WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи

Черный Евгений Станиславович

Галектин-опосредованное связывание вируса гриппа с клеткоймишенью

02.00.10 – биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2012

Работа выполнена в лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ИБХ РАН). Заведующий лабораторией – доктор химических наук, профессор, Н.В. Бовин.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией углеводов ИБХ РАН, Н.В. Бовин ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

1. Водовозова Елена Львовна, доктор химических наук, ИБХ РАН 2. Бурцева Елена Ивановна, доктор медицинских наук, ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится 10 октября 2012 года в 10.00 на заседании диссертационного ученого совета Д.002.019.01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117991 ГСП-1, Москва В-437, ул. МиклухоМаклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН Автореферат разослан 7 сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Вирус гриппа – один из наиболее изученных объектов среди возбудителей опасных заболеваний человека. Тем не менее, в начале 21 века человечество фактически не имеет ни надежного лекарства против него, ни системы вакцинации, способной гарантированно предотвратить заболевание. Поэтому расширение представлений о структурной организации, рецепторной специфичности и репликации вируса в организме хозяина, с целью разработки принципиально новых подходов к терапии предупреждению этого заболевания, является крайне актуальной задачей.

Стадии первичного связывания и проникновения вируса гриппа в клетку-мишень активно изучаются; в результате, устоявшиеся представления о том, что единственным и достаточным рецептором вируса гриппа являются сиалогликаны, регулярно подвергаются сомнению. Современные исследования говорят о возможном существовании дополнительных факторов, способствующих адгезии вирионов на поверхности клетки.

Поэтому поиски в данной области являются актуальной задачей, решение которой может привести к разработке нового поколения блокаторов адгезии вируса гриппа. Кроме того, изучение иммунного ответа, прежде всего к поверхностным гликопротеинам вируса гриппа, открывает возможности разработки новых иммунотерапевтических подходов.

Цели и задачи исследования.

Целью данной кандидатской диссертации являлось обнаружение дополнительных факторов рецепции вируса гриппа на начальной стадии заражения клеток.

Предполагалось решить следующие задачи:

1. Изучить возможность связывания вируса гриппа с другими углеводами клетки человека, помимо классических лигандов – сиалогликанов.

2. Проверить экспериментально гипотезу о возможности связывания галектинов с вирусом гриппа и установить роль этих белков во взаимодействии вирусных частиц с клеткой-мишенью.

3. Изучить влияние галектинов на свойства поверхности вируса гриппа, в том числе – на связывание антител.

Научная новизна.

В данной работе впервые показано, что в процессе взаимодействия вируса гриппа с клеткой-мишенью способны принимать участие углеводсвязывающие белки – галектины; их роль в инфекционном цикле сложна и неоднозначна:

- большинство (но не все) представителей семейства куриных и человеческих галектинов связываются с вирусом;

- галектины, не смотря на способность увеличивать адгезию вируса, выступают как фактор препятствующий проникновению вируса гриппа в клетку;

- даже при отсутствии сиало-рецептора, галектины могут обеспечивать высокий уровень адгезии вируса на клетке;

- связывание галектинов с вирусом гриппа не приводит к изменению функциональных свойств гемагглютинина и нейраминидазы, но маскирует их антигенные детерминанты.

Практическая значимость.

Обнаруженная компенсаторная роль галектинов при отсутствии сиалорецепторов на клетке заставляет по-новому относиться к терапевтическим методам, нацеленным на ингибирование сиало-опосредованного заякоревания вируса гриппа.

Галектин-опосредованную адгезию вируса гриппа на клетке необходимо учитывать в производстве живых вакцин, которые получают наращиванием вируса в клеточных культурах.

Найденный эффект ингибирования галектинами протективных антивирусных антител открывает новую возможную область для совершенствования антивирусной иммунотерапии.

Публикации и апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах. Основные материалы диссертации были представлены на следующих международных конференциях:

Summer Course Glycosciences (Нидерланды, 2008), Annual Conference of the Society for Glycobiology (Сан-Диего, 2009).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 150 cтраницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного структурной организации вируса гриппа и общей характеристике класса галектинов, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы; содержит 58 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

На поверхности вируса гриппа располагаются два гликопротеина – гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA). НА инициирует инфекцию, связываясь с сиалогликанами на клетке-мишени, NA отщепляет сиаловую кислоту с углеводных цепей гликоконъюгатов, причем не только клетки, но и с поверхности вирионов. Таким образом, NA препятствует агрегации вирусных частиц и обеспечивает их успешное высвобождение из зараженной клетки.

Согласно устоявшимся представлениям, только сиалогликаны являются молекуламирецепторами для вируса гриппа. Однако, в литературе был описан факт заражения десиалилированных клеток и, таким образом, возникли экспериментальные предпосылки к тому, что возможно вирус гриппа использует альтернативные или дополнительные рецепторы при адгезии на клетках. В связи с этим, мы предположили три механизма рецепции вируса гриппа, не требующих сиалогликанов:

1) HA или NA имеют лектино-подобные, углеводсвязывающие сайты, «настроенные» на несиалилированные структуры.

2) В процессе отпочковывания вирионов, в составе вируса гриппа оказывается белок (или белки) клетки-хозяина, которые впоследствии взаимодействуют с собственными комплементарными молекулами (не обязательно углеводными) на поверхности клеткимишени.

3) Так как оба поверхностных белка (НА и NA) вируса гриппа сильно гликозилированы, то дополнительную адгезию осуществляют углевод-связывающие белки клетки-хозяина – лектины.

