WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

 

БУШИНА ЕКАТЕРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

Новые высокоэффективные ферментные препараты для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих субстратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium

03.01.06 – биотехнология (в том числе нанобиотехнология)

02.00.15 – кинетика и катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

МОСКВА – 2012

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии

Химического факультета Московского государственного университета

имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Синицын Аркадий Пантелеймонович

кандидат химических наук Рожкова Александра Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор,

зав. лабораторией физиологически активных биополимеров

Федерального государственного бюджетного учреждения науки

Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова

Российской академии наук

Ямсков Игорь Александрович

доктор биологических наук, профессор,

зав. лабораторией молекулярных основ биотрансформаций

Федерального государственного бюджетного учреждения науки

Института биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук

Королева Ольга Владимировна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

РАН, г. Пущино

       Защита состоится  « 25 »  декабря  2012 года  в  15oo  часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

       С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

       Автореферат разослан  « 23 » ноября  2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, 

кандидат химических наук       Сакодынская И.К.

Актуальность темы. В настоящее время существует широкий спектр полезных продуктов, производимых на основе возобновляемого сырья растительного происхождения. Так, из растительных материалов с высоким содержанием пектиновых веществ производят различные пищевые продукты, например, сахар, вина, плодово-овощные соки и пюре, ягодные морсы и т.д. Применение ферментных препаратов, обладающих высокой гидролитической способностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим субстратам, позволяет увеличить выход целевых конечных продуктов, способствует повышению качества и улучшению их органолептических показателей.

Ферментативный гидролиз также является ключевым звеном в процессе переработки отходов пищевой промышленности. Полученные в результате гидролиза простые сахара в последующих стадиях используют в качестве основы для получения различных полезных продуктов - топлива (метана, этанола), исходных соединений для получения полимеров (изопрена, янтарной кислоты), кормовых добавок (ветеринарных антибиотиков, аминокислот, кормовых дрожжей, ферментных препаратов и пр.). Отметим, что в последние десятилетия особое значение приобрела концепция переработки природных ресурсов, реализация которой подразумевает снижение выбросов в окружающую среду отходов производства, более рациональный подход к использованию растительного сырья - извлечение из него максимума полезных продуктов.

Наиболее многотоннажным отходом пищевой промышленности России является свекловичный жом – отход производства сахара из сахарной свёклы. По данным Росстата за 2009 год, только малая его часть - 13 %, используется как кормовая добавка, большая же часть жома остается невостребованной. Существующие избытки свекловичного жома целесообразно использовать для получения различных полезных продуктов.

Одним из основных этапов переработки отходов растительного происхождения является превращение сложных полисахаридов клеточной стенки растений в простые сахара. Эффективность проведения этого процесса определяет выход конечного продукта и экономическую целесообразность процесса переработки растительного сырья в целом. Основу клеточной стенки растений с высоким содержанием пектиновых веществ, к которым, в частности, относится сахарная свёкла, составляют волокна целлюлозы, покрытые слоем гемицеллюлоз. Пространство между волокнами заполняют пектиновые вещества, снижающие доступ соответствующих ферментов к целлюлозе и гемицеллюлозам. Следовательно, комплекс ферментов для эффективного превращения такого сырья в простые сахара помимо целлюлаз и гемицеллюлаз, обеспечивающих гидролиз соответствующих полисахаридов, должен также содержать пектиназы, способствующие повышению эффективности гидролиза за счет разрушения пектиновых веществ.

Коммерческие ферментные препараты, применяемые по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам, можно разделить на две категории. К первой принадлежат ферментные препараты с высоким содержанием пектолитических ферментов, используемые при производстве пищевых продуктов и обладающие относительно невысокой гидролитической способностью по отношению к целлюлозе и гемицеллюлозам. Ко второй категории относятся ферментные препараты целлюлаз и гемицеллюлаз, предназначенные для гидролиза растительной биомассы с низким содержанием пектиновых веществ и не обеспечивающие высокоэффективный гидролиз пектин- и целлюлозосодержащих материалов вследствие вышеупомянутых особенностей их строения. Ферментные препараты, содержащие в оптимальном соотношении пектиназы, целлюлазы и гемицеллюлазы, на рынке не представлены. Согласно литературным данным, гидролиз пектин- и целлюлозосодержащих отходов пищевой промышленности, например, выжимок различных цитрусовых, проводят смесью ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз, подбирая их оптимальное соотношение для каждого конкретного вида сырья. В условиях современного биотехнологического производства приготовление смесей ферментных препаратов является нецелесообразным, поскольку вносит дополнительную стадию в технологическую схему переработки отходов и увеличивает расходы.

В ходе систематических исследований, проводимых в нашей лаборатории, было показано, что комплекс внеклеточных ферментов гриба Penicillium verruculosum по гидролитической способности в отношении лигноцеллюлозных материалов превосходит ферментный комплекс гриба Trichoderma reseei, наиболее часто использующийся в качестве основы для производства коммерческих ферментных препаратов целлюлаз. Кроме того, было показано, что гриб Penicillium canescens секретирует эффективный комплекс гемицеллюлаз. Однако пектолитические ферменты являются минорными компонентами комплекса внеклеточных ферментов как P.canescens, так и P.verruculosum. Следовательно, создание продуцентов ферментов-карбогидраз (пектиназ и других недостающих ферментов) на основе штаммов грибов P.canescens и P.verruculosum с последующим получением ферментных препаратов оптимального состава на их основе, обладающих высокой гидролитической способностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось получение высокоактивных комплексных ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium для гидролиза природных пектин- и целлюлозосодержащих субстратов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

  • клонировать гены целевых ферментов,
  • осуществить трансформацию штаммов-реципиентов грибов рода Penicillium,
  • подобрать оптимальное соотношение компонентов ферментного комплекса,
  • определить гидролитическую способность новых ферментных препаратов, полученных на основе созданных штаммов-продуцентов, по отношению к природным пектин- и целлюлозосодержащим субстратам на примере свекловичного жома, яблочных и цитрусовых выжимок,
  • изучить биохимические свойства и определить компонентный состав полученных ферментных препаратов.

