WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

CИТНИКОВ НИКОЛАЙ СЕРГЕЕВИЧ

МЕТОДОЛОГИИ СИНТЕЗА АНТИМИТОТИЧЕСКИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ КОЛХИЦИНОВОГО РЯДА

02.00.03 – органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Нижний Новгород – 2012

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им.

Н. И. Лобачевского»

Научный консультант: доктор химических наук, доцент Фдоров Алексей Юрьевич

Официальные оппоненты: Учреждение Российской академии наук Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева РАН зав. лаборатории органических производных непереходных металлов, член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Федюшкин Игорь Леонидович Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации зав. кафедрой фармацевтической химии и фармакогнозии, доктор химических наук, профессор Мельникова Нина Борисовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Новосибирский институт органической химии им.

Н.Н. Ворожцова СО РАН

Защита диссертации состоится 26 сентября 2012 года в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.05 при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, ГСП-20, пр. Гагарина, 23, корп. 2, Конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Автореферат разослан 20 августа 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук О.Г. Замышляева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из наиболее острых проблем современной медицины не только в нашей стране, но и во всем мире. Прогноз 50% увеличения числа онкологических заболеваний к 2020 г.

создает потребность в развитии новых противоопухолевых препаратов (Материалы 42-nd International Meeting on Medicinal Chemistry, 5-7 July, 2006, Marseille, France).

Ключевая роль митотического веретена в клеточном делении сделала его перспективной мишенью для противоопухолевой химиотерапии. Антимитотические агенты таксол и таксотер относятся к наиболее успешным препаратам, используемым в современной клинической практике. Ряд антимитотических противоопухолевых агентов в настоящее время проходит клинические испытания (СА4Р, омбрабулин, подофиллотоксин, а также несколько соединений колхицинового и аллоколхицинового ряда).

Несмотря на существенный прогресс, достигнутый за последние два десятилетия в разработке новых противоопухолевых химиотерапевтических средств, подавляющее большинство лекарств, применяемых в медицинской практике, а также находящихся на стадии клинических тестов, обладает общими недостатками. К ним относятся низкая селективность биологического действия и, как следствие, высокая системная токсичность, а также снижение терапевтической активности ввиду множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Труднодоступность природных источников и отсутствие промышленно реализуемых путей синтеза (например, в случае таксанов) ограничивает клинические исследования и практическое внедрение многих противоопухолевых препаратов. В связи с этим, актуален поиск новых синтетически доступных антимитотических агентов, имеющих высокий терапевтический индекс (отношение минимальной токсичной дозы к эффективной терапевтической дозе), и улучшение их фармакокинетических параметров (биодоступность, распределение по органам и тканям) путем синтеза пролекарственных форм и создания адресных противоопухолевых препаратов на их основе.

Данная работа посвящена разработке методологий синтеза новых антимитотических противоопухолевых агентов - гетероциклических аналогов природных алкалоидов колхицина и аллоколхицина. Полученные соединения наряду с известным противоопухолевым агентом колхицинового сайта комбретастатином А4 были использованы для получения липофильных пролекарственных форм и создания липосомных систем адресной доставки лекарств на их основе.

Цель работы. Получение новых антимитотических противоопухолевых агентов колхицинового сайта клеточного белка тубулина. В работе решались следующие задачи:

1) Синтез индолсодержащих структурных аналогов природного алкалоида аллоколхицина с целью исследования их противоопухолевых свойств;

2) Синтез липофильных производных природных противоопухолевых агентов колхицина, аллоколхицина и комбретастатина А-4 с целью их включения в состав липосомных систем адресной доставки лекарств и исследования противоопухолевых свойств.

Объекты исследования. Структурные аналоги аллоколхицина, содержащие 1Н-индольный фрагмент; (1,2,3-триазол)содержащие структурные аналоги колхицина, аллоколхицина, а также их липофильные производные на основе олеиновой и пальмитиновой кислот; липофильные производные комбретастатина А4, содержащие остатки жирных кислот.

Методы исследования. В работе использованы современные методы тонкого органического синтеза и металлокомплексного катализа. Состав и строение соединений подтверждали физико-химическими методами (ЯМР-, ИК-спектроскопия, масс-спектрометрия, РСА). Для разделения соединений использовали хроматографические методы (ВЭЖХ, ТСХ, флэш-хроматография на силикагеле).

Научная новизна и практическая значимость работы. Предложены и реализованы методологии синтеза четырех структурных типов индолсодержащих аналогов алкалоида аллоколхицина исходя из коммерчески доступных реагентов – 3(3,4,5-триметоксифенил)пропионовой кислоты и производных индола. Методом 1Н ЯМР спектроскопии выявлено наличие атропизомеризационного равновесия некоторых аллоколхициноидов в растворе при комнатной температуре.

Установлено, что некоторые из полученных соединений проявляют антимитотическую и апоптоз-индуцирующую активность по отношению к штамму лимфомы Беркитта BJAB в нано/cубнаномолярных концентрациях наряду с низкой неспецифической токсичностью.

Показано, что аллоколхициноид 1,2,3-триметоксибензо[4,5:4,5]1H-6,7дигидро-1-гидроксициклогепта[2,3-e]1H-1''-метилиндол ингибирует фазу G2/M клеточного цикла и индуцирует апоптоз нескольких штаммов клеток хронического лимфолейкоза в наномолярном интервале концентраций. Установлено, что данное соединение по цитотоксичности превосходит клинический препарат винкристин, используемый в терапии лимфолейкозов.

Синтезированы новые 7-триазолилзамещенные аналоги колхицина и аллоколхицина, а также их липофильные формы. Предложен механизм перегруппировки колхицинового молекулярного скелета в аллоколхициновый.

Получены липофильные пролекарственные формы природного противоопухолевого агента комбретастатина А-4.

