WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Акмурзина Валентина Александровна

ПОИСК ЛИПИДНЫХ МАРКЕРОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РИСКОМ РАЗВИТИЯ ПОЗДНИХ ОСЛОЖНЕНИЙ САХАРНОГО ДИАБЕТА 1 ТИПА

Специальность 02.00.10 – Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2012

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В.

Ломоносова» и на Биологическом факультете ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор химических наук Селищева Алла Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Алесенко Алиса Владимировна зав. лабораторией нейролипидологии ФГБУН Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН доктор химических наук, профессор Безуглов Владимир Виленович зав. лабораторией оксилипинов ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Научно- исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медикобиологического агентства РФ

Защита состоится «15» октября 2012г в 15 ч 00 мин на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) по адресу: 119571, г. Москва, пр.

Вернадского, д.86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова (119571, г.

Москва, пр. Вернадского, д.86).

Автореферат диссертации разослан «12» сентября 2012г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

*

Актуальность темы. СД1 обусловлен дефицитом гормона инсулина в организме, вызванным деструкцией бета-клеток поджелудочной железы. В настоящее время основным диагностическим признаком СД1 является уровень глюкозы в крови натощак выше 6,ммоль/л. Также известно, что инсулин регулирует не только углеводный, но и липидный обмен, влияя на активность ферментов метаболизма липидов (ЛХАТ, ЛПЛ, гормончувствительной и печеночной липазы, десатуразы), которые локализуются как в плазме, так и в клетках тканей (Vergs B., 2009). Особый интерес вызывают изменения липидного состава эритроцитов, мембраны которых являются моделью молекулярной организации плазматических мембран.

При лечении СД1 основное внимание уделяется степени компенсации углеводного обмена, которую обычно оценивают по концентрации глюкозы и гликозилированного гемоглобина в крови. Считается, что при компенсированном СД1 имеется низкая степень риска развития поздних осложнений, таких как ангиопатии, ретинопатии, невропатии, атеросклероз и др. Однако нарушениям липидного обмена в лабораторной практике при СДуделяют меньше внимания и обычно определяют содержание ТАГ и общего ХОЛ как сумму свободного ХОЛ и его эфиров. Для получения наиболее полной картины необходимо максимально расширить спектр исследуемых липидов и объектов исследования. Поэтому для поиска липидных маркеров, характеризующих данное заболевание, а также для получения Список используемых сокращений: АК - арахидоновая кислота, ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭЖХ/МС - высокоэффективная жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией, ГХ – газовая хроматография, ДАГ – диацилглицерин, лФХ – лизофосфатидилхолин, ЛПЛ – липопротеинлипаза, ЛХАТ – лецитинхолестеринацилтрансфераза, МАГ – моноацилглицерин, МЭЖК – метиловый эфир жирной кислоты, НЛ – нейтральные липиды, НЭЖК – неэтерифицированная жирная кислота, СД1 – сахарный диабет 1 типа, СМ - сфингомиелин, ТАГ – триацилглицерин, ТСХ – тонкослойная хроматография, ТФЭ – твердофазная экстракция, ФЛ – фосфолипиды, флА2 - фосфолипаза А2, ФС – фосфатидилсерин, ФХ – фосфатидилхолин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, пФЭ - плазмалогенфосфатидилэтаноламин, ХОЛ – холестерин, ЦЕР – церамид, ЭХ – эфиры холестерина, ЯМР – ядерный магнитный резонанс.

* В руководстве работы принимал участие зав.кафедрой Биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова академик РАМН, д.х.н., проф. Швец В.И.

фундаментальных знаний о метаболизме липидов при СД1 необходимо провести качественное и количественное исследование разных классов липидов, а именно ФЛ, НЭЖК, ХОЛ и его эфиров, ТАГ. Эти проблемы решает липидомика – интенсивно развивающееся направление науки, осуществляющее анализ липидных метаболитов биологических объектов.

Многие авторы рассматривали дислипидемию как изменение соотношения в классах липидов (Rubba P. et. al., 1985; Loh K.C. et. al., 1996), и лишь немногие работы посвящены изучению липидных изменений на уровне индивидуальных молекулярных видов внутри каждого класса (Orei M. et. al., 2008).

Для анализа липидов используют различные аналитические методы (спектрофотометрия, ЯМР-, ИК-спектроскопия, ГХ, ВЭЖХ, ТСХ), однако для более полного профилирования липидов всех классов наиболее информативным является метод хроматомасс-спектрометрии. Определение липидного состава мембран эритроцитов и плазмы у пациентов, страдающих сахарным диабетом, ранее проводили в основном в группах пациентов с сахарным диабетом 2 типа (Prisco D. et. al., 1989). В случае СД1 в литературе представлены противоречивые результаты о липидном составе, что может быть связано с точностью используемого метода анализа и с состоянием инсулинотерапии пациентов (Watda C. et. al., 1990; Freyburger G. et. al., 1989; Labrouche S. et. al., 1996; Watda C. et. al., 1989).

Цель работы заключается в поиске липидных компонентов эритроцитов и плазмы крови, ассоциированных с риском развития осложнений СД1 у детей.

Были поставлены следующие задачи:

- оптимизировать методики для тестирования липидного спектра эритроцитов и плазмы крови методами ВЭЖХ/МС и ГХ.

- определить качественный и количественный состав глицеро- и сфинголипидов эритроцитов и плазмы крови больных с разными сроками СД1 методом ВЭЖХ/МС.

- определить качественный и количественный состав нейтральных липидов (холестерина и его эфиров, триацилглицеринов) плазмы крови больных с разными сроками СД1 методом ВЭЖХ/МС.

- оптимизировать методику твердофазной экстракции для выделения НЭЖК из липидного экстракта плазмы крови.

- определить качественный и количественный состав НЭЖК плазмы крови больных с разными сроками СД1 методом ГХ.

- на основании статистического анализа определить липидные маркеры СД1 и оценить риск развития поздних осложнений у детей с СД1.