Научная новизна. Показана принципиальная возможность получения штаммов-продуцентов на основе грибов рода Penicillium, секретирующих несколько целевых ферментов в заданном соотношении, путем котрансформации исходного штамма-реципиента смесью двух и трех целевых плазмид совместно с трансформирующей плазмидой и последующего скрининга полученных трансформантов.

Изучены биохимические свойства и компонентный состав новых ферментных препаратов, полученных на основе созданных штаммов-продуцентов и обладавших максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому, яблочным и цитрусовым выжимкам. Показано, что состав новых ферментных препаратов соответствует оптимальному составу смеси ферментов, обеспечивающей максимальный выход глюкозы или арабинозы при гидролизе свекловичного жома.

Практическая значимость работы. На основе созданных штаммов-продуцентов получены новые ферментные препараты, обладающие высокой гидролитической способностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам. Так, ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов Penicillium canescens, эффективнее (26-38% по выходу арабинозы при гидролизе свекловичного жома) по сравнению с ферментным препаратом на основе реципиентного штамма. В то время как ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum, эффективнее (20-30% по выходу глюкозы при гидролизе свекловичного жома) по сравнению с ферментным препаратом исходного штамма BI.  Гидролитическая способность новых ферментных препаратов в 4,5 и 4 раза выше по сравнению с ферментным препаратом на основе реципиентного штамма при гидролизе яблочных и цитрусовых выжимок, соответственно.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: международной конференции «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2009), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2010” (Москва, 2010), II Международной конференции Российского Химического общества им. Д.И.Менделеева “Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов” (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 116 источников. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включает 55 рисунков и 23 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы приведены данные об особенностях структуры растительных материалов с высоким содержанием пектиновых веществ, примеры технологических процессов ферментативной переработки растительного сырья. Подробно описаны состав и свойства комплекса внеклеточных ферментов грибов P.verruculosum и P.canescens, а также возможности их применения в качестве штаммов-реципиентов в ходе создания продуцентов различных практически значимых ферментов. Заключительные разделы обзора литературы посвящены обсуждению методов получения грибных рекомбинантных штаммов-продуцентов.

Экспериментальная часть содержит описание методов, использованных в работе, а также субстратов, реактивов, плазмид, ферментов и ферментных препаратов.

В последующих главах изложены результаты исследований и их обсуждение.

1. Создание продуцентов целевых ферментов

Клонирование генов целевых белков. Ген пектинлиазы А (pelA) из P.canescens был клонирован в векторы pXEGuniversal, обеспечивающий экспрессию гена pelA под контролем индуцибельного промотора ксиланазы А (P.canescens), и pCBH, обеспечивающий экспрессию гена pelA под контролем индуцибельного промотора целлобиогидролазы I (P.verruculosum). В результате клонирования гена pelA были получены кольцевые плазмиды pRN_PelA и pBI_PelA, которые обеспечивали интеграцию гена pelA в хромосому грибов P.canescens и P.verruculosum, соответственно. Остальные кольцевые плазмиды (pRN_Glu, pRN_EGII, pBGP, pRN_EnPG, pRN_Abn, pBI_Glu – см. рис. 1-2) были получены ранее в нашей лаборатории.

На рис. 1 и 2 приведены схемы экспрессионных кассет, обеспечивающих экспрессию целевых ферментов.

Рисунок 1. Схемы экспрессионных кассет для трансформации штамма гриба P.canescens RN3-11-7 niaD(-). Голубым цветом обозначены промоторные области, красным цветом – сигнальные пептиды, зеленым цветом - целевые гены, желтым цветом – терминаторные участки генов ксиланазы (xylA), β-галактозидазы (bgaS) и пектинлиазы А (pelA) P.canescens,  β-глюкозидазы (bglI), эндо-1,4--полигалактуроназы (pga) и эндо-1,5--арабиназы (abnA) A.niger, эндо-1,4-β-глюканазы III (eglIII) и эндо-1,4-β-глюканазы II (eglII) P.verruculosum.

В наборе экспрессионных кассет, предназначенных для трансформации штамма-реципиента гриба P.canescens, представлены структуры, в составе которых гены целевых белков находятся под контролем одного из двух промоторов – β-галактозидазного (bgaS) или ксиланазного (xylA). Например, ген pelA из P.canescens состыкован как с промотором xylA (плазмида pRN_PelA), так и промотором bgaS (плазмида pBGP), ген эндо-1,4--полигалактуроназы (pga) из A.niger в составе плазмиды pRN_EnPG находится под контролем bgaS промотора, в то время как гены эндо-1,5--арабиназы (abnA) из A.niger (плазмида pRN_Abn), ген эндо-1,4--глюканазы eglII из P.verruculosum (плазмида pRN_EGII) и ген -глюкозидазы (bglI) из A.niger (плазмида pRN_Glu) – под xylA промотором. Секреция целевых белков в культуральную жидкость (КЖ) трансформантов гриба P.canescens обеспечивалась сигнальным пептидом целевого белка в случае экспрессионных кассет pRN_Glu, pRN_EGII и pRN_Abn, а также β-галактозидазным сигнальным пептидом в остальных случаях (см. рис. 1).

Экспрессионные кассеты для трансформации штамма-реципиента P.verruculosum (см. рис. 2) содержат ген соответствующего зрелого белка и последовательности, кодирующие промоторную и терминаторную области целлобиогидролазы I (cbhI), а также сигнальный пептид пектинлиазы А в случае плазмиды pPel A (pelA SS) и -глюкозидазы в случае плазмиды pBI_Glu (bglI SS).

Рисунок 2 Схемы экспрессионных кассет для трансформации штаммов гриба P.verruculosum BI-537 niaD(-). Голубым цветом обозначены промоторные области, красным цветом – сигнальные пептиды, зеленым цветом - целевые гены, желтым цветом терминаторные участки генов пектинлиазы А (pelA) P.canescens,  β-глюкозидазы (bglI) A.niger, целлобиогидролазы I (cbhI) P.verruculosum.

Трансформация штаммов-реципиентов P.canescens RN3-11-7 и P.verruculosum BI с использованием CaCl2/PEG-метода была проведена одной или комбинацией двух и трех целевых плазмид совместно с котрансформирующей плазмидой pSTA10, обеспечивающей комплиментацию дефектного гена нитратредуктазы в штамме-реципиенте. Общее количество целевых плазмид, используемых для трансформации в равных соотношениях, составляло 10 мкг на 1 мкг плазмиды pSTA10. Сочетания трансформированных целевых плазмид, а также количество клонов, полученных в результате трансформации, приведены в табл. 1.

