WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

СКИБА Татьяна Васильевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ИНВЕРСИОННОВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ТИТРОВАНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОЛЬНЫХ, ДИСУЛЬФИДНЫХ ГРУПП И СУЛЬФИДНОЙ СЕРЫ В ПРИРОДНЫХ ВОДАХ И БИОЖИДКОСТЯХ

02.00.02 – аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН Научный руководитель кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Захарчук Нина Федоровна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, зав. лабораторией Стожко Наталья Юрьевна ФГБОУ ВПО «Уральский государственный экономический университет» г. Екатеринбург кандидат химических наук, научный сотрудник Александрова Татьяна Павловна ФГБУН Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН г. Новосибирск Ведущая организация ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»

Защита состоится «19» декабря 2012 г. в 10.на заседании диссертационного совета Д 003.051.в ФГБУН Институте неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН по адресу: просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 6300

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН Института неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН

Автореферат разослан «16» ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук В.А. Надолинный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. Окислительный стресс – это нарушение в организме баланса между прооксидантами и компонентами системы антиоксидантной защиты (АОС). Защитные свойства относительно окислителей и активных радикалов проявляют, прежде всего, тиолы (RSH). Являясь физиологическим показателем активности внутриклеточной системы защиты от действия реактивного кислорода, и благодаря их способности подвергаться окислительно-восстановительным превращениям (2RSH RSSR + 2Н+ + 2е- - тиолдисульфидный статус), они могут быть использованы для непосредственной диагностики антиоксидантного статуса организма. Соотношение восстановленной (-SH) и окисленной (-SS-) форм тиоловых антиоксидантов в крови отражает степень повреждающего воздействия окислительного стресса и может служить для совершенствования диагностики заболеваний, прогнозирования их исхода, и оценки лечебных и профилактических средств.

Сероводород и его растворимые соли – сульфиды издавна известны, как чрезвычайно токсичные соединения, оказывающие губительное влияние на состояние экосистем и жизнедеятельность населяющих ее организмов, включая человека. В зависимости от объекта и продолжительности воздействия диапазон токсичности может варьироваться в широких пределах.

В то же время все чаще появляются сведения биологов и биохимиков о том, что отравления сероводородом можно получить не только в случае прямого контакта с отравляющим веществом, но и в результате сероводородной аутоинтоксикации, обусловленной неправильным пищеварением, курением, протеканием воспалительных процессов и т.д. Обсуждается также положительная роль сероводорода в биохимических процессах при низких ( 10-моль·дм-3) уровнях концентраций. Поэтому очень важной становится проблема контроля над состоянием тиолдисульфидного звена АОС и сульфидной серы, в идеальном случае – в клиниках, поскольку является залогом успешной диагностики и терапевтической коррекции при патологиях различного вида. В последнее десятилетие наблюдается «взрыв» в количестве публикаций, посвященных развитию различных физико-химических методов для исследования тиолов в биологических объектах и оценки уровней токсичного и биологически значимого воздействия сероводорода на живой организм.

Однако многие из описанных методов либо не доведены до уровня конкретных методик анализа биологических объектов, либо трудоемки и малодоступны из-за высокой стоимости анализа и требований к квалификации работников, что препятствует их внедрению в широкую клиническую практику.

Кроме того, во всех упомянутых в литературе методах искомую концентрацию определяют относительно концентрации образцов сравнения (ОС) RSH или сульфидной серы, которые из-за высокой летучести и способности легко окисляться кислородом воздуха, приходится готовить и проверять их титр трудоемкими классическими методами каждые три часа. Из-за нарушения этого правила результаты измерений существующими методами часто несопоставимы друг с другом, что нарушает их интерпретацию. Поэтому поиск нового подхода к разработке способов определения тиолов, дисульфидов и сульфидной серы в водных и биологических средах и установки титра ОС, отличающегося высокой чувствительностью, точностью и экспрессностью, пригодного для использования, как в специализированных лабораториях, так и небольших клиниках, является весьма актуальной задачей.

Цель работы: развитие нового электрохимического метода – инверсионно-вольтамперометрическое титрование (ИВТ) для определения органических тиолов, дисульфидов, растворимых сульфидов и разработки экспрессных, высокоточных и высокочувствительных методик исследования тиолдисульфидного статуса (ТДС) цельной крови и ее фракций и определения сульфидной серы в водных и биологических средах.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

– разработать основные принципы инверсионно-вольтамперометрического титрования до точки эквивалентности (ИВТ-1), с регистрацией всего двух (ИВТ-2) и трех (ИВТ-3) точек;

– исследовать электрохимическое поведение солей меди, свинца, кадмия, ртути и серебра в условиях образования их тиолятов;

– исследовать инверсионно-вольтамперометрическое поведение серебра в зависимости от природы электрода и состава фонового электролита в условиях титрования AgNO3 тиолами и сульфидами;

– разработать ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 методики определения низкомолекулярных тиолов и дисульфидов в цельной крови и её фракциях;

– исследовать ТДС крови и её фракций методами ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-в норме, при различных патологиях, до и после медикаментозной терапии;

– разработать высокочувствительные методики определения растворимых сульфидов в воде и слюне человека;

– разработать методики для экспрессного и высокоточного контроля титра нестабильных ОС органических тиолов, неорганических сульфидов и азотнокислого серебра.

Научная новизна работы.

1. Впервые инверсионно-вольтамперометрический (ИВ) сигнал использован в качестве аналитического в условиях титрования и разработаны основные принципы нового электрохимического метода анализа – инверсионновольтамперометрическое титрование.

2. Впервые предложен способ и расчетные уравнения для обратного титрования с регистрацией всего трех точек на кривой титрования – ИВТ-3.

3. Впервые предложен способ и расчетные уравнения для непосредственного определения искомой концентрации, основанный на определении доли электроактивного компонента, вступившей во взаимодействие с искомым компонентом реакции с учетом фактора эквивалентности – ИВТ-2.

4. Впервые разработаны простые альтернативные друг другу ИВТ-1, ИВТ-и ИВТ-3 способы исследования ТДС цельной крови и её фракций, не требующие предварительного отделения матрицы и разделения определяемых компонентов.

5. Разработана высокочувствительная методика определения растворимых сульфидов в природных и питьевых водах и слюне с пределами обнаружения 5·10-10 моль·дм-3. Впервые предложено проводить анализ слюны с целью диагностики процессов сероводородной аутоинтоксикации организма.

6. Предложен новый, альтернативный классическому титрованию экспрессный ( 3 мин.) и высокоточный (Sr 1.5%) ИВТ-2 способ установки титра органических тиолов, неорганических сульфидов и азотнокислого серебра.

Практическая значимость. Исследование в динамике ТДС методами ИВТ в комплексе с показателями процесса перекисного окисления липидов при кардиохирургических вмешательствах позволяет обнаружить наиболее опасную стадию операции и может служить диагностически значимым показателем про- и антиоксидантного равновесия в экстремальных условиях (НИИ патологии кровообращения им. Е.Н. Мешалкина, Новосибирск). ИВТ способы исследования ТДС использованы для оценки адаптационных резервов организма и их искусственной коррекции, для диагностики и прогнозирования заболеваний, выявления хронических патологий, для неспецифической профилактики и терапии. Исследована эффективность действия биологических добавок в реабилитации больных с онкологическими заболеваниями крови (Центральная клиническая больница СО РАН).