Липофильные производные колхицина и комбретастатина А-4 использованы для создания противоопухолевых липосом. Установлено, что производные колхицина и их липосомные формы проявляют цитотоксическую активностью по отношению к пяти штаммам опухолевых клеток человека в наномолярном интервале концентраций.

Липосомный препарат на основе олеоильного производного комбретастатина А-4, содержащий адресные углеводные векторы SiaLeX, продемонстрировал способность подавлять развитие опухоли у мышей линии BLRB/BYRB со спонтанно возникающим раком молочной железы.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Синтез индолсодержащих структурных аналогов аллоколхицина, липофильных производных колхицина, аллоколхицина, комбретастатина А-выполнен в полном объеме лично диссертантом. Соискатель принимал активное участие в постановке цели и задач исследования, разработке структур целевых биологически активных молекул и методологий их получения, анализе результатов биологических исследований синтезированных соединений.

На защиту выносятся следующие положения:

экспериментальные данные о синтезе индолсодержащих структурных аналогов аллоколхицина;

экспериментальные данные о синтезе липофильных производных колхицина, аллоколхицина, комбретастатина А-4;

результаты исследования структуры полученных соединений физико-химическими методами;

результаты исследования биологической активности полученных соединений.

Степень достоверности полученных результатов. Структуры всех синтезированных в работе соединений подтверждены с применением современных физико-химических методов анализа – ИК-, ЯМР-спектроскопии, массспектрометрии, рентгеноструктурного анализа.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международной конференции «International congress on Organic Chemistry» (Казань, 2011), ХIV Молодежной конференции по органической химии (Екатеринбург, 2011), 15- и 16-ой Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучная секция, г.

Н.Новгород, 2010, 2011), 13- и 14-ой Конференции молодых ученых-химиков г.

Н.Новгорода (2010, 2011), молодежной конференции «Topical problems of Organic Chemistry» (Казань, 2010), Международной конференции «Topical problems of organometallic and coordination chemistry. V Razuvaev lectures» (Нижний Новгород, 2010), Всероссийской конференции по органической химии (Москва, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 5 докладов на международных и всероссийских научных конференциях.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обоснования диссертационных исследований, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы (2наименований) и одного приложения. Работа изложена на 205 страницах машинописного текста, включает 80 схем, 37 рисунков, 18 таблиц. Литературный обзор посвящен обсуждению известных методологий синтеза аллоколхицина и его структурных аналогов. В разделе «Обоснование диссертационных исследований» приводится информация о корреляции структура - физиологическая активность для противоопухолевых агентов колхицинового сайта клеточного белка тубулина, на основании которой предложены структуры целевых биологически активных молекул.

В данном разделе также обосновывается перспективность применения липофильных форм противоопухолевых антимитотических агентов в составе липосомных систем адресной доставки лекарств.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Германской службы академических обменов (DAAD A0879551), Совета по грантам при Президенте РФ (МД_5606.2010.3), РФФИ (09-03-00647а), ФЦП (16.740.11.0476 и 14.740.12.1382).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез индолсодержащих структурных аналогов аллоколхицина В работе предложены и реализованы методологии синтеза соединений I-IV – структурных аналогов природного антимитотического агента аллоколхицина (рис. 1).

MeO MeO MeO A B NHAc X X MeO MeO MeO C MeO MeO MeO N CO2Me N Me Me 1 тип I тип II (aR,7S)-аллоколхицин X = O, OH, N3, NHAc MeO MeO MeO X X X MeO MeO MeO N NH Me MeO MeO MeO N тип III тип IVa тип IVb Me Рис. 1 Аллоколхицин и его гетероциклические структурные аналоги I-IV Целевые производные I-IV сочетают в своей структуре циклы А и B алкалоида 1 и аннелированный 1Н-индольный фрагмент, который, в свою очередь, является фармакофорной группой 4-гетероарилкумаринов, гетерокомбретастатинов и индолобензазепинонов (рис. 2) – известных противоопухолевых агентов, общей биологической мишенью которых, подобно аллоколхицину 1, является клеточный белок тубулин.

RR1 O O N N O N NH MeO Me MeO O RR3 Me MeO MeO N NH OMe OMe N N Me Me гетерокомбретастатины R4 = алкил R1, R2, R3 = H, OMe 4-гетероарилкумарины индолобензазепиноны Рис. 2 Антимитотические противоопухолевые агенты, содержащие 1Н-индольный фармакофорный фрагмент 1.1. Синтез аллоколхициноидов I, II Структурной особенностью соединений I, II (рис. 1) является расположение атома азота в пара-положении по отношению к связи арил-арил. Поэтому оба типа производных было решено синтезировать исходя из общего синтетического интермедиата 2 по реакции ацилирования Фриделя-Крафтса (схема 1). Атом брома в соединении 2 выполняет роль защитной группы, предотвращающей электрофильную атаку в электрононасыщенный триметоксифенильный фрагмент.

CO2H CO2Me Br кросс-сочетание MeO MeO X Br Z1 ZMeO MeO + N MeO OMe MeO OMe Me N Me OMe I, II 2 ацилирование Фриделя-Крафтса Z1 = I, ZnI Z2 = SnBu3, BPin, Br Схема Исследована применимость различных реагентов с общими формулами 3 и для получения ключевого синтетического интермедиата 2. Показано, что реакция галоген-селективного кросс-сочетания Сузуки-Мияура между борорганическим производным индола 6 и арилиодидом 7 в присутствии каталитической системы Pd(OAc)2 PPh3 Cs2CO3 позволяет получить биарил 8 с высоким выходом (схема 2).

С использованием данной реакции, соединение 2 было синтезировано из коммерчески доступной кислоты 5 в 5 стадий с суммарным выходом 62% (схема 2).

