WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА ____________________________________________________ ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВ Илья Игоревич

НОВЫЙ МЕХАНИЗМ Са2+-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ РОДОПСИНКИНАЗЫ

02.00.10 – биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва 2012

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и в отделе сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В.

Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук Сенин Иван Иванович доктор биологических наук, профессор Филиппов Павел Павлович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Цетлин Виктор Ионович доктор биологических наук, профессор Чернов Николай Николаевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 29 » мая 2012 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 27 » апреля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук И.Г. Смирнова

Общая характеристика работы



Актуальность проблемы Рецепторы, сопряжённые с G-белками (GPCR), играют ключевую роль в межклеточных биохимических взаимодействиях, отвечающих за управление важнейшими физиологическими процессами, включая сердечную и легочную деятельность, пищеварение и воспалительные реакции, а также восприятие внешних сигналов, таких как свет, звук, запахи. Ключевым аспектом регуляции активности представителей семейства сопряжённых с G-белками рецепторов является их десенситизация, которая достигается в процессе их множественного фосфорилирования под действием протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с Gбелками (GRK), специфически распознающих и фосфорилирующих только активированные агонистами формы рецепторов. Нарушение регуляции десенситизации GPCR в настоящее время связывают с развитием таких патологий, как ночная слепота, хроническая сердечная недостаточность, гипертензия, опиатная зависимость, некоторые виды рака.

В большинстве клеток десенситизация GPCR является Са2+чувствительным процессом, что является следствием Са2+-зависимой регуляции активности GRK представителями семейства EF-hand-содержащих Са2+связвывающих белков. Так, специфические для фоторецепторных клеток родопсинкиназа (GRK1) и GRK7 регулируются нейрональным Са2+-сеносором рековерином, в то время как активность других протеинкиназ из семейства GRK (GRK2-6) регулируется универсальным медиатором клеточных сигналов кальция кальмодулином. Интенсивные исследования регуляции десенситизации GPCR в различных типах клеток показали, что Са2+-зависимая регуляция GRK является намного более сложным процессом, чем считалось ранее и, в частности, может осуществляться одновременно несколькими Са2+-связывающими белками. Так, к моменту начала настоящей работы в литературе имелись сведения о том, что присутствующий в фоторецепторных клетках кальмодулин способен связываться с родопсинкиназой Ca2+-зависимым образом. Однако функциональное влияние этого взаимодействия на фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой, оставалось неизвестным. В настоящей работе изучались способность кальмодулина регулировать активность родопсинкиназы Са2+-зависимым образом и структурные основы механизма ингибирования родопсинкиназы кальмодулином, а также участие кальмодулина в совместной с рековерином Са2+-зависимой регуляции активности родопсинкиназы.

Актуальность настоящей работы состоит в том, что в ней обнаружена новая функция кальмодулина в фоторецепторной клетке, в значительной степени расширяющая понимание механизмов Са2+-зависимой регуляции фототрансдукции.

Цель и задачи исследования Целью работы являлось изучение роли кальмодулина в Са2+-зависимой регуляции родопсинкиназы. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:

1. изучить способность кальмодулина регулировать активность родопсинкиназы Са2+-зависимым образом; установить участок связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы 2. исследовать возможность совместной регуляции родопсинкиназы кальмодулином и рековерином 3. изучить роль кальмодулина во взаимодействии родопсинкиназы с родопсином.

Научная новизна и практическая значимость работы Впервые показано участие кальмодулина в регуляции родопсинкиназы:

продемонстрирована способность кальмодулина Са2+-зависимо ингибировать родопсинкиназу и определены параметры этого ингибирования. Установлен участок связывания кальмодулина в родопсинкиназе и показано, что участки для связывания рековерина и кальмодулина в молекуле родопсинкиназы не перекрываются. Впервые изучено совместное действие кальмодулина и рековерина на активность родопсинкиназы и экспериментально доказан факт синергизма в ингибировании родопсинкиназы этими Са2+-связывающими белками. Впервые идентифицирован участок связывания родопсина в молекуле родопсинкиназы и показано, что участки для связывания кальмодулина и родопсина в родопсинкиназе перекрываются. Предложена модель совместной Са2+-зависимой регуляции кальмодулином и рековерином светозависимого фосфорилирования родопсина под действием родопсинкиназы, основанная на конкуренции между Са2+связывающими белками и фотоактивированным родопсином за взаимодействие с родопсинкиназой.