Разработанные методики определения растворимых сульфидов в природных и питьевых водах и слюне характеризуются высокой чувствительностью и хорошими метрологическими параметрами. Это создает перспективу для их широкого внедрения в областях экологического и биологического мониторинга объектов с суб-микромолярным содержанием сульфидов.

На защиту выносятся следующие положения:

обоснование выбора ИВ-сигнала в качестве аналитического в условиях титрования;

результаты исследований по оптимизации условий регистрации ИВсигнала серебра в качестве аналитического в условиях титрования AgNOтиолами и сульфидами;

расчетные уравнения экспрессных методов титрования ИВТ-2 и ИВТ-для нахождения концентрации определяемых веществ;

результаты исследований стехиометрии протекания изучаемых реакций в растворе;

методики и результаты исследования ТДС в цельной крови и ее фракциях в норме и при различных заболеваниях;

методики определения растворимых сульфидов в природных и питьевых водах, слюне;

методики контроля титра нестабильных ОС органических тиолов, неорганических сульфидов и азотнокислого серебра.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на семи конференциях: IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006); XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научнотехнический прогресс» (Новосибирск, 2007); VIII Всероссийской научнопрактической конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2007); VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА2008» (Уфа-Абзаково, 2008); VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 2008); Съездe аналитиков России «Аналитическая химия – новые методы и возможности» (Москва-Клязьма, 2010); IX научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Красноярск, 2012).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ – 3 статьи в рецензируемых международных и отечественных научных журналах и 7 тезисов докладов.

Работа является частью исследований, проводимых в аналитической лаборатории ИНХ СО РАН в рамках решения задач, обозначенных в проекте МНТЦ № 2132 «Sensors and instruments for evaluation of the microelemental and immune status of organisms», а также в интеграционном проекте №6 СО РАН «Молекулярные механизмы функционирования защитно-репарационных систем человека; разработка дифференциальных комплексных методов диагностики и терапии заболеваний с аутоиммунными, онкологическими патологиями».

Личное участие автора состоит в анализе литературных данных, проведении экспериментальной работы для решения поставленных задач, систематизации, обобщении и интерпретации полученных результатов.

Подготовка материалов для публикаций проводилась совместно с научным руководителем и соавторами.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка цитируемой литературы из 188 наименований. Содержит 150 страниц текста, 42 рисунка и 22 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследований, сформулирована научная новизна, практическая значимость работы и положения, выносимые на защиту.

В первой части литературного обзора (глава I) обсуждены работы, посвященные проблемам биологической и клинической значимости тиоловых соединений, их роли в механизмах антиоксидантой системы защиты организма от окислительного стресса. Представлен обзор работ, посвященный методам определения тиольных и дисульфидных групп, входящих в состав различных биотиолов. Дано обоснование разработки нового доступного для любой клинической лаборатории метода исследования ключевого звена АОС – тиолдисульфидного статуса живой клетки. Вторая часть литературного обзора посвящена роли сероводорода и растворимых сульфидов, токсичной и биологически значимой. Дан обзор способов их определения в водных и биообъектах. Показано, что чувствительность существующих физико-химических методов недостаточна для определения сульфидной серы в особо чистой воде ( 5·10-9 моль·дм-3) и, соответственно, в важном биообъекте-индикаторе аутоинтоксикации организма – слюне.





В главе II изложены предпосылки к созданию метода ИВТ, описаны его основные принципы и расчетные уравнения.

Суть предлагаемого в диссертации метода ИВТ заключается в измерении вольтамперометрического инверсионного максимума тока (Im) в условиях титрования вместо амперометрического диффузионного тока (Id). Возникший на основе двух электрохимических методов (инверсионной вольтамперометрии и амперометрического титрования – АТ) метод ИВТ объединил достоинства обоих методов, исключив их недостатки, и представляет собой абсолютно независимый метод с уникальными свойствами и принципиально новыми возможностями. С одной стороны – это простой, надежный, высокочувствительный, экспрессный метод измерения теоретически обоснованного аналитического сигнала (Im) с использованием современного компактного и недорогого оборудования. С другой стороны, возможность определения огромного круга веществ, как электрохимически активных, так и не способных к обмену электронами. Процедура титрования до точки эквивалентности и способы расчета не отличаются от таковых для метода АТ. Но, благодаря свойствам ИВ-сигнала, обусловленного протеканием единственной электродной реакции Ox ± e- Red со 100% выходом по току, отпадает необходимость определять точку эквивалентности графически. Достаточно рассчитать уравнение регрессии. Кроме того, имеется возможность количественно связать величину тока с концентрациями, как титранта, так и аналита в растворе. Это позволяет исключить процедуру титрования до точки эквивалентности и получать информацию о концентрации искомого компонента с регистрацией всего 3-х (ИВТ-3) и даже 2-х (ИВТ-2) точек. Как и в методе АТ, для ИВТ могут быть использованы самые разнообразные химические реакции.

Идеально подходят реакции комплексообразования и осаждения:

nMex+ + mBy- Menx+Bmy- (1) Метод ИВТ-3 идентичен методу косвенной инверсионной вольтамперометрии с элементами титрования. В качестве титранта выступает компонент реакции 1 – Mex+. Определяемым веществом (S) является By-. Измеряется максимум инверсионного тока Mex+, взятого в избытке, до (I0), и после (I1) введения пробы и стандартной добавки (I2) в раствор определяемого вещества. Если Vяч Vпр и Vяч Vd, расчет концентрации в анализируемой пробе СS основывается на следующих предпосылках:

(2), (3) I0 kCMeVMe I1 kCMeVMe k n CSVS m n n (4).

I kCMeVMe k CSVS k CdVd m m I0 I1 CS VS QS Из соотношений 2-4 следует: (5) I1 I Сd Vd Qd откуда следует:C Qd (6) S S VS d где VMe и CMe – объём и концентрация стандартного раствора реагента Mex+ в нем; VS и CS – объём анализируемой пробы и искомая концентрация аналита в нем; Vd и Cd – объём добавки стандартного раствора искомого вещества и его концентрация; Qd выражает количество вещества, содержащегося в стандартной добавке; k – коэффициент пропорциональности, = I0-I1 и = S d I1-I2 – абсолютное снижение сигналов, обусловленное введением в анализируемый раствор пробы и добавки, соответственно.

Метод ИВТ-2. Основная идея непосредственного количественного определения веществ путем вольтамперометрического титрования по двум точкам состоит в нахождении избытка Mex+, стехиометрично взаимодействующего с Вy- в соответствии с реакцией 1. Возможны два варианта ИВТ-анализа.

1. Определяемым (S) является Вy-, а в качестве титранта выступает Mex+.

В этом случае для расчета искомой концентрации требуется лишь часть экспериментальных данных, описанных для метода ИВТ-3, а именно: максимальный инверсионный ток (аналитический сигнал – АС) Mex+, взятого в избытке, до (I0) и после (I1) введения в ячейку аликвоты пробы. Тогда справедливым является уравнение:

I0 I1 nCS VS QS (7) I0 mCMe VMe QMe где – относительное cнижение АС может служить мерой для непосредственной оценки количества аналита пробы (CSVS = QS), вступившего во взаимодействие с заданным количеством титранта (CMeVMe = QMe) в ходе химической реакции 1 в растворе. Отсюда концентрацию анализируемой пробы можно рассчитать, пользуясь уравнением:

QMe (8) CS VS где – фактор эквивалентности, равный отношению n/m.

