WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г.

Чернышевского»

На правах рукописи

ЛОМОВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ФОРМИРОВАНИЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ОБОЛОЧЕК МИКРОКОНТЕЙНЕРОВ, СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА, ИНГИБИРУЮЩИЕ ПРОЦЕСС ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

03.01.02 – Биофизика 02.00.04 - Физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Саратов - 2012

Работа выполнена на кафедре физики полупроводников факультета нано- и биомедицинских технологий ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» Научные руководители:

доктор химических наук, доцент Горин Дмитрий Александрович кандидат физико-математических наук Антипина Мария Николаевна

Официальные оппоненты:

Богатырев Владимир Александрович доктор биологических наук, доцент, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, лаборатория нанобиотехнологии, ведущий научный сотрудник Букреева Татьяна Владимировна кандидат химических наук, доцент, Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, лаборатория биоорганических структур, заведующая лабораторией Ведущая организация ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита диссертации состоится «14» мая 2012 г. в 15:30 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.05 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г.

Саратов, ул. Астраханская, д. 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».

Автореферат разослан «___» апреля 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета д. ф.-м. н., профессор Дербов Владимир Леонардович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Одной из фундаментальных задач современной биофизики является регулирование процесса пероксидного окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран для обеспечения правильного функционирования организма человека на клеточном уровне и предотвращения накопления в организме канцерогенных и мутагенных молекулярных продуктов и свободных радикалов. Кроме того, понимание влияния различных факторов на кинетику ПОЛ находит важное прикладное применение в разработке способов ингибирования и предотвращения пероксидного окисления полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) липидов, входящих в состав многих пищевых и косметических продуктов. Биологическая роль ПНЖК омега-3 и омега-6 типов заключается в препятствии развития атеросклероза, улучшении кровообращения, кардиопротекторном и антиаритмическом действии, уменьшении воспалительные процессов в организме и улучшении питания тканей. ПНЖК омега-3 и омега-типов являются невосполнимыми, поскольку они не синтезируются de novo в тканях позвоночных животных и человека и могут быть получены только из пищи. Задача о предотвращении пероксидного окисления ПНЖК липидов значительно осложняется тем, что в современных продуктах питания используется большое количество эмульгированных жиров. Входящие в состав жиров ПНЖК намного активнее подвергаются атаке реактивных форм кислорода и других прооксидантов из-за протяженной границы раздела фаз в дисперсной системе.

Поэтому, формирование на границе раздела фаз вода-масло защитной оболочки, содержащей вещества, ингибирующие ПОЛ, представляется перспективным способом предотвращения пероксидного окисления ПНЖК липидов, а практическая задача находится на стыке таких наук, как биофизика (выяснение механизмов регуляции процесса ПОЛ) и физическая химия (стабилизация дисперсной фазы эмульсии, процессы адсорбции на границе раздела фаз для получения покрытия из молекулярного комплекса, нерастворимого как в воде, так и в масле).

Многослойные пленки [1] на поверхности частиц микронного размера, образуемые последовательной адсорбцией макромолекул синтетических и природных полимеров, хорошо зарекомендовали себя для получения микроконтейнеров, с помощью которых возможно капсулирование широкого спектра веществ – полимеры, белки, нуклеиновые кислоты и некоторые лекарственные препараты. Благодаря слоистой структуре пленки в нее легко могут быть включены различные функциональные элементы (молекулы, образующие комплексы, чувствительные к рН и/или ионной силе, наночастицы, красители и т.д.), позволяющие контролируемо высвобождать содержимое микроконтейнера и управлять его положением в пространстве [2-5]. Для использования микроконтейнеров в живых системах, особую актуальность имеет разработка биосовместимых и биодеградируемых оболочек [6, 7].

Для защиты ПНЖК от пероксидного окисления, функциональными элементами могут служить молекулы, ингибирующие процесс ПОЛ. В работах Д.Д. Макклементса было показано замедление пероксидного окисления ПНЖК липидов, входящих в состав эмульгированных масел, используя в качестве эмульгатора сывороточные протеины [8]. Однако защита, обеспечиваемая такой оболочкой, оказалась эффективна лишь при низких значениях рН дисперсионной среды. Как альтернативный способ ингибирования пероксидного окисления липидов, было предложено в качестве дисперсионной среды использовать раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты [9] (хелатирующего агента, связывающего катионы переходных металлов, которые являются прооксидантами, так как могут разветвлять цепь реакций пероксидации и тем самым ускорять процесс ПОЛ, а так же вступать в реакции с образованием реактивных форм кислорода [10]). Таким образом, задача ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов в эмульсиях остается во многом нерешенной. В частности, необходима разработка универсальной защитной оболочки, способной эффективно ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов независимо от состава дисперсионной среды. Включение хелатирующего агента непосредственно в оболочку на поверхности дисперсной фазы представляется эффективным решением задачи ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов в эмульсиях, тем более, что было продемонстрировано успешное формирование многослойной пленки, в состав которой входит хелатирующий агент – танниновая кислота, на поверхности плоской подложки и показано, что такая пленка способна ингибировать окисление гемоглобина [11].

Анализируя современное состояние исследований, ориентированных на разработку лекарственных препаратов, можно убедиться в том, что: 1) часть лекарственных препаратов в необходимых для лечения дозах токсична для пациентов; 2) эффективность некоторых препаратов снижается при достижении очага воздействия из-за нивелирования активности окружающей средой; 3) адресная доставка некоторых препаратов затруднена. В связи с этим капсулирование биологически-активных веществ (БАВ) методом последовательной адсорбции макромолекул [12] может также решить проблемы повышения эффективности доставки, обеспечивая защиту БАВ, и позволяя контролировать локальность и момент их высвобождения, тем самым, приводя к разработке новых эффективных форм лекарственных препаратов.

Объектом исследования являются многослойные биосовместимые полимерные и нанокомпозитные покрытия, формируемые на поверхностях с различной геометрией и физико-химическими свойствами (диспергированные в водной фазе микрочастицы масла, неорганические пористые микрочастицы, поверхность свежеотчужденных зубов).

Предметом исследования является получение биосовместимых многослойных покрытий и оболочек микроконтейнеров, включающих функциональные элементы (вещества, ингибирующие пероксидное окисление ПНЖК липидов; углеродные одностенные трубки и металлические наночастицы) для обеспечения защиты субстрата или содержимого микроконтейнеров от повреждающих факторов внешней среды (УФ- излучение, прооксиданты).

Цель и задачи исследования. Цель исследования состоит в разработке и получении стабильных, биосовместимых и биодеградируемых наноструктурированных оболочек, капсулирующих дисперсную фазу эмульсии льняного масла, обеспечивающих эффективную защиту ПНЖК липидов от пероксидного окисления, инициированного прооксидантами и ультрафиолетовым излучением.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. сформировать стабильные оболочки, капсулирующие дисперсную фазу эмульсии льняного масла, включающие вещества, ингибирующие пероксидное окисление ПНЖК липидов;

2. изучить влияние физико-химических параметров эмульсионной системы, таких как толщина и состав оболочек, капсулирующих дисперсную фазу эмульсии, на скорость процесса пероксидного окисления ПНЖК липидов, используя в качестве дисперсионной среды чистую воду, а также водные растворы, содержащие прооксиданты (ионы железа (II) в физиологической и более высоких концентрациях, пероксид водорода);

3. сравнить эффективность защиты от пероксидного окисления капсулированных ПНЖК липидов при расположении ингибитора пероксидации в ядрах и в оболочках микроконтейнеров типа «жидкое гидрофобное ядро/многослойная оболочка»;

4. исследовать эффективность защиты капсулированных ПНЖК липидов оболочками микроконтейнеров, содержащих танниновую кислоту, при инициации пероксидного окисления ультрафиолетовым излучением;

5. получить многослойные оболочки, капсулирующие дисперсную фазу эмульсии льняного масла, содержащие танниновую кислоту - вещество, способное ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов, и белок - бычий сывороточный альбумин, и установить возможность ферментативной деградации таких оболочек;

6. исследовать цитотоксичность полых микроконтейнеров, содержащих танниновую кислоту, для клеточной линии L929 фибробластов мыши;

7. создать нанокомпозитные покрытия на поверхности неорганических микрочастиц и образцах свежеотчужденных зубов, содержащие одностенные углеродные трубки, наночастицы оксидов железа, золотые наночастицы.