Первичный скрининг трансформантов. В КЖ трансформантов серии RN_PEB (P.canescens), BI_P и BI_PB (P.verruculosum) были определены концентрация белка, целевые и базовые активности. Под целевыми подразумевались активности пектинлиазы А (ПЕЛ) для серий трансформантов RN_PEB, BI_P и BI_PB, β-глюкозидазы (БГЛ) в случае RN_PEB и BI_PB, эндо-1,4-β-глюканазы II (ЭГ) для трансформантов серии RN_PEB. Базовыми активностями являлись активности ферментов целлюлолитического комплекса P.verruculosum - целлобиогидролазы (ЦБГ) и ЭГ, а также активность ксиланазы P.canescens (КСИЛ).

Таблица 1. Результаты трансформации наборами целевых конструкций.

Штамм-реципиент

Комбинация трансформируемых конструкций

Название серии трансформантов

Кол-во полученных трансформантов

P.canescens RN3-11-7

pRN_βGlu, pRN_EGII, pBGP

RN_PEB

48

pRN_βGlu, pRN_EGII, pRN_PelA

82

pRN_EnPG, pRN_PelA

RN_PP

124

pRN_Abn

RN_A

110

pRN_Abn, pRN_PelA

RN_AP

95

pRN_Abn, pRN_EnPG, pRN_PelA

RN_AEP

130

P.verruculosum BI

pBI_PelA

BI_P

98

pBI_PelA, pBI_βGlu

BI_PB

72

На основании полученных данных для трансформантов серии RN_PEB был отобран ряд штаммов, которые показали увеличение активности ПЕЛ, ЭГ и БГЛ активностей по сравнению с исходным штаммом P.canescens RN3-11-7.

Одним из важных факторов при отборе штаммов-продуцентов из серии BI_P и BI_PB являлось сохранение в составе КЖ трансформантов активностей целлюлолитического комплекса - ЦБГ и ЭГ. Таким образом, среди трансформантов на основе P.verruculosum были выбраны штаммы-продуценты, в КЖ которых активности ПЕЛ (в  случае серии трансформантов BI_P) и ПЕЛ и БГЛ (BI_PB) были существенно выше по сравнению с исходным штаммом-реципиентом, а активности целлюлолитических ферментов сохранялись на максимально высоком уровне.

Остальные трансформанты (серии RN_PP, RN_A, RN_AP, RN_AEP) были анализированы методом ПЦР с использованием геномной ДНК в качестве матрицы, что позволило упростить трудоемкую стадию первичного скрининга, основанного на определении активности ферментов в КЖ трансформантов. Например, доказательством факта произошедшей встройки гена гетерологичной abnA в геномную ДНК трансформантов серии RN_AЕР (см. рис. 3) являлось наличие полосы ~1500 п.н. в амплификате, полученном на основе геномной ДНК трансформантов с использованием праймеров, специфичных гену abnA. В качестве контроля выступали исходная плазмида pRN_Abn (Pr) и геномная ДНК штамма-реципиента (RN).

Штаммы, полученные в результате трансформации штамма-реципиента P.canescens RN3-11-7 комбинацией двух и трех плазмид были скринированы поэтапно. Например, в начале трансформанты серии RN_PP были скринированы на наличие гена pelA, а затем был проведен анализ трансформантов со встроенным геном pelA на наличие гена эндо-1,4--полигалактуроназы (pga).

Поскольку геномная ДНК P.canescens содержала ген pelA, то в ходе ПЦР, предназначенного для скрининга трансформантов на наличие гена pelA, использовались праймеры, комплементарные промотору xylA и 3’-концу гена pelA, в результате чего проходила амплификация именно встроенных олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих гену pelA.

Рисунок 3 Электрофореграммы образцов ДНК, полученных в результате скрининга трансформантов серии RN_AEP на наличие гена abnA с использованием метода ПЦР (в качестве матрицы выступали геномная ДНК трансформантов - обозначены цифрами 25-72 и штамма-реципиента - RN, а также плазмида pRN_Abn с геном abnA - Pr).

Тестирование штаммов-продуцентов на стабильность секреции целевых белков. Отобранные в результате первичного скрининга штаммы культивировали в качалочных колбах объемом 750 мл на среде, состав которой был подобран ранее в соответствии с видом гриба. В полученной КЖ определяли целевые активности и концентрацию белка. Под целевыми активностями подразумевались ПЕЛ (в случае трансформантов серий RN_PEB, RN_PP, RN_AP, RN_AEP, BI_P и BI_PB), БГЛ (RN_PEB и BI_PB), ЭГ (RN_PEB), эндо-1,5--арабиназы - АБН (RN_A, RN_AP, RN_AEP) и эндо-1,4--полигалактуроназы - ПГ (RN_PP, RN_AEP).

Полученные штаммы-продуценты были три раза последовательно рассеяны на чашки Петри с агаризованной, минимальной селективной средой, содержащей нитрат натрия, глюкозу и дигидрофосфат калия. Наблюдаемые скорость и характер роста, форма и размер колоний, а также способность к спорообразованию оставались одинаковыми в ходе трех пересевов. После второго и третьего пересева было проведено культивирование штаммов в качалочных колбах, в полученной КЖ были определены целевые активности и концентрация белка.

Полученные результаты показали, что активности ПЕЛ и БГЛ в КЖ штаммов-продуцентов серий BI_P и BI_PB, полученных на основе штамма P.verruculosum, после двух последовательных пересевов снизились не более чем на 15 % по сравнению с первым культивированием, а после третьего остались на уровне результатов второго культивирования. Таким образом, штаммы-продуценты серий BI_P и BI_PB обладали стабильной способностью к секреции гетерологичных ПЕЛ и БГЛ.

Таблица 2 Целевые активности (ед/мл) и концентрация белка (г/л) в КЖ, полученной в результате культивирования в колбах новых штаммов-продуцентов, созданных на основе P.verruculosum BI.