Каждый из этих механизмов имел право на существование, благодаря наличию подтверждающих литературных фактов. Было известно, что NA, кроме каталитического сайта связывания сиалогликанов, имеет так называемый НВ-сайт, специфичность и назначение которого до конца не установлены. Другой гликопротеин вируса гриппа – НА, также предположительно имеет потенциальный дополнительный сайт связывания, который изучен в еще меньшей степени, чем НВ-сайт. Белки клетки-хозяина, которые не кодируются геномом вируса, были действительно обнаружены в составе вирионов, и по-видимому захватываются с поверхности в процессе баддинга. Согласно литературным данным, Автор выражает благодарность: А.С.Гамбарян (Институт полиомелита РАМН, Москва) за помощь в выращивании вирусов, Е.М.Рапопорт (ИБХ РАН, Москва) за предоставление реактивов и помощь в клеточной работе, Е.Ю.Корчагиной (ИБХ РАН, Москва), за синтез Fluo-DOPE и обсуждение работы, Л.В.Кордюковой (НИИ ФХБ, Москва), за рекомендации в проведении ряда экспериментов, Т.Гардеру (Институ ФридрихаЛеффлера, Грайфсвальд, Германия) за сотрудничество в проведении работы, М.Н.Матросовичу (Марбургский университет имени Филиппа, Марбург, Германия) за предоставление культуры MDCK6SIAT, Е.И.Бурцевой (НИИ Вирусологии, Москва) за предоставление вируса H1N1 Москва и человеческой сыворотки и Г.И.Габиусу (Мюнхен, Германия) за предоставление галектинов.

полученным с помощью протеомных методов, в вирионы гриппа может включаться до различных белков. Вопрос, является ли такой захват специфическим и важен ли он для последующего распространения инфекции, остается открытым.

1. Проверка первых двух предположений. Прежде всего, необходимо было убедиться, что в составе вируса гриппа действительно присутствуют белки клетки-хозяина.

В нашей работе, с помощью метода электрофореза было проведено разделение очищенных вирионов и идентифицированы все известные компоненты вируса, основываясь в том числе на литературных данных. Кроме основных структур вируса, как и описано в литературе, на электрофорезе было обнаружено наличие дополнительных белков. Эти компоненты соответствовали предполагаемым белкам клетки-хозяина, среди которых могли быть лектины, поэтому далее мы исследовали связывание вируса гриппа с рядом гликанов.

Для изучения неизвестных рецепторных свойств гликопротеинов вируса и возможной роли клеточных белков использовался твердофазный анализ, в котором вирусы гриппа взаимодействуют с биотинилированными полиакриламидными гликоконъюгатами (GlycPAA-biot). Известно, что лигандами для вируса гриппа являются сиалилированные олигосахариды (6’SiaLacNAc (6’SLN) и 3’SiaLacNAc (3’SLN), поэтому их использовали как положительный контроль. Выбор гликанов, «нетипичных» для вируса, основывался на нескольких известных научных. Ранее было показано, что вирусы гриппа могут связываться c сульфатированным производным лактозы. Подобные структуры типичны для респираторных муцинов, поэтому в группу протестированных был включен гликоконъюгат, несущий 6’HSO3LacNAc. Кроме того, имелись предпосылки к тому, что вирус связывается с GalNAc, поэтому в эксперимент включили гликаны с терминальным остатком Nацетилгалактозамина: GalNAc1-3GalNAcFs-2), GalNAc-OSer, GalNAc (Tn), и GalNAc1-4(Fuc1-2)Gal1-4GlcNAc и ряд контрольных конъюгатов. Эксперименты провели на четырех различных штаммах (A/NIB/26/90 (H3N2), A/СССР/90/77 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и A/FPV/Rostock/34 (H7N1), но ни один из тестированных гликанов, кроме сиалилированных, не связывался с образцами вирусов (Рис. 1, приведено для одного вируса).

Таким образом, с помощью твердофазного анализа не удалось обнаружить вируссвязывающих гликанов, отличных от сиалозидов, а гипотезы о том, что HA, NA или приобретенные белковые компоненты в составе вируса гриппа, могут играть роль в инициации адгезии без сиалогликанов не нашли экспериментального подтверждения.

1,6'SLN 1,3'SLN 0,GalNAc1-4(Fuc12)Gal1-4GlcNAc 0,Fs-0,0,GalNAc-O-Ser 0 5 10 Tn -0,концентрация конъюгата, мкМ Рисунок 1. Связывание вируса гриппа A/NIB/26/90 (H1N1) с глико-конъюгатами Glyc-PAAbiot в твердофазном анализе.

2. Гипотеза о взаимодействии вируса гриппа с галектинами. Вирус гриппа плотно покрыт НА и NA, которые занимают большую часть его поверхности. Оба белка обильно гликозилированы, и каждая субъединица может нести несколько углеводных цепей комплексного или олигоманнозного типа. Состав этих цепей варьирует между штаммами, но для преимущественного числа вирусов общим свойством является наличие большого числа комплексных цепей с терминальными остатками галактозы. В белках млекопитающих галактоза как правило маскирована сиаловой кислотой, тогда как в составе вируса гриппа, благодаря действию NA, те же цепи в составе вирионов всегда десиалилированны. Из-за этого поверхность вируса гриппа приобретает необычный, уникально плотный паттерн галактозидов. Мы предположили, что такая поверхность может служить высокоаффинной мишенью для галактозидсвязывающих белков – галектинов.

В данной работе был протестирован ряд куриных (chicken galectin (CG)-1A, CG-1B, CG-2, CG-3 и CG-8I) и человеческих (human galectin (hG)-1, hG-2, hG-3, hG-4, hG-7 и hG-8) галектинов. Большая часть экспериментов проводилась на куриных белках, что обусловлено несколькими причинами. Во-первых, птичьи вирусы гриппа изучены лучше всего, а образцы штаммов выращенные на куриных эмбрионах более доступны, и их значительно легче получать в чистом виде. Во-вторых, параллельное исследование человеческой и птичьей систем открывало возможность сравнения видозависимости изучаемых процессов.