O B O CO2Me CO2R CO2H Br Br N MeO MeO MeO Me 72% 1) Br2, AcOH Pd(OAc)I MeO MeO 2) I2, AgOC(O)CF3 MeO PPh3, Cs2COOMe OMe OMe 3) CH2N2, Et2O TolH, 110oC Me N : R = Me 96% LiOH 2: R = H 89% HOH/MeOH Схема На следующей стадии кислоту 2 по реакции с 1-хлоро-N,N,2-триметил-1пропениламином превращали в хлорангидрид 9, который в присутствии двукратного избытка хлорида цинка претерпевал внутримолекулярное ацилирование ФриделяКрафтса (схема 3). Применение данного подхода позволило получить региоизомеры 10 и 11 в соотношении 4:1 с суммарным выходом 40%. Другие кислоты Льюиса (AlCl3, ZnBr2, BF3·Et2O, Sc(OTf)3, Ti(OiPr)4, EtAlCl2, Et2AlCl) оказались менее эффективны.

Br MeO O O O MeO Me NMeMeO 40% Br Cl Br Cl (10:11 4:1) MeO MeO N Me Cl Me + ZnCl2 (2 экв) Br CH2Cl2 MeO MeO CH2Cl2 (0,02M) MeO OMe OMe O Me Me N N 9 MeO MeO 11 N Me Схема Удаление брома в соединениях 10, 11 проводили по реакции восстановительного дегалогенирования трибутилстаннаном в присутствии ДАК (схема 4). Выход продуктов 12, 13 составил 92% и 90% соответственно.

Br 4 MeO MeO MeO O O NHAc Bu3SnH 1) NaBH4 MeO MeO MeO ДАК 2) Zn(N3)2*2Py MeO MeO MeO PPh3, DIAD 3) LiAlH10, 11 12, 4) Ac2O, Py DIAD = i-PrO2C N N CO2Pr-i MeO MeO MeO MeO O NOH NHAc MeO MeO MeO MeO MeO MeO MeO MeO N N N Me Me N Me Me r ac-14 rac-r ac-92% 89% из 92% из 12 87% из MeO MeO MeO MeO O NOH NHAc MeO MeO MeO MeO MeO MeO MeO MeO N N N N r ac-15 r ac-r ac-Me Me Me Me 90% 68% из 93% из 13 89% из Схема Последующие реакции взаимопревращения функциональных групп, включающие восстановление карбонильной группы боргидридом натрия, замещение гидроксильной группы на азидную по реакции Митсунобу, восстановление азида алюмогидридом лития и ацилирование полученного амина уксусным ангидридом в пиридине позволили с хорошими-высокими выходами синтезировать ряд аллоколхициноидов 14-19, содержащих различные С-7 функциональные группы (схема 4).

Методом Н ЯМР спектроскопии показано, что продукты 14-19 претерпевают атропоизомеризацию в растворе при комнатной температуре (cхема 5).

MeO MeO R R MeO MeO MeO MeO (aS,7S) (aR,7S) N N Me Me R = OH, N3, NHAc MeO MeO R R 7 MeO MeO MeO MeO N N (aR,7S) (aS,7S) Me Me Схема Соотношение стереоизомеров изменяется в зависимости от полярности растворителя, что может быть обусловлено различной энергией сольватации С-функциональной группы в диастереомерных молекулах.

1.2. Синтез аллоколхициноидов III Соединения III были получены с применением описанного выше синтетического подхода. Реакция кросс-сочетания Сузуки-Мияура между арилгалогенидом 6 и борорганическим производным индола 20 приводила к биарилу 21, сложноэфирную группу которого подвергали основному гидролизу (схема 6).

Выход производного 22 после двух стадий составил 48%. Кислоту 22 превращали в хлорангидрид 23, который при действии двукратного избытка диизобутилалюминийхлорида претерпевал внутримолекулярное ацилирование Фриделя-Крафтса и in situ восстановление карбонильное группы. Выход тетрациклического спирта 24 составил 68%. Удаление брома в соединении 24 по реакции с трет-бутиллитием в тетрагидрофуране позволило получить продукт 25 с выходом 96%.

Насколько нам известно, возможность применения диизобутилалюминийхлорида для проведения реакции Фриделя-Крафтса с последующим in situ восстановлением карбонильной группы показана нами впервые.

Br CO2Me CO2H CO2Me MeO Br Br MeO MeO I MeO 51% 95% OMe 6 MeO MeO Pd(OAc)+ LiOH aq OMe OMe PPh3, Cs2CO3, ТГФ/MeOH 21 N TolH, 110oC N O N B Me Me Me Me NMeO CH2Cl2, 0oC Me Cl O Br Br Cl MeO MeO MeO OH OH 96% 68% из MeO MeO MeO 1) t-BuLi (3,05 экв) i-Bu2AlCl (2 экв) MeO MeO OMe CH2ClТГФ, -78oC rac-25 N rac-2) MeOH N N Me Me Me Схема Производное 25 является субстратом для получении аллоколхициноидов с различными С-7 функциональными группами (схема 7). Так, окисление соединения 25 N-метилморфолин-N-оксидом в присутствии каталитического количества перрутената тетрапропиламмония (реакция Лея) приводило к кетону 26 с выходом 90%. Превращение спирта 25 в ацетат 27 было осуществлено с выходом 98% по реакции переэтерификации с этилацетатом. Взаимодействие соединения 25 с азидом цинка в условиях реакции Митсунобу завершалось образованием продукта 28 (выход 93%), который был восстановлен алюмогидридом лития до амина 29 (выход 93%).

Ацилирование последнего уксусным ангидридом в пиридине приводило к ацетамиду 30 с выходом 94%.

NMO = N-метилморфолин-N-оксид MeO MeO MeO N3 91% OH 7 O 90% MeO MeO MeO NMO, MS 4A Zn(N3)2*2Py MeO MeO MeO PPh3, DIAD, Pr4NRuO4 (0,05 экв) TolH CH2Cl2/CH3CN N N N rac-Me r ac-Me Me 98% 93% LiAlH4, ТГФ EtOLi, EtOAc, 40oC, 50 мм. рт. ст.