Серия

Номер штамма

ПЕЛ

БГЛ

ЦБГ

ЭГ

Белок

BI_P

7

25,9±2,96

-

2,683±0,1

-

5,7±0,3

12

20,8±1,7

-

2,706±0,2

-

4,9±0,5

13

19,8±1,6

-

2,591±0,3

-

5,3±0,6

28

12,4±1,9

-

2,827±0,5

-

5,2±0,7

BI_PB

8

34,6±1,3

10,0±1,1

1,97±0,4

35,0±3,6

5,4±0,4

11

9,4±0,6

3,2±0,8

0,79±0,1

8,9±1,2

4,1±0,6

4

10,1±0,5

5,5±0,3

1,62±0,3

47,4±4,1

5,0±0,5

15

22,8±1,8

64,4±7,4

1,04±0,2

18,6±2,2

4,6±0,7

5

12,1±1,2

50,6±6,9

2,65±0,8

21,8±2,0

5,2±0,5

2

5,0±0,5

39,6±4,8

1,23±0,4

23,3±1,9

4,5±0,6

6

5,2±0,9

16,0±0,96

1,87±0,3

36,2±3,2

5,6±0,4

20

35,8±3,3

39,8±2,6

1,96±0,2

27,3±2,6

5,5±0,5

18

4,6±0,7

60,3±5,7

1,17±0,1

17,3±1,5

5,3±0,8

-

BI

0,0

5,1±0,4

3,2±0,2

29,1±2,7

4,8±0,7

Штаммы-продуценты, полученные на основе штамма P.canescens, также обладали стабильной секреторной способностью. Наблюдаемое падение целевых активностей после двух последовательных пересевов составляло в среднем 11 % по сравнению с первым культивированием, а после третьего пересева оставалось на уровне второго культивирования. Следует отметить, что концентрация белка в КЖ штаммов-продуцентов, полученных как на основе P.canescens, так и на основе P.verruculosum, оставалась постоянной. Величины целевых активностей и концентрации белка в КЖ штаммов-продуцентов, усредненные по результатам трех культивирований приведены в табл. 2 и 3.

На рис. 4 приведены примеры электрофореграмм образцов КЖ, полученной в результате культивирования в колбах штаммов-продуцентов. Видно, что на основе штаммов-реципиентов P.canescens RN3-11-7 и P.verruculosum BI в результате проведенных генно-инженерных работ, были получены штаммы-продуценты, секретирующие АБН (40 кДа, рис. 4б), ПГ (36 кДа, рис. 4а,б), ПЕЛ (38 кДа, рис. 4а-г), ЭГ (36 кДа, рис. 4в) и БГЛ (120 кДа, рис. 4в,г).

Таким образом, с использованием методов генной инженерии были созданы штаммы гриба P.canescens, являющиеся продуцентами гомологичной пектинлиазы А P.canescens и гетерологичных -глюкозидазы A.niger и эндо-1,4--глюканазы II P.verruculosum (RN_PEB), гетерологичной эндо-1,5--арабиназы A.niger (RN_A), эндо-1,5--арабиназы A.niger и пектинлиазы А P.canescens (RN_AP), пектинлиазы А P.canescens  и гетерологичных эндо-1,5--арабиназы A.niger и эндо-1,4--полигалактуроназы A.niger (RN_AEP), а также штаммы гриба P.verruculosum, продуценты гетерологичной пектинлиазы А P.canescens (BI_P), гетерологичных пектинлиазы А P.canescens и -глюкозидазы A.niger (BI_PB, F10_P). Полученные штаммы-продуценты характеризовались стабильной секрецией целевых ферментов. Эти штаммы были культивированы в 3л- и 10л- ферментерах для получения сухих ферментных препаратов (ФП) путем лиофильного высушивания КЖ или ультраконцентратов КЖ.

                     

                             

Рисунок 4 Электрофореграммы КЖ, полученной в результате культивирования в колбах штаммов-продуцентов серии RN_PP (а), RN_A, RN_AP, RN_AEP (б), RN_PEB (в) на основе P.canescens RN3-11-7 и серии BI_PB (г) на основе P.verruculosum BI.


Таблица 3. Целевые активности (ед/мл) и концентрация белка (г/л) в КЖ, полученной в результате культивирования в колбах новых штаммов-продуцентов, полученных на основе штамма-реципиента P.canescens RN3-11-7.

Серия

Название штамма

БГЛ

ЭГ

ПЕЛ

ПГ

АБН

Белок

RN_PEB

A1

93,43±14,01

13,04±1,96

0,63±0,09

-

-

8,26±1,24

A4

71,04±10,66

10,06±1,51

0,34±0,05

-

-

8,37±1,26

A8

38,08±5,71

60,43±9,06

11,67±1,75

-

-

13,09±1,96

B2

65,09±9,76

63,31±9,50

1±0,15

-

-

8,74±1,31

B5

38,88±5,83

26,18±3,93

6,44±0,97

-

-

9,97±1,50

C1

0,53±0,08

69,74±10,46

24,5±3,68

-

-

12,85±1,93

C9

42,94±6,44

114,21±17,13

0,69±0,10

-

-

8,68±1,30

D6

33,23±4,98

13,21±1,98

0,59±0,09

-

-

7,52±1,13

C3’

34,94±5,24

55,51±8,33

6,45±0,97

-

-

6,72±0,81

C5’

31,85±4,78

61,08±9,16

26,55±3,98

-

-

6,09±0,73

C9’

67,32±10,10

98,06±14,71

16,51±0,98

-

-

8,24±0,99

D3’

57,59±8,64

85,92±12,89

28,28±1,54

-

-

7,19±0,86

RN_PP

24

-

-

61,2±5,2

120,2±13,9

-

13,0±0,6

39

-

-

0,7±0,02

263,3±13,0

-

13,7±1,2

RN_A

7

-

-

-

-

119,2±10,4

9,5±1,1

11

-

-

-

-

263,6±20,1

10,6±1,4

RN_AP

16

-

-

27,8±1,8

-

87,8±10,2

8,1±0,5

20

-

-

11,4±1,0

-

111,3±9,9

6,5±0,3

RN_AEP

8

-

-

7,2±0,8

232,1±20,0

81,8±9,5

14,4±1,7

11

-

-

1,6±0,2

270,6±22,1

218,0±25,0

13,8±1,5

12

-

-

0,6±0,1

304,5±29,5

187,4±20,0

14,1±2,1

31

-

-

0,4±0,1

174,0±15,2

169,2±18,0

16,2±2,0

-

RN3-11-7

5,79±0,87

17,52±2,63

0,20±0,03

3,0±0,8

21,0±2,5

7,82±0,94


2. Гидролитическая способность ферментных препаратов, полученных на основе новых штаммов-продуцентов