На начальном этапе работы факт взаимодействия галектинов с вирусами гриппа был подтвержден с помощью твердофазного анализа, аналогичного методу изучения связывания с гликоконъюгатами. Для этого вирус сорбировали на 96-луночном планшете и далее детектировали связывание с галектинами меченными антителами к этим белкам (данные не показаны). Взаимодействие было продемонстрировано на четырех штаммах: A/NIB/23/Поглощение, 492 нм (H1N1), A/Duck/France/46/82 (H1N1), A/PuertoRico/8/34 (H1N1) и A/FPV/Rostock/34 (H7N1), и это мотивировало дальнейшее, более детальное исследование галектинов.

3. Влияние галектинов на функции HA и NA вируса гриппа. Можно предположить, что связывание галектинов с поверхностью вируса гриппа приведет к изменению функциональной активности гемагглютинина и нейраминидазы, так как некоторые из их углеводных цепей находятся рядом с углеводсвязывающим сайтом.

Твердофазным методом (см. выше) было проверено три вирусных штамма, два из которых были птичьи – A/FPV/Rostock/34 (H7N1), A/Duck/France/46/82 (H1N1), и один человеческий – A/NIB/23/89-МА (H1N1), все выращены на куриных эмбрионах. В качестве функционального теста использовалось взаимодействие вирусного НА с его рецептором в виде конъюгата 3'SLN-PAA-biot, к которому все три штамма обладали высоким сродством.

Было обнаружено, что при нагрузке на вирусы галектина CG-1A уровень взаимодействия с 3’SLN несколько снижался, тогда как CG-1B, CG-2, CG-3, hG-8 и hG-1 влияния не оказывали (Рис. 2).

Ферментативную активность NA исследовали с помощью флуоресцентно меченых субстратов 3’SiaLac-BODIPY или 3’SiaLacNAc-BODIPY. Перед добавлением субстрата вирус инкубировали с галектинами (20 мкг/мл) в течение 1 часа, то есть времени, которого заведомо достаточно для нагрузки галектинов. CG-1A, -2 и -3 не оказывали существенного влияния на каталитические свойства вирусов гриппа (Рис. 3). По-видимому, на поверхности вириона галектины преимущественно присоединяются к углеводным цепям НА, либо связывание с NA стерически не затрагивает каталитический центр и не мешает отщеплению сиаловых кислот. Таким образом, в этой серии экспериментов было установлено, что влияние галектинов на функциональные свойства гликопротеинов поверхности вируса гриппа проявляется слабо, либо отсутствует вовсе.

Вирус 1,1,hG-1,CG-1A 1,CG-1B 0,CG-0,0,CG-0,0 2 4 концентрация гликоконъюгата, мкМ Рисунок 2. Связывание вируса гриппа A/Duck/France/46/82 (H1N1) с гликоконъюгатом 3’SLNPAA-biot в присутствии галектинов.

а) б) вирус вирус вирус+CG-вирус+CG-вирус+CG-1A вирус+CG-вирус+CG-1A 0 20 40 60 0 20 40 60 Рисунок 3. Расщепление (выражено в %) вирусами гриппа a) A/FPV/Rostock/34 (H7N1) и б) A/Duck/France/46/82 (H1N1) субстратов 3’SL-BODIPY и 3’SLN-BODIPY соответственно, в присутствии галектинов.

4. Ингибирование галектинами связывания антител с вирусом гриппа.

Поскольку галектины не влияют на активность НА и NA, мы предположили, что их связывание с вирионами выполняет иную функцию, а именно – маскирует антигенные свойства вируса гриппа.

Из литературы известно, что гликозилирование НА и NA связано с адаптацией к организму хозяина. С одной стороны, существует направленное уменьшение числа сайтов гликозилирования, как например при адаптации к организму мышей. Наличие или отсутствие углеводных цепей в этом случае является частью регуляторного механизма и может приводить к изменению рецепторной специфичности вируса или к повышению его устойчивости к маннозо-связывающим белкам. С другой стороны, у человеческих штаммов вируса обнаружена тенденция к увеличению степени гликозилирования. Как результат – углеводные цепи НА и NA могут маскировать антигенные детерминанты и предотвращать связывание защитных антител c вирусом. Основываясь на этом, мы предположили, что поглощение, 492 нм связывание галектинов с гликанами НА и NA будет усиливать эффект маскировки антигенных детерминант, или давать этот эффект, даже когда сама по себе углеводная цепь не оказывает заметного влияния.

Роль галектинов в качестве ингибиторов на поверхности вирионов была изучена с помощью описанного выше твердофазного анализа. Нагруженные галектином птичий A/Duck/France/46/82 (H1N1) и человеческий A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) вирусы сорбировали на планшете, после чего наносили поликлональные противовирусные антитела к штамму Н1N1 (коммерческие, Abcam, получены к штамму A/СССР/90/77 (H1N1)). Как и предполагалось, нагрузка галектинов на вирионы привела к ухудшению связывания антител (Рис. 3). Наибольший ингибирующий эффект для обоих вирусов проявлял CG-2 и, в меньшей степени – CG-1A. Один из галектинов – CG-3, влияния не оказывал. Между штаммами вируса также наблюдались различия, в частности, CG-1B выступал как ингибитор только для человеческого (Рис. 4а), но не птичьего вируса (Рис. 4б).

а) б) CG-1A CG-1A CG-1B CG-1B CG-2 CG-CG-3 CG--5 5 15 -5 5 15 --концентрация галектина, мкг/мл концентрация галектина, мкг/мл Рисунок 4. Ингибирование галектинами связывания поликлональных антител с вирусами a) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и б) A/Duck/France/46/82 (H1N1).

Углеводный состав цепей вируса, который влияет на связывание с галектином, целиком определяется аппаратом гликозилирования клетки-хозяина. Поэтому в следующем варианте эксперимента было проведено сравнение двух вариантов одного штамма вируса.