MeO MeO MeO NHAc NH2 94% OAc MeO MeO MeO Ac2O, Py MeO MeO MeO N N N Me r ac-29 r ac-Me r ac-Me Схема 1.3. Синтез аллоколхициноидов IVa Для формирования семичленного цикла аллоколхициноидов IVa нами предложено использовать реакцию внутримолекулярного каталитического С-Н арилирования арилиодида 31, который, в свою очередь, может быть получен по методу синтеза кетонов Вайнреба (схема 8).

O OMe MeO OMe MeO OMe N MeO Me X MeO I I MeO OMe N Me MeO + [M] O тип IVa реакция AdN N N (синтез кетонов каталитическое Me Me Вайнреба) С-Н арилирование 31 33 M = металл Схема Амид Вайнреба 32 был синтезирован из коммерчески доступной кислоты 5 в стадии с выходом 91% (схема 9). 1-Метилиндол 34 превращали в церийорганический реагент 36 с помощью реакции металлирования трет-бутиллитием и трансметаллирования хлоридом церия(III). Металлорганический реагент использовали in situ в реакции с электрофилом 32. Оптимизация условий проведения трех one pot cтадий позволила получить кетон 31 с выходом 78% при использовании мультиграммовых количеств исходных субстратов. Показано, что реакция литийорганического соединения 35 с амидом 32 приводит к целевому продукту 30 с выходом не более 8%. Следует отметить, что гетероароматические соединения церия (III) к настоящему моменту практически не изучены.

Li CeClN N N CeCl3 (1,05 экв) t-BuLi (1,05 экв) Me Me -5 - 0оС, ~30 сек Me ТГФ, -5 - 0оС 35 10 мин MeO Me N MeO CO2H MeO 91% O 1) (COCl)2, ТГФ MeO MeO I 2) HN(OMe)Me*HCl, Py OMe OMe OMe 3) AgOC(O)CF3, I2, CH2ClMeO 5 I O Me Me MeO Me MeO N N I O NH4Cl водн O CeClMeO N OMe 31 78% Me Схема Превращение производного 31 в тетрациклический кетон 38 было осуществлено с выходом 71% по реакции внутримолекулярного каталитического С-Н арилирования в присутствии каталитической системы Pd(OAc)2 – Cs2CO3 – t-BuCOOH – ДМФ (схема 10). Показано, что энантиоселективное восстановление кетона боран-тетрагидрофурановым комплексом в присутствии (S)-метилоксазаборолидина 39 (восстановление Кори-Бакши-Шибата) приводит к образованию спирта 40 с выходом 90% и 89% ee (схема 10).

H MeO OMe Ph MeO MeO Ph N I OMe O OH O B H 39 MeO MeO Me 71% N N Me Me MeO MeO BH3*ТГФ Pd(OAc)2 (0,1 экв) N O -30oC Cs2CO3, PivOH Me 31 Ar (3 атм), 80oC, ДМФ 90% 89%ee Схема Соединение 40 подвержено легкой дегидратации, в связи с этим превращение кетона 31 в целевой ацетамид 42 было осуществлено через промежуточное образование оксима 41, который восстанавливали системой боргидрид натрия хлорид никеля(II) и ацилировали уксусным ангидридом в пиридине (схема 11). Выход продукта 42 после трех стадий составил 43%.

MeO MeO MeO OH N O NHAc 83% 52% MeO MeO MeO N N N 1) NaBHMe Me Me NH2OH*HCl MeO MeO MeO NiCl2, MeOH пиридин 2) Ac2O, Py EtOH, 85oC 41 r ac- Схема Установлено, что реакция восстановления оксима 41 алюмогидридом лития в тетрагидрофуране протекает иным образом и приводит к азиридину 43, который при хроматографиовании на силикагеле системой растворителей дихлорметан - метанол претерпевает раскрытие цикла с образованием -метоксиамина 44 (схема 12).

Ацилирование производного 44 уксусным ангидридом в присутствии пиридина завершается образованием продукта 45. Ацетамид 45 получен в виде смеси диастереомеров в соотношении ~5:1 с выходом 42% относительно исходного оксима 41. Структура соединения 45 подтверждена методом ЯМР-спектроскопии, массспектрометрии высокого разрешения и РСА (транс-диастереомер).

MeO MeO OH NH N MeO MeO LiAlH4, N N Me Me MeO MeO ТГФ, 66oC rac-MeOH, CH2Clсиликагель NHNHAc MeO MeO 42% OMe OMe (3 стадии) MeO MeO Ac2O, CH2Cl2 N N Me Me MeO MeO пиридин rac-45 rac-Схема 1.4. Синтез аллоколхициноидов IVb По аналогии с соединениями IVa, для формирования семичленного цикла аллоколхициноидов IVb нами предложено использовать реакцию внутримолекулярного каталитического С-Н арилирования производного 46 (схема 13). Применение описанного выше метода синтеза кетонов Вайнреба позволило получить соединение 46 с выходом не более 20%. Поэтому был использован альтернативный подход, включающий реакцию конденсации индолилкетона 47 и бензальдегида 48 и гидрирование двойной связи полученного енона.

MeO OMe MeO X SiMeN O I OMe MeO SEM NH SEM = MeO + O MeO тип IVb O N O кротоновая 46 SEM каталитическое MeO I конденсация С-Н арилирование и восст-е енона OMe Схема Синтез начинали с превращения 1Н-индол-2-карбоновой кислоты 49 в кетон с помощью реакций нуклеофильного присоединения метиллития и N-алкилирования 2-(хлорометокси)этилтриметилсиланом (схема 14). Выход производного 47 составил 86%. Арилиодид 48 был получен из коммерческого реагента 51 с выходом 92% по реакции с N-йодосукцинимидом в присутствии каталитического количества трифторуксусной кислоты. Кротоновая конденсация соединений 47 и 48 в условиях основного катализа приводила к образованию сопряженного енона 52 с выходом 93%.