Научная новизна. Методами ВЭЖХ/МС и ГХ исследовали широкий спектр липидов плазмы и эритроцитов, принадлежащих к разным кассам (ФЛ, НЭЖК и НЛ) у детей с СД1. В результате впервые установлены достоверные изменения (р<0,05) не только в суммарном содержании двух типов липидов (НЭЖК и лФХ) у детей вне зависимости от длительности СД1 относительно контрольной группы, но и в содержании их молекулярных видов. Они свидетельствуют о декомпенсации липидного метаболизма несмотря на проводимую инсулинотерапию и о высоком риске развития поздних осложнений, таких как ангиопатии и жировой гепатоз печени. Впервые в одном эксперименте проведен количественный анализ ХОЛ, 15 молекулярных видов ТАГ, 4 – ЭХ. Обнаружено достоверное увеличение (р<0,05) общего содержания ХОЛ у детей со сроком СД1 более 1 года относительно контрольной группы, которое обусловлено повышением уровня как свободного ХОЛ, так и этерифицированного. Впервые получен профиль из 26 индивидуальных НЭЖК, 16 из которых достоверно (р<0,05) отличаются от контрольной группы. Показано достоверное увеличение содержания АК и транс-изомера олеиновой кислоты в плазме детей, болеющих менее 1 года и уменьшение содержания докозагексаеновой (22:6 n-3) и докозапентаеновой (22:5 n-6) кислот, которое при проводимой инсулинотерапии приходит к норме.

Практическая значимость. Впервые показано, что, несмотря на проводимую инсулинотерапию, компенсации со стороны липидного обмена у детей с СД1 не происходит, что требует дополнительного назначения липотропных препаратов. При статистической обработке данных, полученных в результате количественного анализа липидов в плазме и в эритроцитах, обнаружены биохимические маркеры липидных нарушений при СД1, которыми являются: 1) лФХ; 2) ФЛ, содержащие арахидоновую кислоту; 3) суммарное содержание НЭЖК плазмы; 4) индивидуальные НЭЖК плазмы: арахидоновая, докозагексаеновая, докозапентаеновая и элаидиновая кислоты. Предложены оптимизированные методики для тестирования липидного спектра эритроцитов и плазмы крови методами ВЭЖХ/МС и ГХ, которые могут быть предложены для использования в клинической практике для оценки риска развития поздних осложнений и компенсации СД1.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Результаты идентификации и количественного определения глицеро- и сфинголипидного состава эритроцитов и плазмы крови больных с разными сроками СД1 методом ВЭЖХ/МС.

2) Результаты идентификации и количественного определения нейтральных липидов (холестерина и его эфиров, триацилглицеринов) плазмы крови больных с разными сроками СД1 методом ВЭЖХ/МС.

3) Результаты идентификации и количественного определения неэтерифицированных жирных кислот плазмы крови больных с разными сроками СД1 методом ГХ.

4) Оценка риска развития поздних осложнений у детей с СД1.

Апробация работы и публикации. Результаты работы представлялись на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2011), на Международном симпозиуме ASOC «Успехи науки в области органической химии» (Мисхор, Украина, 2010), на XII Зимней школе молодых ученых ИБХ РАН (Москва, Россия, 2010).

По результатам диссертационной работы опубликовано 4 оригинальных статьи в журналах, входящих в список изданий, рекомендованных ВАК.

Структура диссертации Диссертационная работа изложена на 123 страницах и состоит из следующих разделов:

введение, обзор литературы, обсуждения результатов, экспериментальная часть, выводы и список литературы, включающий 149 источников. Работа иллюстрирована 66 рисунками, содержит 30 таблиц.

Автор выражает глубокую признательность своим научным консультантам: д.б.н., проф.

С.В.Савельеву (Институт морфологии человека РАМН) и к.м.н. Петряйкиной Е.Е.

(Московская детская городская клиническая больница), а также всем сотрудникам, принимавшим участие в проведении исследований: к.б.н. Купцову В.Н, к.х.н. Корженевскому Д.А., с.н.с. Федорову В.Е. (АНО «Институт биомедицинских проблем»), д.б.н., проф.

Максимову Г.В., к.б.н. Паршиной Е.Ю., к.б.н. Юсиповичу А.И. (МГУ им. М.В.Ломоносова).

Основные этапы работы были выполнены в рамках ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 гг. (ГК№П2277 от13.11.09).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследования использовались эритроциты и плазма крови детей, проходящих лечение в отделении эндокринологии Морозовской детской городской клинической больницы. Родители предоставили информированное согласие об участии в данном исследовании. При формировании групп контролировались следующие параметры:

отсутствие полового созревания (возраст от 7 до 11 лет), отсутствие острой фазы воспаления (содержание С-реактивного белка 0-10 мг/л, скорость оседания эритроцитов 2-10 мм/час) и наличие биохимических анализов крови. Таким образом, из общего массива образцов, полученной от 140 детей, отобрали 94 образца крови, удовлетворяющих этим условиям. Для проведения исследований были сформированы 3 группы пациентов. Первая группа (контрольная) состояла из детей, не страдающих нарушением углеводного обмена.

Следующие группы пациентов были выделены в зависимости от длительности заболевания:

вторая группа, которую составили дети, болеющие СД1 менее 1 года (с продолжительностью заболевании от 0 до 8 месяцев) и третья группа, которую составили дети, болеющие СДболее 1 года (с продолжительностью заболевании от 1,5 до 7 лет). Показатели метаболизма глюкозы указывали на декомпенсированное течение заболевания у всех пациентов с СД(декомпенсацию углеводного обмена у пациентов с СД1 считали при содержании глюкозы натощак выше 7.0 ммоль/л и НbА1с выше 7.5 %). Все пациенты обследованы в момент диспансеризации на фоне проведения корректирующей углеводный обмен инсулинотерапии.

Дети имели одинаковый рацион и режим питания. Забор венозной крови для лабораторных исследований и анализа липидов производили утром натощак после 16-тичасового воздержания от приема жирной пищи.

Для получения липидных экстрактов эритроцитов и плазмы применяли комбинацию методов Фолча (Folch J. et.al., 1951) и Блайя-Дайера (Bligh E.G. et.al., 1959). Для статистической обработки результатов использовали программу «Statistica» (версия 8.0).