Как видно из расчетных уравнений 6 и 8, методы ИВТ-3 и ИВТ-2 являются альтернативными друг другу и могут быть использованы для проверки правильности полученных результатов.

В случае анализа проб с концентрацией 10-8 моль дм-3 (Vпр Vяч), чтобы избежать учета разбавления пробы, предлагается альтернативный алгоритм (1а) процедуры ИВТ-2 анализа. В электролитическую ячейку совместно с аликвотой пробы VS вводят строго контролируемое количество титранта Mex+ ( ), и измеряют ИВ-сигнал, обусловленный его остатком в расCMeVMeтворе после реакции с определяемым веществом (I0). Затем в ячейку вносят в качестве добавки вторую порцию ( ) титранта и вновь измеряют CMeVMeего ИВ-сигнал (I1). В этом случае расчет искомой концентрации в анализируемой пробе СS основывается на следующих предпосылках:

1 (9), (10) I0 k(CMeVMe CSVS ) I1 k(CMeVMe CSVS CMeVMe ) 2 1 I1 I0 CMe VMe (11), C CMe ( VMe VMe ) (12) I0 CMe VMe CS VS S VS Здесь – относительное повышение ИВ-сигнала Mex+ на добавку.

2. Если определяемым компонентом (S) реакции 1 является Mex+, а в качестве титранта выступает вещество Вy-. В этом случае в электролитическую ячейку сначала вводят строго контролируемое количество титранта ( ), добавляют первую порцию (VS CS ) анализируемой пробы в полтораVBCB два раза большую, чем введенное количество Вy- и после тщательного перемешивания раствора измеряют АС (I0) избыточного количества искомого вещества Mex+. Затем в ячейку вводят вторую порцию (VS2CS ) анализируемой пробы в полтора-два раза меньше, чем, и опять измеряют VS CS ИВ-сигнал Mex+ (I1). Его искомую концентрацию рассчитывают с помощью формул, основанных на следующих предпосылках:

(13), (14) I0 k(VS CS VBCB ) I1 k(VS CS VBCB VS2CS ) I1 I0 CSVS (15), (16).

I1 I0 VS2CS I0 CSVS CBVB CBVB Откуда (17) CS VS VSПри исследовании модельных растворов с известными концентрациями и аликвотами растворов Mex+ и Вy-, пользуясь уравнениями 7, 11 и 16, легко предварительно рассчитать значения и сравнить их с экспериментально расч полученными ( ) путем исследования зависимости = f(CSVS = QS). Эта эксп же зависимость может служить источником информации при исследовании полноты и скорости реакции 1. Результаты достоверны, если =.

эксп. расч В главе III представлены данные об используемых материалах, оборудовании и объектах исследования. Описаны процедуры приготовления модельных образцов и проб для анализа.

В главе IV обсуждены подходы к разработке методик ИВТ для определения тиольных и дисульфидных групп. Представлены алгоритмы анализа цельной крови и ее фракций и результаты исследования ТДС в норме и при различных заболеваниях.

Известно, что тиолы легко связываются с ионами различных металлов (Mex+) с образованием устойчивых меркаптидов состава Me[S-R]x. А это значит, что теоретически соль этих металлов может быть использована в качестве титранта при определении тиолов. Для выбора сигнал образующего реагента исследовали ИВ-поведение меди, свинца, кадмия, ртути и серебра в отсутствии и в присутствии сульфгидрильных групп в растворе аммиачного буфера, в котором происходит наиболее полная диссоциация тиольных соединений. Наиболее надежные результаты получили при использовании ИВ-сигналов кадмия, ртути, серебра. Однако растворы солей ртути исключили из-за их токсичности и медленной стабилизации АС в отсутствии тиолов, соли кадмия из-за необходимости применения ртутно-графитовых электродов и замедленной скорости реакции с тиолами. Кроме того, соли этих металлов образуют прочные комплексы с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) – основного антикоагулянта крови в медицинской практике. В качестве сигнал образующего реагента идеальным оказался раствор азотнокислого серебра. С растворами тиолов AgNO3 реагирует немедленно.

ИВ-сигнал серебра стабилизируется после первой же его регистрации независимо от используемого рабочего электрода (Pt или GC-стеклоуглеродный), характеризуется отличной сходимостью. ЭДТА не образует прочного комплекса с Ag+ и не изменяет характер ИВ-сигнала.

Для обоснования правомерности использования ИВ-сигнала серебра в качестве аналитического при титровании тиолов раствором AgNO3 изучили его поведение на Pt электроде (S = 2 мм2) в растворе аммиачного буфера (фон № 1) и аммиачного буфера, содержащего от 0.005 до 1.0 моль дм-3 Na2SO(фон № 2) в отсутствии и в присутствии органических тиолов и дисульфидов (рис. 1 и 2). На фоне № 1 окисление накопленного на поверхности электрода серебра протекает обратимо (dEm/dlg = 0.031) (рис. 1а). Круто восходящая ветвь «псевдополярограммы» (рис. 1б-1) также подтверждает обратимый характер электродного процесса. Очевидно, предельный ток уменьшается из-за взаимодействия Ag+ с тиолами, присутствующими в крови (рис. 1б-2).

Величина сигнала с достоверностью аппроксимации 0.99 прямо пропорционально зависит от количества AgNO3 в растворе (рис. 1с-1) и времени электролиза (табл. 1). Дисульфиды не взаимодействуют с ионами Ag+ (рис. 1с-1).

Присутствие в растворе цельной крови не нарушает кинетику процесса.

Параметр dEm/dlg остается прежним. Приведенные факты весьма важны, поскольку позволяют в дальнейшем развить метод анализа такого сложного объекта, как цельная кровь. В присутствии Na2SO3 (фон №2) растворение осадка серебра протекает квазиобратимо. Параметр dEm/dlg = 0.040 (табл. 1).

ИВ-сигнал сдвигается к отрицательным значениям потенциала, его величина уменьшается по мере добавления в раствор сульфита натрия (калия) и достигает плато в интервале концентраций Na2SO3 в ячейке от 0.до 0.10 моль дм-3. Тем не менее, зависимость Im – CAgNO3 остается прямо пропорциональной (рис. 1с-2). Оптимальная концентрация Na2SO3 в ячейке находится в диапазоне от 0.04 до 0.08 моль дм-3, достаточном для полного и быстрого завершения реакции восстановительного расщепления дисульфидных групп в сульфидрильные:

R-SS-R + Na2SO3 + H2O 2RSH + Na2SO4 (18) а б с Em = 0.031 lg + 0. R2 = 0.9930 0, 20 0,0, 0,0, 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,0,0 0,2 0,4 0,2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,QAg, µмоль lg, мВ·с-1 Em, B Рис. 1. Зависимости потенциала максимума ИВ-тока серебра от логарифма скорости развертки потенциала (а), величины максимума ИВ-тока серебра от потенциала электролиза в отсутствии (1) и в присутствии (2) 0.005 мл цельной крови (б), от количества AgNO3 в ячейке:, – в отсутствии и в присутствии 0.5 µмоль GSSG, соответственно (с).