Гидролиз свекловичного жома под действием новых ферментных препаратов был проведен с целью определения гидролитической способности ФП, полученных на основе созданных штаммов-продуцентов и соответствующих реципиентных штаммов (в качестве контроля). Критериями, выбранными для сравнения эффективности деструкции свекловичного жома под действием ФП серий RN_PEB, BI_P, BI_PB и F10_P, служили концентрация восстанавливающих сахаров (ВС) и глюкозы (Глю), а в случае ФП серий RN_A, RN_AP и RN_AEP – концентрация ВС и арабинозы (Ара).

На рис. 5 приведены результаты гидролиза сухого свекловичного жома, измельченного на мельнице MF 10 basic (“IKA WERKE”, Германия), под действием ФП, полученных на основе реципиентного штамма P.canescens (RN3-11-7) и штамма С9', являющегося продуцентом трех ферментов - ПЕЛ, БГЛ и ЭГ (серия RN_PEB) и обладающего максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому среди ФП серии RN_PEB. При дозировке ФП 2, 5 и 10 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома ФП С9’ обеспечил выход ВС (обозначен сплошной линией черного цвета на рис. 5) в среднем на 45% выше по сравнению с ФП RN3-11-7 (обозначен черной пунктирной линией на рис. 5).

Рисунок 5 Выход ВС по истечении 3, 24 и 48 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием ФП, полученного на основе штамма-продуцента С9’ серии RN_PEB и штамма-реципиента RN3-11-7 при 50°С и рН 5,0 (дозировка ФП составляла 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата).

На рис. 6 приведены результаты гидролиза измельченного свекловичного жома под действием ФП, обладающих повышенными активностями АБН, ПЕЛ и ПГ. Видно, что при дозировке ФП 2 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата  среди ФП серий RN_PP, RN_A, RN_AP и RN_AEP максимальный выход ВС наблюдался в случае ФП на основе штамма P.canescens АЕР 8, являющегося продуцентом АБН, ПГ и ПЕЛ. Выход ВС после 3, 24 и 48 ч гидролиза свекловичного жома под действием ФП АЕР 8 (обозначен сплошной линией серого цвета на рис. 6а) в среднем на 20 % выше по сравнению с ФП RN (обозначен черной пунктирной линией на рис. 6а). Однако при повышении дозировки ФП (5 мг/г) картина менялась и максимальный выход ВС наблюдался в случае ФП АР_16, являющегося продуцентом АБН и ПЕЛ (обозначен сплошной линией черного цвета на рис. 6б). Выход ВС после 3, 24 и 48 ч гидролиза оказался в среднем на 19 % выше по сравнению с ФП RN (обозначен черной пунктирной линией на рис. 6б). Причем в тех же условиях ФП AP 16 показал выход Ара на 26 % выше по сравнению с ФП RN (см. рис. 6в).

Рисунок 6 Выход ВС (а,б) и Ара (в) по истечении 3, 24 и 48 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием ФП АР 16 и AEP 8, обладавших максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому среди ФП серий RN_A, RN_AP, RN_AEP, RN_PP, а также ФП RN (на основе исходного штамма) при 50°С и рН 5,0 (дозировка ФП составляла 2 и 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата).

Наиболее существенное увеличение гидролитической способности ФП АР 16 по сравнению с ФП RN наблюдалось на начальном этапе гидролиза свекловичного жома. Так, при дозировке ФП 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата по истечении 3 ч гидролиза выход ВС и Ара под действием ФП АР 16 был, соответственно, на 29 и 38 % выше, соответственно, по сравнению с ФП RN. Наблюдаемый эффект, по-видимому, обусловлен особенностями строения клеточной стенки сахарной свеклы. Согласно литературным данным, в состав свекловичного жома входит значительное количество пектиновых веществ, которые не расщеплялись в случае ФП RN с низкой активностью ПЕЛ и затрудняли доступ гемицеллюлаз к соответствующим полисахаридам. Напротив, ФП АР 16, обладающий высокой активностью ПЕЛ, обеспечивал расщепление пектиновых веществ уже на первом этапе процесса, что, в свою очередь, приводило к активизации гемицеллюлаз. 

На рис. 7 приведены результаты гидролиза измельченного свекловичного жома под действием ФП, полученных на основе исходного штамма P.verruculosum (BI, обозначен пунктирной черной линией) и нового штамма-продуцента ПЕЛ и БГЛ - № 5 (обозначен сплошной черной линией), обладающего максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому среди ФП серий BI_PB, BI_P и F10_P. ФП № 5 обеспечивал выход ВС и Глю, соответственно, на 38% и 32% выше по сравнению с ФП BI по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома при дозировке ФП 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата. Наиболее значимое повышение гидролитической способности ФП № 5 серии BI_PB по сравнению с ФП BI наблюдалось на начальном этапе гидролиза, так, выход Глю после 3 ч гидролиза был выше контроля на 80%, в то время как после 24 ч гидролиза разница составляла 32 %.

Таким образом, на основании данных по выходу Глю в ходе гидролиза свекловичного жома, ферментный  препарат BI_PB 5, полученный на основе созданного штамма P.verruculosum, являющегося продуцентом ПЕЛ и БГЛ, обладал максимальной гидролитической способностью по отношению к целлюлозной компоненте свекловичного жома по сравнению с другими исследованными ФП. На основании данных по выходу Ара, ФП RN_AP 16 на основе штамма P.canescens, продуцента ПЕЛ и АБН, обладал максимальной среди исследованных ФП гидролитической способностью по отношению к арабинану свекловичного жома. Наконец, ФП RN_PEB C9’ на основе штамма P.canescens, продуцента ПЕЛ, БГЛ и ЭГ, обеспечивал максимальный  выход ВС.

