WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

КОСТАРНОЙ Алексей Викторович

Влияние местной стимуляции врожденного иммунитета липополисахаридом Salmonella typhi на репарацию раневых дефектов кожи

03.02.03 – микробиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России).

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Народицкий Борис Савельевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Наровлянский Александр Наумович, заведующий лабораторией цитокинов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России кандидат медицинский наук, Жуховицкий Владимир Григорьевич, заведующий клинико-диагностической лабораторией Государственного бюджетного учреждения здравоохранения города Москвы Городская клиническая больница имени С.П.

Боткина Департамента здравоохранения города Москвы

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « » 2012 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.

Гамалеи» Минздрава России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д.18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.

Гамалеи» Минздрава России.

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Русакова Екатерина Владимировна  

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.



Актуальность проблемы. Раны различной этиологии, ожоги и язвы кожи и слизистых оболочек являются трудно разрешаемой медико-социальной проблемой современного общества. Особую актуальность изучение вопросов репарации ран кожного покрова приобретает в связи с постоянным ростом ран различного генеза вследствие ожогов, операций, механических травм. Терапия трофических язв, диабетических ран, пролежней, вялогранулирующих инфицированных ран, требует применения широкого арсенала лекарственных средств в течение длительного времени, во многих случаях вызывает необходимость стационарного лечения и зачастую оказывается недостаточно эффективным.

Микробная флора является обязательным участником процесса заживления ран кожи. Полагают, что микроорганизмы, способствуя воспалению и лизису омертвевших тканей, играют важную роль в очищении от них раневого дефекта;

вместе с тем известно, что контаминация раны микроорганизмами может отрицательно сказываться на течении раневого процесса (Раны и раневая инфекция / Под ред. М. И. Кузина, Б. М. Костюченок, 1990). В целом, влияние микрофлоры на раневый процесс определяется характером повреждения, вирулентностью и количеством микробов, контаминировавших рану и особенностями иммунной системы макроорганизма (Edwards and Harding, 2004).

 Известно, что ключевую роль в процессах репарации играет система врожденного иммунитета (Park and Barbul, 2004, Kluwe et al., 2009, Ioannou et al., 2010). Паттерн-распознающие рецепторы врожденного иммунитета, в отличие от Т- и В-клеточных рецепторов адаптивного иммунитета, распознают не уникальные структуры антигенных эпитопов, а высоконсервативные молекулярные структуры, характерные для микроорганизмов и вирусов (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) (Medzhitov and Janeway, 1997), а также структуры молекул, высвобождаемых или секретируемых в ответ на повреждение ткани (Danger-associated molecular patterns, DAMPs) (Bianchi, 2007).

Активация Toll-подобных рецепторов (TLRs), одного из основных семейств рецепторов врожденного иммунитета, приводит к запуску биохимических каскадов, приводящих к активации ряда транскрипционных факторов (NF-B, IRF3, 5, 7, AP-1), регулирующих секрецию спектра цитокинов, хемокинов, антимикробных пептидов, молекул адгезии и других факторов, которые могут влиять на процесс репарации.

Рецепторы врожденного иммунитета (в частности Toll-подобные рецепторы) экспрессируются широким спектром клеток, образующихся или присутствующих в коже: фибробластами, адипоцитами, кератиноцитами, эндотелиальными клетками, а также клетками иммунной системы, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, клетки Лангерганса, тучные клетки, Т- и В-лимфоциты (Miller and Modlin, 2007).

Важность проведения сигнала через Toll-подобные рецепторы для заживления ран была показана с использованием генетически модифицированных животных. Так, у мышей, нокаутных по гену цитозольного белка MyD88, необходимого для передачи сигнала от большинства TLR (кроме TLR3) наблюдается значительно худшее заживление ран кожи, ассоциированное с уменьшенным уровнем ангиогенеза раневого дефекта (Macedo et al., 2007).

Репарация ран кожи у мышей, нокаутных по гену TLR3, замедлена, и ассоциирована с уменьшенным уровнем секреции хемокинов и худшей инфильтрацией нейтрофилов и альтернативно активированных макрофагов в области раневого дефекта (Lin et al., 2011).