Научная новизна исследования.

1. Разработаны многослойные биосовместимые оболочки микроконтейнеров для ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов льняного масла, содержащие хелатирующие агенты (танниновая кислота, диэтилентриаминпентауксусная кислота). Показана высокая агрегативная устойчивость микроконтейнеров льняного масла, содержащих в оболочке танниновую кислоту.

2. Показана стабильность ПНЖК липидов к пероксидному окислению при температуре +37°С в течение по крайней мере 15 дней, при условии что дисперсная фаза эмульсии льняного масла была капсулирована в многослойные оболочки, содержащие один слой танниновой кислоты. Стабильность к пероксидному окислению показана как в чистой воде, взятой в качестве дисперсионной среды, так и в присутствии в дисперсионной среде прооксиданта - ионов железа (II) в физиологической концентрации и в 10 раз превышающей её.

3. Установлено влияние локализации веществ, ингибирующих пероксидное окисление ПНЖК липидов льняного масла, в эмульсиях на концентрацию продуктов окисления в образцах.

4. Показана возможность ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов капсулированных в оболочки, содержащих танниновую кислоту при инициировании пероксидации ультрафиолетовым излучением.

5. Показана возможность ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов, капсулированных в оболочки, содержащих ферменты каталаза и супероксиддисмутаза.

6. Получены стабильные к коалесценции многослойные оболочки из белка (бычий сывороточный альбумин) и танниновой кислоты, капсулирующие дисперсную фазу эмульсии льняного масла, деградируемые посредством фермента -химотрипсин.

7. Получены и исследованы многослойные нанокомпозитные оболочки микроконтейнеров из полиимидных полимерных щеток и наночастиц оксидов магнетита.

8. Сформированы нанокомпозитные покрытия, содержащие золотые наночастицы, на поверхности свежеотчужденных зубов.

Практическая значимость работы.

Созданы микроразмерные контейнеры, капсулирующие во внутреннюю полость гидрофобное вещество (льняное масло - источник полиненасыщенных жирных кислот типа Омега-3 и Омега-6), ингибирующие ПОЛ, что позволяет на их основе разрабатывать объекты для капсулирования лекарственных средств и субстанций для фармацевтической промышленности.

Лучший уровень защиты от пероксидного окисления липидов полиненасыщенных жирных кислот (в течение 15 дней не происходит образования продуктов окисления) в чистой воде, в растворе, содержащем ионы железа (II), а также под действием ультрафиолетового излучения, был показан для образцов микроконтейнеров с оболочками, содержащими танниновую кислоту.

Биотест, проведенный с фибробластами мышей и полыми микроконтейнерами, включающими танниновую кислоту, показал высокую активность жизнедеятельности клеток (около 81%). Таким образом, микрообъекты, заключающие во внутреннюю полость окисляющиеся масла, и ингибитор окисления - танниновую кислоту — в оболочках, могут быть основой для создания косметологических продуктов.

Наноструктурированная оболочка микроконтейнеров содержит в качестве эмульгатора белок, ориентация которого подобна ориентации интегральных белков мембраны клетки согласно жидкостно-мозаичной модели. Введение в оболочку ингибирующего окисление вещества, например, танниновой кислоты, предопределяет возможность получения новой модели для изучения протекания пероксидного окисления липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, в мембранах клеток.

Для создания систем адресной доставки лекарственных средств путем микрокапсулирования определяющим также является вопрос локального высвобождения препарата. Приведенный механизм высвобождения биологически активных веществ посредством специфичного фермента является одним из таких селективных методов.

Достоверность полученных результатов.

Достоверность полученных результатов подтверждается применением научного оборудования, которое верифицируется в соответствии с международными стандартами обеспечения единства измерений и единообразием средств измерений.

Основные результаты исследований выносимые на защиту.

На защиту выносятся следующие результаты исследований:

• устойчивость к окислению в деионизованной воде и в растворе, содержащем физиологическую концентрацию ионов железа (II), а также под воздействием ультрафиолетового излучения (длина волны излучения – 254 нм, плотность мощности излучения – 69 мкВт*см-2, время воздействия – 90 мин) содержимого контейнеров субмикронных и микронных размеров, созданных путем эмульгирования льняного масла, покрытых оболочками с биодеградируемыми компонентами: танниновой кислотой, являющейся ингибитором пероксидного окисления липидов, и гидробромидом поли-L-аргинина;

• инициирующее действие ионов железа (II) в экспериментах in vitro по изучению защиты от пероксидного окисления заключенных во внутреннюю полость микроконтейнеров липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, хелатирующим агентом - танниновой кислотой, являющейся компонентом оболочек, в водных растворах ионов железа (II) и перекиси водорода;

• ферментативная защита от пероксидного окисления заключенных во внутреннюю полость микроконтейнеров липидов, включающих полиненасыщенные жирные кислоты, посредством капсулированных в оболочки микроконтейнеров белков каталаза и супероксиддисмутаза;

• возможность разрушения оболочек микроконтейнеров состава {бычий сывороточный альбумин/танниновая кислота/бычий сывороточный альбумин} специфичным ферментом -химотрипсин, доказанная методом конфокальной сканирующей лазерной микроскопии;

• цитотоксичность полых микроконтейнеров (структуры оболочек {натриевая соль декстран сульфата/гидробромид поли-L-аргинина/танниновая кислота/ гидробромид поли-L-аргинина} и {натриевая соль декстран сульфата/гидробромид поли-L-аргинина} ), которая определенна с помощью биотеста, основанном на спектрофотометрическом определении продуктов метаболизма клеток, показанная на мышиных фибробластах (клеточная линия L 929), дыхательная активность жизнедеятельности составляет 81% от нормальной для образца с танниновой кислотой и 84% от нормальной для образца с натриевой солью декстран сульфата при количестве микроконтейнеров 100 штук на одну клетку.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационного исследования были представлена в работе 1-ой Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (1 st International summer school “Nanomaterials and nanotechnologies in living systems”) (Москва, 2009, подача тезисов); в работе XIII ежегодной международной Школы для молодых учёных и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике «Saratov Fall Meeting-2009» в конкурсе «У.М.Н.И.К.» («Участник молодёжного научно-инновационного конкурса 2009») (Саратов, 2009, устный доклад); на «18 Международной Конференции по Биоинкапсулированию» (XVIII International Conference on Bioencapsulation) (Португалия, 2010, стендовый доклад); на «Второй Конференции по Молекулярным Материалам» (2nd Molecular Materials Meeting) (Сингапур, 2012, стендовый доклад); на Всероссийском конкурсе бакалавров и магистрантов по направлению «Биомедицинские материалы и покрытия» (Саратов, 2010, устный доклад, доклад отмечен дипломом второй степени); на конкурсе научно-практических работ аспирантов в «Институте изучения материалов и техники» (Сингапур, IMRE A*STAR, 20102011, стендовый доклад); на семинарах научной группы под руководством профессора Г.Б. Сухорукова в Университете Лондона, Королевы Марии (Великобритания, Queen Mary University of London, 2009, 2011, устные доклады);

на семинарах научной группы под руководством ведущего научного сотрудника М.Н. Антипиной в «Институте изучения материалов и техники» (Сингапур, IMRE A*STAR, 2010-2011, устные доклады); на семинарах научной группы доцента Д.А.