Оценку статистической значимости различий проводили с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни. За уровень статистически значимых принимали изменения при p<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение ФЛ состава эритроцитов.

На протяжении многих лет липидный состав эритроцитов интенсивно изучался методом ТСХ с последующим денситометрическим анализом или определением липидного фосфора. Этим методом в работе (Watda C. et. al., 1989) обнаружено достоверное увеличение лФХ, СМ, ФЭ, ФИ и ФС в эритроцитах детей, болеющих СД1 в течение 10 лет. Однако эти данные не были подтверждены в работе (Labrouche S. et. al., 1996), где показано достоверное уменьшение количества ФС у пациентов с СД1 относительно контрольной группы.

В данной работе методом ВЭЖХ/МС с ионизацией электрораспылением определили качественный и количественный состав ФЛ эритроцитов детей, больных СД1, в зависимости от длительности заболевания. Разделение проводили на колонке Polaris C18-А (Varian Inc, США) 2х100 мм с размером частиц 3 мкм при скорости потока элюента 0.2 мл/мин.

Экспериментально оптимизированные хроматографические условия (градиент фаз А и Б, где фаза А – вода:триэтиламин:муравьиная кислота (99,8:0,1:0,1 по объему), фаза Б - смесь ацетонитрил:изопропанол:триэтиламин:муравьиная кислота (40:50,8:0,1:0,1 по объему)) и условия масс-спектрометрического детектирования (температура осушающего газа в о источнике 220 С, напряжение на игле распылителя -4500 В) позволили определить молекулярные виды 6-ти классов ФЛ (лФХ, ФХ, пФЭ, ФЭ, ФС и СМ), а также молекулярных вида ЦЕР. Типичный вид хроматограммы липидного экстракта эритроцитов, записанной в режиме полного ионного тока с дискриминацией по массам, приведен на рис.1.

Именно применение обращенно-фазной ВЭЖХ/МС в отличие от нормальной фазы дает возможность разделить индивидуальные молекулярные виды, принадлежащие к одному классу липидов, и с большей точностью определить их содержание. Также методом ВЭЖХ/МС/МС была проведена идентификация обнаруженных ионов. При введении внутренних стандартов СМ (17:0/S18) и ЦЕР (17:0/S18) на этапе получения липидного экстракта была рассчитана их степень извлечения, которая составила 90.1 % и 94.7 % соответственно. В составе эритроцитов детей обнаружено 3 молекулярных вида лФХ, 8 - ФХ, 6 - ФЭ, 6 - пФЭ, 2 - ФС, 10 - СМ и 4 - ЦЕР.

Рисунок.1. Хроматограмма липидного экстракта эритроцитов здорового ребенка, зарегистрированная по полному ионному току. Обозначение над чертой - класс липида, под чертой – [(M+СН3COO)-СН3]- (для лФХ, ФХ, СМ), [М+НСОО]- для ЦЕР и [М-Н]- (для ФС, пФЭ и ФЭ), диапазон m/z 500-920.

В табл.1 приведены молекулярные виды ФЛ эритроцитов, содержание которых достоверно (р<0.05) изменяется в разных группах детей. В результате проведенных исследований обнаружено достоверное увеличение общего содержания лФХ относительно контрольной группы на 30 % вне зависимости от срока болезни (р<0.05). Причем наблюдается увеличение содержания всех идентифицированных молекулярных видов лФХ. Известно, что, отн. ед при воспалении происходит повышение активности фермента флА2, гидролизующего ацильную цепь ФЛ в sn-2 положении (Meyerzu H. et. al., 2007; Kudo I. et. al., 2002). Также известно, что изменение соотношения мембранных липидов приводит к ухудшению деформируемости эритроцитов и реологии крови (Juhan I. et. al., 1982, Garnier M. et. al., 1990).

Следовательно, данный метаболит является маркером развития неспецифического воспалительного процесса при СД1, увеличение содержания которого прогнозирует высокий риск поражения сосудов и развитие микроангиопатий.

Таблица 1. Содержание основных классов ФЛ эритроцитов и молекулярных видов ФЛ, достоверное отличающихся у здоровых детей и детей, больных СД1, % мол Класс и Группа 1 Группа 2 Группа состав m/zа Контроль Диабет <1года Диабет >1года липида (14 человек) (14 человек) (16 человек) лФХ 2.47±0.55 3.19±1.01* 3.22±0.84* 16:0 540.3 1.30±0.33 1.85±0.62* 1.76±0.51* 18:2 564.4 0.10±0.05 0.11±0.07 0.14±0.06* 18:0 568.3 1.07±0.24 1.23±0.32 1.32±0.31* ФХ 36.53±2.12 36.65±1.45 36.30±2.18:2/18:2 826.4 0.37±0.11 0.46±0.14 0.55±0.12** 16:0/20:4 826.4 2.75±0.55 3.19±0.61 2.65±0.51# ФЭ 12.89±1.23 12.36±1.22 13.09±1.16:0/18:2 714.4 1.64±0.26 1.49±0.33 1.91±0.30*# 16:0/18:1 716.5 5.26±0.74 4.30±0.51** 4.91±0.18:2/20:4 762.6 0.82±0.40 1.15±0.36* 1.01±0.пФЭ 14.37±1.31 14.11±0.99 13.62±1.16:0/18:1 700.5 0.92±0.11 0.80±0.14* 0.88±0.18:0/18:1 728.5 1.00±0.16 0.84±0.14* 0.89±0.13* ФС 3.63±1.45 4.20±2.35 3.66±1.СМ 24.51±1.51 23.58±1.60 24.02±1.14:0/S18 719.5 0.38±0.09 0.50±0.11* 0.51±0.13* 16:1/S18 745.5 0.56±0.08 0.50±0.11 0.63±0.07*# 16:0/S18 747.5 7.58±0.98 6.51±1.04 6.97±1.Цер 4.65±0.96 4.80±0.85 4.65±1.а [(M+СН3COO)-СН3]- (для лФХ, ФХ, СМ), [М+НСОО]- для ЦЕР и [М-Н]- для ФС, пФЭ и ФЭ.