Условия эксперимента: фон аммиачный буфер (а, б, с-1), аммиачный буфер + 0.08 моль·дм-Na2SO3 (с-2), QAg = 0.4 µмоль (а, б), = 250 мВ с-1 (б, с), tэ = 30 с, Еэ = -0.5 В (а, с) С тиолами азотнокислое серебро реагирует в эквимолярном соотношении: AgNO3 + RSH = AgSR + HNO3 (19) Фактор эквивалентности равен 1. Максимум ИВ-тока серебра (рис. 2a) линейно снижается при введении в ячейку RSH и с достоверностью аппроксимации 0.99 подчиняется уравнению регрессии Im = -67.6 QRSH + 33.(рис. 2а). Рассчитанное из этого уравнения количество RSH (0.502 моль) с погрешность 0.2% соответствует введенному в зону химической реакции количеству тиолов. Значения (рис. 2а) и (рис. 2б) с достоверностью аппроксимации 0.99 прямо пропорционально зависят от количества RSH в растворе. Экспериментальные значения (R2 0.99) соответствуют предварительно рассчитанным значениям QRSH/QAg. Все эти экспериментальные факты подтверждают правомерность использования ИВ-сигнала серебра в качестве аналитического в процессе титрования органических тиолов солями серебра любым из трех методов ИВТ-1, ИВТ-2 или ИВТ-3.

Суммированные результаты выше названных исследований представлены в табл. 1.

m I, µА m m I, µА Е, В Т а б л и ц а Коэффициенты уравнения регрессии Y = aX b для зависимостей Em = f(lg ), Im = f(QAgNO3/tэ) и = f(QRSH) (n = 6, Р = 0.95) Уравнение регрессии Диапазон Фон а b R2 линейности Y = aX b 1 0.99Em = alg b 0.031 0.01 0.15 0.02 100 82 0.9980 (мВ с-1) 0.040 0.02 0.09 0.01 0.99Im = aQAgNO3/tэ b 2.84 0.07 -0.07 0.003 0.01 0.2 0.9975 ( моль) 2.21 0.06 -0.05 0.01 0.99 = aQRSH b 2.02 0.03 0.01 0.002 0.02 1.2 0.9984 ( моль) 1.98 0.04 -0.02 0.01 – Аммиачный буфер; 2 – Аммиачный буфер + 0.08 моль·дм-3 Na2SO3.

Условия экспериментов, как на рис. Рис. 2. ИВ-кривые серебра на фоне № а 1,0 б (а) и зависимость относительного сни0,жения ( ) аналитического сигнала Im от 0,количества SH-групп в растворе (б).

0,Раствор содержит: фон + 0.5 моль 0,2 AgNO3 (1) + х моль SH-групп в форме смеси GSH+CSH последовательно.

0,0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,x = 0.05 (2), 0.125 (3), 0.20 (4), 0.25 (5) Q, µмоль SH 8 0.35 (6), 0.40 (7).

Расчетные () и экспериментальные () Фон №Im = -67.3QRSH + 33.7, R2 = 0.99 данные. Условия эксперимента:

= 67.6QRSH – 0.05, R2 = 0.99= 2.01QRSH + 0.04, R2 =099Eэ = -0.50 В, tэ = 30 с, = 250 мВ с--0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0. Е, В Что особенно важно, в присутствии цельной крови (рис. 3а, б) или любой ее фракции в растворе коэффициенты уравнения регрессии не изменяются.

Прирост (точки и ), соответствующий стандартным добавкам SHSH групп (рис. 3с-3), также практически равен расчетным () значениям. Более того, уравнение регрессии = 2.02QSH + 0.01 (R2 = 0.9969) с погрешностью SH не более 1% соответствует уравнениям регрессии, полученным для модельных растворов (рис. 2б и табл. 1). При этом значения не зависят от того, SH присутствует или отсутствует в электролите Na2SO3. То же самое наблюдается при исследовании плазмы, эритроцитарной массы или сыворотки крови.

Это значит, что матрица крови не изменяет кинетику реакции 19 и стехиометрия не нарушается в присутствии вышеупомянутых биологических жидкостей.

Модельные растворы для исследования представляли собою физиологический раствор (0.5 % NaCl) смеси RSH и RSSR, содержащий имитатор микроэлементного состава крови (0.04 моль·дм-3 K+, 1.5 ммоль·дм-3 Ca2+, 1.ммоль·дм-3 Mg2+, 0.11 ммоль·дм-3 Zn2+, 8.0 ммоль·дм-3 Fe3+, 15.7 моль·дм-Cu2+, 1.0 моль·дм-3 Pb2+, 0.05 моль·дм-3 Hg2+, Cd2+) и антикоагулянт Ток, A (5.9 ммоль·дм-3 ЭДТА или 0.4% глюгицир – молярная смесь 1:2 натрия гидроцитрата и глюкозы).

i (1, 2), (3) а б SH с 1, 0,16 0,0,фон 0,фон 0,-0.1 0.0 0.1 0.2 0.-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,Е, В E, В QGSH, µмоль Рис. 3. ИВ-кривые серебра на фоне № 1 (а) и № 2 (б). Растворы содержат: а) – фон + 0.50 µмоль AgNO3 + 0.01 мл цельной крови + 0.11 и 0.22 моль GSH, последовательно; б) – фон + 0.50 µмоль AgNO3 + 0.01 мл цельной крови + 0.05, 0.10 и 0.15 моль GSH, последовательно.

с) – Кривые титрования для определения RSH (1) и суммы RSH (2), т.е. нативных тиолов крови плюс образовавшихся вследствие восстановительного расщепления RSSR. Зависимость относительного понижения максимума инверсионного тока серебра от стандартных количеств SH-групп в растворе ( = - ) (3). Расчетные () и экспериментальные (, ) значения.

SH i пр SH Условия эксперимента: Eэ = -0.50 В, tэ = 30 с, = 300 мВ с-1.

Рис. 4. ИВ-кривые серебра, полученные в случае исследования ТДС модельного образца, содержащего 10.20 а б ммоль·дм-3 GSH и 2.5 ммоль·дм-GSSG методами прямого и обратного ИВТ-1. Растворы содержат:

5 а) Фон № 1 + 0.01 мл пробы (1) + х моль AgNO3 последовательно; х = 8 0.12 (2), 0.15 (3), 0.20(4) и 0.25 (5).

б) Фон № 2 + 0.5 моль AgNO3 + 0.мл пробы (1) + х мл GSH. х = 0.10 (2), 0.20 (3), 0.30 (4) и 0.33 (5).