Человеческий A/NIB/23/89-MA (H1N1) был одновременно выращен на куриных эмбрионах (вариант Е) и в культуре клеток MDCK (вариант С). Как и ожидалось, наблюдались существенные различия. В то время как птичьи галектины CG-1A и CG-2 оказывали ингибиторное действие в обоих случаях, человеческие галектины hG-1 и hG-8 выступали ингибиторами только для С-варианта вируса (Рис.5).

% ингибирования % ингибирования a) б) hG-1 hG-hG-hG-CG-1A CG-1A CG-CG--5 5 15 -5 5 15 --концентрация галектина, мкг/мл концентрация галектина, мкг/мл Рисунок 5. Ингибирование галектинами связывания поликлональных антител с алантоисным – a) и культуральным – б) вариантами вируса A/NIB/23/89-MA (H1N1).

Аналогично действовали поликлональные антитела в составе сыворотки крови, полученной от людей, переболевших гриппом. В этом случае, тестировали сезонный штамм вируса А/Москва/17/98 (H1N1), выращенный на культуре клеток MDCK. С куриными галектинами CG-1A и CG-2 наблюдалась высокая степень блокировки (Рис. 6а), а из человеческих галектинов наибольшей активностью обладали hG-1 и hG-2 (Рис. 6б).

Специфичность эффектов, оказываемых галектинами, косвенно подтверждается тем, что степень ингибирования для разных белков различалась, а один галектин, а именно hG-3, вообще не оказывал никакого действия (Рис. 6б).

а) б) 1hG-CG-1A CG-1B hG-CG-2 hG-hG-hG-0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 --концентрация галектина, мкг/мл концентрация галектина, мкг/мл Рисунок 6. а) Ингибирование куриными и б) человеческими галектинами связывания человеческой сыворотки с вирусом А/Москва/17/98 (H1N1).

Следующим шагом было изучение препарата внутривенного иммуноглобулина (ИГВВ), который представляет собой суммарный набор антител из пула сывороток как минимум 1000 доноров. Такие пулы могут содержать антитела к вирусу гриппа, направленные против консервативных антигенных сайтов и, таким образом, потенциально способные защищать организм от всех штаммов вируса.

% ингибирования % ингибирования % ингибирования % ингибирования Для человеческих вирусов, а именно A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и А/Москва/17/(H1N1), было показано, что при концентрациях ИГВВ 25 и 50 мкг/мл соответственно наблюдается высокая степень ингибирования их связывания человеческими галектинами.

Все без исключения галектины блокировали связывание ИГВВ с вирусом гриппа, а наиболее эффективное действие оказывали, как и в случае сыворотки, человеческие галектины hG-1 и hG-2, ингибирование которыми достигало 90% (Рис. 7).

Полученные данные представляют несомненный интерес для разработки терапевтических направлений, основанных на применении моноклональных и гетеротипических антител и вакцин, так как галектины, экскретируемые клетками при воспалении, могут в значительной степени ослаблять терапевтический эффект.

а) б) 11hG-hG-1hG-hG-hG-60 hG-40 hG-hG-hG-hG-0 20 0 20 --концентрация галектина, мкг/мл концентрация галектина, мкг/мл Рисунок 7. Ингибирование человеческими галектинами связывания ИГВВ с вирусами гриппа а) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и б) А/Москва/17/98 (H1N1).

5. Роль галектинов на стадии адгезии вирионов на клетке. Дальнейшие эксперименты проводились на клеточной модели, где мы ожидали два возможных проявления действия галектинов – ингибиторное или, наоборот – способствующее развитию инфекции. Ингибиторный эффект от галектинов мог развиваться вследствие экранирования галектином сиалолигандов клетки, вовлеченных в адгезиию вируса. Кроме того, галектины могли приводить к слипанию вирионов, и таким образом, снижать их инфекционность. С другой стороны, наличие галектинов могло напротив, повышать уровень адгезии вируса гриппа, если за счет мультивалентности, галектины одним из углеводсвязывающих доменов связываются с галактозидом на клетке, а другим – на вирусе. Следствием такого двухсайтного взаимодействия предположительно может быть обеспечение полноценной адгезии, без участия сиаловых кислот. Оба эффекта от галектинов имели литературные предпосылки:

галектин-опосредованное заякоревание вирионов на клетке известно для ВИЧ-1, а снижение уровня инфекции при введении галектина-1 in vivo – для вируса гриппа.

% ингибирования % ингибирования 5.1. Расположение галектинов и вируса на клетке изучали методом, разработанным ранее в лаборатории углеводов ИБХ РАН (Е.М.Рапопорт и др.) для исследования углеводной специфичности галектинов. Галектины нагружали на поверхность клеток, после чего проверяли их взаимодействие с вирусом гриппа. Сочетание данного метода с конфокальной микроскопией позволило установить, что на поверхности клеток вирус гриппа и галектин CG-2 колокализуются, т.е. располагаются в одних и тех же кластерах (Рис. 8). В то же время, для CG-3 подобной колокализации не наблюдалось (данные не показаны).

а) б) в) Рисунок 8. Колокализация CG-2 и вируса гриппа A/NIB/23/89_МА (H1N1) на поверхности клеток MDCK. Вирус инкубировали с клетками (30 мин при 37 °С), предварительно нагруженными галектинами (30 мин при 4 °С). а) Вирус, меченый флуоресцеином;

б) галектин (детекция антителами, мечеными фикоэритрином); в)вирус и галектин вместе.

5.2. Изучение влияния галектинов на связывание вируса с клетками. Результаты конфокальной микроскопии, а именно – наличие колокализации, подтвердили возможное участие галектинов в процессе адгезии вирионов на поверхности клетки. Для количественного определения уровня связывания вирионов применялась проточная цитофлуориметрия, в которой преимущественно использовали вирус гриппа с флуоресцентной меткой (эти результаты на первом этапе дополнительно подтверждали экспериментами с нативным вирусом, который детектировали с помощью меченых антител).