Практическая ценность. Установление механизмов десенситизации зрительного пигмента родопсина в фоторецепторных клетках необходимо для понимания механизмов зрительной трансдукции и выяснения молекулярных механизмов зрения. Полученные результаты имеют большое значение и в более широком плане, поскольку фоторецепторная клетка служит удобной моделью для понимания регуляции процесса десенситизации других сопряжённых с Gбелками рецепторов, которые являются фармакологическими мишенями для значительного количества используемых в терапевтической практике лекарственных препаратов.

Апробация работы Материалы диссертации обсуждались на семинарах отдела сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ и были доложены на заседании кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ. Отдельные аспекты работы представлялись на XXV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, Россия, 2008), 13-й международной конференции по белкам сетчатки (Барселона, Испания, 2008), Европейской конференции по сетчатке-2009 (Ольденбург, Германия), 14-й Международной Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, Россия, 2010), 11-й конференции Европейского кальциевого сообщества (Варшава, Польша, 2010).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 – в рецензируемых научных журналах, отвечающих требованиям ВАК.

Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 21 рисунок и 3 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка литературы (185 ссылок).

Содержание работы 1. Са2+-зависимая регуляция родопсинкиназы кальмодулином К моменту начала настоящей работы были получены предварительные сведения, указывающие на способность Са2+-связывающего белка кальмодулина образовывать Са2+-чувствительный комплекс с родопсинкиназой (Levay et al., 1998), однако какие-либо данные о физиологической значимости образования этого комплекса в фоторецепторной клетке в литературе отсутствовали. Поэтому наша работа была начата с выяснения вопроса, влияет ли кальмодулин на фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

1.1. Изучение влияния кальмодулина на фосфорилирование родопсина Установлено, что в реконструированной системе, состоящей из отмытых мочевиной фоторецепторных мембран и очищенных препаратов кальмодулина и родопсинкиназы, уровень фосфорилирования фотовозбуждённого родопсина зависит от концентрации свободных ионов кальция ([Са2+]своб.) – он понижается при возрастании [Са2+]своб. от 10 нМ до 5 мкМ. Как следует из рис. 1А, Са2+зависимость ингибирования фосфорилирования родопсина кальмодулином носит кооперативный характер (коэффициент Хилла (n) равен 1,5 ± 0,1), а полумаксимальное ингибирование (IC50) проявляется при [Са2+]своб. = 0,36 ± 0,мкМ.





Рис. 1Б демонстрирует зависимость фосфорилирования родопсина родопсинкиназой от концентрации кальмодулина в реконструированной системе.

Видно, что (1) в отсутствие кальмодулина фосфорилирование родопсина не чувствительно к концентрации Са2+; (2) в присутствии EGTA уровень фосфорилирования родопсина максимален и не зависит от концентрации кальмодулина; (3) Рисунок 1. Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы кальмодулином в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине фоторецепторные мембраны и родопсинкиназу. А. Зависимость активности родопсинкиназы от [Ca2+]своб. в присутствии 30 мкМ кальмодулина () или в его отсутствие (). Б. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации кальмодулина при насыщающей концентрации [Ca2+]своб (200 мкМ, ) или в присутствии 1 мМ EGTA (). Точки на графиках вычислены как среднее ± стандартное отклонение по данным трёх независимых экспериментов.

в присутствии Са2+ уровень ингибирования фосфорилирования родопсина возрастает по мере повышения концентрации кальмодулина с полумаксимальным эффектом при концентрации кальмодулина, равной 14,1 ± 0,9 мкМ.

Таким образом, мы установили, что кальмодулин способен Са2+зависимым образом ингибировать фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой, и что для проявления ингибирующего эффекта кальмодулина не требуется каких-либо дополнительных белковых факторов.