0.1 0.2 0.3 0.4 -0.1 0.0 0.1 0.Условия эксперимента: Еэ = -0.5 В, Е, В E, В tэ = 30 с, = 300 мВ с-На рис. 4 показан пример анализа модельного раствора, содержащего тиолы и дисульфиды в концентрации 10.0 GSH + 2.5 GSSG ммоль дм-3 методом ИВТ-1. Здесь процедура анализа и расчетные уравнения не отличаются от хода анализа, предложенного В.В. Соколовским для определения ТДС методом АТ. Но поскольку в предлагаемом методе имеется возможность контролировать и вычитать величину остаточных токов, отпадает необходимость графически определять точку эквивалентности. Достаточно рассчитать уравнение регрессии. Сначала на фоне № 1 титруют сульфгидрильные группы пробы контрольным раствором AgNO3 (рис. 4а). Во второй аликвоте пробы на фоне № 2 титруют дисульфиды в виде RSH (рис. 4б). В этом случае µ Ток, А R = 0.99R = 0.99Ток, А m Ag NOm GSH I = 126 Q – 12.I = -86.1 Q + 30.предпочтительно использовать обратное титрование, так как возникающие при разрыве дисульфидных связей SH-группы, склонные к реоксидации кислородом воздуха, немедленно осаждаются избытком ионов серебра. Оставшееся свободным количество AgNO3 оттитровывают контрольным раствором любого RSH. Количество RSH, израсходованное на титрование избыточного количества AgNO3, находят c помощью уравнения регрессии без построения кривой титрования. Таким образом, определяется сумма, состоящая из нативных и образованных вследствие реакции 18 RSH:.

QAg QRSH С SH Vпр Концентрацию дисульфидных групп находят по разности между суммарной (C CSH ) концентрацией и определенной в ходе прямого титрования:, СSS SH где QAg – количество ( моль) AgNO3, введенное в ячейку; QRSH – контрольное количество RSH (GSH, CSH или ACSH), израсходованное на титрование избытка AgNO3; Vпр – объём пробы, взятой для анализа. Найденные концентрации GSH (10.2) и GSSG (2.45) ммоль дм-3 в исследуемом модельном образце с погрешностью не более 2 % соответствуют заданным. Именно применение ИВ-сигнала в качестве аналитического в условиях титрования позволяет использовать методы ИВТ-2 и ИВТ-3 для определения искомых концентраций. Рис. 5 и данные табл. 2 демонстрируют правомерность использования всех трех, предложенных в работе методов для определения тиолов и дисульфидов. Даже в одном эксперименте с регистрацией всего четырех точек титрования можно получить альтернативные результаты для оценки их правильности, поскольку количества разных ОС используются для нахождения искомой концентрации (уравнение 6 и 8). Для расчета искомой концентрации в методе обратного ИВТ используются контрольные количества обоих участников реакции в растворе (Спр = QAg – QRSH/Vпр). Но ИВТ-2 метод имеет ряд преимуществ: отпадает необходимость приготовления стандартных растворов RSH через каждые три-четыре часа, что приводит к существенному упрощению и ускорению анализа. Появление систематических расхождений между результатами, полученными методами ИВТ-2 и ИВТ-3, как правило, свидетельствует об изменении концентрации контрольного раствора RSH и необходимости его корректировки.

К сожалению, на результаты определения C ИВТ-2 способом в некотоSH рых случаях, особенно при наличии патологий, влияет реоксидация SH-групп в момент их образования. При определении SH- и -SS-групп в одной пробе (рис. 6), когда избыточный объем раствора соли серебра в стадии определения SS-групп вносят в реакционную смесь не однократно, а отдельными порциями в процессе анализа, такое явление не наблюдается для любых проб крови. При этом такой способ (мы его назвали комбинированным ИВТ - КИВТ) значительно упрощает процедуру анализа, экономит время и особенно необходим, если биологический материал для исследования имеется в малых количествах Т а б л и ц а Сравнительные результаты и метрологические характеристики, полученные при исследовании ТДС модельных образцов (1, 2, 3) и цельной крови (4) методами ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 одновременно (n = 6, P = 0.95) Результат, (ммоль дм-3) С Х Проба ИВТ-1 ИВТ-2 ИВТ-RSH RSSR RSH RSSR RSH RSSR 10.3 0.2 2.45 0.06 9.9 0.14 2.51 0.03 14.9 0.5 14.9 0.7.48 0.10 2.41 0.05 7.50 0.09 2.51 0.03 7.54 0.12 7.54 0.14.6 0.48 4.98 0.15 15.2 0.35 4.99 0.09 14.8 0.53 14.8 0.16.8 0.46 5.42 0.13 16.9 0.39 5.47 0.14 16.7 0.42 16.7 0.Заданный состав (ммоль дм-3) модельных образцов: 10.0 CSH + 2.5 GSSG (1); 7.5 GSH + 2.CSSC (2); 10.0 CSH+ 5.0 GSH + 5.0 GSSG (3). Цельная кровь от здорового донора 45 лет (4).

I0 I32 а I0 б с Iпр I1 IId 16 IdId1 IdId2 Id = 0.333; / = 2.пр пр д = 0.298; / = 1.0 пр пр d 0.0 0.1 0.2 0.3 Е, В -0.3 -0.2 -0.1 Е, В Е, В 0.0 0.1 0.2 0.3 -0.1 0.0 0.1 0.Рис. 5. Определение сульфгидрильных групп крови (а) и ТДС модельного образца, содержащего 10.0 CSH + 2.5 GSSG ммоль·дм-3 (б и с) методами ИВТ-1, ИВТ-2 и ИВТ-3 одновременно.

Растворы содержат:

а) – фон № 1 + 0.5 моль AgNO3 (I0) + 0.01 мл пробы (I1) + 0.15 (I2) + 0.25 (I3) моль GSH;

б) – фон № 1 + 0.5 моль AgNO3 (I0) + 0.02 мл пробы (I1) + 0.10 (I2) + 0.20 (I3) моль GSH;

с) – фон № 2 + 0.5 моль AgNO3 (I0) + 0.01 мл пробы (I1) + 0.075 (I2) + 0.15 (I3) моль GSH (кровь из пальца). На рис. 6 приведён пример реализации предложенного алгоритма анализа. Здесь сначала методом прямого титрования или ИВТ-(рис. 6а) определяют количество AgNO3, израсходованное на взаимодействие с SH-группами в первой стадии анализа (Q1Ag=CAg V1Ag), эквивалентное пр количеству SH-групп в аликвоте пробы, и рассчитывают концентрацию нативных SH-групп в пробе с помощью уравнения Q1Ag /Vпр. Затем, пр не прерывая перемешивания раствора, вносят в ячейку дополнительную порцию (VAg2) раствора AgNO3 и сульфит натрия. Рассчитывают суммарное 1 количество соли серебра (Q ), введенное в ячейку, как. После Ag СAg (VAg VAg ) этого обратным титрованием стандартным раствором любого RSH определяют количество SH-групп (QSH), израсходованных на взаимодействие остатR =.9986.

Ток, А m GSH I = -66.5 Q + 23.= 0.396;

/ = 1.пр пр d m CSH m CSH I = -40Q + 11.9; R = 0.9984.

I = -61.9Q + 20.5; R = 0.99ка свободных ионов серебра. Концентрацию дисульфидов рассчитывают с помощью уравнения:.

Q Q1 QSH СSS Ag Ag 2Vпр I0 Рис. 6. ИВ-кривые серебра, полу а б ченные в случае исследования ТДС цельной крови методом КИВТ в = 0.4пр 15 одной аликвоте пробы. Растворы Iпр содержат: а) – фон № 1 + 0.2 моль 10 AgNO3 (I0) + 0.005 мл пробы (Iпр).

б) – + еще 0.3 моль AgNO3 + 0.1 г 5 Na2SO3 (1) + х моль СSH. х = 0.Фон № (2), 0.2 (3), 0.3 (4), 0.4 (5).