Рисунок 7 Выход ВС (а) и Глю (б) по истечении 3, 24 и 48 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием ФП, полученных на основе исходного штамма P.verruculosum BI и штамма-продуцента, обладавшего максимальной гидролитической способностью среди ФП серий BI_P, BI_PB, F10_P, при 50°С и рН 5,0 (дозировка ФП составляла 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата).

Определение состава ферментного комплекса, оптимального для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих материалов на примере свекловичного жома. Был проведен поиск оптимального (обеспечивающего наиболее эффективную деструкцию свекловичного жома) соотношения гомогенных ферментов (АБН из A.niger и ПЕЛ из P.canescens) и комплекса внеклеточных ферментов реципиентного штамма P.canescens RN3-11-7. На первом этапе был проведен гидролиз свекловичного жома смесями ФП RN (полученного на основе штамма P.canescens RN3-11-7) и гомогенной АБН (результаты гидролиза приведены на рис. 8, состав смесей - в табл. 4). Наибольшей гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому обладали смеси № 2’, 3’ и 4’, содержащие 10% - 30 % АБН от общего количества белка в реакционной смеси. Выход ВС и Ара по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома под действием смесей № 2’, 3’ и 4’ в среднем, соответственно, на 48% и 49% выше по сравнению с ФП RN (см. рис. 8а).

Далее были приготовлены смеси с фиксированным соотношением гомогенной АБН (30 % по белку) и ФП RN и различным содержанием гомогенной ПЕЛ (состав смесей приведен в табл. 4). Из данных на рис. 8 видно, что наибольшей гидролитической способностью обладали смеси № 10’, 11’, 12’ и 13’ с содержанием ПЕЛ от 10% до 50% по белку, обеспечившие выход ВС и Ара в среднем на 78% и 67% выше по сравнению с ФП RN. Следовательно, наиболее оптимальной для гидролиза полисахаридов свекловичного жома является смесь ферментов, состоящая, в пересчете на общее количество добавляемого белка, из 15-30% АБН, 10-50% ПЕЛ и 35-60% ферментного комплекса штамма-реципиента P.canescens RN3-11-7.

Рисунок 8 Выход ВС ( - концентрация ВС), Ара ( - концентрация Ара) и Глю ( - концентрация Глю) по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием смесей ФП RN (полученного на основе реципиентного штамма P.canescens RN3-11-7) и АБН (а) и смесей  ФП RN, АБН и ПЕЛ (б) при 50°С и рН 5,0 (общая дозировка смеси составляла 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата, состав смесей ферментов приведен в табл. 4).

Таблица 4 Состав смесей, состоящих из ферментного препарата, полученного на основе реципиентного штамма P.canescens RN3-11-7 - (ФП RN) и гомогенных АБН и ПЕЛ (смеси № 1’ – 17’), а также ферментного препарата, полученного на основе реципиентного штамма P.verruculosum BI - (ФП BI) и гомогенных БГЛ и ПЕЛ (смеси № 1”-17”).

№ смеси

ФП RN

АБН

ПЕЛ

№ смеси

ФП BI

БГЛ

ПЕЛ

1’

100 %

-

-

1”

100 %

-

-

2’

90 %

10 %

-

2”

90 %

10 %

-

3’

80 %

20 %

-

3”

80 %

20 %

-

4’

70 %

30 %

-

4”

70 %

30 %

-

5’

50 %

50 %

-

5”

50 %

50 %

-

6’

30 %

70 %

-

6”

30 %

70 %

-

7’

20 %

80 %

-

7”

20 %

80 %

-

8’

10 %

90 %

-

8”

10 %

90 %

-

9’

-

100 %

-

9”

-

100 %

-

10’

63 %

27 %

10 %

10”

81 %

9 %

10 %

11’

56 %

24 %

20 %

11”

72 %

8 %

20 %

12’

49 %

21 %

30 %

12”

63 %

7 %

30 %

13’

35 %

15 %

50 %

13”

45 %

5 %

50 %

14’

21 %

9 %

70 %

14”

27 %

3 %

70 %

15’

14 %

6 %

80 %

15”

18 %

2 %

80 %

16’

7 %

3 %

90 %

16”

9 %

1 %

90 %

17’

-

-

100 %

17”

-

-

100 %

Согласно литературным данным, среднее содержание остатков Ара в свекловичном жоме, составляет 20,9 % масс. по с.в., следовательно, при концентрации свекловичного жома в реакционной смеси 100 г/л (по с.в.) максимальная ожидаемая концентрация образовавшейся в результате ферментативного гидролиза Ара составляет 23,8 г/л (с учетом присоединенной молекулы воды). Таким образом, выход Ара на уровне 23,0±2,5 г/л по истечении 48 ч гидролиза свекловичного жома под действием смесей ФП RN, АБН и ПЕЛ оптимального состава близок к теоретическому.

Аналогичным образом был проведен поиск оптимального для проведения гидролиза свекловичного жома соотношения гомогенных ферментов - БГЛ из A.niger и ПЕЛ из P.canescens и комплекса внеклеточных ферментов реципиентного штамма P.verruculosum BI (ФП BI). На первом этапе было определено оптимальное соотношение ФП BI и гомогенной БГЛ (соотношения компонентов ферментного комплекса реципиентного штамма и гомогенной БГЛ приведены в табл. 4), на втором – оптимальный состав смеси ФП BI, БГЛ и ПЕЛ (см. табл. 4).

Наилучший результат гидролиза смесями ФП BI и БГЛ после 24 ч и 48 ч наблюдали для смеси, содержащей 10% БГЛ от общего количества белка  в реакционной смеси (смесь № 2’’ на  рис. 9а). Более значительные эффекты наблюдались при гидролизе свекловичного жома смесями с фиксированным соотношением БГЛ и ФП BI и различным содержанием гомогенной ПЕЛ. Смеси с максимальной гидролитической способностью (№ 10'' – 13'', см. рис. 9б), состоявшие из 5-9% БГЛ, 10-50% ПЕЛ и 45-80% ферментного комплекса реципиентного штамма P.verruculosum BI, обеспечили выход ВС и Глю после 3 ч гидролиза, соответственно, на 44% и 108% выше по сравнению с ФП ВI.