Горина в Саратовском государственном университете имени Н.Г. Чернышевского (Саратов, 2010, 2011, устные доклады).

Гранты.

Финансовая поддержка проводимой работы осуществлялась при помощи следующих проектов: «Создание нанокомпозитных планарных слоев и оболочек микрокапсул методом полиионной сборки и исследование их физических свойств» (Мин. образования и науки РФ РИ-19.0/002/227 ГК №02.442.11.7183) (2005 г.);

«Формирование нанокомпозитных микро- и наноразмерных структур и исследование их физических свойств» (Мин. Образования и науки РФ РИ19.0/001/051 ГК №02.442.11.7249) (2006 г.); «Функционализация поверхности дисперсной фазы эмульсионных систем неорганическими наночастицами » (Мин.

образования и науки РФ, грант РФФИ № 09-03-00245-а) (2009-2011); стажировка, финансово поддерживаемая согласно заключенному соглашению на проведение совместных исследований между Саратовским государственным университетом и Университетом Лондона, Королевы Марии (Queen Mary University of London) (2009 г.); стажировка «A*STAR Research Attachment Programme (ARAP)» («A*STAR исследовательская программа») г. Сингапур, которая проводилась при поддержке Университета Лондона, Королевы Марии; стажировка в Университет Лондона, Королевы Марии в рамках Программы развития Национального исследовательского Саратовского государственного университета (2010 г).

Личный вклад диссертанта.

Получение микроконтейнеров, изучение их физико-химических свойств и устойчивости к пероксидному окислению содержимого, эксперименты по энзиматической деградации оболочек, характеризация микроконтейнеров с помощью растровой электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, методом спектроскопии комбинационного рассеяния света, а так же анализ литературы по соответствующей тематике были проведены автором.

Публикации.

За время работы над диссертацией опубликовано 15 работ, из них: 4 статьи в журналах из списка ВАК, 11 работ опубликовано в материалах и сборниках тезисов конференций.

Объем, логика и структура работы обусловлены поставленной целью и сформулированными задачами исследования, а также требованиями, предъявляемыми к диссертационным работам. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и библиографии. В тексте работы содержатся таблицы, схемы, диаграммы и графические иллюстрации. Общий объем диссертации составляет ___ страниц, включая ___ рисунков и ___ таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении кратко описана актуальность темы исследования, раскрыта научная новизна работы, ее научно-практическая значимость, а так же определены основные цели и задачи.

В первой главе представлен аналитический обзор литературы, в котором подробно рассмотрены методы формирования и характеризации нанокомпозитных покрытий на поверхности твердых и жидких гидрофобных микрочастиц с помощью последовательной адсорбции макромолекул и функциональных элементов; ферментативная деградация оболочек микроконтейнеров;

формирование оболочек микроконтейнеров в органических средах и особенности такого типа капсулирования; капсулирование низкомолекулярных водорастворимых веществ; механизм пероксидного окисления липидов полиненасыщенных жирных кислот, роль основных прооксидантов;

взаимодействие живых клеток и микроконтейнеров.

Вторая глава посвящена получению и исследованию агрегативной устойчивости микроконтейнеров, содержащих в оболочке хелатирующий агент – танниновую кислоту, а так же изучению эффективности хелатирующих агентов в оболочке для ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов капсулированного льняного масла.

Схема процесса формирования микроконтейнеров типа «жидкое гидрофобное ядро/многослойная оболочка» представлена на рис. 1. Используя ультразвуковое воздействие, были получены микрочастицы льняного масла, поверхность которых стабилизировали раствором бычьего сывороточного альбумина. Далее методом послойной адсорбции макромолекул, в соответствии с тем, как показано на рис.1, были сформированы следующие оболочки:

БСА/ПАРГ/ТА/ПАРГ, БСА/ПАРГ/ТА/ПАРГ/ТА/ПАРГ, БСА/ПАРГ/ДС/ПАРГ (БСА - бычий сывороточный альбумин, анионный полиэлектролит при нейтральном значении рН водной фазы; ПАРГ - поли-L-аргинин (из раствора гидробромида поли-L-аргинина), катионный полиэлектролит, ДС - декстран сульфат (из раствора натриевой соли декстран сульфата), анионный полиэлектролит, TA – танниновая кислота, полифенол, вступающий в реакцию с молекулами поли-L-аргинина, а также с молекулами БСА, взаимодействуя с аргининовыми остатками).

Сформированные микроконтейнеры, содержащие в оболочке один слой танниновой кислоты обладают высокой агрегативной устойчивостью, что было установлено при лиофильном высушивании образцов. Доказательством этому служат данные, приведенные на рис. 2 и рис. 3. На рис. 2 показаны конфокальные изображения высушенных микроконтейнеров. Для удобства визуализации микроконтейнеров их ядра были помечены жирорастворимым красителем 3,4,9,10-тетра-(гекто-карбонил)-перилин (ТГКП) с длиной волны возбуждения и излучения света 488 нм и 525 нм соответственно, а оболочка - с помощью красителя ТРИТЦ с длиной волны возбуждения и излучения света 529 нм 596 нм соответственно. После лиофильного высушивания микроконтейнеры сохранили свою форму, что говорит о достаточно высокой жесткости их оболочек.

С помощью данных, полученных методом динамического рассеяния света показано, что распределение частиц по размерам в свежеприготовленном образце не претерпевает существенного изменения после лиофильного высушивания и последующего повторного диспергирования микроконтейнеров в воде, и кривая Рис. 1. Схема получения микроконтейнеров с гидрофобными жидкими ядрами и многослойными оболочками: 1) с помощью ультразвукового воздействия смешиваются водный раствор бычьего сывороточного альбумина (эмульгатора) и масло (стакан с оранжевой и фиолетовой прозрачной жидкостями рядом с ультразвуковой установкой), в результате чего происходит 2) адсорбция слоя эмульгатора на поверхность дисперсной фазы (стакан с желто-фиолетовыми сферами распределенными в прозрачной жидкости). 3) После промывки, заключающейся в удалении из дисперсионной среды неадсорбированных молекул белка, осуществляется адсорбция поликатионного полимера (прозрачный стакан с желто-фиолетовыми сферами, окруженными красной оболочкой) и промывка дисперсионной среды от неадсорбированных молекул поликатиона. 4) Шаг 3) повторяется с полианионным полимером (прозрачный стакан с желтофиолетовыми сферами, окруженными красно-синей оболочкой). Структура микроконтейнеров, полученных данным методом, представлена на рисунке справа.

Рис. 2. Флуоресцентное и просвечивающее изображения (оптические срезы, полученные с помощью конфокального микроскопа) высушенных микроконтейнеров с оболочкой БСА/ПАРГ/ТА/ПАРГ: а), в) – флуоресцентное изображение, б) – просвечивающее изображение, г) – наложение флуоресцентного и просвечивающего изображений (зеленый канал – ТГКП, красный канал – ТРИТЦ). Шкала - 2 мкм [Л1].

распределения сохраняет свою бимодальную форму. Так, количество частиц со средним размером микроконтейнеров (308±4) нм не изменяется в результате процедуры сушки/диспергирования, а количество частиц со средним размером (1622±32) нм уменьшается лишь на 12% (рис.3).

Рис. 3. Распределение частиц по размерам в образце, содержащем микроконтейнеры с оболочкой БСА/ПАРГ/ТА/ПАРГ: а) сразу после приготовления эмульсии с капсулированной дисперсной фазой, б) после лиофильного высушивания и повторного диспергирования контейнеров в водной фазе [Л1].