1.2. Выявление участков связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы В предыдущем разделе было показано, что кальмодулин способен ингибировать родопсинкиназу Ca2+-зависимым образом. С учетом полученных нами результатов и литературных данных об образовании Са2+-зависимого комплекса между кальмодулином и родопсинкиназой можно ожидать, что ингибирование фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой, происходит благодаря взаимодействию кальмодулина с участком(-ами) родопсинкиназы, ответственным(-и) за выполнение ферментом своей функции - фосфорилирования фотовозбужденного родопсина. Поэтому далее мы провели поиск участков свя- Рисунок 2. Сенсограммы спектроскопии SPR, отражающие взаимодействие кальмодулина с рекомбинантными фрагментами родопсинкиназы, иммобилизованными на поперхности биосенсора: (А) N-концевой (N-RK, M1G183) и С-концевой (C-RK, I455-S561) регуляторные участки родопсинкиназы;

(Б) N-RK и его фрагменты, соответствующие остаткам M1-L102 и L102-G183;

(В) N-RK и его фрагменты, соответствующие последовательностям D100-V1и F125-K175. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение ко- торого в подвижной фазе отсутствовал (не закрашено) или присутствовал (закрашено черным) кальмодулин в концентрации 60 мкМ. Вставки в правом верхнем углу показывают относительную величину сигнала связывания, пропорциональную количеству связавшегося с фрагментами родопсинкиназы кальмодулина.

зывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы. Для решения поставленной задачи мы получили набор рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы и исследовали их способность взаимодействовать с кальмодулином с помощью биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Из рис. 2А следует, что во взаимодействии с кальмодулином принимает участие только N-концевой (M1-G183) регуляторный участок родопсинкиназы.

При этом, в указанном регуляторном участке родопсинкиназы содержатся низко- и высокоаффинный сайты для связывания кальмодулина, расположенные в пределах аминокислотных последовательностей M1-L102 и L102-G183, соответственно (рис. 2Б). С использованием перекрывающихся фрагментов D100-V1и F125-K175 мы показали, что расположенный внутри последовательности Рисунок 3. Определение кажущихся констант диссоциации (КD) комплексов кальмодулина с полноразмерным N-концевым регуляторным участком родопсинкиназы (N-RK, ) и с его фрагментами M1-L102 (), L102-G183 () и F125-K175 () методом SPRспектроскопии. Через проточные ячейки SPR-биосенсора, на которые были иммобилизованы указанные фрагменты, пропускали растворы кальмодулина в различных концентрациях (от до 150 мкМ) и регистрировали амплитуды SPR-сигнала связывания в стационарном состоянии. Измеренные амплитуды были нормированы и нанесены на график в зависимости от концентрации кальмодулина в подвижной фазе. Полученные значения KD приведены в табл. 1.

L102-G183 высокоаффинный участок связывания кальмодулина ограничен последовательностью 150-175 N-концевого домена родопсинкиназы (рис. 2В).

Стоит отметить, что все перечисленные фрагменты родопсинкиназы, подобно полноразмерной молекуле фермента, взаимодействовали с кальмодулином только в присутствии Са2+ (данные не приведены).

Для количественной характеристики термодинамических параметров взаимодействий фрагментов родопсинкиназы с кальмодулином мы определили равновесные константы диссоциации (KD) комплексов кальмодулина с теми фрагметами родопсинкиназы, которые продемонстрировали к нему значииельное сродство (рис. 3, табл. 1). Как видно из таблицы 1, значения KD комплексов кальмодулина с различными фрагментами N-концевого регуляторного участка родопсинкиназы уменьшаются с размером фрагмента. На основании полученных данных можно заключить, что в составе полноразмерного N-концевого регуляторного участка родопсинкиназы сайт связывания кальмодулина менее доступен для взаимодействия с кальмодулином, чем в составе короткого фрагмента 125-175.

Ранее нами было показано, что Таблица 1. Равновесные константы диссоциации комплексов кальмодулина родопсинкиназа образует Са2+с фрагментами родопсинкиназы.

чувствительный комплекс с Са2+Фрагмент KD, мкМ M1-G183 (N-RK) 63 ± связывающим белком рековерином, и M1-L102 54 ± в этом взаимодействии принимают L102-G183 23 ± участие аминокислотные остатки F125-K175 17,0 ± 1,Кажущиеся равновесные константы диссофермента, расположенные в последоциации (KD) были определены с помощью равновесного анализа как концентрации каль- вательности 1-25 родопсинкиназы модулина, необходимые для полунасыщения (Komolov et al., 2009). Поскольку фра- сигнала связывания.

