WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Денисов Андрей Александрович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ  ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ  И СТРУКТУРНОЙ ПЕРЕСТРОЙКИ КОЖИ ПРИ АТОПИЧЕСКОМ ДЕРМАТИТЕ

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Новосибирск-2011

Работа выполнена в Государственном  Бюджетном образовательном учреждении  высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор  Климов Владимир Васильевич

доктор медицинских наук, профессор  Логвинов Сергей Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор  Ширинский Валерий Степанович

доктор медицинских наук, профессор  Ильина Наталья Ивановна

доктор медицинских наук, профессор  Машак Светлана Владимировна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития

Защита состоится « »  2012 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01  в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН по адресу: 630099, г.Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН.

Автореферат разослан «____» ________ 2011 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета

доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Атопический дерматит (АтД) является одним из наиболее распространенных заболеваний кожи, которое характеризуется неуклонно рецидивирующим течением и плохо поддаётся терапии. АтД относится к группе аллергодерматозов и встречается в среднем у 20% пациентов, страдающих всеми аллергическими болезнями [Н.И. Ильина, 2004].

АтД, как известно, встречается в разных возрастных группах – от раннего возраста до преклонных лет, но чаще дебютирует в первые годы жизни [Ю.В.Сергеев, 2002].

В эпидемиологическом плане 3-5% населения земного шара сталкиваются с проблемами АтД. Показатели заболеваемости АтД среди детей в развитых странах колеблется от 4 до 37%, а среди взрослого населения выявлена более низкая заболеваемость, которая составляет 0,2-2% в зависимости от географического региона [B.Wuthrich, 1996]. Все это делает АтД большой медико-социальной проблемой [Р.М. Хаитов, 2002].

В последнее время отмечается неуклонный рост заболеваемости АтД в России. Согласно данным официальной государственной статистики, заболеваемость АтД в Российской Федерации за 1999-2004 г.г. выросла у взрослого населения на 2,9% [Н.Г.Кочергин, 2007]. Инвалидизация пациентов с АтД достигает 8%. Расходы на лечение всех больных с аллергическими заболеваниями в России за последние годы выросли в 5 раз [Н.Г.Кочергин, 2007].

В патогенезе АтД одно из ведущих мест отводится иммунологическим нарушениям. В последнее время в литературе стало уделяться много внимания эпикутанной сенсибилизации [F.Berard, 2003] и цитокиновой составляющей аллергического воспалительного процесса [В.А.Козлов, 2004], включая резидуальную воспалительную активность в коже [T.Bieber, 2008]. Иммунопатогенез атопического дерматита традиционно рассматривается как нарушение баланса Тh1/Тh2 и профилей их цитокинов. Но в патогенезе АтД принимают участие разные цитокины с противоположным действием, которые продуцируются не только антагонистическими субпопуляциями Th1 и Th2 лимфоцитов, но и другими регуляторными клетками (Treg, Тr1, Th17, Th22 и др.) [Р.М. Хаитов, 2002].

Однако в последнее время обосновывается представление об атопии как феномене, в развитии которого принимают участие как иммунные, IgE-опосредованные, так и многочисленные неиммунные механизмы [В.И.Пыцкий, 2005]. К последним, в частности, относится повышение проницаемости кожи  при АтД, связанное с нарушенным процессом кератинизации вследствие дефекта синтеза филаггрина [J.N. Barker, 2006]. Филаггрин является ключевым белком, участвующим в конечной дифференцировке кератиноцитов и образовании кожного барьера [S.Weidinger, 2006]. По результатам недавних исследований C. N. Palmer et al. доказали ассоциацию мутаций в гене филаггрина с развитием АтД [C. N Palmer, 2006].

Большое значение в плане прогноза заболевания стало уделяться исследованию процессов ремоделирования кожи – обратимой морфо-функциональной перестройке, зависимой от активности разных цитокинов [K. Boniface, 2005]. Показано, что при АтД имеется своеобразное нарушение роста эпидермиса и конечной дифференцировки кератиноцитов, которое отличается от расстройств, регистрируемых при псориазе, но в клиническом аспекте при обеих болезнях наблюдается регенеративная эпидермальная гиперплазия. Аномальная программа функционирования кератиноцитов и лежит в основе ремоделирования кожи [E.Guttman-Yassky, 2009].  Двусторонние нейтро-иммунные взаимоотношения вносят свой вклад в эти процессы в коже [S.Hendrix, 2007].  Кератиноциты являются важными клетками-мишенями для IL-22, IL-10 и IFN-γ [R.Sabat, 2006].

Цель работы - охарактеризовать содержание цитокинов, распределение антигенпредставляющих клеток и ультраструктуру кожи при её иммунологической и структурной перестройке (ремоделировании) у больных атопическим дерматитом, провести комплексную клинико-иммунологическую оценку эффективности аллергенспецифической иммунотерапии при данной патологии.

       Задачи исследования:

  1. Исследовать содержание IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 в кожных экссудатах при различных формах атопического дерматита.
  2. Верифицировать наличие резидуальной воспалительной активности кожи в периоде ремиссии болезни.
  3. Исследовать содержание IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 в кожных экссудатах, полученных в очагах лихенификации и вне их.
  4. Установить значение эпикутанной сенсибилизации в этиопатогенезе атопического дерматита.
  5. Изучить распределение CD1a+ клеток Лангерганса в эпидермисе и  CD68+ клеток (макрофагов) в дерме при данной патологии.
  6. Исследовать электронно-микроскопическую картину кожи в остром периоде и в период ремиссии атопического дерматита.
  7. Выделить морфологические маркёры структурной перестройки кожи при атопическом дерматите.
  8. Оценить клиническую характеристику и содержание  IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 в кожных экссудатах у больных с мутациями 2282del4 и R501X в гене филаггрина.
  9. Исследовать распределение CD1a+ клеток Лангерганса в эпидермисе и CD68+ клеток (макрофагов) в дерме и ультраструктуру кожи у больных с мутациями 2282del4 и R501X в гене филаггрина.
  10. Провести клинико-иммунологическую оценку эффективности аллергенспецифической иммунотерапии при атопическом дерматите.

Научная новизна работы

Впервые получены комплексные данные по клиническим, иммунологическим и морфологическим критериям перестройки кожи при атопическом дерматите, а именно исследовано содержание IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 в бесклеточных кожных экссудатах и распределение антигенпредставляющих клеток в динамике атопического дерматита, в группе больных с мутациями 2282del4 и R501X в гене филаггрина,  до и после проведения аллергенспецифической иммунотерапии.

Впервые установлено, что с учётом изменений по отношению к норме в содержании IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 в коже как шоковом органе персистирующего аллергического процесса имеется дисбаланс в активности разных иммунорегуляторных клеток (Th1, Th2, Th17 и Tr1 и др.).

Впервые показано, что в период обострения болезни в экссудатах «кожного окна» наблюдается динамика к увеличению содержания IL-4 и IL-10 и снижение уровня IFN-γ. Научную новизну имеет исследование ультраструктуры кожи. В остром периоде болезни по данным электронной микроскопии кожи отмечены признаки воспаления, а в периоде ремиссии - характерные морфологические изменения, свидетельствующие о тканевой перестройке (ремоделировании) кожи.

Впервые установлено, что в группе больных с мутациями 2282del4 и R501X в гене филаггрина наблюдаются более высокое содержание IL-4 и IL-17 в кожных экссудатах, увеличение количества CD1a клеток Лангерганса и их отростков в эпидермисе, утолщение рогового слоя, деструктивные проявления со стороны мелких десмосом, а также фрагментация и распад тонофибрилл в коже по сравнению с пациентами без мутаций.

Впервые показано, что после проведения аллергенспецифической терапии в кожных экссудатах отмечается повышение IFN-γ и IL-17, а на ультраструктурном уровне наблюдается частичное нивелирование признаков неблагоприятной структурной перестройки кожи.