93% 92% CO2H SEM N N N N O O MeLi, Et2O 1) NaH, DMF H SEM H O 2) SEMCl 35оС 49 50 O O O MeO MeO I 92% 93% N I NIS OMe MeO MeO I NIS, MeCN MeO EtOH/ O NaOH 2M F3CCO2H (кат) OMe 48 OMe 51 OMe Схема Проведен скрининг методов восстановления халконовых систем с целью превращения продукта 52 в синтетический интермедиат 46 (схема 15). Показано, что реакция енона 52 с гидридным комплексом меди (PPh3CuH)6 (реагент Страйкера) в бензоле в присутствии стехиометрического количества воды приводит к образованию продукта восстановления 46 с высоким выходом. Реакция внутримолекулярного каталитического С-Н арилирования соединения 46 в присутствии каталитической системы Pd2(dba)3 t-BuCOOCs ДМФ протекала с образованием тетрациклического продукта 53 (выход 68%). Удаление защитного SEM-фрагмента в производном кислотным гидролизом в этаноле и восстановление карбонильной группы боргидридом натрия позволили получить аллоколхициноиды 54, 55 с высокими выходами (схема 15).

OMe OMe MeO OMe MeO OMe MeO O I I MeO 96% 68% N SEM MeO (PPh3CuH)Pd2(dba)3 (0,1 экв) H2O, C6HO CsO2CBut, ДМФ O N Ar (2 атм), 90oC N SEM SEM HCl aq/EtOH 81% 75oC MeO MeO OH O 97% MeO MeO NH NH NaBHMeO MeO ТГФ/MeOH rac- Схема 1.5. Результаты исследования противоопухолевой активности аллоколхициноидов I-IV Определена цитотоксическая активность аллоколхициноидов I-IV по отношению к штамму лимфомы Беркитта BJAB (Таблица 1). Выявлен ряд соединений (12-15, 18, 19, 25-27), ингибирующих клеточное деление и вызывающих апоптоз в наномолярном/cубнаномолярном интервале концентраций. C помощью LDH-теста показана низкая неспецифическая токсичность указанных производных в концентрациях 0,001-100 мкМ.

Таблица 1 Цитотоксическая активность аллоколхициноидов I-IV по отношению к штамму лимфомы Беркитта BJAB структурн. № IC50 1 AC50 2 Ингибир-е пролифе- Некроз при Х тип (рис.1) соед рации при AC50 [%] AC50 [%] [мкM] [мкM] колхицин 0,02 0,03 - - O 12 0,001-0,005 0,005 84 OH 14 0,01-0,05 0,1 83 I N3 16 0,1-0,5 0,1-0,5 32-93 NHAc 18 0,05-0,1 0,1-0,5 76-99 O 13 <0,001 <0,001 83 (при 0,001М) II OH 15 0,005-0,01 0,01 85 NHAc 19 0,01-0,05 0,01-0,05 24-84 OH 25 0,001 0,001 52 O 26 0,01-0,05 0,05 98 OAc 27 0,01-0,05 0,05 89 III N3 28 ~50 >100 30 NH2 29 0,5-1 5 90 NHAc 30 >100 >100 - - IV NHAc 42 0,1-0,5 0,5 70 O 54 >100 >100 - - V OH 55 >100 >100 - - – концентрация вещества, ингибирующая деление клеток на 50%; параметр определен методом CASY cell counting после 48 часов инкубации концентрация вещества, вызывающая апоптоз 50% клеток; параметр определен по фрагментации ДНК после 72 часов инкубации – параметр определен с помощью LDH-теста после 1 часа инкубации Наиболее активными среди исследованных структурных изомеров являются аллоколхициноиды II, содержащие 4,5-аннелированный 1-метилиндольный фрагмент.

С-7 функциональная группа оказывает существенное влияние на цитотоксические Исследования проведены в группе Dr. A. Prokop, Отделение педиатрической гематологии/онкологии, Детский госпиталь г. Кельн, Германия.

свойства. Общей тенденцией является более высокая активность производных, содержащих С(7)-O связь (рис.1, X = O, OH, OAc) по сравнению с соответствующими С(7)-N аналогами (X = N3, NH2, NHAc).

Исследовано влияние аллоколхициноидов I, II в концентрации 50 нМ на метаболическую активность клеток хронического лимфолейкоза Mec-1 (Таблица 2). Наибольшее снижение метаболической активности вызвало соединение 15.

Таблица 2 Цитотоксическая активность аллоколхициноидов I,II по отношению к штамму хронического лимфолейкоза Мес-1 по результатам XTT-теста колхицин 12 13 14 15 16 18 метаболическая 10 100 32 35 26 98 77 активность [%]Величина рассчитана относительно контрольного эксперимента без терапевтического агента Проведен сравнительный анализ апоптоз-индуцирующей активности аллоколхициноида 15, колхицина и клинического препарата винкристина по отношению к нескольким штаммам хронического лимфолейкоза, в том числе к первичным клеткам (CLL1-CLL4), полученным после проведения биопсии у четырех пациентов. На основании полученных данных рассчитаны параметры IC50 (таблица 3).

В случае первичных клеток CLL1-4 цитотоксичность аллоколхициноида превысила активность винкристина и уступила активности колхицина.

Таблица 3 Цитотоксическая активность аллоколхициноида 15, колхицина и винкристина по отношению к различным штаммам хронического лимфолейкоза по результатам проточной цитометрии FACS IC50 [нМ] Mec-1 SU-DHL-5 СLL1 CLL2 CLL3 CLLколхицин 13 10 20 14 11 15 11 11 60 76 33 винкристин 45 ~ 0,4 172 90 119 1 Показано, что механизм биологического действия аллоколхициноида аналогичен таковому для колхицина и винкристина и заключается в нарушении формирования веретена деления клетки, ведущем к остановке клеточного цикла в фазе G2/M, и, впоследствии, к апоптозу.