Недавно опубликованные данные позволяют утверждать, что местная стимуляция врожденного иммунитета лигандами Toll-подобных рецепторов, являющихся структурными компонентами бактерий или вирусов, способна стимулировать репарационные процессы в коже. Так, Deiters и соавт. установили высокую эффективность терапии диабетических ран агонистом TLR2 – макрофаги-активирующим липопептидом-2 (MALP-2): местное применение MALP-2 усиливало секрецию хемокина MCP-1 и способствовало инфильтрации раны макрофагами (Deiters et al., 2004). Sato и соавт. показали, что местное нанесение лиганда TLR9, CpG олигонуклеотида, значительно ускоряло заживление ран кожи, способствовало фиброплазии и ранней эпителизации раневых дефектов (Sato et al., 2010). Нанесение на раневую поверхность poli I:C, лиганда TLR3, стимулировало ангиогенез, способствовало инфильтрации раны макрофагами и приводило к ускорению репарации (Lin et al., 2012).

Однако к настоящему моменту отсутствуют данные, касающиеся влияния местного нанесения одного из наиболее активных лигандов TLRs, бактериального липополисахарида (лиганда TLR4) на процесс репарации ран кожи. Учитывая, что TLR4 экспрессирован большинством клеток кожи, известен обширный перечень DAMPs лигандов этого рецептора, опубликован ряд данных, полученных in vitro, показывающих участие этого рецептора в активации фибробластов, эпителиальных клеток, клеток эндотелия сосудов, можно предположить, что местная стимуляция TLR4 может оказывать существенное влияние на процессы репарации кожи in vivo.

Цель работы: Изучение влияния местной стимуляции врожденного иммунитета бактериальным липополисахаридом (ЛПС), лигандом Toll-подобного рецептора 4, на репарацию ран кожи.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать физико-химические, иммунобиологические и токсикологические свойства используемого в работе липополисахарида Salmonella typhi.

2. Изучить влияние местного нанесения ЛПС S. typhi на скорость заживления, процессы воспаления, ангиогенеза, коллагенообразования и эпителизации в области раневого дефекта.

3. Провести полногеномное изучение изменения экспрессии генов при местном нанесении на раневый дефект бактериального ЛПС S. typhi.

4. Изучить кинетику секреции хемокинов, провоспалительных цитокинов и факторов роста, индуцированных местным нанесением ЛПС S. typhi.

5. Определить влияние местного применения ЛПС S. typhi на инфильтрацию макрофагов и нейтрофилов в области раневого дефекта.

6. Провести доклинические исследование разработанной по результатам исследования лекарственной формы для местного применения, содержащей ЛПС S. typhi.

Научная новизна.

1. Впервые показана способность низкотоксичного липополисахарида S.

typhi при местном нанесении стимулировать заживление ран кожи in vivo, дозозависимо стимулировать ангиогенез и увеличение количества фибробластов на ранних сроках раневого процесса; уменьшать продолжительность воспалительной фазы раневого процесса и стимулировать процесс коллагенообразования и эпителизацию раны.

2. Впервые установлено, что местное нанесение ЛПС S. typhi на область раны увеличивает экспрессию ряда генов, в том числе генов факторов, участвующих в биохимическом каскаде активации транскрипционного фактора NF-B; генов цитокинов, хемокинов, и их рецепторов; генов молекул адгезии;

генов, кодирующих белки, вовлеченные в антибактериальный, противовирусный иммунный ответ и иммунный ответ против простейших.

3. Впервые установлено, что местное нанесение ЛПС S. typhi на раневую поверхность приводит к избирательному повышению секреции спектра медиаторов, вовлеченных в процесс репарации, в том числе хемокинов, провоспалительных цитокинов и факторов роста.