гмент 1-102 родопсинкиназы оказался способен взаимодействовать и с кальмодулином (рис. 2Б), то можно было ожидать, что низкоаффинный участок связывания кальмодулина перекрывается с таковым для рековерина, что приводило бы к конкуренции между двумя этими белками за связывание с мишенью. Для подтверждения Рисунок 4. Сенсограммы SPR, отраили опровержения этой гипотезы, мы жающие взаимодействие кальмодулина (CaM) и рековерина (Rc) с иммобилизоизучили способность кальмодулина ванным на сенсорном чипе фрагментом родопсинкиназы M1-S25. Измерения вы- взаимодействовать с рековеринполнены при [Са2+]своб. = 2 мМ. Конценсвязывающим участком родопсинкитрация Са2+-связывающих белков составляла 40 мкМ. Полоса над сенсограммами назы. Из рис. 4 следует, что в отличие обозначает период времени, в течение коот рековерина, кальмодулин не споторого в подвижной фазе отсутствовали (не закрашено) или присутствовали (засобен взаимодействовать с рекомбикрашено черным) рековерин или кальмодулин.

нантным фрагментом родопсинкиназы 1-25. Таким образом, участки связывания кальмодулина и рековерина в родопсинкиназе не перекрываются.

Подводя итог текущему разделу настоящей работы можно заключить, что кальмодулин образует Са2+-чувствительный комплекс с родопсинкиназой посредством двух различных сайтов в молекуле фермента: низкоаффинного (KD = 54 мкМ) и высокоаффинного (KD = 17 мкМ), которые локализованы в последовательностях 26-102 и 150-175 в N-концевом регуляторном домене родопсинкиназы. Поскольку KD для низкоафинного участка связывания более чем в 5 раз превышает физиологическую концентрацию кальмодулина в фоторецепторных клетках (около 10 мкМ), в дальнейшем мы не рассматривали этот участок родопсинкиназы как имеющий физиологическую значимость в контексте Са2+зависимой регуляции фермента.

В заключение главы, посвященной выяснению механизма Са2+/кальмодулин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, суммируем основные выводы, которые могут быть сделаны на основе приведенных экспериментов: кальмодулин ингибирует родопсинкиназу Са2+-зависимым образом; в молекуле родопсинкиназы, помимо сайта для связывания рековерина, присутствуют низкоаффинный и высокоаффинный сайты для связывания кальмодулина, при этом сайты для связывания кальмодулина и рековерина не перекрываются, что даёт основание предположить, что оба этих Са2+-связывающих белка могут одновременно взаимодействовать с родопсинкиназой и ингибировать её активность.

2. Са2+-зависимая регуляция родопсинкиназы рековерином и кальмодулином В предыдущей главе мы показали, что в присутствии Са2+ кальмодулин ингибирует фосфорилирование родопсина, при этом участки связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы не перекрываются с сайтом для связывания другого Са2+-чувствительного ингибитора фермента – рековерина. В настоящем разделе мы изучили совместное влияние кальмодулина и рековерина на фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

2.1. Изучение Са2+-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина в присутствии кальмодулина и рековерина Рис. 5А демонстрирует, что в реакции фосфорилирования родопсина эффективность ингибирования родопсинкиназы эквимолярной смесью кальмодульна и рековерина выше по сравнению с эффективностью отдельно взятых белков: значения IC50 для эквимолярной смеси кальмолулина и рековерина, а также кальмодулина и рековерина по отдельности составили 4,6 ± 0,2, 14,1 ± 0,и 5,8 ± 0,7 мкМ, соответственно. Полученный результат можно объяснить тем, что кальмодулин и рековерин связываются с различными участками родопсинкиназы, и ингибирование фермента происходит без конкуренции между Са2+связывающими белками, что создает условия для проявления синергизма при ингибировании фосфорилирования родопсина.