Исследования проведены в группе Dr. G. Krause, Department of Internal Medicine, Center for Integrated Oncology Kln Bonn, Кльнский университет, Германия.

2. Синтез липофильных производных колхицина, аллоколхицина и комбретастатина А-2.1. Синтез липофильных производных колхицина и аллоколхицина В работе синтезированы новые 7-(1',2',3'-триазолил)замещенные аналоги природных противоопухолевых агентов колхицина и аллоколхицина, а также их липофильные формы на основе олеиновой и пальмитиновой кислот.

Целевые соединения были получены в 5-6 стадий из природного колхицина (схема 16). Трехстадийное удаление ацетильной группы алкалоида 56 проводили в соответствии с известной методикой [J. Org. Chem. 2004, 69, 8987].

Дезацетилколхицин 59 превращали в азид 60 по реакции диазотрансфера c трифлилазидом в присутствии карбоната калия и каталитического количества сульфата меди(II). Применение данного подхода позволило получить продукт 60 с суммарным выходом 4 стадий 48%.

MeO MeO MeO Ac NHAc NHBoc N Boc MeO 2 MeO MeO Boc2O, DMAP MeONa (0,2 экв) MeO MeO MeO Et3N, MeCN MeOH, 25oC O O O 45 мин OMe 57 58 OMe OMe (-)-(aR, 7S)-колхицин CF3COOH, CH2Cl2 80% (3 стадии) MeO MeO NNHDMAP = N NMe60% MeO MeO F3CS(O)2N3 в CH2Cl2 MeO O MeO K2CO3, MeOH/H2O O O Cu(OAc)2 (0,01 экв) Boc = OBu-t 60 OMe OMe Схема Превращение колхициноида 60 в алло-аналог 63 было осуществлено с применением классической методики, описанной Фернхольцем в 1950 году для аналогичной трансформации (нагревание с избытком метилата натрия в метаноле, схема 17) [Liebigs Ann. Chem. 1950, 568, 63]. Возможный механизм данной основнокатализируемой перегруппировки с сокращением цикла представлен на схеме 17. Мы предполагаем, что на первом этапе происходит обратимое нуклеофильное присоединение метокси-аниона к карбонильной группе трополонового фрагмента, приводящее к неароматическому интермедиату 61, который далее претерпевает термическую дисротаторную 6-электроциклизацию с образованием норкарадиена Использована нумерация колхицина, схема 62. Фрагментация циклопропанового кольца интермедиата 62 сопровождается перераспределением кратных связей и элиминированием метокси-аниона, приводя к ароматическому аллоколхициноиду 63.

MeO MeO N3 N54% MeO MeO MeONa (2 экв) MeO MeO MeOH, 75oC O 60 O OMe MeO + MeO - MeO MeO MeO 6 DIS NNMeO MeO OMe MeO MeO OMe O O 61 MeO OMe Схема Азиды 60 и 63 использовали в реакции медь(I)-катализируемого диполярного [3+2]-циклоприсоединения с пропаргиловым спиртом и пропаргиловыми эфирами олеиновой и пальмитиновой кислот (схема 18).

MeO MeO N N 92-95% N3 N O R + MeO MeO R O CuSO4, NaAsc MeO MeO t-BuOH/H2O, MW 80-90oC 60, 63 64-MeO MeO MeO N N MeO MeO N MeO N N N N N N MeO MeO MeO OH O O O O O O O OMe 64 94% OMe 66 96% 67 89% OMe MeO MeO MeO N N MeO N MeO MeO N N N N N N MeO MeO MeO O OH O O CO2Me CO2Me CO2Me O 65 95% 90% 69 92% Схема Проведение взаимодействия в микроволновом реакторе в присутствии каталитической системы CuSO4 аскорбат натрия t-BuOH H2O позволило получить целевые триазолсодержащие соединения 64, 65 и их липофильные пролекарственные формы 66-69 с выходами 89-96%.

Следует отметить, что производные 66-69 содержат биодеградируемую сложноэфирную связь, способную претерпевать внутриклеточный гидролиз под действием ферментов (эстераз) с высвобождением исходного терапевтического агента (64 либо 65). Эти соединения были использованы для включения в состав липосомных частиц-носителей лекарств.

2.2. Результаты исследования противоопухолевой активности соединений 58-и липосомных препаратов на их основе С помощью DAPI-теста изучена способность соединений 64-69 ингибировать полимеризацию белка тубулина, который является биологической мишенью колхицина. Показано, что производные 64 и 65 ингибируют полимеризацию белка (мг/мл) в концентрации 40 мкМ. Колхициноиды 66, 67 проявляют умеренную ингибирующую активность в данной концентрации, в то время как аллоколхициноиды 68, 69 не оказывают воздействия на полимеризационный процесс.

Известно, что колхицин ингибирует полимеризацию тубулина (3 мг/мл) в концентрации 3 мкМ [ChemMedChem 2010, 5, 661].

Исследована антимитотическая и апоптоз-индуцирующая активность соединений 64-69 по отношению к штамму лимфомы BJAB (таблица 4) †.

Таблица 4 Цитотоксическая активность соединений 64-69 по отношению к штамму лимфомы Беркитта BJAB Колхицин 64 66 67 65 68 IC50 [нM]1 20 25 4 6 300 15000 200AC50 [нM]1 30 25 8 8,5 800 10000 180 - параметр определен методом CASY cell counting после 48 часов инкубации - параметр определен по фрагментации ДНК после 72 часов инкубации Показано, что цитотоксичность колхициноида 64 примерно равна активности колхицина, в то время как липофильные пролекарства 66, 67 являются более эффективными ингибиторами клеточного деления. Поскольку способность производных 66, 67 нарушать полимеризацию тубулина ниже таковой для соединения 64, повышение их противоопухолевой активности in vitro может быть обусловлено вторичными эффектами, такими как улучшенный транспорт липофильных форм сквозь плазматическую мембрану клетки. С помощью LDH-теста показана низкая неспецифическая токсичность соединений 66, 67 в интервале концентраций 1 нМ – 100 мкМ (после инкубации в течение 1ч некроз клеток BJAB составил не более 3%).