Теоретическая значимость

       Получены новые фундаментальные знания о формировании иммунологической и структурной перестройки кожи в ходе персистирующего атопического воспалительного процесса в ней. Характер установленных закономерностей ремоделирования кожи связан с постоянным резидуальным цитокиновым воспалением, повышенным содержанием клеток Лангерганса, макрофагов, стареющих форм фибробластов, фиброзом, акантозом, утратой коллагеновыми волокнами поперечной исчерченности.

Практическая значимость

Показано, что определение локальных уровней цитокинов в «кожном окне» при атопическом дерматите может служить диагностическими критериями интенсивности локального воспаления, включая резидуальную воспалительную активность кожи в периоде ремиссии болезни, а также терапевтическими критериями эффективности аллергенспецифической терапии.

Установлено, что пациентов с мутациями 2282del4 и R501X в гене филаггрина повышена частота вторичных инфекций и более выражено шелушение кожи – симптомы, которые могут служить критериями отбора больных для диагностического генотипирования на предмет мутаций в гене филаггрина. 

       Показано, что аллергенспецифическая иммунотерапия способствует стабилизации ремиссии атопического дерматита и приводит к частичному нивелированию признаков ремоделирования кожи при данной патологии.

Результаты проведённого исследования внедрены в педагогический процесс на кафедре иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития при обучении студентов, а так же при подготовке интернов и ординаторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. При атопическом дерматите формируется иммунологическая и структурная перестройка кожи (ремоделирование).
  2. В периоде ремиссии атопического дерматита в коже сохраняется резидуальная воспалительная активность, характеризующаяся высоким содержанием в кожном экссудате IL-4 и лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрацией.
  3. Мутации 2282del4 и R501X в гене филаггрина значительно усиливают иммунологическую и структурную перестройку кожи за счёт высокого содержания в кожном экссудате IL-4 и IL-17, CD1a+ клеток Лангерганса и их отростков в эпидермисе, утолщения рогового слоя и деструкции десмосом и тонофибрилл в коже.

  Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

  1. Объединённый иммунологический форум, Екатеринбург, 2004.
  2. Всероссийский научный симпозиум с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск, 2005.
  3. Всероссийская научно-практическая конференция «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск, 2005.
  4. Всероссийская научная конференция с международным участием «Immune-Mediated Diseases: From Theory to Therapy», Москва, 2005.
  5. 13-й международный иммунологический конгресс, Рио-де-Жанейро, 2007.
  6. Всероссийская научно-практическая конференция «Дни иммунологии в Сибири», Омск, 2007.
  7. Национальная конференция «Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы», Москва, 2008.
  8. Объединенный иммунологический форум, Санкт-Петербург, 2008.
  9. Всероссийская научно-практическая конференция «Дни иммунологии в Сибири», Томск, 2008.
  10. VIII конференция иммунологов Урала, Сыктывкар, 2010.

Публикации.  По материалам исследования было опубликовано 30 научных работ, в том числе 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени доктора медицинских наук,  получена 1 медицинская технология "Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии" ФС№2010/217 от 10.06.2010.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 256 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвящённой материалам и методам, 6-ти глав, в которых излагаются результаты собственных исследований, а также заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 49 таблицами, 38 рисунками, 4 микрофотографиямии, 28 электронограммами. Список литературы содержит 312 источников, из них 54 – отечественных, 258 – иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Основную группу обследованных составили 420 пациентов (190 мужчин и 230 женщин) в возрасте от 18 до 54 лет с установленным диагнозом АтД, находившихся под наблюдением в дневном стационаре иммуно-аллергологического отделения Межвузовской больницы г. Томска, кожного отделения клиники им. А.Г.Савиных Сибирского государственного медицинского университета и в клинике ООО «Центр иммунопатологии» (г.Томск).

Все пациенты предварительно дали письменное согласие на участие в проводимом исследовании, которое было разработано биоэтическим комитетом СибГМУ согласно Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Дизайн работы – ретроспективное рандомизированное клиническое сравнительное исследование в группах.

Критериями включения в исследование были:

- наличие диагноза атопический дерматит (АтД) в соответствии с указанными ниже критериями;

- возраст 18-54 года;

- наличие сенсибилизации к аллергенам по результатам кожных проб;

- наличие добровольного информированного согласия.

Критериями исключения из исследования были:

- возраст до 18 лет и после 54 лет;

- наличие острых инфекционных заболеваний и обострений сопутствующих хронических заболеваний;

- получение иммунотропных препаратов, прививок, антибиотиков, цитостатиков в последний 1 месяц;

- проведение местной терапии гормональными и другими кремами в последний 1 месяц;

- отсуствие сенсибилизации при проведении кожных аллергопроб;

- отсутствие добровольного информированного согласия.

Диагностика АтД включала сбор жалоб, анамнеза жизни и заболевания. Тщательное внимание уделялось аллергологическому анамнезу пациента и наследственности по атопическим заболеваниям. Диагноз АтД устанавливался на основании  классических диагностических критериев J. Hanifin и G. Rajka (1980).  В соответствии с рабочей классификацией АтД учитывались стадии заболевания, клинико-морфологические формы, распространенность процесса на коже [Р.М. Хаитов, 2002]; степень тяжести болезни оценивалась с учетом индекса SCORAD [Ю.В. Сергеев, 2002].

Контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров-добровольцев в возрасте 17-24 лет.

Материалом для исследования системных иммунологических параметров (IgE, IL-4, IFN-γ) и генотипирования на наличие мутаций R510Х и 2282del4 в гене филаггрина была венозная кровь. Для определения концентрации IL-4,  IFN-γ, IL-10, IL-17 в разных участках кожи были использованы бесклеточные фракции кожного экссудата, полученные с помощью камеры. Материалом для иммуногистохимического исследования CD1a+ клеток Лангерганса в эпидермисе и CD68+ клеток (макрофагов) в дерме и электронной микроскопии были использованы биоптаты кожи.

Концентрация цитокинов определялась в бесклеточных кожных экссудатах, получаемых согласно патенту № 1534395 на изобретение «Способ диагностики аллергического диатеза» В.В. Климова, Т.В. Кошовкиной, В.К. Раткина и А.А. Денисова, 1993 [В.В.Климов., 1993] и медицинской технологии «Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии» ФС№2010/217 от 10.06.2010 [В.В. Климов и др, 2010].

Переднюю сторону предплечья дезинфицировали спиртом. Затем в средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляли верхний слой эпидермиса, не затрагивая более глубокие слои кожи. После удаления рогового слоя на участке кожи площадью 0,50,5 см образовывалась поверхность с характерным блеском. Слой шиповатых клеток, базальных клеток и базальная мембрана эпидермиса оставались интактными. На скарифицированный участок помещали камеру объемом 1,0 мл, предварительно заполненную с помощью шприца стерильной средой 199. Камеру фиксировали на коже с помощью лейкопластыря. Круговая обвязка предплечья бинтом обеспечивала наиболее надежную фиксацию камеры. Через 6 часов камера снималась, ее содержимое переносилось в пробирку. После центрифугирования экссудата получался супернатант, который в дальнейшем использовался для ИФА-определения цитокинов.

Для определения продукции IL-4, IL-10, IL-17 и IFN- были использованы  наборы реагентов «ИЛ-4-ИФА-БЕСТ», «ИЛ-10-ИФА-БЕСТ», «ИЛ-17-ИФА-БЕСТ» и «гамма-ИНТЕРФЕРОН-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Постановку ИФА проводили в соответствии с методическими рекомендациями производителя. Анализ результатов ИФА проводили на микропланшетном ридере Multiscan EX («Labsystems», Финляндия). Расчет концентрации цитокинов осуществлялся по калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество выражали в пикограммах на миллилитр (пг/мл).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета статистических программ «SPSS». Для представления количественных данных, не подчиняющихся нормальному закону распределения, использовали описательные статистики: Ме (медиана), Q1 (1-й квартиль (25%)) и Q3 (3-й квартиль (75%)). Для всех имеющихся выборок данных применялись непараметрические критерии Краскал-Уолиса и Манна - Уитни. Различие двух сравниваемых величин считалось достоверным  с надежностью Р>0,95, если вероятность их тождества оказывалась меньше 5%. Анализ качественных данных проводили с помощью критерия 2. Анализ взаимосвязей для данных, не подчиняющихся нормальному закону распределения,  проводили с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена [С. Гланц, 1999] .