Рисунок 5Б показывает Са2+-зависимость совместного действия кальмодулина и рековерина на активность родопсинкиназы. Как следует из результатов эксперимента, кальмодулин оказывает ингибирующее действие при более низких концентрациях свободного Са2+, чем рековерин. Полумаксимальное ингибирование родопсинкиназы кальмодулином достигалось при 0,36 ± 0,03 мкМ концентрации Са2+, в то время как ингибирующий эффект рековерина был полумаксимальным при 1,4 ± 0,1 мкМ Са2+. Совместное ингибирование родопсинкиназы 30 мкМ смесью кальмодулина и рековерина наблюдалось при полумаксимальной концентрации Са2+, равной 1,07 ± 0,15 мкМ, что близко к таковой для рековерина. Следует отметить, что профиль кривой Са2+-зависимости совместного ингибирования родопсинкиназы кальмодулином и рековерином также оказался близок по форме к Са2+-зависимости ингибирования родопсинкиназы одним рековерином (см. рис. 5Б). Этот факт свидетельствует о том, что Са2+чувствительность совместного действия эквимолярной смеси кальмодулина и рековерина на родопсинкиназу ограничивается нижней границей Са2+чувствительности рековерина.

Полученный результат можно объяснить, если предположить, что связывание рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой носит последовательный характер и имеет место аллостерическая регуляция родопсинкиназы двумя Са2+- Рисунок 5. Синергическое ингибирование родопсинкиназы кальмодулином и рековерином в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине фоторецепторные мембраны и родопсинкиназу. А. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации кальмодулина (), рековерина () или их эквимолярной смеси () при насыщающей [Са2+]своб. (200 мкМ). Б. Зависимость активности родопсинкиназы в присутствии кальмодулина (), рековерина () или их эквимолярной смеси () от [Са2+]своб. Концентрация каждого Са2+-связывающего белка по отдельности или в смеси составляла 30 мкМ.

связывающими белками: связывание рековерина с родопсинкиназой изменяет конформацию N-концевого домена родопсинкиназы таким образом, что приводит к экспонированию участка для связывания кальмодулина и создает необходимые условия для образования стабильного комплекса. Следует отметить, что одним из подтверждений высказанной гипотезы являются представленные в разделе 1.2. результаты, свидетельствующие об увеличении сродства кальмодулина к фрагменту родопсинкиназы, содержащему высокоаффинный участок связывания кальмодулина, при укорочении этого фрагмента: 63 мкМ для фрагмента 1-183 против 17 мкМ для фрагмента 125-175 (рис. 3 и табл. 1).

Для проверки нашего предположения о наличии аллостерической регуляции при взаимодействии кальмодулина и рековерина с родопсинкиназой, на следующем этапе нашей работы мы провели теоретические расчёты, позволяющие количественно описать механизм совместного ингибирующего действия кальмодулина и рековерина на фосфорилирование родопсина.

2.2. Теоретическая модель механизма последовательного связывания рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой Представленные в предыдущих разделах работы результаты позволили нам разработать математическую модель совместной регуляции кальмодулином и рековерином Са2+-зависимого фосфорилирования родопсина, в основу которой были положены следующие экспериментально подтвержденные данные: (1) кальмодулин и рековерин имеют неперекрывающиеся между собой участки связывания в молекуле родопсинкиназы, (2) ингибирующая эффективность эквимолярной смеси кальмодульна и рековерина выше по сравнению с эффективностью отдельно взятых белков и (3) Са2+-чувствительность совместного действия эквимолярной смеси кальмодулина и рековерина на родопсинкиназу ограничивается нижней границей Са2+-чувствительности рековерина. С учетом полученных данных схема химических равновесий, описываемых изучаемую систему, может быть представлена следующим образом:

[ [1] [ [2] На представленной схеме Сa обозначает ион кальция, Rc и CaM – Са2+связанные состояния рековерина и кальмодулина, соответственно, Rc0 и CaM0 – их бескальциевые формы. Каждое из равновесий характеризуется своей собственной равновесной константой ассоциации (см. табл. 2).

Аппрооксимация экспериментальных данных, показанных на рис. 5А и 5В, с использованием модели Хилла для аллостерического связывания лигандов позволила определить значения констант и стехиометрических соотношений на схемах [1] и [2]. Так, константны KRc и KCaM, характеризующие связывание рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой, соответственно, были приняты Таблица 2. Параметры равновесий, описывающих взаимодействия между родопсинкиназой, рековерином, кальмодулином и ионами кальция.