Фон № 0 Условия эксперимента, как на рис. -0.1 0.0 0.1 0.2 0.Е, В 0.0 0.1 0.Е, В Найденные здесь концентрации (ммоль дм-3) тиолов (17.0) и дисульфидов (5.6) с погрешностью, не превышающей 3%, соответствуют результатам, полученным при исследовании ТДС этой же крови методами ИВТ-1, ИВТ-и ИВТ-3 (табл. 2). Результаты, полученные альтернативным КИВТ методом, когда концентрация нативных SH-групп в первой стадии анализа определяется методом прямого ИВТ, не отличаются от полученных в предыдущем опыте. В отличие от амперометрического и кулонометрического титрований тиолов предлагаемые в настоящей работе методы исключают из процедуры анализа операцию разрушения эритроцитов путем центрифугирования при 60об/мин, что значительно сокращает время, необходимое для анализа и не требует дополнительного оборудования. Правильность предложенного подхода исследования тиолдисульфидного равновесия в цельной крови и ее фракциях проверили способом «введено – найдено» (табл. 4). Незначимые расхождения между величинами введено и найдено свидетельствует об отсутствии систематической погрешности в результатах.

Т а б л и ц а Оценка правильности результатов измерения концентраций SH- и -SS-групп (ммоль·дм-3) в крови здорового донора и ее фракциях методом “введено-найдено” (n = 6, P = 0.95) Проба Аналит СХ Cд CY /CY – CХ - Cд/ К b 1 -SH 15.0 0.20 0.15.5 0.4 30.3 0. -SS- 5.0 0.2 0.4.8 0.2 10.0 0.2 -SH 20.0 1.1 1. 30.5 1.2 51.6 1.-SS- 7.0 0.32 0.8.7 0.2 15.4 0.3 -SH 0.50 0.03 0.1.22 0.04 1.75 0.-SS- 0.30 0.03 0.0.38 0.01 0.71 0.b 1 – цельная кровь, 2 – эритроцитарная масса, 3 плазма. m = 0.48.

К 0.84 ( )2 ( )Y X R =0.99m CSH I = -48.5 Q + 17.Ток, А Правильность полученных результатов может быть оценена и через результаты фракционного анализа. Если объем крови принять за единицу, то SH- или -SS-группы крови распределятся по фракциям согласно уравнению:

mCэр + (1 – m)Cпл = Cкр, где m = Vэр/Vкр – объемная доля эритроцитарной массы по отношению к объему крови, Cэр, Cпл и Cкр – концентрации аналита в эритроцитарной массе, плазме и цельной крови, соответственно. Тогда в соответствии с результатами табл. 4, сумма произведений 0.48 30.5 ммоль·дм-3 и 0.52 1.22 ммоль·дм-3 левой части уравнения, равная 15.2 ммоль·дм-3 с погрешностью менее 1% соответствует найденному содержанию SH-групп в цельной крови (15.5 ммоль·дм-3).

Достоверность полученных в процессе разработки ИВТ способов исследования тиолов и дисульфидов в крови позволили провести обследование 23-х больных лимфогранулематозом (ЛГМ) в период стойкой клиникогематологической ремиссии (КГР) после многократных курсов цитостатической и лучевой терапии. Кроме того, обследовали кровь больных ЛГМ, получивших курс полихимиотерапии (ПХТ). В реабилитационной программе для этих больных были использованы биосорбенты и поливитамины. Контрольную группу в количестве 23-х человек составили практически здоровые добровольцы, находящиеся на обычной диете и водной нагрузке, некурящие.

Применяли систему контроля качества выполняемых анализов, включающую оценку повторяемости, воспроизводимости и правильности результатов анализа. Для оценки последней характеристики погрешности использовали результаты независимых методов или применяли метод добавок в сочетании с методом разбавления. Полученные результаты подвергали статистической обработке. В табл. 5 представлены средние (СХ) значения концентраций ± среднее квадратичное отклонение (S). Для сравнения средних значений данных анализов исследуемых групп и определения степени достоверности различий использовали разностный метод t-критерия Стьюдента.

Как видно из табл. 5, достоверно (р 0.05) наблюдается более низкая буферная емкость тиолдисульфидного звена АОС больных ЛГМ по сравнению со здоровыми людьми и это свидетельствует о том, что интенсивность окислительно-восстановительных процессов для таких больных значимо менее выражена. Особенно это касается больных ЛГМ, получивших курс полихимиотерапии. Как оказалось, у них самая низкая буферная емкость SH SS. Значение К = SH/SS ниже 2.4 ед. косвенно характеризует истощение адаптационных резервов организма. После проведения курса восстановительной терапии (ВТ) сорбентами и поливитаминами средние показатели К заметно изменились в сторону достижения равновесия. Количество SH-групп увеличилось, а -SS-групп – уменьшилось так, что тиолдисульфидный коэффициент достиг значений, характерных для относительно здоровых лиц (2.4 – 4.0 ед.). Улучшилось качество жизни пациентов. Тем не менее, буферная емкость SH SS системы, которая определяется в большей мере количеством SH-групп, осталась достоверно ниже, чем это наблюдается для пациентов контрольной группы.

Т а б л и ц а Средние показатели ТДС крови больных лимфогранулематозом и относительно здоровых добровольцев (P = 0.95) Больные лимфогранулематозом Контрольная Показатель ПХТ (n =9) КГР (n = 23) группа До курса После кур- До курса После кур- (n = 23) ВТ са ВТ ВТ са ВТ SH-, моль·дм-10.6 1.8 12.8 1.6 12.2 2.0 13.5 1.5 15.1 0.-SS-, моль·дм-4.8 1.2 3.8 0.9 4.5 1.3 4.5 0.8 4.5 0.К = SH/SS 2.2 0.3 3.4 0.5 2.7 0.4 3.1 0.42 3.4 0.Глава V посвящена разработке методик определения сульфидной серы в природных, питьевых водах и слюне методом ИВТ.

Неорганические сульфиды наравне с тиолами образуют трудно растворимые соединения с рядом металлов: nMex+ + mS2- MenSm. Наименьшие величины произведений растворимости (ПР) 4.0·10-53 и 6.3·10-50 характерны для сульфидов ртути (II) и серебра (I), соответственно. А это значит, что применение солей каждого из этих металлов в качестве титрантов открывает перспективу исследования нанограммовых концентраций водорастворимых сульфидов в растворах. Однако растворы солей ртути – высоко токсичны, поэтому в качестве титрующего реагента при определении сульфидов выбрали раствор нитрата серебра, тем более, что в предыдущем разделе доказана правомерность его использования в качестве аналитического. К сожалению, Pt-электрод способен адсорбировать продукты реакции AgNO3 с сульфидами, поэтому в качестве рабочего выбрали GC-электрод. В связи с этим дополнительно изучили поведение ИВ-сигнала серебра на GC-электроде, которое не отличается от такового для Pt-электрода. Все закономерности, алгоритмы анализа и расчетные уравнения, описанные в предыдущем разделе, сохраняются. В выбранных условиях титрования стехиометрия реакции Na2S + 2AgNO3 Ag2S + 2NaNO3 в растворе не нарушается. Об этом свидетельствует полное совпадение расчетных = 2QNa2S/QAg и экспериментальных значений. В области исследуемых концентраций ниже 1·10-6 моль дм-использовали более чувствительный режим поляризации электрода – дифференциально-импульсный (рис. 7).