Для наблюдения за процессом пероксидного окисления ПНЖК липидов образцы с диспергированными в водной фазе микроконтейнерами инкубировали в течение 15 дней при температуре +37 °С, отбирая пробы для последующего анализа каждые трое суток. Измерение уровня пероксидного окисления липидов проводили, определяя содержание молекулярного продукта пероксидного окисления ПНЖК липидов - малонового диальдегида - в исследуемом объеме образца. Для этого в аликвоте эмульсии проводили реакцию малонового диальдегида и тиобарбитуровой кислоты с образованием окрашенного триметинового комплекса, а затем спектрофотометрически детектировали наличие продукта окисления, измеряя интенсивность поглощения на длине волны 532 нм, соответствующей максимуму поглощения в комплексе.

Рис. 4. Зависимость концентрации малонового диальдегида от количества дней инкубации для микроконтейнеров, отличающихся количеством и структурой слоёв. Микроконтейнеры, диспергированные в чистой воде, инкубировали при температуре +37°С [Л1].

Во всех исследуемых образцах микроконтейнеров, диспергированных в чистой воде, не содержащих танниновую кислоту в оболочке (БСА, БСА/ПАРГ, БСА/ПАРГ/ДС/ПАРГ), наблюдался высокий уровень пероксидного окисления ПНЖК липидов капсулированного льняного масла не зависимо от толщины оболочки и полиэлектролита, формирующего ее внешний слой (рис.4). Наличие в оболочке даже одного слоя танниновой кислоты (БСА/ПАРГ/ТА/ПАРГ) приводило к ингибированию процесса пероксидации содержимого микроконтейнеров в течение всего времени наблюдения (рис. 4).

Полученный результат обусловлен тем, что танниновая кислота будучи хелатирующим агентом удерживает ионы железа (которые могут содержаться в следовых количествах в эмульсионной системе), образуя хелаты на поверхности микрочастиц масла, тем самым, не позволяя прооксидантам проникать в дисперсную фазу и ускорять пероксидацию, разветвляя цепь окислительных реакций (LOOH+Fe2+LO+Fe3++HO-), а также предотвращая участие ионов железа в химических реакциях с образованием в системе реактивных форм кислорода. Схема действия танниновой кислоты по предотвращению пероксидного окисления ПНЖК липидов приведена (рис. 5).

Рис. 5. Схематическое изображение механизма действия хелатирующих агентов, в оболочках микроконтейнеров.

Хелатирующие агенты захватывают ионы железа (II) из водной фазы, тем самым, предотвращая их взаимодействие с липидами ядра и участие в химических реакциях с образованием реактивных форм кислорода. Аналогичным механизмом защиты капсулированного льняного масла от пероксидного окисления обладает оболочка содержащая диэтилентриаминпентауксусную кислоту (ДТПА). Однако эффективность защиты оболочки, имеющей один слой ДТПА, оказалась чуть ниже, чем оболочки с танниновой кислотой в слоистой структуре (рис. 6).

Для возможности практического применения принципиальным является степень эффективности защиты содержимого микроконтейнеров от пероксидного окисления, обеспечиваемой танниновой кислотой в присутствии прооксидантов – ионов железа II. Эффективность устанавливали, диспергируя микроконтейнеры с оболочками, содержащими один или два слоя танниновой кислоты, в растворе бромированного железа с физиологической концентрацией 0.03 мМ и превышающей её в десять и в сто раз (рис.7). Из рис. 7 видно, что пероксидного окисления содержимого микроконтейнеров, которые инкубировали в растворах Рис. 6. Зависимость концентрации малонового диальдегида от количества часов инкубации для микроконтейнеров с оболочками, содержащими хелатирующие агенты (ТА и ДТПА) и без них (ДС). Микроконтейнеры, диспергированные в чистой воде, инкубировали при температуре +37°С.

FeBr с концентрациями 0.03 мМ и 0.3 мМ, не наблюдается в течение по крайней мере 15 дней. Однако увеличение концентрации FeBr до 3 мМ сопровождается резким ростом концентрации малонового диальдегида в образцах. С помощью спектрометрических измерений было показано, что в случае превышения концентрации танниновой кислоты в 1.5 раза по сравнению с концентрацией катионов Fe2+ окисления ПНЖК липидов капсулированного льняного масла не наблюдается. Однако, при соотношении C(TA):C(Fe2+)=1:2.4 (в случае микроконтейнеров с оболочкой БСА/ПАРГ/ТА/ПАРГ/ТА/ПАРГ диспергированных в 3 мМ FeBr ) хелатирующего агента становится недостаточно, чтобы связать все имеющиеся в системе катионы переходного металла, и в соответствующих образцах наблюдается пероксидное окисление.

Рис. 7. Зависимость концентрации малонового диальдегида от количества дней инкубации для образцов микроконтейнеров с оболочками содержащими один и два слоя танниновой кислоты.

Микроконтейнеры, диспергированные в растворах, содержащих ионы железа (II), инкубировали при температуре +37 °С [Л1].

Роль механизма защиты и места локализации веществ, ингибирующих пероксидное окисление ПНЖК липидов, была установлена, используя жирорастворимую смесь токоферолов в качестве антиоксиданта, ассоциированного с ядром микроконтейнера. Для этого смесь токоферолов, была предварительно добавлена к льняному маслу в концентрации 10 000 млн-1 и диспергирована в растворе эмульгатора (БСА) под действием ультразвука. На поверхности образовавшихся микрочастиц «льняное масло/смесь токоферолов/БСА» затем формировали оболочки следующего состава БСА/ПАРГ/ДС/ПАРГ. Далее полученные микроконтейнеры были диспергированы либо в чистой воде, либо в 0.03 мМ растворе бромида железа и выдержаны в течение 15 дней при температуре +37 °С. Концентрацию малонового диальдегида в образцах измеряли аналогично описанному выше. График зависимости концентрации малонового диальдегида от времени показан на рис. 8. В случае использования чистой воды в качестве дисперсионной среды пероксидация содержимого микроконтейнеров не наблюдалось в течение первых 9 дней. С 9 по 15 день наблюдался незначительный уровень пероксидного окисления в образцах.

Так, содержание в образце малонового диальдегида на 15 сутки инкубации составляло (10 ± 1.6) ммоль/кг масла, тогда как образец микроконтейнеров чистого льняного масла с оболочкой, не содержащей ингибитора пероксидации (БСА/ПАРГ/ДС/ПАРГ), содержал (85 ± 8) ммоль/кг масла малонового диальдегида уже на 6 день инкубации (рис.4, рис. 8). Однако при использовании в качестве дисперсионной среды 0.03 мМ раствора ионов железа (II) пероксидация ПНЖК липидов льняного масла, защищенных смесью токофероллов, была значительно ускорена – на 15 сутки наблюдений образец содержал (77 ± 8) ммоль/кг масла малонового диальдегида (рис. 8). Таким образом, ассоциация хелатирующих агентов, ингибиторов пероксидного окисления, с оболочками микроконтейнеров имеет преимущество над помещением антиоксидантов в его ядро, причем более высокая эффективность защиты, обеспечиваемая оболочкой, связана как с локализацией ингибитора на поверхности микрочастицы масла, так и с механизмом действия ингибитора. Если хелатирующие агенты в оболочке связывают прооксиданты на границе раздела фаз, предотвращая их проникновение в ядро и взаимодействие с ПНЖК липидов, то молекулы токоферола взаимодействуют уже с липопероксирадикалами, то есть обрывают цепь реакций ранее начавшегося процесса пероксидации.