Результаты исследования и их обсуждение

В общей клинической группе было 190 мужчин и 230 женщин, средний возраст составил 31,1±2,9 лет.

Таблица 1. Результаты скарификационного кожного тестирования у больных атопическим дерматитом

Вид аллергена

Число больных (n=420)

++++

+++

++

+

Всего

Dermatophagoides pteronissinus

97

177

112

10

396 (94,3%)

Домашняя пыль

98

196

120

6

420 (100%)

Библиотечная пыль

45

64

91

5

205 (48,8%)

Перо подушек

23

37

67

7

134 (31,9%)

Эпидермальные аллергены

12

23

43

12

90 (21,4%)

Пыльца деревьев

2

3

23

18

46 (11,0%)

Пыльца злаковых трав

6

5

27

16

54 (12,9%)

Пыльца сорных трав

7

8

30

14

59 (14,0%)

Пищевые аллергены

-

6

12

14

32 (7,6%)

Как видно из таблицы сенсибилизация к аллергенам домашней пыли наблюдалась у 100% обследованных, а к аллергену Dermatophagoides pteronissinus – у 94,3%, что подчёркивало её эпикутанный характер в популяции взрослых пациентов с АтД [Laouini, 2003]. Преобладала выраженная степень кожного ответа на вводимый аллерген (+++). Результаты кожного аллерготестирования свидетельствуют о наличии в основе болезни атопической конституции как особого полигенно наследуемого состояния.

У всех пациентов с АтД в общедиагностическом аспекте проведено определение в сыворотке крови общего IgE. Концентрация IgE составила 326,6 (88,5-697,3) КЕ/мл.

В табл. 2 показано распределение больных в заивсимости от индекса SCORAD.

  Таблица 2. Распределение пациентов с атопическим дерматитом

по индексу SCORAD

Индекс SCORAD

Число больных (n=420)

n

%

SCORAD 0-20 баллов

(легкая степень тяжести)

135

32,1%

SCORAD  20-40 баллов

(средняя степень тяжести)

204

48,6%

SCORAD более 40 баллов

(тяжелая степень)

81

19,3%

Как видно из таблицы, в выборке преобладали больные со средне-тяжёлой  (48,6%) и лёгкой формой болезни (32,1%). В среднем индекс SCORAD в остром периоде составил 36,51 ± 10,32 баллов.

       У подавляющего большинства пациентов болезнь стартовала в детском возрасте, причём чаще в всего – в раннем детстве (61%). Установлено, что  у 2/3 всех пациентов выявлены различные сопутствующие атопические болезни. Наиболее часто встречался круглогодичный аллергический ринит (33,6%), в 13,3 % случаев диагностировалось более одного заболевания. Таким образом, клинико-анамнестическая характеристика пациентов с АтД указывала на наличие в основе данной патологии атопической конституции как особого полигенно наследуемого состояния. Особенности спектра сенсибилизации, выявляемые при проведении кожных аллергопроб, а именно 100%-ное выявление кожного ответа на аллергены домашней пыли с преобладанием выраженной степени реакции, подчёркивало эпикутанный характер сенсибилизации при АтД.

На системном уровне по данным содержания IL-4 и IFN-γ в крови не удалось однозначно констатировать поляризацию иммунорегуляторных популяций в сторону повышенной активности Th2, что диктовало необходимость проведения исследований цитокинов на локальном уровне непосредственно в коже.

Были проанализированы данные по содержанию цитокинов «кожного окна» у пациентов в стадии обострения АтД с учетом индекса SCORAD. У всех пациентов в остром периоде камеры устанавливадись на поражённые участки кожи. Содержание IL-4 в кожных экссудатах колебалось в зависимости от тяжести АтД, но достоверное по отношению к контролю увеличение IL-4 отмечено только при средне-тяжёлой и тяжёлой формах: 0,95 (0,6-1,1) и 1,0 (0,7-1,2) пг/мл соответственно. Повышение уровня IL-4 в период обострения АтД можно объяснить тем, что этот цитокин относится к основным пусковым медиаторам атопического воспаления, регулируемого Th2-клетками, и  выполняет ключевую роль в продукции IgЕ при АтД [Leung, 1999].

Уровень IFN-γ в остром периоде АтД имел тенденцию к снижению, при этом при тяжёлой форме болезни это уменьшение имело достоверный по отношению к контролю характер – 32 (20-44) пг/мл.

Содержание IL-10 колебалось в остром периоде АтД в заивисимости от  тяжести, достоверно нарастая при средне-тяжёлой и тяжёлой формах болезни: 29 (16–55) и 43,5 (21,6-60,5) соответственно. Увеличение продукции IL-10 у больных в период обострения АтД,  возможно, отражало повышенную активность Tr1-клеток и других синтезирующих его клеток. Роль Tr1-лимфоцитов в патогенезе АтД остается в настоящее время мало изученной. По результатам некоторых исследований было обнаружено повышенное количество Tr1-клеток в кровотоке у пациентов с АтД по сравнению с контролем  [Szegedi, 2009]. Полученные результаты подтверждают возможное  увеличение  Tr1-клеток у пациентов с АтД на местном уровне, что, видимо, связано с их участием в регуляции острого аллергического воспаления в коже.

Уровень IL-17 в кожных экссудатах при обострении разных форм АтД достоверно не изменялся по отношению к контролю, но имел тенденцию к снижению. Эта тенденция снижения продукции IL-17 в период обострения болезни отражала подавление функциональной активности Th17-клеток [Toda, 2003] и, возможно, свидетельствовала о супрессорной активности других клеток (прежде всего Тh2).  Обобщая результаты исследования уровня цитокинов в остром периоде АтД, можно констатировать, что отмечалось достоверное по отношению к контролю повышение содержания IL-4 и IL-10 при средне-тяжёлой и тяжёлой формах АтД, снижение IFN-γ при тяжёлой форме. Колебания IL-17 в остром периоде болезни оказались недостоверными. При проведении корреляционного анализа выявлены корреляционные связи между показателями цитокинов и клиническими данными. Содержание IL-4 коррелировало с тяжёлой формой обострения (r=0,69, p<0,05), а IL-10 – с наличием эритематозно-сквамозной формы (r=0,44, p<0,05).

Колебания содержания цитокинов в остром периоде АтД при группировке пациентов по признаку пола и длительности болезни оказались недостоверными.

В периоде ремиссии сохранялась в основном та же направленность в отклонениях в содержании цитокинов, что была отмечена в периоде обострения. Наблюдались высокие уровни IL-4 и IL-10, при этом снижение IFN-γ в стадию ремиссии было даже более значительное и достоверно отличалось по отношению к обобщённой группе больных АтД в остром периоде.

Далее,  для исследования зависимости концентраций цитокинов от конкретных участков кожи (условно здорового или лихенифицированного), на которые устанавливась камеры, сделан анализ,  где учитывались данные по содержанию цитокинов кожного экссудата в разных местах установки камеры. Лихенификация – это клинический эквивалент ремоделирования кожи [Katayama, 2002]. Установлено, что место установки камеры влияет только на IL-10, содержание которого существенно возрастает в очагах лихенификации по сравнению со здоровыми участками кожи (см. табл. 3). Это согласовывается с особенной ролью IL-10 в аллергических процессах [Bellingshausen, 2001; Mocellin et al, 2003; Wu et al, 2007]. IL-10 вырабатывается многими видами клеток (Тh2, Tr1, Th22, дендритные клетки и др.); по-видимому, многие из них вовлечены в процессы ремоделирования кожи. 