Анализ воды. Для определения сульфидов в воде использовали методы прямого и обратного ИВТ. Однако метод обратного ИВТ уступает методу прямого ИВТ, где нет необходимости применять более неустойчивые по сравнению с тиолами стандартные образцы сульфидов, требующие ежедневного приготовления и проверки титра раствора. Правильность определения сульфидов в природных и питьевых водах проверили методом «введено-найдено» 2.Рис. 7. Дифференциально-импульсные ИВ1.кривые серебра в случае обратного титрова 1.50 ния раствора, содержащего 3.5 nмоль·дм-Na2S. Раствор содержит 10 мл пробы + 0.1.моль AgNO3 (1) + 5.0 (2) + 7.5 (3) + 10.0 (4) 1.+ 12.5 (5) + 15.0 (6) nмоль Na2S.

Условия эксперимента: Еэ = -0.4 В; tэ = 60 с;

0.амплитуда = 0.05 В, = 30 мВ·с- -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.E, В и сопоставлением результатов независимых методов прямого и обратного ИВТ. Расхождения между результатами «введено» и «найдено» при измерении сульфидов в природных и питьевых водах методом прямого ИВТ незначимы (табл. 6). Найденные с помощью методов прямого и обратного ИВТ концентрации сульфидов в анализируемых пробах вод подчиняются уравнению регрессии у = 0.993х – 0.05 (R2 = 0.9953) с коэффициентом корреляции, близким 1.0, во всем диапазоне концентраций. Наименьшие значения концентраций Т а б л и ц а Оценка правильности результатов (моль·дм-3) измерения концентрации сульфид-ионов в природных и питьевых водах методом прямого ИВТ (n = 7) Найдено в Введено, Найдено в пробе /СY –СX - Сд/ К Проба пробе, Сд с добавкой, СХ S СY S 1 5.0·10-5 0.2 0.(7.1 0.12) 10-5 (12.3 0.20)·10-2 3.0·10-7 0.(3.4 0.11) 10-7 (6.2 0.17) 10-7 -0.3 6.0·10-9 0.1 0.(5.4 0.28) 10-9 (11.5 0.55) 10-4 3.0·10-8 0.(2.9 0.14)·10-8 (5.8 0.23) 10-8 -0. 1 и 2 – артезианская вода через 1 месяц и 1 год после сдачи скважины в эксплуатацию, соответственно, 3 – речная вода, р. Обь, 4 – водопроводная вода (ИНХ СО РАН).

сульфидов обнаружены в речной воде, что хорошо согласуется с литературными данными. Найденная концентрация сульфидов в водопроводной воде в 3 раза ниже ПДК (8.8·10-8 моль·дм-3), установленной для сероводорода в питьевых водах. Содержание растворимых сульфидов в воде из скважины превышает установленные нормы.

Предел обнаружения (3 ) сульфидов для методов прямого и обратного ИВТ составляет 2.0·10-10 и 5.0·10-10 моль·дм-3, соответственно при tэ = 180 с.

Анализ слюны. При исследовании наномолярных концентраций сульфидов в биологических пробах с ограниченным количеством анализируемого материала, таких как слюна, Vпр приближается к Vяч и требуется делать поправку на разбавление. Чтобы избежать учета разбавления пробы, анализ слюны проводили методом ИВТ-2 в строгом соответствии с алгоритмом 1а.

Ток, µA m Na2S I = -44.4Q + 1.4, R = 0.9Для расчета искомой концентрации использовали уравнение 12, которое для реакции взаимодействия AgNO3 с сульфидами с учетом фактора эквивалент1 CAg ( VAg VAg ) ности представляет собой соотношение:. В табл. 7 предCпр 2 Vпр ставлены результаты определения сульфидной серы в слюне. Наименьшие концентрации сульфидов определяются в слюне здорового некурящего человека (№ 1). У условно здорового курящего мужчины (№ 2) и некурящего, но страдающего хроническими заболеваниями (№ 3), прослеживаются явные признаки аутоинтоксикации организма, о чем свидетельствует повышение уровня концентрация сероводорода в этих пробах на 2 порядка по сравнению со слюной № 1. В случае с пробой № 2 диагностируется скрытая аутоинтоксикация, очевидно, обусловленная образованием сероводорода в желудочнокишечном тракте в результате курения. Более выраженная аутоинтоксикация, которая уже сопровождается неприятным запахом изо рта, наблюдается у мужчины со слюной № 3. Предел обнаружения сульфидов 5 nмоль·дм-3.

Т а б л и ц а Оценка систематических расхождений результатов определения сульфидной серы в слюне людей, полученных методами ИВТ-2 и ИВТ-(n = 6, Р = 0.95, Fтабл = 5.05, tтабл = 2.57) Проба Содержание в пробе, моль·дм-3 Fэксп tэксп ИВТ-2 ИВТ-CХ Sr (%) CХ Sr (%) 1 1.85·10-9 1.7 - - - - 2 1.24·10-7 1.5 - - - - 3 5.21·10-7 1.5 5.18·10-7 2.3 2.33 0.1 – слюна условно здорового некурящего мужчины, 2 – слюна условно здорового курящего мужчины, 3 – слюна некурящего мужчины, но страдающего хроническими заболеваниями (запоры, сахарный диабет) и имеющего неприятный запах изо рта (халитозис) В главе VI обсуждаются результаты исследования по применению метода ИВТ-2 в качестве альтернативного классическим титриметрическим методам для определения и контроля над устойчивостью во времени титра ОС нестабильных веществ RSH, Na2S, HCl, KI и AgNO3.

Стандартизации ОС для определения нестабильных веществ совсем не тривиальная задача. От исследователя требуется особая тщательность, должная предосторожность и несомненная проверка правильности результатов. К сожалению, многочисленные классические способы стандартизации ОС страдают рядом недостатков и не отвечают многим требованиям, которые согласно мнению Лоуренса и Комптона, скорее всего, и являются источником систематических погрешностей и разногласий между результатами различных публикаций при определении сульфидной серы, как в природных, так и в биологических образцах. Применение предложенного в настоящей работе метода ИВТ-2 для стандартизации ОС нестабильных веществ исключает практически все недостатки классического титрования – визуальная регистрация точки эквивалентности, длительность проведения анализа, узкий диапазон определяемых концентраций, относительно высокая погрешность результатов анализа, низкая чувствительность. Об этом свидетельствуют суммированные результаты, полученные в условиях титрования свежеприготовленных ОС сульфида натрия и глутатиона восстановленного методом ИВТ-и известными классическими методами (табл. 8). Как видно, по сравнению с результатами известных методов титрования ИВТ-2 имеет явные преимущества. Вся процедура анализа занимает не более 5 минут, практически Т а б л и ц а Сопоставление результатов (моль·дм-3), полученных независимыми методами, при стандартизации свежеприготовленных образцов сравнения Na2S и GSH (n = 9) Введено ИВТ-2 Классический метод * ** * ** (C) t, Найдено, Sr, % R, t, мин Найдено, Sr, % R, мин СХ % СХ % GSH Амперометрическое титрование 5.0·10-3 3-5 5.06·10-3 1.1 1.2 4.93·10-3 2.8 -1.10 1.5·10-4 1.52·10-4 1.3 1.3 1.40·10-4 5.1 -6.5.0·10-6 4.94·10-6 1.2 -1.2 н/о - - Na2S Титрование K3[Fe(CN)6] 1.0·10-3 3-5 9.92·10-4 1.1 -0.8 9.81·10-4 3.4 -1.15 1.0·10-4 9.93·10-5 1.3 -0.7 9.18·10-5 7.1 -8.5.0·10-6 4.95·10-6 1.5 -1.0 н/о - - t – время, затраченное на единичное измерение, R = (СХ – С)/С.