Рис. 8. Зависимость содержания малонового диальдегида от количества дней инкубации для образцов микроконтейнеров, содержащих в жидком ядре смесь токоферолов, как антиокисляющее вещество.

Микроконтейнеры, диспергированные в чистой воде и 0.03 мМ FeBr растворе, инкубировали при температуре +37 °С [Л1].

Пероксид водорода является важным прооксидантом in vivo. Будучи окислителями слабой силы молекулы Н О участвуют в реакциях с образованием 2 более реактивных форм кислорода - реакциях Фентона Fe2++H O Fe3++OH+OH- 2 и Хабера-Вайса O +H O O +H O+OH. Из рис. 9 видно, что капсулированное 2 2 2 2 льняное масло, защищенное оболочкой, содержащей танниновую кислоту не подвергается пероксидации при использовании 10% раствора Н О в качестве 2 дисперсионной среды. В связи с тем, что субстрата (супероксидный радикал, ионы переходных металлов) для протекания реакций Фентона и Хабера-Вайса в чистой деионизованной воде не достаточно, значительное ускорение процесс ПОЛ в эмульсионной системе in vitro в присутствии ионов железа (II) связано с ихспособностью разветвлять цепь реакций процесса ПОЛ.

Рис.9. Зависимость концентрации малонового диальдегида от количества часов инкубации для образцов микроконтейнеров с оболочками содержащими танниновую кислоту и без неё. Микроконтейнеры, диспергированные в чистой воде и 10%-ом растворе перекиси водорода, инкубировали при температуре +37 °С.

Ультрафиолетовое (УФ) излучение активирует пероксидное окисление ПНЖК липидов, вызывая разветвление цепи окислительных реакций. Под действием ультрафиолетового излучения льняное масло деградирует, ввиду деградации составляющих его полиненасыщенных жирных кислот.

Спектрофотометрически это удалось определить с помощью метода комбинационного рассеяния лазерного света. На рис. 10 показаны спектры комбинационного рассеяния чистого (не эмульгированного) льняного масла до и после воздействия ультрафиолетового излучения (длина волны излучения – 2нм, плотность мощности излучения – 69 мкВт*см-2, время воздействия – 90 мин).

После воздействия УФ-излучением два характерных пика - 1150 см-1, 1520 см-1 — пропадают (рис. 10), что свидетельствует о разрушении связей С-О-С и С=С соответственно. Оптический спектр поглощения танниновой кислоты имеет два максимума в дальней УФ-области при длинах волн 223 нм и 283 нм соответственно [13], что дает возможность использовать оболочки микроконтейнеров, содержащих танниновую кислоту, для защиты капсулированных ПНЖК липидов льняного масла от пероксидного окисления, вызванного УФ-излучением. Действительно, после 90 мин облучения ультрафиолетом микроконтейнеров с оболочками БСА/ТА их содержимое не окислялось (рис. 10), в отличие от контрольного образца, представленного оболочками БСА/ДС капсулирующими льняное масло. Стоит заметить, что интенсивность характерных пиков в спектре поглощения микроконтейнеров ниже, чем для чистого льняного масла, ввиду меньшего количества анализируемого вещества (рис. 10). В образцах микроконтейнеров спектры поглощения снимали с микрочастиц диаметром 3-5 мкм.

Рис. 10. Спектры комбинационного рассеяния чистого льняного масла и микроконтейнеров, капсулирующих льняное масло, с оболочками БСА/ТА и БСА/ДС до и после облучения ультрафиолетом. Желтыми прямоугольниками выделены области, в которых находятся наблюдаемые характерные пики льняного масла.

Таким образом, во второй главе показано, что многослойные оболочки, имеющие в слоистой структуре хелатирующие агенты, способны предотвращать (танниновая кислота) или значительно замедлять (ДТПА) пероксидное окисление ПНЖК липидов капсулированного льняного масла. При этом, защита, обеспечиваемая оболочками, имеющими в слоистой структуре танниновую кислоту оказывается эффективной не только в чистой воде в качестве дисперсионной среды, но и в растворах, содержащих катионы железа в физиологической концентрации (0.03 мМ) и в 10 раз превышающей ее. Показано влияние механизма защиты и места локализации веществ, ингибирующих пероксидное окисление ПНЖК липидов льняного масла, в микроконтейнерах.

Установлено, что значительное ускорение процесса ПОЛ в эмульсионной системе in vitro в присутствии ионов железа (II) связано с их способностью разветвлять цепь реакций пероксидации. Установлена возможность ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов капсулированного льняного масла, инициируемое УФизлучением с помощью слоя танниновой кислоты в оболочке микроконтейнера.

Третья глава посвящена исследованию эффективности защиты от пероксидного окисления ПНЖК липидов льняного масла, капсулированного в оболочку, содержащую ферменты – каталаза (КАТ) и супероксиддисмутаза (СОД).

In vivo каталаза и супероксиддисмутаза обеспечивают первичную защиту клетки от пероксидного окисления липидов мембраны: супероксиддисмутаза катализирует реакцию образования перекиси водорода, деактивируя свободные радикалы кислорода. В свою очередь фермент каталаза катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и атомарный кислород. Таким образом, формируя многослойную оболочку из молекул этих ферментов представляется возможным ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов капсулированного льняного масла (рис. 11).

Рис. 11. Схематическое изображение механизма защиты ПНЖК липидов льняного масла от пероксидации с помощью многослойной оболочки, содержащей ферменты каталаза и супероксиддисмутаза.

Данные, показывающие уровень окисления ПНЖК липидов льняного масла, капсулированного в оболочки БСА/ПАРГ/СОД/ПАРГ/КАТ/ПАРГ и КАТ/ПАРГ/СОД/ПАРГ представлены на рис. 12. Образцы были выдержаны дней при температуре + 37 °С, пробы для анализа содержания малонового диальдегида отбирались каждые 12 часов. Максимальная концентрация малонового диальдегида в образцах наблюдалась через 48 часов инкубации и составляла (62±5) ммоль/кг масла и (25±0.6) ммоль/кг масла в образцах микроконтейнеров с оболочками БСА/ПАРГ/СОД/ПАРГ/КАТ/ПАРГ и КАТ/ПАРГ/СОД/ПАРГ соответственно.

Рис. 12. Зависимость концентрации малонового диальдегида от количества часов инкубации для микроконтейнеров с оболочками, содержащими ферменты каталаза и супероксиддисмутаза.

Микроконтейнеры, диспергированные в чистой воде, инкубировали при температуре +37 °С.

Послойно измеряя массу адсорбированных ферментов с помощью биуретового метода, было показано, что оболочки микроконтейнеров БСА/ПАРГ/СОД/ПАРГ/КАТ/ПАРГ содержат большее количество каталазы и супероксиддисмутазы, чем оболочки КАТ/ПАРГ/СОД/ПАРГ. Однако измерения каталитической активности молекул каталазы, встроенных в оболочки микроконтейнеров, показали, что активность фермента в оболочке КАТ/ПАРГ/СОД/ПАРГ выше, чем в оболочке БСА/ПАРГ/СОД/ПАРГ/КАТ/ПАРГ.

Данные о количестве и активности каталазы в оболочках свидетельствуют о том, что локализация каталазы в большей степени определяет способность пары СОДКАТ защищать содержимое микроконтейнеров от пероксидного окисления. Когда каталаза используется как эмульгатор, стабилизирующий дисперсную фазу эмульсии льняного масла, уровень защиты от пероксидного окисления липидов ПНЖК выше, чем когда каталаза является составляющей частью оболочки микроконтейнера.