Степень адгезии вируса на клетках измеряли по изменению уровня флуоресценции.

Наличие галектинов на поверхности клеток приводило к возрастанию адгезии вируса гриппа. Из куриных галектинов подобное действие оказывали CG-1A и CG-2, тогда как нагрузка других галектинов не оказывала эффекта (Рис. 9). Литературные данные свидетельствуют, что физиологические концентрации галектинов в организме человека варьируют в диапазоне 0,5-300 мкг/мл, а при заражении патогенными микроорганизмами концентрация галектинов может локально возрастать и до 600 мкг/мл; мы использовали галектины в концентрации 400 мкг/мл и ниже. Оптимизация условий показала, что В рамках диссертации был разработан метод мечения вируса с помощью флуоресцентного липида FluoDOPE, который изложен в разделе 7 данного автореферата.

увеличение адгезии вируса гриппа под действием галектинов достигает максимума при концентрации 100-150 мкг/мл (Рис. 10а) CG-1A CG-1B CG-3 CG-Рисунок 9. Связывание вируса гриппа A/Rheinland Pfalz/14/07 (H1N1) с клетками MDCK в присутствии галектинов (400 мкг/мл). Прерывистая линия – контрольные клетки без вируса; серое заполнение – клетки со связанным вирусом без галектина; жирная – галектиннагруженные клетки с вирусом. Цитофлуорограмма; по оси абсцисс – интенсивность флуоресценции выбранной популяции клеток (в отн. ед.), по оси ординат – относительная частота встречаемости.

Увеличение адсорбции вируса вызывал также ряд человеческих галектинов, а именно hG-1, hG-3 и hG-8 (Рис. 10б).

а) CG-2 200 мкг/мл CG-2 100 мкг/мл CG-2 50 мкг/мл CG-2 25 мкг/мл CG-2 10 мкг/мл CG-2 5 мкг/мл вирус без галектина 0 20 40 60 80 100 1Флуоресценция б) hG-hG-hG-hG-hG-вирус без галектина 0 10 20 Флуоресценция Рисунок 10. а) Влияние CG-2 на связывание вируса гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7N1) с клетками MDCK в различных концентрациях. б) Действие человеческих галектинов при связывании A/FPV/Rostock/34 (H7N1) с клетками MDCK. Здесь и далее - данные цитофлуориметрии, по оси абсцисс - значения флуоресценции в отн. ед.

Возрастание адсорбции вирионов на поверхности клетки-мишени под действием галектинов обнаруживалось для всех изученных штаммов вируса гриппа:

A/Mallard/NPV/41/04 (H7N1), A/Guinea fowl/Germany/DZ3/85 (H2N2), A/Lesserblack_backed gull/Finland/R2265/09 (H13N2), A/Rheinland Pfalz/14/07 (H1N1), A/FPV/Rostock/34/ (H7N1), A/NIB/23/89-МА (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1); величина эффекта отличалась, что объясняется различиями в их гликозилированнии. Так, согласно литературным данным, НА штамма A/FPV/Rostock/34/ (H7N1) несет существенное количество углеводных цепей (не менее 7 сайтов) и, в соответствии с этим, эффект от галектинов был значительно выше, чем для других вирусов. Некоторые из галектинов специфически способствовали заякореванию только определенных штаммов вируса, так, hG-1 действовал только на A/FPV/Rostock/34/ (H7N1) (Рис. 11), но не A/Puerto Rico/8/34 (H1N1); а на связывание последнего действовал галектин hG-8 (данные не показаны).

a) б) Рисунок 11. Влияние галектина hG-1 на взаимодействие вирусов гриппа а) A/FPV/Rostock/(H7N1) и б) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с клетками MDCK.

5.3. Ингибирование взаимодействия галектинов с вирусом. Для понимания механизмов действия галектинов на адгезию вирусов гриппа необходимо знать специфичность этих белков. В отличие от человеческих галектинов, специфичность куриных аналогов изучена мало. Поэтому два куриных галектина, один из которых (CG-2) увеличивал адгезию вируса на клетке, а другой (CG-3) – нет, была исследована с помощью гликочипа, в состав которого входило 205 гликанов, многие из которых являются потенциальными лигандами галектинов.

Анализ данных (не показаны) гликочипа выявил, что наиболее сильным лигандом для CG-2 являются сахариды A (тип 2) и А (тип 1), а также другие антигены групп крови системы АВН – B (тип 2) и Н (тип 2). По сравнению с этими гликанами, «классические» лиганды галектинов, такие как полилактозамины, показали низкий уровень связывания. Для CG-3 предпочтительными лигандами, напротив, выступали типичные лактозаминовые гликаны – (LacNAc)3 и (LacNAc)2. Таким образом, галектины имели существенные различия в углеводной специфичности, что, по-видимому, обусловило их разное действие в отношении вируса гриппа.

Опираясь на данные гликочипа, мы провели ингибирование действия галектинов на клеточной модели. Условия эксперимента оставались прежними; отличие состояло в том, что после нагрузки галектинов и перед нанесением вируса гриппа, клетки инкубировали с ингибиторами. Как и ожидалось, после добавления в систему лиганда для CG-2, а именно мультивалентного тетрасахарида A (тип 2), степень заякоривания вируса на поверхности клетки уменьшалась до уровня без галектина (Рис. 12). Контрольный конъюгат (LacNAc)либо не влиял на связывание вируса, либо его действие проявлялось только при высокой концентрации (100 мкг/мл). Таким образом, высокоаффинный лиганд галектина действительно отменяет связывание вируса гриппа с клеткой.