Рисунок 9 Выход ВС ( - концентрация ВС) и Глю (  - концентрация Глю)  по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием смесей ФП BI (полученного на основе реципиентного штамма P.verruculosum BI) и БГЛ (а) и смесей ФП BI, БГЛ и ПЕЛ (б) при 50°С и рН 5,0 (общая дозировка смеси составляла 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата, состав смесей ферментов приведен в  табл. 4).

При увеличении времени гидролиза свекловичного жома (24ч и 48ч, см. рис. 9) смеси № 10'' – 13'' также обладали максимальной гидролитической способностью, причем выход Глю составлял 22,3±2,1 г/л. Среднее содержание Глю в свекловичном жоме составляет приблизительно 21,1% по с.в., следовательно, при концентрации свекловичного жома в реакционной смеси 100 г/л (по с.в.) максимальная ожидаемая концентрация образовавшейся в результате ферментативного гидролиза Глю составляет 23,4 г/л (с учетом присоединенной молекулы воды). Отметим, что уже по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома происходила практически полная конверсия глюкозосодержащих полисахаридов под действием смесей ферментов, состоявших, в пересчете на общее количество добавляемого белка, из 5-9% БГЛ, 10-50% ПЕЛ и 45-80% компонентов ферментного комплекса реципиентного штамма P.verruculosum BI.

3. Свойства новых ферментных препаратов

По результатам гидролиза свекловичного жома новыми ФП, а также цитрусовых и яблочных выжимок образцами КЖ штаммов-продуцентов серии RN_PEB были отобраны лучшие ФП для дальнейшего изучения их свойств, к ним относятся ФП, полученные на основе штаммов P.canescens B5 и С9' (продуценты ПЕЛ, БГЛ, ЭГ) и AP 16 (продуцент АБН и ПЕЛ), а также ФП, полученный на основе штамма PB 5 (продуцента ПЕЛ и БГЛ), удельные активности ФП приведены в табл. 5. На рис. 10 представлены электрофореграммы образцов лучших ФП, полученных на основе штаммов грибов P.canescens и P.verruculosum.

Таблица 5 Удельные активности ФП, обладавших максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому (16, РВ 5, С9), яблочным (B5) и цитрусовым выжимкам (B5).

ФП, полученные на основе штаммов гриба P.canescens:


ПЕЛ

ЭГ

КСИЛ

ЦБГ

БГЛ

RN3-11-7 (реципиентный)

0,0

0,1

130

0,1

0,1

Продуценты ПЕЛ, ЭГ II и БГЛ:

В5

1,1

0,3

138,2

0,2

2,4

С9

6,6

1,4

67,1

0,1

2,4

ПЕЛ

КСИЛ

АБН

RN3-11-7 (реципиентный)

0,0

130

0,1

Продуцент ПЕЛ и АБН:

16

5,6

60,1

8,1

ФП, полученные на основе штаммов гриба P.verruculosum:

ПЕЛ

ЭГ

КСИЛ

ЦБГ

БГЛ

BI (реципиентный)

0,0

11,1

21,0

0,35

1,0

Продуценты ПЕЛ и БГЛ:

РВ 5

7,0

6,8

3,9

0,40

2,0

   

Рисунок 10 Электрофореграммы образцов растворенных и предварительно обессоленных ФП, полученных на основе штаммов грибов P.canescens (a) и P.verruculosum (б). Обозначения: RN – реципиентный штамм RN3-11-7, B5 и С9’ – лучшие штаммы серии RN_PEB, 16 – лучший штамм серии RN_AP, BI - реципиентный штамм BI, 5 – лучший штамм серии BI_PB.

Компонентный состав. Разделение ФП проводили с использованием методов гель-фильтрации, анионо-обменной хроматографии (АОХ) на носителе Source 15Q и гидрофобной хроматографии на носителе Source 15ISO в соответствии с многократно апробированной в нашей лаборатории методикой разделения ФП, полученных на основе различных штаммов P.canescens и P.verruculosum. Выделенные гомогенные ферменты идентифицировали по целевой активности и молекулярной массе (ДДС-электрофорез), а также методом масс-спектрометрии. На основании данных определения концентрации белка и целевой активности гомогенных фракций ферментов был рассчитан компонентный состав ФП. Оказалось, что компонентный состав ФП RN_АР 16 (см. табл. 6) и ФП BI_PB 5 (см. табл. 7) соответствует составу смесей ферментов (см. п. 2), показавших максимальный выход ВС, Глю и Ара в ходе гидролиза свекловичного жома (см. табл. 4, рис. 8 и 9).

Таблица 6 Содержание основных компонентов в составе ФП, полученных на основе штаммов гриба P.canescens.

Серия

Штамм

КСИЛ, %

ПЕЛ, %

ЭГ, %

БГЛ, %

АБН, %

-

RN3-11-7 й)

30

<1

0

0

0

RN_PEB

B5

32

4

1

1

0

C9’

15

11

18

12

0

RN_AP

№ 16

10

10

0

0

26

Таблица 7 Основные компоненты ФП, полученных на основе штаммов гриба P.verruculosum.

Серия

Штамм

ПЕЛ, %

ЦБГ, %

ЭГ, %

БГЛ, %

-

BI

<1

69

14

4

BI_PB

№ 5

27

33

13

11

Биохимические характеристики. Было изучено влияние температуры и рН на активность и стабильность сухих ФП, полученных на основе новых штаммов-продуцентов и обладавших максимальной гидролитической способностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим субстратам.

Согласно полученным данным (см. табл. 8), новые ФП обладали высокой стабильностью целевых активностей в процессе инкубирования при рН 4,0 и 5,0 и температуре от 25 до 50°С. Следует отметить, что в ходе гидролиза различных полисахаридных субстратов полученные ФП проявляют целевые активности, близкие к максимальным, при рН 5,0 и 50°С, что позволяет считать данные условия оптимальными для гидролиза таких субстратов, как свекловичный жом, яблочные и цитрусовые выжимки.

Таблица 8 Влияние температуры и рН на активность ФП.