*p<0.05 по сравнению с группой 1, ** p<0.001 по сравнению с группой 1, # p<0.05 по сравнению с группой 2.

Несмотря на тот факт, что изменения суммарного содержания остальных классов липидов статистически незначимы, наблюдаются достоверные отличия в содержании отдельных молекулярных видов внутри каждого класса липидов. Нами были обнаружены изменения в количественном содержании молекулярных видов липидов, содержащих остаток АК (рис. 2).

В исследуемых группах наблюдается одинаковая динамика изменения молекулярных видов ФХ 16:0/20:4 и ФЭ 18:2/20:4, показывающая увеличение количества ФЛ, содержащих АК, на ранних сроках развития заболевания. Причем у детей со сроком СД1 более 1 года количество видов, содержащих остаток АК, приходит в норму. Следовательно, данный параметр является маркером компенсации СД1. Так как между клетками крови и компонентами плазмы идет постоянное взаимодействие, то увеличение ФЛ, содержащих АК, в мембране эритроцитов может быть связано с ростом таких же видов ФЛ в плазме. Поэтому необходимо перейти к исследованию липидного состава плазмы крови.

Итак, полученные данные показывают, что существует липидный профиль, характерный для больных с СД1, что делает возможным использование обнаруженных изменений в лабораторной практике в качестве маркеров для оценки риска развития поздних осложнений данного заболевания.

р=0,р=0,р=0,р=0,Рисунок 2. Изменение количественного содержания молекулярных видов ФЛ эритроцитов, содержащих остаток АК в sn-2 положении в зависимости от срока заболевания СД1. Группа 1- контрольная, группа 2 – дети, болеющие СД1 меньше года, группа 3 – дети, болеющие СД1 больше года.

2. Определение фосфолипидного состава плазмы 2.1. Выделение отдельных классов липидов из липидного экстракта плазмы методом ТФЭ.

В настоящее время не существует единого метода, с помощью которого в одном эксперименте можно было бы количественно измерить все липидные компоненты биологического образца, несмотря на усилия, предпринимаемые в этом направлении (Han X.

et. al., 2004). Поэтому некоторые классы липидов анализируют отдельно. Для выделения интересующих классов липидов и для очистки липидного экстракта используют предварительные методики разделения, например, ТФЭ (Kaluzny M.A. et. al., 2004). В данной работе из липидного экстракта плазмы крови были выделены отдельные фракции липидов:

НЛ (ТАГ, ДАГ, МАГ, ХОЛ, ЭХ), НЭЖК и ФЛ. Для этого использовалась колонка на основе аминопропилсиликагеля BondElut LRC-NH2 (Varian, США) с размером частиц 70 мкм и диаметром пор 140 и последовательное элюирование органическими растворителями (рис.

3).

Состав выделенных фракций был подтвержден методом ТСХ с использованием силикагеля в системе гексан:диэтиловый эфир:уксусная кислота (55:45:1) и ВЭЖХ/МС. Затем выделенные липидные классы были исследованы различными хроматографическими методами. Проведение ТФЭ особенно важно для анализа НЭЖК методом ГХ, так как при этом исключается переэтерификация жирных кислот в составе других классов липидов при получении метиловых производных.

Липидный экстракт Диэтиловый эфир: уксусная Хлороформ:

Метанол кислота изопропанол 98:2:Нейтральные липиды НЭЖК ФЛ ВЭЖХ-МС ГЖХ ВЭЖХ-МС Рисунок 3. Схема разделения липидных классов методом ТФЭ.

2.2. Определение ФЛ состава плазмы крови.

Ранее при исследовании липидного состава плазмы крови детей методом ТСХ было выявлено уменьшение содержания лФХ и СМ в случае СД1 по сравнению с контрольной группой (Watda C. et. al., 1990). Используемый в этой работе метод не позволяет идентифицировать отдельные молекулярные виды ФЛ. Для этих целей с успехом применяют метод тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (Han X. et. al.,1994;

Kerwin J.L. et. al., 1994). На сегодняшний день в небольшом количестве работ методом ВЭЖХ/МС установлено различие между некоторыми молекулярными видами ФЛ плазмы крови здоровых и больных СД1 (Orei M. et. al., 2008; Sorensen C. M. et. al., 2010).

В данной работе определение молекулярных видов ФЛ плазмы, предварительно выделенных из липидного экстракта методом ТФЭ, проводили методом ВЭЖХ/МС по методике, описанной выше для определения липидного состава эритроцитов. На рис. приведена хроматограмма и виды ФЛ, обнаруженные в липидном экстракте плазмы крови здорового ребенка.

Рисунок 4. Хроматограмма ФЛ, выделенных из липидного экстракта плазмы крови здорового ребенка, зарегистрированная по полному ионному току. Обозначение над чертой - класс липида, под чертой - [(M+СН3COO)-СН3]- (для лФХ, ФХ, СМ) и [М-Н]- (для ФС, пФЭ и ФЭ), диапазон m/z 520-900.

При введении внутренних стандартов лФХ (17:0) и СМ (17:0/S18) на этапе получения липидного экстракта была рассчитана их степень извлечения с учетом всех стадий пробоподготовки и анализа, которая составила 72.5 % и 84.8 % соответственно. В составе эритроцитов детей обнаружено 4 молекулярных вида лФХ, 12 - ФХ, 4 - ФЭ, 2 - пФЭ и 13 - СМ.

, отн.ед.

Рисунок. 5. Динамика изменения лФХ в плазме и эритроцитах крови детей с разными сроками СД1. Группа 1 – дети, не болеющие СД1, группа 2 – дети, болеющие СД1 меньше года, группа 3 – дети, болеющие СД1 больше 1 года.

Рисунок 6. Изменение количественного содержания молекулярных видов ФЛ плазмы, содержащих остаток АК в sn-2 положении в зависимости от срока заболевания СД1. Группа 1- контрольная, группа 2 – дети, болеющие СД1 меньше года, группа 3 – дети, болеющие СДбольше года.