Таким образом, в третьей главе показано, что способность оболочки КАТ/ПАРГ/СОД/ПАРГ ингибировать пероксидное окисление ПНЖК капсулированного льняного масла существенно ниже, чем у оболочки, содержащей танниновую кислоту (рис. 12), но превышает эффективность оболочки, не содержащей ингибиторы пероксидации (рис. 6) Четвертая глава описывает получение биодеградируемых микроконтейнеров, многослойные оболочки которых включают вещество, способное ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов, и исследование их цитотоксичности in vitro.

Белки, образующие слои оболочки микроконтейнера могут служить удобными мишенями для протеолитических ферментов поджелудочной железы, расщепляющих пептидные связи. (При этом фермент является катализатором прямой и обратной реакции гидролиза белка, понижая энергию активации).

Поэтому обработка белковой оболочки ферментами может приводить к ее полному разрушению и высвобождению содержимого микроконтейнера. В диссертационной работе было предложено получить многослойные оболочки, составленные из БСА/ТА/БСА, капсулирующие дисперсную фазу эмульсии льняного масла, и исследовать возможность их деградации ферментом химотрипсин.

Из рис. 13 видно, что до обработки протеолитическим ферментом микроконтейнеры обладали ядром (сферы, окрашенные зеленым), которое было заключено в оболочку БСА/ТА/БСА (красное кольцо вокруг ядра) (рис. 13,1).

Инкубация микроконтейнеров, диспергированных в растворе -химотрипсина (pH 8.0) в течение суток при температуре +37 °С приводит к полной деградации их оболочек (рис. 13,2,в). Микрочастицы масла, более не стабилизированные оболочкой коалесцируют, формируя большие капли дисперсной фазы (рис. 13,2).

Рис. 13. Флуоресцентное и просвечивающее изображения (оптические срезы) микроконтейнеров с оболочкой БСА/ТА/БСА, до и после воздействия ферментом -химотрипсин: 1а, 2a, 1в, 2в – флуоресцентное изображение микроконтейнеров, 1б, 2б – просвечивающее изображение микроконтейнеров, 1г, 2г – наложение флуоресцентного и просвечивающего изображений (зеленый канал – ТГКП, красный канал – ТРИТЦ).

Для дополнительного подтверждения полученного результата – деградации оболочки БСА/ТА/БСА под действием фермента -химотрипсин - были получены и подвергнуты обработке -химотрипсином микроконтейнеры, содержащие в оболочке ПАРГ/БСА/{TA/БСА}, и, капсулирующие БСА, помеченный флуоресцентным красителем ТРИТЦ. Многослойные пленки указанного состава формировали на поверхности пористых микрочастиц карбоната кальция, содержащих в порах БСА-ТРИТЦ. Растворение карбоната кальция при обработке 0.2 М раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты приводило к образованию оболочек, капсулирующих растворенный в воде БСА-ТРИТЦ. На рис. представлены флуоресцентные изображения микроконтейнеров с оболочкой ПАРГ/БСА/{TA/БСА} до и после обработки -химотрипсином. В течение 3 дней в растворе -химотрипсина (pH 8.0) при температуре +37 °С оболочки микроконтейнеров были полностью разрушены, что подтверждается данными конфокальной микроскопии. Следует отметить, что время, требующееся для полной деградации таких оболочек (3 дня) существенно больше, чем время за которое разрушаются оболочки, капсулирующие дисперсную фазу эмульсии льняного масла (1 день). Объяснением служат большее количество белка в оболочках ПАРГ/БСА/{TA/БСА} капсулирующих БСА-ТРИТЦ, а также слоистая структура пленки, делающая более глубокие слои белка менее доступными для молекул фермента.

Рис. 14. Флуоресцентные изображения (оптические срезы) микроконтейнеров с оболочкой ПАРГ/БСА/{TA/БСА}, полученные с помощью конфокального микроскопа, до и после воздействия фермента -химотрипсин (красный канал - ТРИТЦ).

Чтобы установить возможность дальнейшего использования оболочек, содержащих ингибитор пероксидного окисления ПНЖК липидов, in vivo и in vitro, была исследована их цитотоксичность для фибробластов мыши клеточной линии L929. Для этого были получены полые микроконтейнеры (ДС/ПАРГ) и ДС/ПАРГ/ТА/ПАРГ. К фибробластам, образующим монослой на дне емкости для клеточной культуры, заполненной питательной средой, добавляли полученные микроконтейнеры. Цитотоксичность микроконтейнеров определяли через 3 дня инкубации при +37 С и 5% CO методом восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест), позволяющего определить активность дегидрогеназы в метаболически активных клетках. Было установлено, что активность жизнедеятельности клеток при концентрации микроконтейнеров 100 шт. на одну клетку составляет около 81% для оболочек ДС/ПАРГ/ТА/ПАРГ и 84% для оболочек (ДС/ПАРГ) (рис. 15), что свидетельствует низкой цитотоксичности микроконтейнеров, содержащих танниновую кислоту.

Таким образом, в четвертой главе было продемонстрировано получение Рис. 15. Зависимость активности жизнедеятельности фибробластов мыши клеточной линии L929 от количества добавленных в культуру микроконтейнеров из расчета на одну клетку (МТТ-тест).

многослойных оболочек, содержащих белок (бычий сывороточный альбумин) и танниновую кислоту, и установлена возможность биодеградации таких оболочек под действием протеолитического фермента -химотрипсин. Используя фибробласты мыши клеточной линии L929 была установлена низкая цитотоксичность оболочек, содержащих танниновую кислоту, по данным проведенного биотеста Пятая глава описывает получение и характеризацию нанокомпозитных полимерных покрытий в водной и этанольной средах на поверхности твердых сферических ядер и образцах свежеотчужденных зубов.

Помимо водных растворов, оболочки микроконтейнеров можно формировать и в органической фазе, которая часто используется для капсулирования водорастворимых, а также низкомолекулярных веществ в многослойные полимерные пленки. Низкомолекулярные водорастворимые вещества (< 1 кДа) могут свободно диффундировать через оболочку, которая сформирована в водной фазе. Однако замена водной фазы на органическую препятствует диффузии в виду их нерастворимости в органической фазе. Поэтому получение оболочек микроконтейнеров с использованием полимеров полиэтиленимина и полиимидных полимерных щеток на основе полиметакриловой кислоты, растворимых в органических растворителях, является важным этапом решения задачи капсулирования низкомолекулярных водорастворимых веществ в полимерные многослойные пленки.

В диссертационной работе были впервые получены многослойные плёнки со структурой (ПЭИ/ПИ-g-ПМК) /ПСС на поверхности пористых микрочастиц карбоната кальция, где ПЭИ-полиэтиленимин, ПИ-g-ПМК — этанол-растворимые полимерные щетки на основе полиметакриловой кислоты, ПССполистиролсульфонат, адсорбированный из водного раствора его натриевой соли.

Одной из основных проблем при получении таких оболочек является то, что экстракцию матрицы, то есть микрочастиц карбоната кальция, необходимо проводить в водной среде, что зачастую приводит к разрушению оболочки.

Формирование последнего внешнего слоя оболочки в водном растворе натриевой соли ПСС, который также обладает поверхностно-активными свойствами, помогло сохранить целостность оболочек при экстракции неорганической матрицы. Поверхность микрочастиц карбоната кальция после формирования пленок со структурой (ПЭИ/ПИ-g-ПМК) имеет отрицательный заряд. При дальнейшем инкубировании таких микроконтейнеров в водном растворе ПСС, согласно правилу Кёна, макромолекулы ПСС становятся положительно заряженными и адсорбируются на сформированную ранее пленку. Изображение полученных оболочек после растворения ядра представлено на рис.16.

