cho B., Lee S., Lee H., Vischuk O., Zvyagintseva T., Ermakova S., Lee Y. Effect of Fucus evanescens fucoidan on expression of matrix metalloproteinase-1 promoter, mRNA, protein and signal pathway // J. Life Science. – 2010. - Vol. 20. - P. 1603-1610.

5. Вищук О.С., Ермакова С.П., Фам Д.Т., Шевченко Н.М., Ли Б.М., Звягинцева Т.Н.

Противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2009. - № 3. - C. 92-96.

6. Sokolova R., Vishchuk O., Ermakova S., Zvyagintseva T. Brown algae as source of sulphated polysaccharides with anticancer activity // Тез. докл. The 3rd Annual KoreaRussian Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application.

Gangneung. - 2011. - P. 333.

7. Vishchuk O. Brown algae are perspective source of biological active polysaccharides // Тез. докл. Междисциплинарной конференции «Биологически активные вещества:

фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». Украина. - 2011. - С. 250.

8. Vishchuk O., Ermakova S., Zvyagintseva T. Sulphated polysaccharides of brown seaweeds: perspectives of production of medicine with antitumor effect // Тез. докл.

International symposium «Bioprosp 2011». Norway. - 2011. - P. 63.

9. Vishchuk O., Ermakova S., Zvyagintseva T. Brown algae is source of bioactive polysaccharides with anti-tumor effect // Тез. докл. 9th International Marine Biotechnology Conference (IMBC 2010). Qingdao. China. - 2010. - P. 413.

10. Vishchuk O., Ermakova S., Pham T., Ly B., Zvyagintseva T. The supplement with antitumor effect, based on polysaccharides from brown algae // Тез. докл. 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology». Новосибирск. - 2009. – P. 152.

11. Ермакова С.П., Вищук О.С., Кусайкин М.И., Ли Н.Е., Чой Х.С., Чой Х.К., Звягинцева Т.Н. Противоопухолевая активность фукоиданов из бурой водоросли L. cichorioides // Тез. докл. III Международной научной конференции ТИНРО.

Владивосток. - 2008. - С. 311.

Соискатель Вищук О.С.

Вищук Олеся Сергеевна Структура и противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.