В результате обнаружено достоверное (р<0.05) уменьшение содержания лФХ в плазме крови детей на 30 % независимо от срока заболевания (рис. 5). При сравнении с содержанием лФХ в эритроцитах наблюдается обратная динамика изменения лФХ в плазме крови детей.

Суммарное содержание других классов ФЛ в липидном экстракте плазмы крови больных СДдостоверно не отличалось от контрольной группы. Также рассчитано количественное содержание молекулярных видов липидов, содержащих остаток АК, и обнаружена сходная с липидами эритроцитов динамика изменений (рис. 6). Причем у детей со сроком СД1 более года количество видов, содержащих остаток АК, приходит в норму. Следовательно, данный параметр является маркером компенсации СД1.

Проведенное количественное профилирование показало, что в плазме крови детей на ранних сроках развития СД1 достоверно изменяется содержание отдельных молекулярных видов ФЛ, что делает возможным использование обнаруженных изменений в лабораторной практике в качестве маркеров для оценки риска развития поздних осложнений данного заболевания. (табл.2) Таблица 2. Содержание основных классов ФЛ и молекулярных видов ФЛ плазмы, достоверное отличающихся у здоровых детей и детей, больных СД1, мкмоль/л.

Класс и Группа 1 Группа 2 Группа состав m/zа Контроль Диабет < 1 года Диабет > 1 года липида (12 человек) (16 человек) (20 человек) лФХ 164.23±43.40 124.72 ±44.24* 107.88 ±37.38** 16:1 538.4 2.18±0.68 3.34±1.85* 1.36±0.64**## 16:0 540.3 74.53±19.39 63.94±23.17 44.42±16.13**# 18:2 564.4 30.08±12.40 17.64±7.13* 21.53±5.31* 18:1 566.4 17.55±4.20 14.34±5.45 13.50±5.33* 18:0 568.3 34.51±11.12 20.14±7.68** 20.70±9.23** ФХ 796.61 ±167.75 827.50 ±150.24 762.35 ±137.16:0/16:0 778.5 9.16±2.70 11.85±2.51* 8.99±2.30# 16:0/18:1 804.5 115.86±39.94 175.94±39.89** 118.16±31.75## 18:2/18:2 826.5 18.04±10.16 8.78±4.02* 12.27±4.57*# 16:0/20:4 826.4 90.48±23.82 103.40±45.04* 96.11±26.25# 18:0/18:2 830.5 195.28±47.12 135.07±38.29* 177.07±43.28# ФЭ 6.19 ±3.67 8.99 ±5.54 5.34 ±1.57# 16:0/18:2 714.4 0.86±0.46 1.32±0.95 0.74±0.24# 16:0/22:6 762.5 1.24±0.91 3.43±2.87* 1.26±0.60# пФЭ 7.97 ±2.94 7.56 ±2.53 9.86 ±3.16:0/20:4 722.5 2.73±0.95 2.29±0.80 3.56±1.51# СМ 394.77 ±83.38 363.46 ±52.45 386.70 ±54.14:0/S18:1 719.5 12.11±2.69 9.73±3.13* 11.46±3.15:0/S18:1 733.5 7.37±1.61 5.72±1.32* 7.35±1.33# 22:2/S18:0 829.4 18.81±4.50 15.20±3.27* 17.30±3.23:0/S18:1 845.5 17.94±4.97 15.86±4.17 19.24±4.26# 24:2/S18:0 857.5 22.83±5.19 18.87±3.83* 20.92±4.Сумма 1369.76±269.66 1332.23±237.87 1272.19±171.а [(M+СН3COO)-СН3]- (для лФХ, ФХ, СМ) и [М-Н]- для ФС, пФЭ и ФЭ. *p<0.05 по сравнению с группой 1, ** p<0.001 по сравнению с группой 1, # p<0.05 по сравнению с группой 2, ## p<0.001 по сравнению с группой 2.

2.3. Определение нейтральных липидов плазмы крови Для количественного анализа НЛ с успехом применяют методы ВЭЖХ, ТСХ и ГХ (Hoving E.B. et. al., 1995). Определение НЛ методом обращенно-фазной ВЭЖХ затруднено совместным элюированием некоторых молекулярных видов ЭХ и ТАГ, что накладывает жесткие ограничения на выбор объекта исследования, процесс пробоподготовки и детектирования. В последнее время были разработаны хромато-масс-спектрометрические методы определения НЛ, основанные на различных способах ионизации, таких как химическая и фотоионизация при атмосферном давлении. В противоположность этим методам ионизации, ионизация электрораспылением не позволяет эффективно ионизировать холестерин, поэтому его предварительно необходимо дериватизировать.

В данной работе методом ВЭЖХ/МС с ионизацией электрораспылением выполнили количественное определение НЛ плазмы детей, больных СД1, в зависимости от длительности заболевания. Фракция НЛ предварительно была выделена из липидного экстракта плазмы методом ТФЭ. Непосредственно перед анализом фракцию НЛ ацилировали ацетилхлоридом по методике предложенной (Liebisch G. et. al., 2006) для перевода ХОЛ в эфир холестерина 2:([M+NH4]+, m/z 446.5) без переэтерификации других классов НЛ (рис. 7).

H3C CHH3C CHCH3 H CH3 H Ацетилхлорид/хлороформ CHCH1/CH3 H CH3 H O H H H H HO H3C O Холестерин Ацетат холестерина Рисунок 7. Дериватизация холестерина с помощью ацетилхлорида.

Степень конверсии ХОЛ оценивали методами ТСХ и ВЭЖХ с лазерным детектором испарительного светорассеяния. Разделение НЛ проводили на колонке Purospher STAR RP-(Merck, США) 4.6х150 мм с размером частиц 5 мкм при скорости потока элюента 0.3 мл/мин.