Таблица 3. Содержание IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 в экссудате «кожного окна» у здоровых лиц и пациентов с АтД в периоде ремиссии в зависимости от места установки камеры, Ме (Q1-Q3)

Группа

IL-4

(пг/мл)

IFN-γ

(пг/мл)

IL-10

(пг/мл)

IL-17

(пг/мл)

Контроль 

0,45

(0,4–0,7)

n=10

46

(35,5–51,75)

n=10

7

(3,5–13,5)

n=10

23

(7,75-34,55)

n=8

Здоровый участок кожи в периоде ремиссии

0,5

(0,14-0,97)

n=7

27,6

(22-44)

n=6

11,6

(10-22)

n=5

22

(11,5-36,7)

n=7

Участок лихенификации в периоде ремиссии

0,95

(0,4-1,2)

n=6

р1

31

(10,3-65,7)

n=7

р1

37,5

(30-65,5)

n=5

р1, р2

15

(7-29)

n=10

Ме – медиана,

Q1 – первый квартиль,

Q3 – третий квартиль,

р1 – достоверность различий в сравнении с контрольной группой (р<0,05),

р2 – достоверность различий в сравнении со здоровым участком кожи в периоде ремиссии (р<0,05)

Для определения резидуальной воспалительной активности кожи обследовано 60 больных с АтД. Для оценки информативности метода и расчёта точности, чувствительности и специфичности больные были разделены на 3 группы, сопоставимые по полу и возрасту. Основную группу составили 20 пациентов с АтД в стадии ремиссии, которым оценка воспалительной активности кожи проводилась в соответствии с определением содержания цитокинов IL-4, IFN- и IL-10 в бесклеточной фракции кожного экссудата «кожного окна».  Контрольную группу 1 составили 20 пациентов с АтД в стадии обострения, которым оценка воспалительной активности проводилась также по концентрациям указанных цитокинов (аналогично основной группы). Контрольную группу 2 составили 20 пациентов с АтД в стадии ремиссии, у которых оценка воспалительной активности осуществлялась по определению клеточного состава в экссудате «кожного окна» [В.В. Климов, 1999]. В результате проведенных исследований у пациентов основной группы с АтД в стадии ремиссии и пациентов контрольной группы 1 с АтД в стадии обострения выявлено наличие воспалительной активности кожи практически в одинаковом проценте случаев, что подтверждало возможность использования данного метода в определении воспалительной активности кожи при АтД. Данный метод зарегистрирован как новая медицинская технология «Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии" ФС№2010/217 от 10.06.2010.

При гитологическом исследовании в образцах кожи здоровых лиц,  в 100% исследуемых случаях, фиброзных изменений не было выявлено. Установлено, что в остром периоде АтД в коже имеется повышение фибробластов, а в периоде ремисии - лимфоцитов и макрофагов; фиброзные изменения дермы встречаются в 13,6-54,6% случаев. Полученные данные согласуются с описанными гистологическими критериями ремоделирования кожи при АтД [Н.Г.Кочергин, 2007].

Для оценки распределения дендритных клеток и макрофагов осуществлено иммуногистохимическое исследование кожи с использованием соответственно CD1a- и CD68-маркёров. Отличительной особенностью кожи при обострении АтД было заметное повышение количества CD1a+ клеток Лангерганса и их отростков в средней трети эпидермиса:  0,75 (0.53-1,52) и 2,87 (1,38-6,15) соответственно. С другой стороны, количество КЛ и отростков было минимальным в верхней и нижней третях эпидермиса в образцах кожи, взятых у здоровых лиц и у больных АтД в период ремиссии. Увеличение количества КЛ, а также их отростков в разные периоды заболевания, вероятно, свидетельствует о том, что данная субпопуляция дендритных клеток эпидермиса при АтД является ответственной за инициацию и хронизацию иммунологических реакций  в коже. Это соответствует современной концепции о минимальной воспалительной реакции, которая поддерживается в период ремиссии любой атопической болезни [Toda, 2003]. Количество CD68+ клеток в дерме у пациентов в стадию обострения АтД было 3,8 (2,2–8,0), а в стадию ремиссии 11,8 (7,6-14,85) в 1мм2, что достоверно выше показателя контрольной группы, составляющего 1,7 (0–2,6) клеток в 1 мм2, что свидетельствует о напряжении иммунного ответа (антигенного представления) и воспаления в коже в динамике АтД.

Для верификации ультраструктурных изменений кожи в динамике АтД была проведена электронная микроскопия. В период обострения АтД определялись признаки выраженного воспалительного процесса в коже:  уменьшение количества клеточных слоев рогового слоя, наличие активированных форм мононуклеаров с лопастным ядром, повышение числа тканевых базофилов в сосочковом и сетчатом слоях, преобладание фибробластов с высоким содержанием лизосом и низким числом белоксинтетических органелл. В периоде ремиссии описываются следующие особенности, характризующие ремоделирование кожи при АтД: выраженный акантоз, изменение коллагеновых фибрилл с утратой ими поперечной исчерченности, умеренная лимфоцитарная инфильтрация, увеличение стареющих форм фибробластов с пикноморфными изменениями в виде повышенной базофилии и электронной плотности цитоплазмы и ядра, фиброз и гиалиноз сосочкового слоя и базальной мембраны.

Генотипирование на выявление мутаций 2282del4 и R501X в гене филаггрина было проведено у 143 пациентов с АтД в возрасте от 18 до 47 лет. Средний возраст составил 25,8±8,7, из них было 98 женщин (68%) и 45 мужчин (32%). При разделении выборки по полу частота мутаций среди женщин сильно превалировала над частотой среди мужчин и составила 94%, а среди мужчин – только 6%. При разделении выборки по полу частота мутаций среди женщин сильно превалировала над частотой среди мужчин и составила 94%, а среди мужчин – только 6% .

Для проведения анализа клинико-анамнестических данных все пациенты были поделены на две группы. Основная группа (n=17) была представлена пациентами с мутациями в гене филаггрина (2282del4 и/или R501X) при АтД. В группу сравнения (n=126) вошли пациенты с АтД без мутаций в гене филаггрина. У 80% представителей основной группы выявлена сезонность заболевания,  а именно - чаще обострение отмечалось в осенний период года. У пациентов группы сравнения сезонность определялась в 65% случаев, период обострения чаще приходился на осенне-зимнее время года.  Для определения риска развития осложнения вторичной инфекцией в группе пациентов с мутациями по отношению к группе сравнения был произведен расчет отношения шансов:  OR=(a/b)\(с/d) , где а – количество пациентов основной группы c осложнением, b – количество пациентов основной группы без осложнения, c – количество пациентов группы сранения с осложнением, d – количество пациентов группы сравнения без осложнения.

OR = (11/6)/(10/116)=21,27 – то есть возможность возникновения вторичного осложнения у пациентов основной группы в 20 раз больше, чем у пациентов группы сравнения. Мутации в гене филаггрина (2282del4 и R501X) у пациентов при АтД, выявленные в 11,8% случаев, играют ключевую роль в нарушении барьерной функции кожи, что способствует повышенному проникновению инфекционных агентов и аллергенов через кожу, и обусловливают некоторые клинические особенности пациентов с мутациями в гене филаггрина при АтД. Этими особеностями в нашем исследовании были более выраженное шелушение кожи, более частый контакт с аллергенами как анамнестически выявляемый провоцирующий фактор обострения АтД, повышенная частота вторичной инфекции.

В основной группе пациентов индекс SCORAD колебался от 7 до 81, средний показатель составил 27,9±13,8. Данная группа пациентов имела разную степень тяжести АтД:  у 8 больных (47%) отмечена легкая степень тяжести, у 5 пациентов (30%) была тяжелая степень, у 4 (23%) – средняя степень тяжести.

Развитие аллергического воспаления при АтД связано с нарушением баланса иммунорегуляторных лимфоцитов Th1/Th2 с преобладанием Th2-клеток и секрецией соответствующих цитокинов, в частности IL-4 [Д.С. Загрешенко. и др., 2010]. На фоне повышенной активности Th2-клеток происходит угнетение функциональной активности Th1-лимфоцитов и снижение продукции ими IFN- [Grewe, 1998]. Полноценными участниками в аллергическом воспалении являются и другие цитокины, способные активно влиять на формирование и течение АтД. Сравнительно недавно открыты Th17- и Th22-субпопуляции лимфоцитов, продуцирующие соответственно цитокины IL-17 и IL-22, чья роль в патогенезе атопических заболеваний остается до конца не изученной [Cheung et al, 2008].