Исследования проведены в группе Prof. H. Oschkinat, Институт молекулярной фармакологии, Берлин † Исследования проведены в группе Dr. A. Prokop, Отделение педиатрической гематологии/онкологии, Детский госпиталь г. Кельн, Германия.

В отличие от производных колхицина, алло-аналог 65, и, в особенности, его липофильные производные 68, 69 продемонстрировали на несколько порядков меньшую цитотоксичность.

Методом экструзии получены моноламеллярные липосомы (85±36 нм), состоящие из природных фосфолипидов (фосфатидилхолин /фосфатидилинозит, 8:1, 90 мольн%) и липофильного производного 66 либо 67 (10 мольн%) (рис. 3).

MeO N N N O MeO MeO O O мембранный якорь OMe MeO N N N O MeO MeO O Липофильное соединение 66 или O Фосфолипиды OMe Рис. 3 Состав терапевтических липосом Исследована in vitro противоопухолевая активность колхициноида 64, соединений 66, 67, а также их липосомных форм L66 и L67 по отношению к нескольким типам опухолевых клеток человека (таблица 5). Данные препараты проявляют цитотоксические свойства в наномолярных концентрациях (2,5 100 нМ) и оказывают дозозависимый ингибирующий эффект на клеточную пролиферацию.

Все линии опухолевых клеток, за исключением Т-лимфомы Jurkat, показали более высокую чувствительность к липофильным производным 66, 67 по сравнению с колхициноидом 64. Включение олеоильного эфира 66 в состав липосом привело к увеличению цитотоксичности (1,5-3 раза).

Таблица 5 Цитотоксическая активность колхициноида 64, липофильных производных 66, 67 и их липосомных форм L66 и L67 по результатам МТТ-теста линия клеток 64 66 67 L66 LHBL-100 9 3,5 3,5 2,5 4,K562 40 20 16 8,5 IC50 (нМ) HaCaT 35 27 15 9 Jurkat 10 15 30 100 Исследовано влияние соединений 64, 66, 67 на протекание клеточного цикла и апоптоз штаммов HBL-100, HaCaT, Jurkat (рис. 4). Показано, что высокая Исследования проведены в группе проф. Е. Л. Водовозовой, Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, г. Москва.

восприимчивость клеток HBL-100 к действию колхициноидов обусловлена блокированием клеточного цикла в фазе G2/M в сочетании с повышением количества апоптотических клеток. Основным механизмом воздействия колхициноидов на клетки линий HaCaT и Jurkat является индуцирование апоптоза.

ДМСО ДМСО HBL-1Jurkat 66 LLLLДМСО HaCaT LL Рис. 4 Влияние колхициноидов 64, 66, 67 и липосомных форм L66, L67 в концентрации 1 мМ на протекание клеточного цикла штаммов HBL-100, HaCaT, Jurkat после 48 часов инкубации 2.3. Синтез липофильных производных комбретастатина А-4 (СА-4) Комбретастатин А-4 синтезировали по известной методике [Tetrahedron Lett.

2007, 48, 7007] исходя из коммерчески доступного 3,4,5-триметоксибензальдегида в 5 стадий с суммарным выходом 26% (схема 19). Противоопухолевый агент 70 далее переводили в липофильные производные 71, 72 с хорошими выходами по реакции ацилирования хлорангидридами олеиновой и пальмитиновой кислот.

O 26% R (5 стадий) MeO O MeO O MeO OH 1) NaH MeO ТГФ MeO MeO OMe OMe OMe OMe OMe 2) RCOCl 51 комбретастатин А-4 : R = C17H33 67% 72: R = C15H31 72% Схема 2.4. Результаты исследования in vivo противоопухолевой активности липофильных производных СА-4 в составе адресных липосом Методом экструзии получены моноламеллярные липосомы (85±36 нм), состоящие из природных фосфолипидов (фосфатидилхолин 75 мольн% и фосфатидилинозитол 10 мольн%), липофильного производного 71 (13 мольн%) и олигосахаридного лиганда SiaLeX (2 мольн%), обладающего сродством к белкам селектинам, экспрессируемым на мембранах эндотелиальных клеток опухолевых тканей (рис. 4).

Рис. 4 Состав адресных терапевтических липосом Противоопухолевый эффект полученного липосомного препарата исследован in vivo на линии мышей BLRB/BYRB, характеризующейся высокой частотой спонтанного возникновения рака молочной железы. Препараты SiaLeX-липосом с пролекарством 71 (0,2 мл дисперсии в фосфатном буферном растворе, 22 мг/кг в эквивалентной дозе по CA-4 70) вводили экспериментальным животным (n = 4) внутривенно 3 раза с интервалом в одну неделю после достижения опухолями диаметра ~ 10 мм (объема ~ 0.5 см3). У трех из четырех исследованных животных трехкратная инъекция липосомного препарата (4, 5 и 6 недели) вызвала остановку развития опухоли. Противоопухолевый эффект отсутствовал в одном из исследованных случаев.

Исследования проведены в группе проф. Е. Л. Водовозовой, Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, г. Москва.

ВЫВОДЫ 1. Впервые разработаны методологии получения и осуществлен синтез структурных аналогов природного антимитотического агента аллоколхицина – 1замещенных 1,2,3-триметоксибензо[4,5:4,5]1H-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-e или 2,3-f или 3,2-f]1H-1-метилиндолов I-III и 1,2,3-триметоксибензо[4,5:4,5]1H-6,7дигидроциклогепта[2,3-b]1H-индолов IV.