Ферментный препарат

RN_PEB_B5

RN_AP 16

BI_PB 5

Целевой фермент

ПЕЛ

ЭГ II

ПЕЛ

АБН

ПЕЛ

Субстрат

Пектин цитрусо-вый СЭ 70%

КМЦ

Пектин цитрусо-вый СЭ 70%

Арабинан линейный

Пектин цитрусо-вый СЭ 70%

рН-оптимум (рН>50%)

5,0

(4,5 - 6,5)

4,5

(3,8 – 6,0)

5,0

(4,2 – 6,5)

4,0

(2,5 – 6,0)

5,0

(4,8 – 6,5)

Т-оптимум (Т>50%)

45

(25-60)

70

(48-65)

45

(25 - 60)

60

(45 – 70)

55

(25 - 60)

Остаточная активность после 3 ч инкубирования (Т 50°С), %

рН 4,0

80

80

80

80

80

рН 5,0

80

70

80

80

80

Остаточная активность после 3 ч инкубирования (pH 4,0 для АБН, во всех остальных случаях рН 5,0), %

25 °С

95

95

95

95

95

40 °С

95

80

95

95

90

50 °С

85

70

85

75

80

60 °С

15

45

20

20

10

ВЫВОДЫ

  1. Созданы новые рекомбинантные штаммы-продуценты пектинлиазы А, эндо-1,4--глюканазы II, -глюкозидазы, эндо-1,5--арабиназы и эндо-1,4--полигалактуроназы на основе грибов P.canescens и P.verruculosum с применением подходов генетической инженерии и микробиологии. Доказано наличие генов целевых белков в хромосомах рекомбинантных штаммов; ферментные препараты, полученные с помощью созданных штаммов, обладали заданными целевыми активностями.
  2. Показано, что ферментные комплексы новых рекомбинантных штаммов P.canescens эффективнее при гидролизе свекловичного жома (на 26-38% по выходу арабинозы) по сравнению с ферментным комплексом исходного реципиентного штамма RN3-11-7, а ферментные комплексы новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum эффективнее (на 20-30% по выходу глюкозы) по сравнению с ферментным комплексом исходного реципиентного штамма BI. 
  3. Ферментные препараты, полученные  с помощью созданных штаммов-продуцентов и обладавшие максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому, имели следующий компонентный состав: P.verruculosum BI_PB 5 – 27% пектинлиазы А, 11% -глюкозидазы, 33% целлобиогидролазы и 13% эндо-1,4--глюканазы;  P.canescens AР 16 – 10% ксиланазы, 10% пектинлиазы А и 26% эндо-1,5--арабиназы от общего количества белка ФП.
  4. Изучена гидролитическая способность ферментных композиций по отношению к свекловичному жому. Установлено, что для обеспечения максимального выхода глюкозы оптимальной являлась смесь гомогенных пектинлиазы А (10-50%) и -глюкозидазы (5-9%) в сочетании с ферментным комплексом реципиентного штамма P.verruculosum BI (45-80% от добавляемого белка). Для обеспечения максимального выхода арабинозы оптимальной являлась смесь гомогенных эндо-1,5--арабиназы (15-30%) и пектинлиазы А (10-50%) с ферментным комплексом реципиентного штамма P.canescens RN3-11-7 (35-60%). Оптимальное соотношение компонентов мультиферментных композиций соответствовало составу ферментных препаратов с максимальной гидролитической способностью, полученных с помощью новых штаммов-продуцентов.
  5. Оптимальные значения целевых активностей ферментных препаратов с максимальной гидролитической способностью наблюдаются при рН 4,0-5,0 и температуре 45-70°С. При температуре 25-50°С и рН 4,0-5,0 ферментные препараты теряют в водном растворе в течение 3 часов  не более 5-30% целевой активности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

  1. Рожкова А.М., Волков П.В., Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Бушина Е.В., Зоров И.Н., Синицына О.А., Синицын А.П., Кошелев А.В., Беккаревич А.О., Бубнова Т.В., Окунев О.Н. Создание продуцентов биотехнологически важных ферментов на основе рекомбинантного штамма гриба Penicillium canescens. Хранение и переработка сельхозсырья, 2010, Т. 7, с. 37-39.
  2. Рожкова А.М., Бушина Е.В., Зоров И.Н., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Применение комплексных ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз для переработки свекловичного жома. Вестник Мичуринского государственного аграрного университета. 2011, Т.2, №2, с. 96-99.
  3. Волчок А.А., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Щербаков С.С., Бушина Е.В., Синицын А.П. Использование ферментных комплексов нового поколения для обработки различных плодово-ягодных субстратов. Виноделие и виноградарство, 2012, № 1, с. 20-21.
  4. Бушина Е.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Сатрутдинов А.Д., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Создание комплексных ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз для переработки свекловичного жома. Прикладная биохимия и микробиология, 2012, Т. 48, № 5, с. 543-549.
  5. Bushina E.V., Rozhkova A.M., Semenova M.V., Sinitsyn A.P. Development Pectinase and Cellulase Strain-producer Using recombinant Strain P.canescens. Abstracts of International Conference “Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications”, Arkhangelsk, June 19-24, 2009, p.87.
  6. Бушина Е.В., Рожкова А.М., Семенова М.В., Синицын А.П. Получение продуцента гетерологичной пектинлиазы на основе рекомбинантного штамма Penicillium sp. Сборник материалов Второго международного конгресс-партнеринга и выставки по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике “EurasiaBio”, Москва, 13-15 апреля, 2010, с.38.
  7. Бушина Е.В. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium для гидролиза отходов пищевой промышленности. Сборник материалов II Международной конференция Российского Химического общества им. Д.И.Менделеева “Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов”. Москва, 28 сентября 2010, с.212.
  8. Бушина Е.В., Рожкова А.М., Середа А.С., Рубцова Е.А., Семенова М.В., Синицын А.П. Получение ферментных препаратов с заданными свойствами для гидролиза отходов пищевой промышленности. Сборник материалов Московской международной научно-практической конференции “Биотехнология: экология крупных городов”, Москва, 15-17 марта 2010, с.301-302.
  9. Бушина Е.В. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium для гидролиза отходов пищевой промышленности. Сборник материалов школы-конференции “Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины”. Москва, 29-30 сентября 2011, с .14.
 



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.