Большинство цитокинов обладают короткодистантным механизмом действия [В. А. Козлов. и др., 2004]. Соответственно, изучение цитокинов при АтД  на системном уровне  не всегда отражает истинную картину происходящего, что определяет актуальность их изучения на локальном уровне – в коже [Kruse et al, 1999]. На первом этапе научной работы проводился сравнительный анализ цитокинов «кожного окна» в стадии ремиссии АтД. Основную группу составили пациенты с АтД с мутациями в гене филаггрина. В группу сравнения вошли пациенты с АтД в стадию ремиссии без мутаций в гене филаггрина. Группа контроля была представлена здоровыми донорами-добровольцами.

В табл. 4 представлены данные по содержанию IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 в кожном экссудате в периоде ремиссии АтД.

Таблица 4. Концентрации IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 (пг/мл)  в экссудате «кожного окна» у пациентов основной группы и группы сравнения при атопическом дерматите в стадии ремиссии и у здоровых лиц (Me (Q1-Q3))

Показатель

IL-4

IFN-γ

IL-10

IL-17

Здоровые доноры-добровольцы

0,45

(0,4 – 0,7)

n=10

46

(35,5 –51,75)

n=10

7

(3,5 – 13,5)

n=10

23

(7,75 - 34,55)

n=8

Атопический дерматит (группа сравнения), ремиссия

0,8

(0,4 - 0,97)

n=13 

р1

15,5

(10,25–41,5)

n=13 

p1

27

(20 – 35)

n=10 

р1

24

(13,5 – 36,7)

n=17

Атопический дерматит с мутациями

(основная группа), ремиссия

1,0

(0,6-1,2)

n=10 

p1, р2

11

(8 - 21)

n=10 

p1

31,5

(12,5–45,3)

n=10 

p1

32

(29,25– 41,25)

n=9 

p1, p2

*Примечания: р1 – достоверность различий в сравнении с контрольной группой (р<0,05),

р2 – достоверность различий в сравнении с группой сравнения (р<0,05),

р3 – достоверность различий в сравнении с основной группой (р<0,05)

Из данных, приведенных в табл. 4 видно, что содержание IL-4 в экссудатах «кожного окна» в период ремиссии составило 1,0 (0,6-1,2) пг/мл в основной группе и 0,8 (0,4-0,97) пг/мл в группе сравнения, что достоверно (р<0,05) выше (в 2 раза) уровня контрольной группы. В контрольной выборке уровень данного цитокина был 0,45 (0,4-0,7) пг/мл. Показатель IL-4 в период ремиссии у пациентов с мутациями в гене филаггрина оказался достоверно выше (р<0,05), чем в группе сравнения.

В отношении IFN- отмечалось достоверное снижение (р<0,05) уровня данного цитокина в период ремиссии в основной группе по отношению к контролю, и составило 11 (8 - 21) пг/мл и 46 (35,5-51,75) пг/мл соответственно. В группе сравнения в период ремиссии концентрация IFN- также была достоверно ниже (р<0,05)  показателей контрольной группы. В период ремиссии показатель IFN- у пациентов с мутациями в гене филаггрина (основная группа) был ниже, чем в группе сравнения, но достоверность различий между двумя сравниваемыми группами не была выявлено.

Низкий уровень IFN- совпадает с высоким уровнем IL-4 в период ремиссии, что указывает на развитие дисбаланса Th1/Th2 в сторону избыточной активации  Th2-клеток [ Grewe, M. A, at all, 1998]. Данный факт может свидетельствовать о том, что у пациентов в стадии ремиссии АтД даже при отсутствии клинических проявлений в коже присутствует резидуальная воспалительная активность, регулируемая Th2-лимфоцитами. Кроме того, инициация вторичного иммунного ответа у данных пациентов будет протекать на фоне исходно измененного баланса Th1/Th2.

В период ремиссии у пациентов с мутациями в гене филаггрина было выявлено достоверное повышение (р<0,05) показателя IL-4 по отношению к пациентам без мутаций в гене, кодирующем белок филаггрин (группа сравнения). Вероятно, это можно объяснить повышенной антигенной нагрузкой, связанной с нарушением барьерной функцией кожи при дефектах синтеза белка филаггрина, и, как следствие, постоянной готовностью организма к активации иммунного ответа на поступающий аллерген [Howell, 2007].

У  здоровых лиц колебания IL-10 были 3,5-13,5 пг/мл с медианой 7 пг/мл. У пациентов основной группы уровень данного цитокина в период ремиссии достоверно превышал (р<0,05) аналогичные показатели в контроле в 4 раза, и его содержание составило 31,5 (12,5 - 45,3) пг/мл. Достоверное повышение IL-10 (р<0,05) в период ремиссии по отношению к контролю было выявлено и у пациентов группы сравнения - 27 (20 – 35) пг/мл. Показатель IL-10 у пациентов двух обследуемых групп в период ремиссии при АтД значительно превышает контрольные цифры. Известно, что IL-10 продуцируется другой иммунорегуляторной субпопуляцией Т-клеток – Tr1, а также дендритными клетками, Тh2-лимфоцитами и др. [Lan et al, 2005]. Можно предположить, что Tr1 могут препятствовать развитию АтД на различных патогенетических этапах, включая сенсибилизацию, ремоделирование и персистенцию аллергического воспаления  [Bellinghausen, 2001]. Таким образом, IL-10, как противовоспалительный цитокин, супрессируя продукцию провоспалительных цитокинов и антигенпредставляющую функцию дендритных клеток, вероятно, является одним из факторов стабилизации ремиссии болезни [Mocellin et al, 2003].

Концентрация IL-17 в основной группе в период ремиссии составила 32 (29,25-41,25) пг/мл, что было достоверно выше аналогичного показателя в группе сравнения - 24 (13,5 – 36,7) и достоверно выше уровня IL-17 в контрольной группе - 23 (7,75 - 34,55) пг/мл.  Повышение IL-17 в экссудате «кожного окна» у пациентов с мутациями в гене филаггрина при АтД, возможно, связана с нарушением кожного барьера. Следствием этого является колонизация кожи золотистым стафилококком, грибковой инфекцией, которая способствует активации Th17-клеток, продуцирующих IL-17. Клинически это подтверждается более частыми гнойничковыми инфекциями кожи в анамнезе у данной группы пациентов с АтД. Кроме того, высокий уровень IL-17 на фоне дефекта синтеза белка филаггрина по данным литературы определяет темпы хронизации кожного процесса, приводящие к ремоделированию кожи [Toda, 2003].

В период ремиссии у пациентов с мутациями в гене филаггрина было выявлено достоверное повышение (р<0,05) показателя IL-4 по отношению к пациентам без мутаций в гене, кодирующем белок филаггрин (группа сравнения). Вероятно, это можно объяснить повышенной антигенной нагрузкой, связанной с нарушением барьерной функцией кожи при дефектах синтеза белка филаггрина, и, как следствие, постоянной готовностью организма к активации иммунного ответа на поступающий аллерген [Howell, 2007].

Полученные данные по продукции цитокинов в экссудатах «кожного окна» однозначно свидетельствуют о сдвиге баланса в сторону Th2-клеток при АтД. Последовательной активации продукции цитокинов Th2- и Th1-профилей не происходит. Снижение концентраций цитокинов Th1- и Th17-лимфоцитов обусловлено действием цитокинов Th2-клеток и, возможно, Tr1-лимфоцитов. Таким образом, зарегистрировано достоверное повышение содержания IL-4 и IL-10 в экссудатах «кожного окна» в период обострения АтД у пациентов двух исследуемых групп по сравнению с контролем. В период ремиссии АтД в обеих группах были отмечены достоверно более высокие уровни IL-4 и IL-10 и более низкая концентрация IFN- по отношению к контролю (p<0,05). Однако у пациентов с мутациями в гене филаггрина в период ремиссии зарегистрированы достоверно более высокие уровни IL-4 и IL-17 (p<0,05).