Равновесная константа ассоциации Коэффициент Хилла Обозначение Значение, M-1 Обозначение Значение KRc 1,7·105 n 1,KСaM 7,1·104 m 1,KRc CaM 2,7·105 - - KCaM Rc 1,1·105 - - KRcCa 7,4·105 v 1,KCaMCa 2,8·106 w 1,Параметры схем [1] и [2] были вычислены при аSPRоксимации уравнением Хилла экспериментальных данных, показанных на рис. 5А и 5Б, за исключением значений параметров KRc CaM и KCaM Rc, которые были оценены при анализе данных, приведённых на рис. 5А, принимая [Rc] = [CaM] = 2,3 мкМ.

равными IC50 зависимостей активности родопсинкиназы от концентрации рековерина и кальмодулина, а стехиометрические коэффициенты n и m – как коэффициенты Хилла этих зависимостей (рис. 5А). Аналогично, значения параметров KRcCa и KCaMCa, а также стехиометрические коэффициенты v и w, характеризующие связывание ионов кальция с рековерином и кальмодулином, соответственно, были определены из Са2+-зависимостей активности родопсинкиназы в присутствии рековерина и кальмодулина (рис. 5Б).

Основываясь на экспериментальных данных, приведённых на рис. 5А, и приняв равновесные концентрации кальмодулина и рековерина в системе равными 2,3 мкМ, путём комбинации и преобразования математических выражений для констант равновесия мы рассчитали значения констант KRc CaM и KCaM Rc из схемы [1] (табл. 2). Согласно проведённым расчётам, связывание Са2+/рековерина с родопсинкиназой способствует последующему связыванию этого комплекса с Са2+/кальмодулином, что выражается в повышении значения константы равновесия KCaM Rc по сравнению с KCaM в 1,55 раза (табл. 2). Таким образом, результаты наших расчётов подтверждают, что рековерин и кальмодулин могут действовать согласованным образом, взаимно усиливая ингибирование родопсинкиназы.

Подводя итог второму разделу настоящей работы, можно сделать вывод, что кальмодулин и рековерин синергически связываются с родопсинкиназой и ингибируют её активность, при этом взаимодействие родопсинкиназы с этими Са2+-связывающими белками носит последовательный характер: на первой стадии связывается рековерин, что способствует дальнейшему связыванию с образующимся комплексом кальмодулина.

3. Изучение роли кальмодулин-связывающего участка в функционировании родопсинкиназы На основании первичной структуры и гомологии с другими протеинкиназами из семейства GRK в молекуле родопсинкиназы выделяют три функциональных домена: центральный каталитический домен, и фланкирующие его N- и С-концевой регуляторные домены. Несколько ранее опубликованных работ показали, что регуляторные домены родопсинкиназы могут быть вовлечены в распознавание этим ферментом своего субстрата - фотовозбуждённого родопсина.

Однако, несмотря на интенсивное исследование механизмов фосфорилирования родопсина родопсинкиназой, до сих пор точно не установлены конкретные аминокислотные остатки, формирующие сайт для связывания родопсина в родопсинкиназе. Представленные в разделе 1.2. результаты по связыванию кальмодулина с N-концевым регуляторным доменом родопсинкиназы позволили предположить, что механизм ингибирования фосфорилирования родопсина кальмодулином может состоять в конкуренции между кальмодулином и фотовозбуждённым родопсином за связывание с N-концевым регуляторным участком родопсинкиназы. Чтобы проверить высказанное предположение, мы провели сравнение способности различных фрагментов родопсинкиназы взаимодействовать с фотовозбуждённым родопсином, использовав метод спектроскопии SPR.

Как следует из рис. 6, среди фрагментов родопсинкиназы, охватывающих N-концевой (N-RK, M1-G183), каталитический (Cat-RK, E184-D454) и Сконцевой (C-RK, I455-S561) функциональные домены родопсинкиназы, взаимодействовать с фотовозбуждённым родопсином способен только фрагмент N-RK, содержащий участок связывания кальмодулина. Для дальнейшей локализации участка связывания родопсина в N-концевом домене родопсинкиназы нами была получена серия фрагментов этого домена и изучена их способность взаимодействовать с родопсином методом спектроскопии SPR.