Т а б л и ц а Сравнение расчетных и экспериментальных значений, полученных при исследовании свежеприготовленных ОС Na2S и L-CSH моногидрата методом ИВТ-(n = 6, P = 0.95) Введено, мл·моль·дм-3 Уравнение регрессии расч эксп VAg CAg VX CX a b расч эксп Na2S ( = 2) 0.50·1.0·10-3 0.05·1.0·10-3 0.20 0.2= 0.991 + 0.0расч эксп 0.10·1.0·10-3 0.40 0.3R2 = 0.990.20·1.0·10-3 0.80 0.80.10·1.0·10-4 0.10·5.0·10-6 0.10 0.096 - L-CSH ( = 1) 0.50·1.0·10-3 0.05·1.0·10-3 0.10 0.1= 1.006 – 0.0расч эксп 0.10·1.0·10-3 0.20 0.1R2 = 0.990.25·1.0·10-3 0.50 0.40.08·1.0·10-4 0.04·1.0·10-5 0.050 0.0= 0.998 + 0.0расч эксп 0.10·1.0·10-5 0.125 0.1R2 = 0.990.20·1.0·10-5 0.250 0.20.05·1.0·10-4 0.80·5.0·10-6 0.80 0.798 - отсутствуют потери аналита в процессе титрования, за счет увеличения чувствительности метода расширился диапазон определяемых концентраций, снизилась погрешность результатов измерения. Особенное достоинство предлагаемого метода стандартизации растворов – возможность быстрой корректировки концентрации ОС, как в процессе их приготовления, так и хранения во времени путем сравнения расчетных и экспериментальных значений (табл. 9).

Никаких препятствий не возникло при стандартизации ОС иодида калия, хлористоводородной кислоты и корректировки свежеприготовленного из навески AgNO3 ОС азотнокислого серебра. Для установки титра раствора AgNO3 предложена методика ИВТ-2 (алгоритм 2) по титрованному раствору KCl. Для расчета искомой концентрации использовали уравнение:

CKClVKCl.

CAg 1 VAg VAg ВЫВОДЫ 1. Разработаны основные принципы нового метода электрохимического анализа – ИВТ. Возникший на основе двух электрохимических методов – ИВ и АТ – метод ИВТ объединил достоинства обоих методов, исключив их недостатки, и представляет собой абсолютно независимый метод с уникальными свойствами и принципиально новыми возможностями.

2. Разработаны алгоритмы и расчетные уравнения экспрессных методов титрования с регистрацией всего двух (ИВТ-2) и трех (ИВТ-3) точек для нахождения концентрации определяемых веществ и исследования стехиометрии протекающих в растворе реакций.

3. Обоснована правомерность применения инверсионного сигнала серебра в качестве аналитического в условиях титрования AgNO3 тиолами и сульфидами. Доказано, что в выбранных условиях эксперимента присутствие матрицы крови, её фракций и слюны не влияют на кинетику электрохимических реакций на поверхности рабочего электрода и химических реакций в растворе.

4. Разработаны не требующие предварительной пробоподготовки методики исследования ТДС цельной крови и отдельных ее фракций с использованием двух отдельно взятых проб.

5. Предложены унифицированные экспрессные способы исследования ТДС цельной крови и ее фракций в норме и при различных заболеваниях непосредственно в одной аликвоте пробы.

6. Разработаны высокочувствительные и селективные методики ИВТисследования концентраций сульфидов в природных и питьевых водах и слюне с пределом обнаружения 5·10-10 и 5·10-9 моль·дм-3 для вод и слюны, соответственно. Предложенная ИВТ-2 методика использована для диагностики сероводородной аутоинтоксикации организма.

7. Метод ИВТ-2 применен для создания экспрессных и надежных методик стандартизации ОС неустойчивых во времени веществ органических тиолов, неорганических сульфидов, хлороводородной кислоты, йодистого калия и азотнокислого серебра.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Захарчук Н.Ф., Борисова Н.С., Титова Т.В. Исследование тиолдисульфидного равновесия в цельной крови и ее фракциях методом инверсионновольтамперометрического титрования // Журн. аналит. химии. – 2008. – Т. 63 № 2.

С. 189-198.

2. Titova T.V., Borisova N.S., Zakharchuk N.F. Determination of sub-micromolar amounts of sulfide by standard free anodic stripping voltammetry and anodic stripping voltammetric titration // Anal. Chim. Acta. – 2009. – V. 653. – P. 154-160.

3. Скиба Т.В., Борисова Н.С., Захарчук Н.Ф. Инверсионно-вольтамперометрический способ экспрессной установки титра нестабильных образцов сравнения // Аналитика и контроль. 2011. – Т. 15. № 4. С. 439-449.

4. Zakharchuk N.F., Borisova N.S., Titova T.V. Voltammetric titration. Basic principles and perspectives // Materials of International Scientific Conference «Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology». Tomsk, 2006. V. 2 – P. 173-175.

5. Титова Т.В. Определение серосодержащих веществ методом инверсионновольтамперометрического титрования // Материалы XLV международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 2007 – С. 153-154.

6. Титова Т.В., Захарчук Н.Ф., Борисова Н.С. Титрование органических тиолов, сульфид-ионов и свободных ионов кальция с инверсионно-вольтамперометрической индикацией точки эквивалентности // Тез. докл. VIII Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке». Томск, 2007 – С. 239.

7. Титова Т.В., Захарчук Н.Ф., Борисова Н.С. Определение серосодержащих веществ и ионов щелочноземельных металлов в питьевых водах и биологических жидкостях методом инверсионно-вольтамперометрического титрования // Материалы VII Всерос.

конф. по электрохим. мет. анализа с междун. участием. Уфа Абзаково, 2008 – С. 114.

8. Титова Т.В., Захарчук Н.Ф., Борисова Н.С. Безэталонный способ определения электрохимически неактивных веществ с использованием инверсионновольтамперометрического сигнала // Материалы VIII научн. конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока». Томск, 2008 – С. 152-153.

9. Титова Т.В., Захарчук Н.Ф. Стандартизация растворов малоустойчивых веществ методом вольтамперометрического титрования по двум точкам // Тез. докл. Съезда аналитиков России «Аналитическая химия – новые методы и возможности». Москва Клязьма, 2010 – С. 292.

10. Скиба Т.В., Захарчук Н.Ф. Определение сульфидной серы в слюне методом инверсионно-вольтамперометрического титрования по 2-м точкам (ИВТ-2) // Материалы IX научн. конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока». Красноярск, 2012 – С. 115.

Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001.

Подписано к печати и в свет 12.11.2012.

Формат 60 84/16. Бумага № 1. Гарнитура “Times New Roman” Печать оперативная. Печ. л. 1,2. Уч.-изд. л. 1,1. Тираж 120. Заказ № Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 6300






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.