4. Впервые показано, что местное нанесение ЛПС S. typhi приводит к увеличению количества макрофагов в тканях раны на ранних стадиях раневого процесса, а на более поздних стадиях приводит к уменьшению инфильтрации раны нейтрофилами.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный интерес, заключающийся в более глубоком понимании механизмов влияния структурного компонента бактерий (ЛПС) на процесс репарации, но и обладает потенциалом практического использования. Созданная по результатам исследования лекарственная форма запатентована (Патент РФ № 2447082) и успешно прошла доклинические испытания (отчеты № 244/11, 251/11, 252/лаборатории биологических испытаний ФИБХ РАН, г. Пущино). В настоящее время в рамках Государственного контракта № 12411.1008799.13.112 проходят клинические исследования разработанной лекарственной формы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» имени академика В.И.Иоффе (СанктПетербург, 2011г.), международном симпозиуме International Endotoxin and Innate Immunity Society Meeting 2012/Homeostatic Inflammation Symposium (IEIIS2012) (Токио, 2012).

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции отдела медицинской микробиологии, отдела иммунологии и отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России 18 мая 2012 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 патент и публикации в сборниках конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на ___ страницах машинописного текста и включает Введение и 4 главы: «Обзор 1литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», а также Выводы, Список используемой литературы (___ 2источников, из которых __ отечественных и ___ иностранных). Работа содержит 10 2__ таблицы и ___ рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Местное нанесение липополисахарида S. typhi на область раневого дефекта стимулирует репарацию ран кожи, влияет на процессы воспаления, ангиогенеза, фиброплазии, коллагенообразования и эпителизации.

2. Нанесение ЛПС S. typhi на область раны увеличивает экспрессию ряда генов, в том числе генов факторов, участвующих в процессах репарации.





3. Нанесение ЛПС S. typhi на область раневого дефекта приводит к избирательному повышению секреции спектра медиаторов, вовлеченных в процесс репарации: цитокинов, хемокинов, факторов роста.

4. Местное нанесение ЛПС S. typhi влияет на инфильтрацию лейкоцитов в тканях раны, а именно увеличивает количество макрофагов на ранних стадиях раневого процесса, а на более поздних стадиях приводит к уменьшению инфильтрации раны нейтрофилами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа выполнена в период с 2010 по 2012 годы в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Бактериальный липополисахарид был выделен и очищен в производственном филиале «Медгамал» ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России из Salmonella typhi (Salmonella enterica enterica серовар typhi) штамм Ty2 4446. Также в работе использовался бактериальный липополисахарид E. coli, штамм 0111:B4 (Sigma-Aldrich, США).

В работе была использована клеточная линия HEK293-hTLR4/CD14-MD(клетки эмбриональной почки человека, содержащие ген b-галактозидазы под контролем NF-B-зависимого промотора и экспрессирующие TLR4 человека, а также молекулы MD2 и CD14), любезно предоставленная д.б.н., проф. А.В.

Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Баффало, США).

В работе были использованы аутбредные мыши ICR обоего пола, весом 1820 г, мыши линии BALB/c, самцы, весом 18-20 г (Питомник лабораторных животных «Столбовая» РАМН), аутбредные мыши CD-I обоего пола, аутбредные крысы CD обоего пола, весом 250-300 г (НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН», г. Пущино). Содержание лабораторных животных и проведение экспериментальных исследований проводилось согласно санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию вивариев N 1045-73.

Анализ активности транскрипционного фактора NF-B в клетках проводили спектрофотометрически по реакции на -галактозидазу и методом иммуноблоттинга. Для оценки распределения молекулярных масс ЛПС использовали электрофорез в полиакриламидном геле; для оценки распределения молекулярных масс полисахаридных фрагментов молекул ЛПС использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию; для определения степени ацилирования липидов А исследуемых ЛПС использовали MALDI-масс- спектрометрию. Биомеханические исследования проводили на тензиометре Instron 5848 MicroTester (Instron, Великобритания). Определение концентрации цитокинов проводили при помощи проточного цитофлуориметра Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc., США) с использованием коммерческих наборов FlowCytomixТМ (eBioscience, США); с использованием флуориметра Bio-Plex System и коммерческих наборов (Bio-Rad, США); методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов. Полногеномное исследование экспрессии генов в области раневого дефекта проводилось с использованием оборудования, реактивов и расходных материалов производства Affymetrix, США. Иммуногистохимические исследования проводили с использованием моноклональных первичных антител к Ly6G мыши (Novus Biologicals Inc., США), к F4/80 мыши (Acris-Antibodies, США), а также вторичных антител к IgG крысы (Acris-Antibodies, США). Статистическую обработку проводили, используя программу Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). Значимость отличий значений контрольной и экспериментальной групп оценивали с использованием дисперсионного анализа (ANOVA), различия считались значимыми при p<0.05.