CG-2+A(type 2)1мкг/мл CG-2+A(type 2) мкг/мл CG-2+A(type 2) мкг/мл CG-2 мкг/мл вирус без галектина 0 20 40 60 80 1Флуоресценция Рисунок 12. Ингибирование действия CG-2 на адгезию вируса A/FPV/Rostock/34 (H7N1) гликоконъюгатом А (тип 2) в разных концентрациях.

5.4. Влияние на адгезию особенностей гликома вируса и клеточной поверхности.

Сравнивали два варианта одного вируса A/NIB/23/89-МА (H1N1); один был выращен на куриных эмбрионах, а другой – на культуре MDCK, из-за чего вирусы различались составом углеводных цепей. Ожидалось, что изменение гликома вируса повлияет на галектинопосредованное заякоревание.

В целом, увеличение адгезии вирионов на клетках-мишенях наблюдалось в большей степени для культурального, С-варианта (данные не показаны). Наибольшее различие между вирусами проявлялось в отношении человеческих галектинов hG-1 и hG-8, эффект от которых для С-варианта был более явным. Опираясь на литературные данные, мы объясняем это тем, что углеводный состав вирусов, выращенных в организме млекопитающих, как правило отличается более высокой степенью гликозилирования и разветвленной структурой.

Это обеспечивает более высокую аффинность галектинов к таким вирионам и, как следствие, галектин-опосредованное заякоривание проходит более интенсивно.

Углеводный состав поверхности клеток также важен при адгезии вируса, в том числе опосредованной галектином. Для подтверждения этого факта мы использовали трансфецированный вариант клеток MDCK, а именно – клетки MDCK6SIAT, которые в большей степени (чем исходная культура) синтезируют углеводные цепи с терминальным остатком сиаловой кислоты, присоединенной связью 2-6. Подобное изменение гликома поверхности, как и ожидалось, приводило к уменьшению связывания галектинов, так как известно, что 2-6 сиалирование запрещает присоединение этих белков к углеводным цепям.

Как следствие, галектины хоть и увеличивали связывание вируса гриппа с клеткам, но эффект был гораздо более слабым по сравнению с нормальными клетками, или не детектировался вовсе (данные не показаны).

5.5. Связывание вируса с десиалилированными клетками в присутствии галектинов.

Десиалилирование привело к значительному снижению адгезии вируса, вплоть до ее отсутствия (Рис. 13). Нагрузка галектинов на десиалилированные клетки увеличивала адгезию до уровня равного (галектин CG-2), или даже превышающего (в случае CG-1A) уровень сиало-опосредованного процесса.

Большинство клеток млекопитающих, к которым относятся и клетки MDCK, секретируют галектины при стрессовых состояниях, к которым можно отнести и инфекцию вирусом гриппа. Таким образом, галектины могут служить не только в качестве дополнительного, но и достаточного фактора, обеспечивающего заякоривание вируса гриппа на поверхности клетки-мишени. Данный эксперимент имитирует ситуацию, когда вирус обладает высоко активной NA и низкоаффинным НА.

клетки+вирус клетки+вирус+CG-клетки+вирус+CG-1A deSia клетки+вирус deSia клетки+вирус+CG-deSia клетки+вирус+CG-1A 0 10 20 30 Флуоресценция Рисунок 13. Компенсирующее действие галектинов CG-1A и CG-2 при связывании вируса гриппа A/NIB/23/89-МА (H1N1) с нативными и десиалилированными (deSia), с помощью нейраминидазы из V. cholerae клетками MDCK.

5.6. Действие галектинов при нагрузке на вирионы. Известно, что галектины обнаруживаются во внеклеточном пространстве, а также, что вирус гриппа необычно плотно галактозилирован. Эти факты говорят о реальности физиологического связывания галектина с вирусом до стадии адгезии на клетке, и мотивировали эксперименты, в которых вирус инкубировали с галектинами (1 ч) и затем наносили на клетки. Нагрузка галектина CG-1A на вирионы способствовала адгезии на клетках, причем эффект был сильнее, чем при нагрузке того же галектина на клетку. В то же время, для родственного галектина CG-2 был получен противоположный результат (Рис. 14).

галектин на CG-клетке CG-1A галектин на вирусе вирус без галектина 0 500 1000 15Флуоресценция Рисунок 14. Влияние куриных галектинов CG-1A и CG-2 на взаимодействие вируса гриппа A/NIB/26/90 (H1N1) с клетками MDCK при нагрузке на клетки/вирус. Детекция вируса с помощью флуоресцентных антител.

Совокупность полученных данных говорит о возможности нескольких сценариев взаимодействия между вирусом, клеткой и галектином - взаимодействия, которое зависит от предпочтительной локализации галектинов и множества факторов, таких как паттерн гликозилирования клетки и вируса, активность вирусных белков, наличие гликопротеиновконкурентов в межклеточном пространстве и т.д. Заякоревание вируса на клетке является лишь начальной стадией в процессе заражения, поэтому были проведены эксперименты, отражающие весь цикл заражения.

6. Исследование полного цикла заражения вируса в присутствии галектинов. Для качественной/полуколичественной оценки действия галектинов использовали метод окрашивания монослоя. После инкубации с вирусом гриппа в течение ночи, зараженные клетки инкубировали с конъюгатом фетуин-пероксидаза: НА на поверхности зараженных клеток и вирионов, не успевших отпочковаться, связывался с сиалилированными гликанами фетуина, а благодаря пероксидазе осуществлялось окрашивание клеток. Результат анализировали с помощью микроскопа, сравнивая заражение монослоя с галектином и без него.

Для инфицирования клеток MDCK использовалась алантоисная жидкость, полученная наращиванием вируса A/FPV/Rostock/34 (H7N1) в куриных эмбрионах. Важно было взять именно нативный, «живой» вирус, без каких либо стадий очистки. Галектины в различных концентрациях от 0,1 до 50 мкг/мл добавляли к клеткам одновременно с алантоисной жидкостью (разбавление 1:105).