Экспериментально оптимизированные хроматографические условия (градиент фаз А и Б, где фаза А –ацетонитрил, фаза Б – изопропанол, содержащие 1 мМ ацетата аммония) и условия масс-спектрометрического детектирования (температура осушающего газа в источнике 2о С, напряжение на игле распылителя 5500 В) позволили впервые в одном эксперименте определить 3 вида НЛ: ХОЛ, ЭХ и ТАГ (рис.8).

Также методом ВЭЖХ/МС/МС была проведена идентификация обнаруженных ионов.

Масс-спектрометрическое детектирование ЭХ 2:0 проводили методом ВЭЖХ/МС/МС, сканируя ионы-предшественники дочернего иона m/z 369.2 в диапазоне m/z 440.0-450.(энергия соударений – 15 eV, давление аргона в ячейке соударений 1 мТор) до 18 минуты анализа, а другие ЭХ и ТАГ определяли в режиме записи полного ионного тока в диапазоне m/z 600-1000. При введении внутреннего стандарта ТАГ ((10:0)3) на этапе получения липидного экстракта была рассчитана степень его извлечения с учетом всех стадий пробоподготовки и анализа, которая составила 92.5 %.

Рисунок 8. Хроматограмма НЛ, выделенных из липидного экстракта плазмы крови здорового ребенка. Обозначение над чертой - класс липида, под чертой - [M+NH4]+, m/z.

В результате в составе плазмы крови детей обнаружено 4 молекулярных вида ЭХ и 15 - ТАГ. В табл. 3 представлены молекулярные виды НЛ плазмы крови детей, содержание которых достоверно (р<0.05) отличается в разных группах.

Таблица 3. Содержание основных классов и молекулярных видов НЛ плазмы, достоверное отличающихся у здоровых детей и детей, больных СД1, ммоль/л.

Группа 1 Группа 2 Группа Жирнокислотный [М+NH4]+, m/z Контроль СД1<1 года СД1>1 года состав (11 человек) (10 человек) (11 человек) ХОЛ 0.54±0.07 0.60±0.09 0.65±0.09* ЭХ 3.10±0.43 3.30±0.76 3.63±0.62* 690 20:4 0.35±0.10 0.50±0.16* 0.45±0.666 18:2 2.09±0.22 1.90±0.38 2.24±0.27# 642 16:0 0.25±0.09 0.41±0.16* 0.47±0.15* ТАГи 0.78±0.17 1.27±0.28 0.89±0.898 18:1/18:2/18:2 0.01±0.0006 0.03±0.0003* 0.01±0.0004# 874 16:0/18:1/18:2 0.11±0.02 0.16±0.10* 0.10±0.876 16:0/18:1/18:1 0.09±0.02 0.25±0.10* 0.11±0.*p<0.05 по сравнению с группой 1, # p<0.05 по сравнению с группой 2.

, отн.ед.

Обнаружено, что общее содержание свободного ХОЛ и ЭХ у детей, болеющих СДболее 1 года, достоверно повышается относительно контрольной группы, несмотря на проводимую инсулинотерапию. Как известно, увеличение уровня ХОЛ и ЭХ в крови ведет к развитию поздних сосудистых осложнений, например, к атеросклерозу. Несмотря на то что общее содержание ТАГ достоверно не изменяется, в группе детей, болеющих СД1 менее года, найдены достоверные изменения в содержании некоторых молекулярных видов ТАГ, которые со временем приходя к норме Проведенное количественное профилирование показало, что в плазме крови детей на ранних стадиях развития СД1 достоверно изменяется содержание свободного ХОЛ на 20 % и молекулярных видов ЭХ (16:0; 18:1 и 20:4), что делает возможным использование обнаруженных изменений в лабораторной практике в качестве маркеров для оценки риска развития поздних осложнений данного заболевания. Выдвинуто предположение о том, что увеличение концентрации ТАГ и ЭХ может являться следствием обнаруженного нами повышенного содержания НЭЖК в плазме крови (пальмитиновой, олеиновой и линолевой).

Поэтому следующим этапом явилось определение НЭЖК плазмы крови.

2.4. Определение НЭЖК плазмы крови Как известно, НЭЖК являются не только альтернативным источником энергии для клеток, но и обладают сигнальными функциями, имея собственные мембранные и ядерные рецепторы в клетках различных тканей организма (Ichimura A. et. al., 2009). Так глюкозоопосредованная секреция инсулина возможна только при физиологической концентрации НЭЖК в плазме крови (0.2 - 0.4 ммоль/л). В свою очередь, в зависимости от длительности воздействия, концентрации, длины углеводородной цепи и количества двойных связей НЭЖК влияют на секрецию инсулина -клетками поджелудочной железы (Frstova V. et. al., 2008).

Анализ индивидуальных НЭЖК может быть осуществлен методами ГХ и ВЭЖХ, что не исключает проведение предварительного выделения НЭЖК из липидного экстракта при помощи ТСХ или ТФЭ, либо селективной дериватизации непосредственно в экстракте.

В данной работе качественный и количественный анализ НЭЖК проводили методом ГХ с пламенно-ионизационным детектором (Varian 3900, США). Метиловые эфиры НЕЖК плазмы, выделенных из липидного экстракта методом ТФЭ, получали в реакции с 15 % раствором концентрированной серной кислоты в метаноле в течение 60 мин при температуре 62 °С. Разделение проводили с использованием капиллярной колонки (СP-select CB for FAME, 100м0.25мм, Chrompack, США), позволяющей разделять различные изомеры жирных кислот. Идентификацию и концентрации индивидуальных МЭЖК определяли, используя стандарт Supelco 37 FAME Mix (США), содержащий 37 МЭЖК. Типичный вид хроматограммы МЭЖК плазмы здорового ребенка представлен на рис. 9.

При введении внутреннего стандарта НЭЖК (12:0) на этапе получения липидного экстракта была рассчитана его степень извлечения с учетом всех стадий пробоподготовки и анализа, которая составила 85.5 %.

Интенсивность, мВ Скорость Температура, Время Время изменения ° С плато, анализа, температуры мин мин ° С/мин - 100 5 0,010 180 10 8 220 10 8 240 10 0,00,00,015 20 25 30 35 Время удерживания, мин Рисунок 9. Хроматограмма МЭЖК плазмы крови здорового ребенка.