Микроконтейнеры обладают достаточно высокой степенью монодисперности (рис. 16,б). Естественно, такой способ капсулирования низкомолекулярных водорастворимых веществ не может быть универсальным, однако с помощью него могут быть капсулированы соединения, нерастворимые в соответствующей органической фазе.

a) б) Рис. 16. РЭМ изображения оболочек (ПЭИ/(ПИ-g-ПМК)-2) /ПСС при различных увеличениях.

Уникальным свойством нанокомпозитных оболочек микроконтейнеров, сформированных с помощью метода послойной адсорбции, является возможность дистанционного управления контейнерами с помощью магнитного поля и/или лазерного излучения [8]. Магниточувствительные оболочки микроконтейнеров, что подтверждается притяжением микроконтейнеров к магниту, были сформированы из растворов водных коллоидов оксидов железа и этанолрастворимых полимерных щеток. Измеряя толщину таких оболочек с помощью атомно-силовой микроскопии, показано, что толщина оболочек микроконтейнеров, содержащих полиимидные этанол-растворимые полимерные щетки, в среднем в 3 раза выше по сравнению с толщиной оболочек микрокконтейнеров, не содержащих полимерных щеток. Для придания чувствительности к лазерному излучению оболочки микроконтейнеров были функционализированы наноразмерными углеродными трубками [Л2]. Облучая оболочки лазером на длине волны 473 нм и 830 нм, удавалось их локально вскрывать.

Допирование наночастицами покрытий, полученных методом последовательной адсорбции, не только придает им чувствительность к внешним воздействиям, но и антибактериальные свойства. В частности, была показана возможность использования серебряных покрытий для лечения кариеса [14], а также для некоторых приложений зубного протезирования. Кроме того, некоторые препараты золота обнаруживали антибактериальное действие, в частности, против Helicobacter pylori, а также антигрибковую активность – эксперименты ученых клиники Рочестера (Миннесота, США) показали, что наночастицы золота блокировали функцию VEGF, оказывали антиопухолевое действие, не оказывая токсического действия на клетки [15]. Используя установку для создания полимерных слоёв методом последовательной адсорбции из раствора [Л3, Л4], были сформированы планарные покрытия на тканях свежеотчужденных зубов с применением биодеградируемого полимера (хитозана) и наночастиц золота, которые затем были охарактеризованы с помощью атомно-силовой микроскопии.

Полученные покрытия уменьшают шероховатость зубной ткани, а возможность осаждения агрегатов золотых наночастиц приводит к уменьшению стадий технологического процесса формирования нанокомпозитных покрытий [Л15].

Таким образом, в пятой главе показана возможность получения нанокомпозитных покрытий в водной и этанольной средах на поверхности твердых сферических микрочастиц и образцах свежеотчужденных зубов.

Допирование оболочек микроконтейнеров углеродными наноторубками делает возможным локальное вскрытие микроконтейнеров с помощью лазерного излучения. Включение наночастиц оксидов железа в оболочки микроконтейнеров, содержащих полиимидные этанол-растворимые полимерные щетки, приводит к магниточувсвительности микроконтейнеров. Охарактеризованы оболочки микроконтейнеров, сформированные в этанольной среде. На поверхности свежеотчужденных зубов получены покрытия, содержащие наночастицы золота и биодеградируемый полимер хитозан.

Основные результаты и выводы:

1. Показано что многослойные оболочки, имеющие в слоистой структуре хелатирующие агенты, способны предотвращать (танниновая кислота) или значительно замедлять (ДТПА) пероксидное окисление ПНЖК липидов капсулированного льняного масла. При этом защита, обеспечиваемая оболочками, имеющими в слоистой структуре танниновую кислоту оказывается эффективной не только в чистой воде, взятой в качестве дисперсионной среды, но и в растворах, содержащих катионы железа в физиологической концентрации (0.03 мМ) и в раз превышающей ее – пероксидации ПНЖК липидов капсулированного льняного масла в указанных растворах не наблюдалось в течение по крайней мере 15 дней инкубации при температуре +37 °С.

2. Показано влияние механизма защиты и места локализации веществ, ингибирующих пероксидное окисление ПНЖК липидов льняного масла, в микроконтейнерах. Так, ассоциация хелатирующих агентов, ингибиторов пероксидного окисления, с оболочкой микроконтейнера имеет преимущество над помещением антиоксидантов в его ядро.

3. Установлено, что значительное ускорение процесса ПОЛ в эмульсионной системе in vitro в присутствии ионов железа (II) связано с их способностью разветвлять цепь реакций процесса ПОЛ.

4. Установлена возможность ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов капсулированного льняного масла, инициируемое УФ-излучением, с помощью включения танниновой кислоты в оболочку микроконтейнеров.

5. Показана возможность ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов льняного масла капсулированного в оболочки, содержащие ферменты каталаза и супероксиддисмутаза (КАТ/ПАРГ/СОД/ПАРГ). Однако способность оболочки КАТ/ПАРГ/СОД/ПАРГ ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов капсулированного льняного масла существенно ниже, чем у оболочки, содержащей танниновую кислоту, но превышает эффективность оболочки, не содержащей ингибиторы пероксидации. Так, максимальная концентрация малонового диальдегида в образцах микроконтейнеров с оболочками КАТ/ПАРГ/СОД/ПАРГ и БСА/ПАРГ/ДС/ПАРГ составляла (25±0.6) ммоль/кг масла и (85±0.8) ммоль/кг масла соответственно.

6. Продемонстрировано получение многослойных оболочек содержащих белок (БСА) и танниновую кислоту, капсулирующих дисперсную фазу эмульсии льняного масла или раствор БСА, и установлена возможность биодеградации таких оболочек под действием протеолитического фермента -химотрипсин.

7. Установлена низкая цитотоксичность оболочек, содержащих танниновую кислоту, для фибробластов мыши клеточной линии L929. Коэффициент (дыхательной) активности жизнедеятельности фибробластов составлял 81% для образцов микроконтейнеров с танниновой кислотой в оболочке (ДС/ПАРГ/ТА/ПАРГ) и 84% для контрольных образцов микроконтейнеров с оболочкой (ДС/ПАРГ), когда микроконтейнеры были добавлены в клеточную культуру в количестве 100 штук, приходящихся на одну клетку.

8. Получены многослойные полимерные оболочки микроконтейнеров путем адсорбции макромолекул этанол-растворимых полиэтиленимина (ПЭИ) и полиимидных полимерных щеток (ПИ-g-ПМК) следующей структуры ПЭИ/(ПИg-ПМК)-2) /ПСС, которые были переведены в водную фазу без последующего разрушения. Описаны основные технологические приемы создания оболочек, содержащих наночастицы оксида железа (НЧ) и этанол-растворимые полиимидные полимерные щетки, следующей структуры (ПЭИ/(ПИ-gПМК)/ПЭИ/НЧ). Показано, что толщина таких оболочек в среднем в 3 раза выше по сравнению с толщиной оболочек, не содержащих полимерных щеток.

9. Получены оболочки микроконтейнеров, чувствительные к воздействию лазерного излучения оптического диапазона, методом последовательной адсорбциии макромолекул полимера полиаллиламин гидрохлорида и наноуглеродных трубок.

10. Сформированы биосовместимые нанокомпозитные покрытия на тканях свежеотчужденных зубов с помощью биодеградируемого полимера – хитозан и наночастиц золота.