Рис. 7А демонстрирует, что связывание фотоРисунок 6. Сенсограммы спектроскопии SPR, отвозбуждённого родопсина ражающие взаимодействие фотовозбуждённого происходило в значительродопсина с N-концевым (N-RK, M1-G183), каталитическим (Cat-RK, E184-D454) и С-концевым ной степени только с фраг(C-RK, I455-S561) функциональными доменами родопсинкиназы. Полоса над сенсограммами обо- ментом L102-G183, а связначает период времени, в течение которого в подзывание с фрагментом M1вижной фазе отсутствовали (не закрашено) или присутствовали (закрашено черным) фрагменты. родопL102 было незначительным.

синкиназы.

Следовательно, именно фрагмент 102-183, содержащий кальмодулин-связывающий участок, отвечает за связывание родопсинкиназы с фотовозбуждённым родопсином. Изучение способности взаимодействовать с родопсином перекрывающихся фрагментов D100V150 и F125-K175, охватывающих последовательность 102-183, показало (рис.

7Б), что из этих двух фрагментов только последний взаимодействует с родопсином. Все изложенные выше результаты были также подтверждены альтернативным методом – с помощью светозависимого аффинного соосаждения солюбилизированного родопсина и фрагментов родопсинкиназе на глутатионсефарозе (данные не приведены).

Следует также отметить, что в выявленной нами последовательности родопсинкиназы F150-K175, узнающей фотовозбуждённый родопсин, содержится большая часть аминокислотных остатков Y167, Q173, W174 и L177. Мутации по аналогичным остаткам в протеинкиназах GRK5 и GRK6, гомологичных родопсинкиназе, как недавно было показано (Baameur et al., 2010), приводят к потере Рисунок 7. Сенсограммы спектроскопии SPR, отражающие взаимодействие фотовозбуждённого родопсина с фрагментами N-концевого регуляторного участка родопсинкиназы. Приведены зависимости резонансного сигнала связывания от времени, полученные при пропускании 6,5 мкМ солюбилизированного фотовозбуждённого родопсина через проточные ячейки с иммобилизованными N-концевым регуляторным участком родопсинкиназы (N-RK, аминокислотные остатки M1-G183) и его фрагментами M1-L102 и L102-G183 (А) и D100-V150 и F125-K175 (Б). Сигнал с контрольной поверхности, покрытой GST, был вычтен из сигналов с остальных дорожек. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствовал (не закрашено) или присутствовал (закрашено черным) родопсин.

способности этих ферментов фосфорилировать активированные рецепторы. Поэтому с учётом литературных данных и представленных в настоящем разделе результатов можно заключить, что аминокислотные остатки родопсинкиназы Y167, Q173, W174 и L177 принимают участие во взаимодействии родопсинкиназы с фотовозбуждённым родопсином.

Таким образом, на основании результатов, представленных в настоящей главе, можно сделать вывод о том, что высокоаффинный участок связывания кальмодулина, расположенный в молекуле родопсинкиназы со 150 по 175 аминокислотные остатки, принимает участие во взаимодействии фермента с родопсином.

Выводы 1. Кальмодулин Са2+-зависимым образом ингибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

2. Участки связывания рековерина и кальмодулина в родопсинкиназе не перекрываются и расположены в пределах 1-25 и 150-175 аминокислотных остатков фермента, соответственно.

3. Связывание рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой происходит последовательно: сначала образуется комплекс родопсинкиназы с рековерином, с которым затем происходит связывание кальмодулина.

4. Кальмодулин и рековерин синергически ингибируют фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

5. Участки связывания родопсинкиназы с родопсином и кальмодулином перекрываются и локализованы в пределах последовательности 150-175 аминокислотных остатков фермента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Komolov K.E., Senin I.I., Kovaleva N.A., Christoph M.P., Churumova V.A., Grigoriev I.I., Akhtar M., Philippov P.P., Koch K.W. (2009) Mechanism of rhodopsin kinase regulation by recoverin. J. Neurochem., 110, 72-79.