2. Установлено, что некоторые гетероциклические аллоколхициноиды проявляют антимитотическую и апоптоз-индуцирующую активность по отношению к штамму лимфомы Беркитта BJAB в нано/cубнаномолярных концентрациях и обладают низкой неспецифической токсичностью. Показано, что 1,2,3-триметоксибензо[4,5:4,5]1H6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта[2,3-e]1H-1''-метилиндол ингибирует фазу G2/M клеточного цикла и индуцирует апоптоз нескольких штаммов клеток хронического лимфолейкоза в наномолярном интервале концентраций. Данное соединение по цитотоксичности превосходит клинический препарат винкристин, используемый в терапии лимфолейкозов.

3. Впервые синтезированы 7-триазолилзамещенные производные колхицина и аллоколхицина по реакции каталитического диполярного [3+2]-циклоприсоединения 7-азидоколхицина и 7-aзидоаллоколхицина с пропаргиловым спиртом и пропаргиловыми эфирами олеиновой и пальмитиновой кислот.

4. Установлено, что липофильные триазолзамещенные производные колхицина, а также липосомные препараты на их основе обладают цитотоксической активностью по отношению к пяти штаммам опухолевых клеток человека в наномолярном интервале концентраций.

5. Впервые получены липофильные пролекарственные формы комбретастатина А-4, содержащие остатки олеиновой и пальмитиновой кислот. Установлено, что фосфолипидные липосомы, несущие олеоильное производное комбретастатина А-4 и углеводный лиганд селектинов SiaLeX, обладают способностью подавлять развитие опухоли у мышей линии BLRB/BYRB со спонтанно возникающим раком молочной железы.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Nicolaus N., Reball J., Sitnikov N., Velder J., Termath A., Fedorov A.Yu., Schmalz H.-G. A Convenient Entry to New C-7-Modified Colchicinoids through Azide Alkyne [3+2] Cycloaddition: Application of Ring-Contractive Rearrangements // Heterocycles – 2011. – V. 82. – P. 1585-1600.

2. Moiseeva E.V., Kuznetsova N.R., Svirshchevskaya E.V., Bovin N.V., Sitnikov N.S., Shavyrin A.S., Beletskaya I.P., Combes S., Fedorov A.Yu., Vodovozova E.L.

Liposome Formulations of Combretastatin A-4 and Its 4-Arylcoumarin Analogue Prodrugs: the Antitumor Effect in the Mouse Model of Breast Cancer // Biochemistry (Moscow) Suppl. Ser. B: Biomed. Chem. – 2011. V. 5 – P. 276-283.

3. Ситников Н.С., Болдырев И.А., Моисеева Е.В., Шавырин А.С., Белецкая И.П., Комб С., Бовин Н.В., Федоров А.Ю., Водовозова Е.Л. Противоопухолевые липосомы с пролекарством комбретастатина А-4 и тетрасахаридным лигандом селектинов // Изв. АН Сер. Хим. – 2010. – Вып. 12. – С. 2234-2240.

4. Sitnikov N.S, Velder J., Prokop A., Fedorov A.Yu., Schmalz H.-G. Synthesis and biological evaluation of indole-containing allocolchicinoids // Abstracts of the International Butlerov Congress on Organic Chemistry. – Kazan, Russia. – 2011. – P.

187-188.

5. Ситников Н.С., Федоров А.Ю., Вельдер Я., Шмальц Г.-Г. Синтез индолсодержащих аллоколхициноидов // Материалы XIV Молодежной конференции по органической химии. – Екатеринбург. – 2011. – С. 221-223.

6. Ситников Н.С., Вельдер Я., Шмальц Г.-Г., Федоров А.Ю. Синтез и исследование противоопухолевой активности индолсодержащих аналогов аллоколхицина // Материалы XVI Нижегородской сессии молодых ученых.

Естественные науки. – Нижний Новгород. – 2011. – С. 157-158.

7. Ситников Н.С., Федоров А.Ю., Вельдер Я., Шмальц Г.-Г. Синтез индолсодержащих аллоколхициноидов // Материалы всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии». – Казань. – 2010. – С. 65.

8. Fedorov A.Yu., Sitnikov N.S., Vodovozova E.L., Schmalz H.-G., Velder J., Beletskaya I.P. Development of liposomic drug delivery systems for the selective transport of colchicines site antitumour agents // Abstracts of the International conference «Topical Problems of Organometallic and Coordination Chemistry». – Nizhny Novgorod. – 2010. – P21.

9. Ситников Н.С., Федоров А.Ю., Водовозова Е.Л., Моисеева Е.В. Создание липосомных систем селективной доставки антимитотических агентов к опухолевым тканям // Материалы XV Нижегородской сессии молодых ученых.

Естественные науки. – Нижний Новгород. – 2010. – С. 141-142.

10. Ситников Н.С., Моисеева Е.В., Болдырев И.А., Кузнецова Н.Р., Водовозова Е.Л., Белецкая И.П., Федоров А.Ю. Создание липосомных систем селективной доставки антимитотических агентов к опухолевым тканям // Материалы Всероссийской конференции по органической химии. – Москваю – 2009. – С.

387.

Благодарности Автор выражает благодарность за ценные научные консультации и помощь академику РАН Белецкой И.П. (МГУ им. М.В. Ломоносова), проф. Шмальцу Г.-Г.

(Кльнский университет, Германия), д.х.н. Водовозовой Е.Л. (ИБХ РАН), д.х.н.

Фукину Г.К. (ИМХ РАН), к.х.н. Вельдер Я. (Кльнский университет, Германия), к.х.н.

Малышевой Ю.Б. (ННГУ им. Н.И. Лобачевского), к.х.н. Дрэгичу А.И. и фирме ДАЛХИМ, аспиранту Нючеву А.В. (ННГУ им. Н.И. Лобачевского).




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.