Список используемой литературы:

1. Decher G. Science. 1997. Vol. 277. P. 1232-1237.

2. Klinkesorn U., Sophanodora P., Chinachoti P., et al. J. Agric. Food Chem. 2005. Vol. 53. P. 45614566.

3. Mei L., Decker E.A., McClements D.J. J. Agric. Food Chem. 1998. Vol. 46. Р. 5072-5077.

4. Hu M., McClements D.J., Decker E.A. J. Agric. Food Chem. 2003. Vol. 51. P. 1435-1439.

5. Shutava T.G., Prouty M.D., Agabekov V.E., et al. Chemistry Letters. 2006. Vol. 35. Р. 1144-1145.

6. Dejugnat C., Halozan D., Sukhorukov G.B. Macromol. Rapid Commun. 2005. Vol. 26. P. 961–967.

7. Khler K., Shchukin D.G., Mhwald H., et al. J. Phys. Chem. B. 2005. Vol. 109. P. 18250-18259.

8. Gorin D.A., Portnov S.A., Inozemtseva O.A., et al. Phys. Chem. Chem. Phys. 2008. Vol. 10. P.

6899–6905.

9. Kolesnikova T. A., Gorin D. A., Fernandes P., et al. Adv. Funct. Mater. 2010. Vol. 20. P. 1189– 1195.

10. Borodina T., Markvicheva E., Kunizhev S., et al. Macromol. Rapid Commun. 2007. Vol. 28. P.

1894–1899.

11. De Koker S., De Geest B.G., Cuvelier C., et al. Adv. Funct. Mater. 2007. Vol. 17. P. 3754–3763.

12. Grigoriev D.O., Bukreeva T., Mhwald H., et al. Langmuir. 2008. Vol. 24. P. 999-1004.

13. Erel-Unal, I., Sukhishvil S.A. Macromolecules 2008. Vol. 41, P. 3962-3970.

14. Суетенков Д.Е., Усачев В.В. Стоматология детского возраста и профилактика. 2005. №3-4. C.

58-61.

15. Bowman M.-C., Ballard T.E., Ackerson C.J., et al. J. Amer. Chem. Soc.. 2008. Vol. 130 (22). P.

6896–6897.

Основные результаты диссертации изложены в работах:

Л1. Lomova M.V., Sukhorukov G.B., Antipina M.N. Biocompatible antioxidant multilayer coating shell for prevention of lipid peroxidation in micronsize oil-in-water emulsion // Applied Materials & Interfaces. 2010. Vol. 2, № 12. P. 3669-3676.

Л2. Yashchenok A.M., Bratashov D.N., Gorin D.A., Lomova М.V., Pavlov A.M., Sapelkin A.V., Shim B.S., Khomutov G.B., Kotov N.A., Sukhorukov G.B., Mhwald H., Skirtach A.G. Carbon nanotubes on polymeric microcapsules: free-standing structures and point-wise laser openings // Adv.

Funct. Mater. 2010. Vol. 20, № 18. P. 3136–3142.

Л3. Ященок А.М., Горин Д.А., Панкин К.Е., Ломова М.В., Штыков С.Н., Климов Б.Н., Курочкина Г.И., Грачев М.К. Коэффициент переноса пленок Ленгмюра-Блоджетт как индикатор поверхности монокристаллического кремния, модифицированной полиионными слоями // ФТП.

2007. T. 41, вып. 6. C. 706-710.

Л4. Портнов С.А., Ященок А.М., Губский А.С., Горин Д.А., Невешкин А.А., Климов Б.Н., Нефедов А.А., Ломова М.В. Автоматизированная установка для получения наноразмерных покрытий методом полиионной сборки // Приборы и техника эксперимента. 2006. № 6. С. 115120.

Л5. Портнов С.А., Иноземцева О.А., Колесникова Т.А., Ломова М.В., Хлебцов Б.Н., Горин Д.А. Нанокомпозитные микрокапсулы и перспективы их применения в медицине // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине: Материалы ежегодной Всероссийской научной школы-семинара под ред. Проф. Д.А. Усанова – Саратов: Изд-во Саратовского университета. 2007. С. 140-143.

Л6. Портнов С.А., Горин Д.А., Ященок А.М., Губский А.С., Невешкин А.А., Нефедов А.А., Ломова М.В. Автоматизация процесса получения нанокомпозитных покрытий методом полиионной сборки // Химия поверхности и нанотехнология: Третья Всероссийская конференция, Санкт-Петербург. 2006. С. 201-202.

Л7. Jashchenok A.M., Gorin D.A., Grigorev D.O., Koksharov Yu.A., Serdobincev A.A., Neveshkin A.A., Lomova M.V., Khomutov G.B., Sukhorukov G.B., Mhwald H. Nanocomposite planar films of polyelectrolyte/iron oxide nanoparticles // International workshop on nanobiotechnologies: Abstracts of international workshop, SPb., Publishing House of Politechnical University. 2006. P. 59.

Л8. Губский А.С., Портнов С.А., Ященок А.М., Горин Д.А., Невешкин А.А., Климов Б.Н., Ломова М.В., Колесникова Т.А. Автоматизированная установка для получения нанокомпозитных покрытий методом полиионной сборки // Индустрия наносистем и материалы: Материалы конференции, М.: МИЭТ. 2006. C. 85-90.

Л9. Портнов С.А., Ященок А.М., Губский А.С., Горин Д.А., Невешкин А.А., Климов Б.Н., Ломова М.В., Колесникова Т.А. Автоматизированная установка для получения нанокомпозитных покрытий методом полиионной сборки // Федеральная школа-конференция по инновационному малому предпринимательству в приоритетных направлениях науки и высоких технологий. Сборник материалов докладов, М., РГУИТП. 2006. C. 22-27.

Л10. Svenskaya Yu.I., Lomova M.V., Lukyanets E.A., Bartkowiak A., Markvicheva E.A., Gorin D.A. Encapsulation of photodynamic dyes using polyelectrolyte core-shell structures // III Международная школа-семинар "Наночастицы, наноструктурированные покрытия и микроконтейнеры: технология, свойства и применения", Материалы III международной школыконференции под ред. С.Б. Венига и Я. Элермана, Саратов: Изд-во Саратовского университета.

2011. C.32-33.

Л11. Malyar I.V., Lomova M.V., Stetsyura S.V., Gorin D.A. The synthesis of magnetic submicron templates by layer-by-layer deposition and additional illumination // III Международная школасеминар "Наночастицы, наноструктурированные покрытия и микроконтейнеры: технология, свойства и применения", Материалы III международной школы-конференции под ред. С.Б.

Венига и Я. Элермана, Саратов: Изд-во Саратовского университета. 2011. C.23-24.

Л12. Lomova M.V., Sukhorukov G.B., Antipina M.N. Biocompatible antioxidant multilayer coating shell for prevention of lipid peroxidation in micronsize oil-in-water emulsion // XVIII International Conference on Bioencapsulation, Porto, Portugal. 2010. P. 10.

Л13. Antipina M.N., Lomova M.V., Sukhorukov G.B. Biomimetic approach to prevent lipid peroxidation in vitro // 2nd Molecular Materials Meeting, Singapore. 2012. P. 43.

Л14. Ломова М.В., Хлебцов Б.Н., Горин Д.А. Формирование нанокомпозитных покрытий полиэлектролит / золотые наночастицы спрей методом // 1-ая Международная школа «Наноматериалы и Нанотехнологии в живых системах», Москва. 2009. C.132.

Л15. Павлов А.М., Ломова М.В., Браташов Д.Н., Портнов С.А., Карагайчев A.Л., Сердобинцев А.А., Воронин Д.В., Фирсова И.В., Венедиктов И.Е., Хлебцов Б.Н., Горин Д.А., Суетенков Д.Е. Формирование нанокомпозитных покрытий золотые наночастицы/хитозан на поверхности тканей зубов // Всероссийский конкурс научных работ бакалавров и магистрантов, проводимый в рамках реализации ФЦП (2009-2013), “Биосовместимые материалы и покрытия”, Сборник материалов конкурса, Саратов, СГТУ. 2010. C.16-17.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.