В табл.4 перечислены НЭЖК плазмы, среди которых основными кислотами являются 16:0, 18:1, 18:0 и 18:2, что согласуется с литературными данными (Melchert et. al., 198;, Decki et. al., 2005; Hodson et. al., 2008). Известно, что при недостатке инсулина усиливается липолиз ТАГ жировой ткани, что приводит к повышению общего уровня НЭЖК в крови. В данной работе обнаружено достоверное (р<0.001) увеличение общего уровня НЭЖК в 1.6 раза как при малых сроках заболевания, так и при увеличении срока болезни (табл.4), причем насыщенные НЭЖК в среднем увеличиваются на 52 %, мононенасыщенные на 106 % и полиненасыщенные на 48 %.

Большой интерес представляет изменение индивидуальных НЭЖК, так как в зависимости от длины углеводородной цепи и количества двойных связей они оказывают различное влияние на секрецию инсулина. В результате показано, что в группе детей с СДменее 1 года происходит увеличение на 30 % содержания АК (20:4) и на 82 % транс-изомера олеиновой кислоты (18:1) (рис.10). Также обнаружено достоверное уменьшение содержания докозагексаеновой кислоты (22:6) на 26 % и докозапентаеновой (22:5) кислоты на 60 % в группе детей со сроком заболевания менее 1 года. Причем у детей со сроком СД1 более 1 года содержание АК, транс-изомера олеиновой кислоты и докозагексаеновой кислоты приходит в норму, что позволяет использовать эти метаболиты в качестве маркеров компенсации СД1.

Таблица 4. Содержание НЭЖК в плазме крови здоровых детей и детей, больных СД1, мкмоль/л.

Группа 1 Группа 2 Группа Контроль Диабет < 1 года Диабет > 1 года НЭЖК (12 человек) (9 человек) (22 человек) Насыщенные 255.28±56.19 389.37±79.12* 341.45±85.29* 14:0 22.72±9.39 30.25±9.07 29.92±10.16:0 134.04±29.20 217.20±55.53* 191.69±56.08* 18:0 93.95±18.04 136.24±26.13* 114.49±22.87*# 20:0 1.83±0.38 2.95±0.69* 1.78±0.58# 22:0 1.26±0.24 0.89±0.28* 1.50±1.24:0 1.48±0.54 1.84±0.50 2.07±0.74* Мононенасыщенные 85.75±33.13 176.90±96.71* 190.32±75.55* 16:1 n-7 с 8.30±2.85 9.68±5.99 11.50±4.41* 16:1 n-9 с 5.88±4.08 12.93±11.56* 15.50±9.20* 16:1 n-11 с 3.01±0.62 4.14±1.01* 3.38±0.78# 18:1 n-9 t 6.20±3.56 11.27±6.86* 6.84±2.98# 18:1 n-9 с 55.03±27.99 128.88±78.47* 143.18±60.61* 18:1 n-11 с 2.79±2.19 5.94±3.51* 6.86±3.27* 20:1 2.72±2.15 1.20±0.38* 1.18±0.58* 22:1 1.81±0.38 2.86±0.60* 1.88±0.75# Полиненасыщенные 57.11±18.69 84.57±38.61* 102.91±42.49* 18:2 n-6 t 2.54±1.25 2.66±1.25 3.45±1.08* 18:2 n-6 с 31.89±17.37 58.28±34.55* 75.00±37.79* 18:3 n-3 c 1.31±0.39 1.67±1.20 2.42±1.31* 20:2 n-6 c 1.06±0.43 1.72±0.76* 1.41±0.20:3 n-6 c 2.36±0.55 2.14±0.75 2.51±0.20:3 n-3 c 3.02±1.39 4.41±2.17 4.32±1.44* 20:4 n-6 c 2.95±0.91 3.86±0.85* 2.52±1.22# 20:5 n-6 c 1.95±0.16 2.69±2.03 3.53±1.39* 22:2 n-6 c 2.76±1.04 2.34±0.72 1.80±1.08* 22:4 n-6 c 1.47±0.52 1.79±0.46 1.49±0.22:5 n-6 c 3.89±1.37 1.57±0.47* 2.42±1.29* 22:6 n-3 c 1.90±0.79 1.41±0.30* 2.05±0.85# Сумма 397.84±84.23 652.87±194.63* 636.93±193.08* *p<0.05 по сравнению с группой 1, # p<0.05 по сравнению с группой 2.

Рисунок 10. Динамика содержания индивидуальных НЭЖК у детей с разным сроками СД1. 18:1 n-9 t - транс-изомер олеиновой кислоты, 20:4 n-6- арахидоновая кислота. 22:5 – докозапентаеновая кислота 22:6 - докозагексаеновая кислота. Группа 1 – дети, не болеющие СД1, группа 2 – дети, болеющие СД1 меньше 1 года, группа 3 – дети, болеющие СД1 больше 1 года.

Полученные данные показывают, что существует жирнокислотный профиль, характерный для больных с СД1, что делает возможным использование обнаруженных изменений в лабораторной практике в качестве маркеров для оценки риска развития поздних осложнений данного заболевания.

Таким образом, проведенный нами количественный анализ липидного состава эритроцитов и плазмы крови детей с разными сроками развития СД1 показал ряд достоверных сдвигов в метаболизме липидов. С помощью оптимизированных условий методов ВЭЖХ/МС и ГХ в данной работе обнаружены липидные метаболиты, которые статистически значимо отличаются от контрольной группы и являются маркерами СД1. Они могут быть использованы в лабораторной практике как для оценки риска развития поздних осложнений СД1, так и для оценки степени компенсации липидного обмена.

ВЫВОДЫ 1. Проведена оптимизация методик для тестирования липидного спектра эритроцитов и плазмы крови методами ВЭЖХ/МС и ГХ, которые могут быть предложены для использования в клинической практике для оценки риска развития поздних осложнений и компенсации СД1. Исходя из обнаруженных количественных изменений липидного профиля можно прогнозировать высокий риск развития поздних осложнений СД1.