  В эпидермисе специализированными аллергенкумулирующими и аллергенпредставляющими высокопотентными клетками являются клетки Лангерганса [М.В. Пащенков. и др., 2006]. Исследование количественного состава данных клеток в коже у пациентов с мутациями в гене филаггрина при АтД не проводилось,  поэтому представляется актуальным изучение содержания КЛ для понимания локального аспекта патогенеза АтД. Установлено, что содержание клеток Лангерганса (CD1a) и их отростков, выявляемое в эпидермисе иммуногистохимическим окрашиванием, достоверно повышено у пациентов с АтД в отличие от здоровых лиц, варьирует в зависимости от слоя эпидермиса, периода болезни и группы больных. В периоде обострения в группе пациентов с мутациями в гене филаггрина регистрируются наиболее высокие показатели СD1а-позитивных клеток и их отростков. Возможно, это обусловлено повышенной проницаемостью кожного барьера при аномальном филаггрине.

Поскольку в патогенезе АтД лежат воспалительные явления в коже, существенное значение придается оценке состояния иммунокомпетентных структур и обусловленных ими патогистологических изменений в дерме при АтД. Нарушение кожного барьера у пациентов с мутациями в гене филаггрина сопровождается постоянным проникновением антигенов через кожу и, как следствие, длительными воспалительными процессами в коже. В результате кожа подвергается тканевому ремоделированию, т.е. происходят такие изменения, которые обусловливают нарушения ее функциональных и морфологических свойств. Клеточная характеристика инфильтрата при ремоделировании в дерме представлена в основном макрофагами [Н.Г.Кочергин, 2007]. Представляет научный интерес исследование количества макрофагов в клеточном инфильтрате дермы с применением маркеров моноцитарно-макрофагального ряда (CD68+) для определения морфо-функциональных изменений в коже больных АтД с мутациями в гене филаггрина. В рамках исследования был использован иммуногистохимический анализ срезов кожи, в котором выявлялись клеточные элементы, экспрессирующие CD68. Подсчет данных клеток проводился в 1 мм2 дермы. В основную группу вошли пациенты с мутациями в гене филаггрина при АтД. Группу сравнения составили пациенты без мутаций в гене филаггрина при АтД. Исследования двух групп пациентов проводились в периоды обострения и ремиссии АтД.

Таблица 5. Количество СD68+клеток у пациентов в основной группе, группе сравнения и у здоровых лиц, Me (Q1-Q3)

Группа

CD68+

Здоровые доноры-добровольцы (n=10)

1,7 (0 – 2,6)

АтД (с мутацией), обострение (n=7)

6,8 (5,4 – 11,1)  р1

АтД (группа сравнения), обострение (n=8)

3,8 (2,2 – 8,0) р1

АтД (с мутацией), ремиссия (n=7)

17,5 (9, 35 – 24,5)  р1

АтД (группа сравнения), ремиссия (n=8)

11,8 (7,6 – 14, 85)  р1

* Примечание: p1 - достоверность различий в сравнении с контролем (р<0,05)

p2 - достоверность различий в сравнении с обострением АтД с мутацией (р<0,05)

p3 -  достоверность различий в сравнении с обострением АтД группы сравнения (р<0,05)

p4 - достоверность различий в сравнении с ремиссией АтД с мутацией (р<0,05)

p5 - достоверность различий в сравнении с ремиссией АтД группы сравнения (р<0,05)

По результатам проведенного исследования можно отметить тенденцию к более повышенному содержанию клеток, экспрессирующих CD68, у пациентов из основной группы, как в период обострения, так  и в период ремиссии. Патогенетическая сущность АтД заключается в атопическом воспалении кожи, интенсивность которого варьирует от выраженного в период обострения до минимального в период ремиссии, а также в процессах ремоделирования кожи. Возможно, повышенная проницаемость кожи, наблюдаемая у пациентов с мутациями в гене филаггрина, сопровождается более выраженными воспалительными процессами в коже, что находит отражение в более высоких показателях распределения CD68+ клеток.  Характеристика  клеточной  картины при ремоделировании кожи при АтД в эпидермисе представлена увеличением количества КЛ, а в дерме – повышением макрофагов.

На ультраструктурном уровне изменения у пациентов с мутациями в гене филаггрина свидетельствуют о нарушенной целостности и проницаемости кожи вследствие деструктивных проявлений со стороны мелких десмосом, а также фрагментации и распада тонофибрилл. Также у пациентов с мутациями в гене филаггрина было отмечено утолщение рогового слоя, что клинически проявляется повышенным шелушением, а также уменьшение пластов межклеточных липидов, что клинически, как известно, проявляется ксерозом кожи.

Из всех исследованных пациентов с АтД, находящихся в стадии ремиссии, методом случайной выборки было отобрано 18 человек в возрасте от 18 до 25 лет для проведения АСИТ (группа наблюдения).  При оценке степени тяжести индекс SCORAD в этой группе больных находился в пределах от 2,9 до 15,4 и в среднем составлял 6,12 ± 1,1.

Методом случайной выборки было отобрано 20 пациентов – группа сравнения, в которой АСИТ не проводилась. По большинству клинических характеристик она была сопоставима с группой наблюдения. Индекс SCORAD у этих больных колебался в пределах 2,7-14,9 и в среднем составлял 6,07 ± 1,0.

С целью достижения состояния стабильной ремиссии и в качестве подготовки к проведению АСИТ все пациенты получили лечение антигистаминными препаратами, мембраностабилизаторами, при выявлении дисбиоза кишечника – биопрепаратами, прошли курс дезинтоксикационной терапии, а так же получили курс гепатопротекторов. При обнаружении каких-либо отклонений в параметрах иммунного статуса проводилась иммунокоррекция в соответствии с выявленными изменениями.

Клиническая эффективность АСИТ у больных АД нами оценивалась по ряду показателей. Прежде всего - по динамике клинической картины: исчезновению клинических проявлений заболевания, стабильности ремиссии. Наглядно динамику субъективного и объективного состояния пациентов в результате АСИТ демонстрировало изменение такого интегративного показателя, как индекс SCORAD. Величина этого индекса оценивалась до начала проведения АСИТ и на 30 сутки после выхода на поддерживающую дозу. Таким образом, видно, что значение индекса SCORAD  достоверно  (р<0,05)  снижается и составляет в среднем до начала терапии 6,12 ± 1,1, а после лечения – 2,36 ± 0,18. В группе сравнения индекс SCORAD достоверно не менялся (см. табл. 6).

Таблица 6. Изменение индекса SCORAD у пациентов с атопическим дерматитом до и после проведения специфической иммунотерапии

Группы

Индекс SCORAD

Группа наблюдения (больные, которым проводилась АСИТ)

Группа сравнения (больные, которым проводилась АСИТ)

До проведения АСИТ

6,12 ± 1,1

6,07 ± 1,0

После проведения АСИТ

2,36 ± 0,18

р<0,05

5,05 ± 1,0

р>0,05

В катамнезе ремиссия в группе наблюдения длилась в среднем 12,5 ± 1,2 месяца, а в группе сравнения – только  6,3 ± 0,5 месяца (р<0,05).

Таким образом, проведение АСИТ приводило к стабилизации клинической ремиссии, уменьшению индекса SCORAD, а, значит и улучшает качество жизни пациентов с АтД.

Для оценки влияния АСИТ на содержание цитокинов в кожных экссудатах проведено исследование у тех же пациентов, у которых оценивались клинические параметры: в группе наблюдения (n=16) и группе сравнения (n=20). Результаты отражены в табл. 7.