В этих экспериментах (данные не показаны) галектины ингибировали инфицирование клеток вирусом гриппа, оба куриных галектина – CG-1A и CG-2, в концентрации 5 мкг/мл и выше полностью отменяли заражение. Уменьшение концентрации галектинов приводило к появлению окрашивания клеток лишь при концентрациях 1 мкг/мл и ниже. Предварительное десиалилирование монослоя MDCK также отменяло заражение клеток, а добавление галектинов не изменяло ситуации.

Таким образом, в полном инфекционном цикле галектины способны ингибировать заражение клеток вирусом гриппа, что противоречит нашим результатам, полученным с помощью цитофлуориметрии (раздел 5.2), где галектины увеличивали адгезию вируса на клетке-мишени. Поэтому была проведена серия дополнительных исследований, где использовался количественный метод оценки заражения, и варьировались условия проведения эксперимента.

6.1. Действие галектинов на эффект заражения клеток вирусом гриппа, сравнение разных условий проведения эксперимента. В данной серии экспериментов использовался метод измерения ферментативной активности нейраминидазы вируса гриппа для количественного измерения степени заражения или связывания вируса с монослоем клеток MDCK: после нанесения вируса на клетки и инкубации в течение часа (этого достаточно для связывания вирионов) или ночи (полный цикл заражения), после чего вносили флуоресцентный субстрат для NA (MUF-гликозид нейраминовой кислоты, MU-NANA).

Таблица 1. Влияние галектинов при взаимодействии вируса гриппа с клетками. Сравнение разных методов.

Стадия, на которой Что Метод Эффект от галектинов № Детекция добавлялся фактически (Интенсивность) галектин исследовалось Галектин Связывание вируса с предварительно клетками. нагружали на меченый Увеличение адгезии 1 Цитофлуориметрия. клетки Связывание вирус вируса (++) (суспензия клеток Галектин MDCK) предварительно нагружали на вирус Окрашивание монослоя клеток Галектин по субстату 2 MDCK фетуин- смешивался с Заражение Ингибирование (– –) пероксидазы пероксидазой после вирусом заражения Галектин а) Связывание Ингибирование (–) смешивался с (а,б) Количественная б) Заражение Ингибирование (– –) вирусом оценка Галектин заражения/связывания По реакции 4 предварительно Связывание Ингибирование по ферментативной расщепления нагружали на вирус активности NA MU-NANA Галектин Увеличение адгезии (монослой клеток а) Связывание 5 предварительно вируса (+) MDCK) (а,б) нагружали на б) Заражение Ингибирование (–) клетки Чтобы понять, какая стадия является ключевой для проявления ингибирующего действия галектинов на заражение, варьировали режим прибавления галектинов (Таблица 1, № 3-5):

- на монослой клеток наносили смесь галектинов с вирусом (№3) - перед нанесением на клетки вирус инкубировали с галектинами (№4) - галектины предварительно нагружали на клетки, и только после этого вносили вирус (№5).

Метод №3а (Таблица 1) позволяет оценить влияние галектинов на стадию адгезии, а метод №3б - на полный цикл заражения. В обоих случаях наблюдалось ингибирующее действие галектинов. Однако, галектины в разной степени ингибировали процесс: в то время как CG-2 при концентрации 25 мкг/мл (Рис. 15а), CG-1A - при концентрации всего лишь мкг/мл (Рис. 15б). Антивирусный эффект в большей степени выражен в условиях полного цикла заражения клеток, нежели при оценке только стадии адгезии (Рис. 15а,б, черные и серые столбики).

а) вирус Связывание CG-2 100 мк/мл Заражение CG-2 25 мкг/мл CG-2 5 мкг/мл CG-2 1 мкг/мл CG-2 500 нг/мл CG-2 200 нг/мл 0 50 100 1Расщепление Mu-NANA б) вирус Связывание CG-1A 100 мкг/мл Заражение CG-1A 25 мкг/мл CG-1A 5 мкг/мл CG-1A 1 мкг/мл CG-1A 500 нг/мл CG-1A 200 нг/мл 0 50 100 1Расщепление Mu-NANA Рисунок 15. Влияние галектинов CG-2 (а) и CG-1А (б) в различных концентрациях на связывание и заражение клеток вирусом гриппа (Метод №3, см. Таблицу 1). Здесь и далее активность нейраминидазы без галектина принята за 100%.

Условия следующего варианта метода, где галектин предварительно нагружали на вирионы (Таблица 1, № 4), позволили наблюдать еще более сильное ингибирование со стороны галектинов, чем в условиях метода 3 (Рис. 16). По-видимому, при такой постановке эксперимента, происходит агрегация вирусных частиц, что значительно снижает заякоревание вируса на клетке.

Последний метод (Таблица 1, № 5) отличался тем, что галектины предварительно нагружали на монослой клеток, и только потом наносили вирус. При этом для адгезии вирионов (№5а) были получены результаты, противоположные тем, что были при рассмотрении полного цикла заражения (№5б). Вирус гриппа лучше связывался с поверхностью клеток, на которую нагружены галектины, хотя эффекты были незначительны (Рис.17). Этот результат согласовался с данными метода №1. Таким образом, эксперименты на монослое клеток подтверждают факт увеличения сорбции вирусов на клетках за счет галектинов.

вирус вирус+галектин (№3) CG-1A 100 мкг/мл вирус+галектин CG-1A 25 мкг/мл (инкубация, №4) CG-1A 5 мкг/мл CG-1A 1 мкг/мл CG-1A 0,5 мкг/мл CG-1A 0,2 мкг/мл 0 20 40 60 80 100 120 1Расщепление Mu-NANA Рисунок 16. Влияние галектина CG-1А на адгезию вируса гриппа в условиях предварительной их инкубации с вирусом (Метод №4) и без нее (Метод №3).