2. Сенин И.И., Тихомирова Н.К., Чурюмова В.А., Григорьев И.И., Колпакова Т.В., Зинченко Д.В., Филиппов П.П., Зерний Е.Ю. (2011) Последовательности двух иммунодоминантных эпитопов рековерина принимают участие в Са2+/рековерин-зависимом ингибировании фосфорилирования родопсина.

Биохимия, 76, 406-413.

3. Zernii E.Y., Komolov K.E., Permyakov S.E., Kolpakova T., Dell'orco D., Poetzsch A., Knyazeva E.L., Grigoriev I.I., Permyakov E.A., Senin I.I., Philippov P.P., Koch K.W. (2011) Involvement of recoverin C-terminal segment in recognition of the target enzyme rhodopsin kinase. Biochem. J., 435, 441-450.

4. Grigoriev I.I., Senin I.I., Tikhomirova N.K., Komolov K.E., Permyakov S.E., Zernii E.Y., Koch K.W., Philippov P.P. (2012) Synergetic effect of recoverin and calmodulin on regulation of rhodopsin kinase. Front. Mol. Neurosci., 5, 28.

5. Григорьев И.И., Ковалева Н.А., Комолов К.Е., Чурюмова В.А., Тихомирова Н.К., Сенин И.И. Роль N-концевого домена родопсинкиназы в механизме ее функционирования. Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Химия», подсекция «Цикл наук о живом», стр. 268.

6. Komolov K.E., Senin I.I., Kovaleva N.A., Christoph M., Churumova V.A., Grigoriev I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. Mechanism of rhodopsin kinase regulation by recoverin. 13th International conference on retinal proteins. Barcelona, June 15 – 19, 2008, p.101.

7. Konstantin E. Komolov, Ivan I. Senin, Nadezda A. Kovaleva, Mathias Christoph, Valeriya A. Churumova, Ilya I. Grigoriev, Pavel P. Philippovm Karl-Wilhelm Koch. Turning off light-activated rhodopsin in rod cells – critical role of a ternary protein complex. European Retina Meeting 2009, October 8-10, Oldenburg, Germany. SP2-P09.

8. Ковалева Н.А., Григорьев И.И., Чурюмова В.А., Сенин И.И., Филиппов П.П.

Изучение функциональных свойств рековеринсвязывающего участка родопсинкиназы. 14-я Международная Пущинская Школа-Конференция молодых учёных «Биология – наука XXI века», апрель 2010, Пущино. Сборник тезисов, т.1., стр. 32.

9. Т.В. Колпакова, Е.Ю. Зерний, Е.Л. Князева, С.Е. Пермяков, Е.А. Пермяков, Д.В. Зинченко, И.И. Григорьев, И.И. Сенин, П.П. Филиппов. С-концевой сегмент в регуляции функционирования нейронального кальциевого сенсора рековерина. 14-я Международная Пущинская Школа-Конференция молодых учёных «Биология – наука XXI века», апрель 2010, Пущино. Сборник тезисов, т.1., стр. 33.

10. Ковалева Н.А., Чурюмова В.А., Григорьев И.И. Механизм действия рековерина в реакции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой. Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2010», секция «Биоинженерия и биоинформатика», подсекция «Физико-химическая биология».

11. Колпакова Т.В., Зерний Е.Ю., Григорьев И.И., Сенин И.И., Зинченко Д.В., Пермяков С.Е., Князева Е.Л. Роль С-концевого сегмента в регуляции Са2+зависимых свойств рековерина. Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2010», секция «Химия», подсекция «Химия живых систем, нанобиоматериалы и нанобиотехнологии».

12. Tatiana V. Kolpakova, Evgeni Yu. Zernii, Konstantin E. Komolov, Sergei E.

Permyakov, Ekaterina L. Knyazeva, Dimitri V. Zinchenko, Ilya I.Grigoriev, Eugene A. Permyakov, Ivan I. Senin, Karl-W. Koch, Pavel P. Philippov. C-terminal segment of recoverin as a built-in modulator of neuronal calcium sensor functioning. 11th Meeting of the European Calcium Society, Warsaw, Poland, September 6th–9th, 2010. Abstracts. Session 4: Calcium signaling. P4.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.