Таблица 7. Содержание IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 в кожных экссудатах до и после АСИТ, Ме (Q1-Q3)

Группа

IL-4

(пг/мл)

IFN-γ

(пг/мл)

IL-10

(пг/мл)

IL-17

(пг/мл)

Контроль

n=10

0,45

(0,4–0,7)

n=10

46

(35,5–51,75)

n=10

7

(3,5–13,5)

n=8

23

(7,75-34,55)

Группа наблюдения:

- до АСИТ

- после АСИТ

n=15

0,95 (0,9-1,2)  р1

n=15

31 (16,25-35,5)  р1

n=8

27

(19–34)

р1

n=14

24

(13,3 – 35,6)

0,6 (0,4-1,0)

44 (34-57)

р2

13 (9-21)

р2

29,5 (17,62-44,7)

Группа сравнения:

- до лечения

- после лечения

n=10

0,91 (0,8-1,3)

р1

n=10

32 (16,3-36,5)

р1

n=7

26

(20–33)

р1

n=7

24

(13,1 – 36,6)

0,66 (0,26-0,8)

31 (34,5-37,8)

р1, р3

27

(20–35)

р1, р3

25 (15.1 – 38.2)

Ме – медиана,

Q1 – первый квартиль,

Q3 – третий квартиль,

р1 – достоверность различий в сравнении с контрольной группой (р<0,05),

р2 – достоверность различий в сравнении с периодом обострения АтД (р<0,05)

       Как видно из таблицы, проведение АСИТ приводило к повышению содержания IFN-γ: 44 (34-57) против 31 (16,25-35,5) пг/мл и снижение IL-10: 13 (9-21) против 27 (19–34) пг/мл. Изменения IL-17 были недостоверными, хотя отмечалась тенденция к повышения IL-17 после АСИТ. Проведение АСИТ также приводило к повышению содержания IFN-γ: 44 (34-57) против 31 (16,25-35,5) пг/мл и снижение IL-10: 13 (9-21) против 27 (19–34) пг/мл. Изменения IL-17 были недостоверными, хотя отмечалась тенденция к повышения IL-17 после АСИТ.

Повышение содержания IFN-γ в в кожных экссудатах можно объяснить одним из известных механизмов AСИТ. Этот механизм приводит к тому, что в результате проведения АСИТ происходит смещение равновесия от Тh2–клеток в сторону Тh1–клеток, а соответственно изменяется и наработка цитокинов этих клеток, то есть происходит увеличение продукции  IFN-γ [Л.Н.Цветкова, 2000]. Данные исследований последних лет подтверждают сведения о том, что АСИТ сопровождается угнетением вызванного специфическим аллергеном пролиферативного ответа лимфоидных клеток периферической крови [И.С. Гущин, 1999].

У пациентов, получавших АСИТ, в отличие от лиц, которым АСИТ не проводилась, при исследовании ультраструктуры кожи отмечено отсутствие маркёров активации белоксинтетической функции, отмечена нормальная структура коллагеновых волокон, отсутствие лимфоцитарной инфильтрации, но на отдельных участках, как и в группе сравнения, найдены явления фиброза, гиалиноза, фиброклазии, деструкции десмосом. Следовательно, по данным электронной  микроскопии кожи проведение АСИТ приводит лишь частично к нивелированию процессов ремоделирования кожи. Описанные особенности ультраструктуры кожи у больных АтД, которым проводилась АСИТ, по-видимому, являются оригинальными, поскольку нам не удалось найти сопоставимых литературных источников.

Выводы:

  1. В остром периоде атопического дерматита в кожных экссудатах наблюдается повышение IL-4 и IL-10 при средне-тяжёлой и тяжёлой формах и снижение IFN-γ при тяжёлой формах болезни, что свидетельствует о дисбалансе Th1/Th2 с увеличением Th2.
  2. В периоде ремиссии атопического дерматита сохраняется повышение в кожных экссудатах IL-4 и снижение IFN-γ, что свидетельствует о резидуальной воспалительной активности в коже.
  3. В очагах лихенификации по сравнению со здоровыми участками кожи отмечается увеличение содержания IL-10, что отражает важную роль данного цитокина в процессах иммунологической перестройки кожи при атопическом дерматите.
  4. В основе этиопатогенеза IgE-зависимой формы атопического дерматита у взрослых лежит эпикутанная сенсибилиация к аэроаллергенам (домашняя пыль, Dermatophagoides pteronissinus) на фоне клинических маркёров атопической конституции.
  5. Гистологическая и гистохимическая картина кожи характеризуется в остром периоде повышением в дерме содержания фибробластов, и CD68+ клеток (макрофагов), а в эпидермисе - CD1a+ клеток Лангерганса и численности их отростков. В периоде ремиссии отмечается лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация и фиброз, что соответствует морфологическим критериям ремоделирования кожи при атопическом дерматите.
  6. На светооптическом и  ультраструктурном уровнях в остром периоде болезни выявляются типичные признаки воспаления: отёк соединительной ткани кожи, уменьшение количества клеточных слоев рогового слоя, наличие активированных форм мононуклеаров с лопастным ядром, повышение числа тканевых базофилов в сосочковом и сетчатом слоях, преобладание фибробластов с высоким содержанием лизосом и низким числом белоксинтетических органелл.
  7. В периоде ремиссии на фоне резидуального воспаления определяются характерные признаки структурной перестройки кожи: выраженный акантоз, изменение коллагеновых фибрилл с утратой ими поперечной исчерченности, умеренная лимфоцитарная инфильтрация, увеличение количества стареющих форм фибробластов с пикноморфными изменениями в виде повышенной базофилии и электронной плотности цитоплазмы и ядра, фиброз и гиалиноз сосочкового слоя и базальной мембраны.
  8. Генотипирование пациентов с атопическим дерматитом на наличие мутаций 2282del4 и R501X в гене филаггрина выявило частоту данных мутаций  11,8%. В отличие от больных без мутаций, у этих пациентов были повышена частота вторичных инфекций, более выраженное шелушение кожи, а в кожных экссудатах в периоде ремиссии регистрировалось достоверно более высокое содержание IL-4 и IL-17.
  9. В периоде обострения в группе пациентов с мутациями в гене филаггрина определялись высокие показатели СD1а+ клеток Лангерганса и их отростков. На ультраструктурном уровне отмечалось утолщение рогового слоя, наличие деструктивных проявлений со стороны мелких десмосом, а также фрагментация и распад тонофибрилл в коже.
  10. Проведение аллергенспецифической иммунотерапии приводит к стабилизации клинической ремиссии, уменьшению индекса SCORAD, повышению в кожных экссудатах IFN-γ и IL-17, что свидетельствует о модификации иммунорегуляции на локальном уровне в коже после иммунотерапии. По данным электронной микроскопии проведение аллергенспецифической иммунотерапии способствует частичному нивелированию процессов ремоделирования кожи, а именно  активации маркеров белоксинтетической функции в клетках кожи, восстановлению структуры коллагеновых волокон, исчезновению лимфоцитарной инфильтрации в коже.

Практические рекомендации:

  1. Целесообразно использовать определение цитокинов в кожных экссудатах как диагностический критерий выраженности резидуальной воспалительной активности в коже в периоде ремиссии атопического дерматита.
  2. В качестве дополнительного метода лечения больных атопическим дерматитом целесообразно проведение аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) причинно-значимыми аллергенами. АСИТ способствует стабилизации ремиссии болезни и приводит к частичному нивелированию ремоделирования кожи при данной патологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Климов В.В., Кошовкина Т.В., Раткин В.К., Денисов А.А. Способ диагностики аллергического диатеза / Патент на изобретение № 1534395 от 110.09.1993.
  2. Eryomenko V.N., Klimov V.V., Denisov A.A. “Skin Window” In Atopic Diseases/ Immunology Letters. - 1997. - V.56. - N.1-3.- Р. 154.
  3. Денисов А.А.,  Климов В.В.,  Кошовкина Т.В., Кошкарова Н.С., Чурина Е.Г., Шваб И.А. Функциональная активность Тх1 и Тх2 при атопическом дерматите/ Аллергология и иммунология. – 2003. – Т.4. - № 2. – С.86-87.
  4. Пронина Н.А., Свиридова В.С., Денисов А.А., Климов В.В., Кологривова Е.Н.  Возможная роль трансформирующего фактора роста β как маркёрного цитокина Т-хелперов типа 3 в патогенезе атопического дерматита / Бюллетень сибирской медицины. 2004. - № 3. С. 27-30.
  5. Денисов А.А., Климов В.В., Свиридова В.С. Цитокиновый профиль регуляторных субпопуляций при атопическом дерматите / Цитокины и воспаление. – 2005. – Т.4. - № 2. - С.91.
  6. Денисов А.А. Субпопуляции Тх1, Тх2 и Тх3 при атопическом дерматите / Материалы Всероссийской науч.–практ. конф. «Дни иммунологии в Сибири», 7 – 9 сент. 2005. – Красноярск, 2005. – С.152-153.
  7. Чурина Е.Г., Климов В.В., Денисов А.А.  γδT-клетки и СD8αα Т–  клетки периферической крови у здоровых добровольцев / Immune-Mediated  Diseases: From Theory to Therapy (Abstracts of the Congress, Moscow, 3-8 oct, 2005) JAPAIR. – 2005. – V.6. – Suppl 1. - P.231.
  8. Денисов А.А., Климов В.В., Загрешенко Д.С., Чурина Е.Г., Шаропина А.В.  Клиническая оценка содержания киллерных клеток и Т-клеток  при атопическом дерматите / Энергетика: экология, надёжность, безопасность: Мат-лы докл. 12-й Всеросс. науч.-техн. конф. 6-8 декабря 2006 г. – Томск, 2006. – С.411-412.
  9. Klimov V.V., Denisov A.A., Zagreshenko D.S. Th1, Th2 and Th3 activity in sera and skin exudates in atopic dermatitis / Immunorio 2007. 13th International Congress of Immunology. Rio de Janeiro, 2007. – P.139.
  10. Денисов А.А., Климов В.В., Загрешенко Д.С., Шаропина А.В.  Экспрессия костимулирующих молекул CD28 и CTLA-4 на лимфоцитах и содержание ИЛ-4 и ИФН-γ в крови в ходе аллергенспецифической иммунотерапии  при атопическом дерматите / Омский научный вестник. – 2007. - № 3 (61). – Приложение. – С.184-185.
  11. Загрешенко Д.С., Денисов А.А., Климов В.В., Кошовкина Т.И. Содержание ИЛ-4 и ИФН-γ в крови и кожном экссудате при атопическом дерматите / Омский научный вестник. – 2007. - № 3 (61). – Приложение. – С.187-188.
  12. Саликова Т.И., Климов В.В., Кошовкина Т.В., Денисов А.А., Фирсова Е.К.  Клеточно-цитокиновые ассоциации при атопическом дерматите / Российский иммунологический журнал.- 2008. – Т2 (11). - № 2 – 3. – С.217.
  13. Денисов А.А., Климов В.В., Кошовкина Т.В., Загрешенко Д.С., Зинатова Е.В.  Иммунологический контроль в ходе аллергенспецифической иммунотерапии при атопическом дерматите / Российский аллергологический журнал. – 2008. - Приложение. - № 1. – С.83-84.
  14. Климов В.В., Денисов А.А. Психонейроиммуномодуляция при атопическом дерматите / Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии: Тез. докл. Второй Всероссийской конференции с международным участием. – Т., 2008. – С.106-107.
  15. Саликова Т.И., Климов В.В., Денисов А.А., Загрешенко Д.С., Фирсова Е.К. Ключевые цитокины Тх1 и Тх2 в крови и кожном экссудате при атопическом дерматите / Российский аллергологический журнал. – 2008. – Приложение. - № 1. – С.253-254.
  16. ДенисовА.А., Логвинов С.В., Климов В.В., Загрешенко Д.С., .Саликова Т.И.  Морфологические и цитокиновые критерии становления ремиссии при атопическом дерматите / Морфология. – 2008. – Т. 134.- № 5. – С.66.
  17. Саликова Т.И., Климов В.В.,  Денисов А.А., Фирсова Е.К. Делеция в гене филаггрина в популяции больных атопическим дерматитом в городе Томске / Сибирский медицинский журнал. – 2008. – Т.23. - № 3 (1). – С. 111.
  18. Загрешенко Д.С., Климов В.В., Денисов А.А., Кошкарова Н. С., Саликова Т.И. Цитокины «кожного окна» и параметры SCORAD при атопическом дерматите / Сибирский медицинский журнал. – 2008. – Т.23. - № 3 (1). – С. 95-96.
  19. Климов В.В., Кологривова Е.Н., Черевко Н.А., Денисов А.А., Алифирова В.М. Клиническая иммунология и аллергология / Учебное пособие /Под ред В.В.Климова. – Изд-ва: Печатная мануфактура, Томск, 2008. – 212 с.
  20. Загрешенко Д.С., Климов В.В., Денисов А.А., Саликова Т.И., Фирсова Е.К. Цитокины «кожного окна» при атопическом дерматите / Бюллетень сибирской медицины. - 2009.-№3.-С.32-36.
  21. Денисов А.А., Загрешенко Д.С., Климов В.В., ., Саликова Т.И., Фирсова Е.К. Содержание цитокинов в кожных экссудатах при атопическом дерматите как психосоматическом заболевании / Сибирский вестник психиатрии и наркологи. - 2009.-№ 5. С.67-69.
  22. Саликова Т.И., Максимов В.Н.,  Максимова Ю.В., Аллахвердян А.А.,  Климов В.В., Денисов А.А., Кошовкина Т.В.  Мутации в гене филаггрина как предрасполагающий фактор развития атопического дерматита / Клиническая дерматология и венерология. 2010.- № 3. С.4-7.
  23. Денисов А.А., Климов В.В., Фирсова Е.К., Загрешенко Д.С., Саликова Т.И., Свиридова В.С. Содержание ИЛ-4 и интерферона-γ в крови и кожном экссудате в ходе проведения аллергенспецифической иммунотерапии при атопическом дерматите / Бюллетень СО РАМН. -2010 Т.30. - № 5. С. 11-14.
  24. Свиридова В.С., Климов В.В.,  Денисов А.А., Стахеева М.Н., Васильева М.В., Чердынцева Н.В. Иммунорегуляторные субпопуляции Т-клеток при опухолевом росте и аллергических заболеваниях / Сибирский онкологический журнал. 2010. - № 3 (39). С. 38-47.
  25. Денисов А.А., Климов В.В., Логвинов С.В., Загрешенко Д.С., Осихов И. А.  Содержание дендритных клеток и цитокинов в коже при атопическом дерматитеБюллетень сибирской медицины. - 2010. - № 6. C. 29-33.
  26. Саликова Т.И., Климов В.В., Денисов А.А., Фирсова Е.К., Загрешенко Д.С.  Расположение клеток Лангерганса в слоях эпидермиса при атопическом дерматите / Вестник Уральской медицинской академической науки. -2010.- № 2/1 (29). С.198-199.
  27. Klimov V.V., Denisov A.A., Salikova T.I., Koshkarova N.S., Koshovkina T.V. IL4, IFNg, IL10 and IL17 values in skin exudates in atopic dermatitis with mutation 2282del4 in the filaggrin gene / International Immunology. – 2010. – Vol. 22. – Suppl. - № 1. – P. 66.
  28. Климов В. В., Денисов А.А., Саликова Т. И., Загрешенко Д.С., Фирсова Е.К. Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии / ФС№2010/217 от 10.06.2010 «ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет».
  29. Денисов А.А., Климов В.В., Логвинов С.В. Морфологические и иммунологические факторы ремоделирования кожи у пациентов с атопическим дерматитом / Сибирский медицинский журнал (Томск). 2011. Т. 26. № 2, вып. 1. - С. 70-75.
  30. Денисов А.А., Климов В.В., Фирсова Е.К. IL-4, IFN-γ, IL-10 и IL-17 кожных экссудатов как диагностические критерии ремоделирования кожи при атопическом дерматите / Цитокины и воспаление. 2011. Т. 10. - №3. С.23-25.








© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.