вирус CG-2 1 мкг/мл CG-2 5 мкг/мл CG-2 25 мкг/мл CG-2 100 мкг/мл CG-1A 1 мкг/мл CG-1A 5 мкг/мл CG-1A 25 мкг/мл CG-1A 100 мкг/мл 0 50 100 150 2Расщепление Mu-NANA Рисунок 17. Влияние галектинов CG-1А и CG-2 на адгезию вируса гриппа на клетках MDCK в условиях метода №5а (см. Таблицу 1).

Результаты, полученные с помощью метода №5а, позволяли предположить, что возрастание адгезии повлечет за собой увеличение заражения (Метод №5б). Однако, в действительности, в полном цикле заражения CG-1А по прежнему выступал как ингибитор (Рис. 18а), аналогично результатам, полученным в условиях методов №2-4. Интересно отметить, что предварительная нагрузка CG-2 на клетки в условиях метода №5 не сказывается на заражении клеток (Рис. 18б).

а) вирус CG-1A 0,5 мкг/мл CG-1A 1 мкг/мл CG-1A 2 мкг/мл CG-1A 5 мкг/мл CG-1A 10 мкг/мл CG-1A 25 мкг/мл CG-1A 50 мкг/мл CG-1A 100 мкг/мл 0 50 1Расщепление Mu-NANA б) вирус CG-2 0,5 мкг/мл CG-2 1 мкг/мл CG-2 2 мкг/мл CG-2 5 мкг/мл CG-2 10 мкг/мл CG-2 25 мкг/мл CG-2 50 мкг/мл CG-2 100 мкг/мл 0 50 1Расщепление Mu-NANA Рисунок 18. Влияние галектинов а) CG-1А и б) CG-2 на заражение клеток MDCK вирусом гриппа в условиях метода №5б.

Таким образом, как в случае суспензионной культуры, так и в случае монослоя клеток, независимо от того, на какой из двух компонентов нагружались галектины, и независимо от того, промотировалась или ингибировалась стадия адгезии, итогом действия галектинов на заражение клеток всегда было его торможение.

7. Введение флуоресцентной метки в состав вириона. Мечение вируса гриппа с помощью флуоресцеинизотиоционата (FITC) проводится в щелочных условиях (рН 9.5), что может вызывать изменения NA и HA. Чтобы избежать влияния процедуры мечения и ковалентного присоединения самой метки на связывание вируса гриппа с галектинами, мы разработали альтернативный подход, где флуоресцентная метка вводилась с помощью синтетического липида (Fluo-DOPE).

Рисунок 19. Структура Fluo-DOPE. Остаток флуоресцеина (Fluo) связан с остатком диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) 15-атомным спейсером.

Дизайн метки Fluo-DOPE (Рис. 19) был сделан в лаборатории углеводов ИБХ РАН к.х.н Е.Ю. Корчагиной. Cтруктура каждого фрагмента в молекуле Fluo-DOPE критична для встраивания в мембрану; в частности, ненасыщенные олеоильные цепи обеспечивают высокую степень и скорость встраивания, а спейсер делает всю конструкцию растворимой (точнее, диспергируемой) в водной среде. Флуоресцентная метка в виде липидного производного вводится в физиологических условиях, что в отличие от химической модификации белков, позволяет максимально сохранять нативность поверхности. Мы сравнили мечение четырех штаммов вируса гриппа с помощью FITC и флуоресцентным липидом по следующим параметрам: изменение рецепторных свойств НА, влияние на ферментативную активность NA, способность меченых вирионов связываться с клетками.

Было показано, что Fluo-DOPE является более «мягким» агентом для введения в состав вируса флуоресцентной метки и не оказывает влияния на активность NA и HA.

ВЫВОДЫ 1. Обнаружена способность галектинов взаимодействовать с вирусом гриппа. Нагрузка галектинов на поверхность вируса не изменяет активность гемагглютинина и нейраминидазы.

2. Связывание с галектинами маскирует антигенные детерминанты поверхности вируса гриппа, предохраняя его от присоединения антител.

3. Галектины способствуют адгезии вируса гриппа на клетке. Показано, что на галектин-опосредованное заякоревание влияет углеводный состав как вируса, так и клетки.

4. Галектины способны восстанавливать адгезию вируса гриппа к десиалилированным клеткам до уровня, типичного для нативных клеток.

5. Несмотря на то, что галектины способствуют стадии адгезии вируса на клетке, этот эффект не является ключевым для процесса инфицирования, который галектинами ингибируется.

6. Предложен новый метод мечения вируса гриппа с помощью введения липидной флуоресцентной метки в состав мембраны.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи 1. Черный Е.С., Рапопорт Е.М. Андрэ С., Калтнер Г. Габиус Г.-И, Бовин Н.В., Галектины способствуют взаимодействию вируса гриппа с клеткой // Биохимия 2011. Т. 76.

С. 23-24.

2. Hadac E.M., Federspiel M.J., Chernyy E.S., Tuzikov A.B., Korchagina E.U., Bovin N.V., Russell S., Henry S.M., Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions //J. Virol. Methods. 2011 V. 176. P. 7884;176(1-2):78-84.

Тезисы докладов на конференциях 1. Chernyy E.S., Bovin N.V., Study of Additional Influenza Virus to Cell Interaction // Program and abstracts for the 2009 meeting of the society for Glycobiology – San Diego, USA.

Glycobiology 2009 V. 19. №11. P. 1259-1379.

2. Chernyy E.S., Bovin N.V., Study of binding of influenza virus with human tracheobronchial mucins // Summer Course Glycosciences 2008, Netherlands; http://www.vlaggraduateschool.nl






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.