2. Определен качественный и количественный состав молекулярных видов ФЛ эритроцитов и плазмы крови детей на разных сроках СД1 методом ВЭЖХ/МС и ВЭЖХ/МС/МС. Показано, что суммарное содержание ФЛ не изменяется, но достоверно увеличивается содержание лФХ в эритроцитах и уменьшается в плазме крови независимо от срока заболевания СД1. Кроме того, обнаружены изменения в отдельных молекулярных видах лФХ. Показано, что в эритроцитах достоверно увеличивается содержание 3-х молекулярных видов лФХ (16:0,18:0,18:2), а в плазме уменьшается содержание 5-ти молекулярных видов (16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2). Увеличение содержания лФХ в мембране эритроцитов прогнозирует высокий риск поражения сосудов и развитие ангиопатии, поэтому данный метаболит предложен в качестве маркера неспецифического воспалительного процесса при СД1. Также в эритроцитах и плазме детей, болеющих СД1 менее 1 года, обнаружено достоверное увеличение суммарного содержания молекулярных видов ФЛ, содержащих остаток АК, которое приходит в норму у детей со сроком СД1 более 1 года. Следовательно ФЛ, содержащие остаток АК, являются маркерами компенсации СД1.

3. Определен качественный и количественный состав нейтральных липидов (ТАГ, ХОЛ, ЭХ) плазмы крови детей с разными сроками СД1 методом ВЭЖХ/МС и ВЭЖХ/МС/МС.

Впервые в одном эксперименте проведен количественный анализ ХОЛ, 15 молекулярных видов ТАГ, 4 – ЭХ. Обнаружено достоверное повышение содержания ХОЛ на 20 % и ЭХ на 17 % у детей, болеющих СД1 более 1 года, относительно контрольной группы, несмотря на проводимую инсулинотерапию. Это ведет к развитию поздних сосудистых осложнений, например, атеросклерозу, что делает возможным использование обнаруженных изменений в лабораторной практике в качестве маркеров для оценки риска развития поздних осложнений СД1. Также у детей, болеющих СД1 менее 1 года, показано достоверное увеличение в количественном содержании 2-х молекулярных видов ЭХ (16:0, 20:4) и 3-х молекулярных видов ТАГ (18:1/18:2/18:2, 16:0/18:1/18:2, 16:0/18:1/18:1).

4. При определении качественного и количественного состава НЭЖК плазмы крови детей с разными сроками СД1 методом ГХ впервые получен профиль из 26 индивидуальных НЭЖК, 16 из которых достоверно отличаются от контрольной группы, что дает возможность использовать данные НЭЖК для оценки риска развития поздних осложнений СД1.

Установлено, что вне зависимости от срока СД1 достоверно увеличивается общее содержание НЭЖК. Данный параметр предложен в качестве маркера указывающего на высокий риск развития такого осложнения, как жировой гепатоз печени. Впервые показано достоверное увеличение содержания АК (20:4 n-6) и транс-изомера олеиновой кислоты (18:1 t) в плазме детей, болеющих менее 1 года, и уменьшение содержания докозагексаеновой (22:6 n-3) и докозапентаеновой (22:5 n-6) кислот, которое при лечении приходит в норму, что позволяет использовать эти метаболиты в качестве маркеров компенсации СД1.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Д.А. Корженевский, В.Н. Купцов, В.А. Митянина (Акмурзина), А.А. Селищева, С.В.

Савельев, Т.Ю. Калашникова. Идентификация молекулярных видов церамидов эритроцитов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии/массспектрометрии и тандемной масс-спектрометрии. // Масс-спектрометрия. - 2010. - Т. 7. - №3. - С. 188-192.

2. D.A. Korzhenevskii, V.N. Kuptsov, V.A. Mityanina, A.A. Selishcheva, S.V. Saveliev and T.Yu.

Kalashnikova. Identification of the Individual Molecular Species of Ceramides Derived from Human Erythrocytes using HPLC/MS and HPLC/MS/MS. // J. Anal. Chem. – 2011. - V. 66. - P.

1270 - 1275.

3. В.А. Митянина, Е.Ю. Паршина, А.И. Юсипович, Г.В. Максимов, А.А. Селищева.

Исследование кислород-связывающих свойств эритроцитов у детей с разными сроками заболевания сахарным диабетом 1 типа. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153.- №3. - С. 499-504.

4. В.А. Митянина, В.Н. Купцов, С.В. Савельев, В.И. Швец, А.А. Селищева. Липидный состав эритроцитов детей на разных стадиях заболевания диабетом 1-го типа. // Биомедицинская химия. – 2012. - Т. 58. - №1. - С. 95-103.

5. Н.С. Морозова, В.А. Акмурзина, А.В. Матвеев, А.Ю. Милентьев, Д.И. Прохоров, А.О.

Ружицкий, А.А. Селищева, В.И. Швец. Определение неэтерифицированных жирных кислот в биологических образцах: различные способы пробоподготовки. // Вестник МИТХТ. – 2012.- Т. 7. - №4. – С. 63-71.

6. В.А. Митянина, Д.А. Корженевский, В.И. Швец. Получение профиля молекулярных фракций церамидов из эритроцитарной мембраны методом ВЭЖХ с массспекрометрическим детектированием. // Тезисы и стендовый доклад XXII Зимней школы молодых ученых ИБХ РАН. - 2010. - С. 71.

7. В.А. Митянина, В.Н. Купцов, А.А. Селищева, С.В. Савельев, В.И. Швец. Получение профиля молекулярных фракций церамидов из эритроцитарной мембраны методом ВЭЖХ с масс-спекрометрическим детектированием // Тезисы Международного симпозиума ASOC «Успехи науки в области органической химии».- Мисхор, Украина.-2010. - С.143.

8. В.А. Митянина. Определение липидного состава эритроцитов детей на разных стадиях сахарного диабета 1 типа методами ВЭЖХ/МС и ВЭЖХ/МС/МС. // Тезисы и стендовый доклад VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».- Москва, Россия, 2011. - С. 150.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.