Значения LD50 были определены с использованием метода пробит-анализа в программе BioStat 2008 (AnalystSoft Inc, США).

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с П.Г. Ганчевой, к.б.н. Л.В. Верховской, к.б.н. Д.В. Щебляковым, н.с.

П.В. Куданом, н.с. П.А. Метальниковым – сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии; д.б.н., Д.Ю. Логуновым, к.б.н. А.И. Тухватулиным – сотрудниками лаборатории клеточной микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им.

Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России; н.с. М.А. Бобровым – сотрудником ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского; Т.П. Малофеевой, В.А. Колесниковой, Н.Е.

Филипповой – сотрудниками филиала «Медгамал» ФГБУ «НИИЭМ им.

Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, которым автор выражает глубокую благодарность за помощь и поддержку. Автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Кобец Н.В., д.б.н. Гудкову А.В., к.б.н. Ветковой Л.Г., к.т.н. Просвирнину Д.В., к.б.н. Сахарову Д.А. за плодотворные дискуссии и помощь в проведении экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительное изучение физико-химических, иммунобиологических и токсикологических свойств липополисахаридов S. typhi Ty2 4446 и E. coli 0111:BДля проведения экспериментов, направленных на изучение влияния местного нанесения бактериального липополисахарида на процесс репарации кожи, на начальном этапе было необходимо исследовать физико-химические и иммунобиологические свойства используемого в работе липополисахарида S.

typhi штамм Ty2 4446, произведенного и очищенного в производственном филиале «Медгамал» ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. В качестве контроля во всех экспериментах на данном этапе использовался липополисахарид E. coli штамм 0111:B4 (Sigma-Aldrich, США), классический лиганд TLR4.

Для оценки способности исследуемых ЛПС активировать TLR4, были проведены эксперименты с использованием клеток линии HEK-293hTLR4/MD2CD14 (клетки эмбриональной почки человека), экспрессирующих TLR4 человека, а также молекулы MD2 и CD14, необходимые для распознавания ЛПС. Данная модель позволяет оценить уровень активации транскрипционного фактора NFB, опосредованного активацией TLR4 как качественно, так и количественно.

Для количественного определения в клетки был введен ген -галактозидазы под контролем NF-B-зависимого промотора.

Известно, что при активации NF-B перемещается из цитоплазмы в ядро.

Анализ методом иммуноблота цитоплазматических и ядерных фракций клеток, стимулированных ЛПС, показал, что ЛПС S. typhi и ЛПС E. coli обладают сравнимой способностью активировать NF-B через TLR4 (рис. 1А.).

Для количественного определения способности ЛПС S. typhi активировать TLR4, к клеткам HEK293-hTLR4/CD14-MD2 были добавлены ЛПС E. coli и ЛПС S. typhi в диапазоне концентраций от 1 нг/мл до 100 нг/мл; уровень активности галактозидазы определяли спектрофотометрически по конверсии о-нитрофенил-Д-галактопиранозида. В соответствии с результатами проведенного эксперимента, ЛПС S. typhi Ty2 4446 и E. coli 0111:B4 не отличаются по способности активировать NF-B через TLR4 (рис. 1Б.).

Количественная оценка активности исследуемых ЛПС также была проведена с использованием турбидиметрического варианта классического фармакопейного метода ЛАЛ-тест (рис. 1Б.). Полученные результаты подтвердили данные предыдущих экспериментов: статистически значимых отличий в активности ЛПС S. typhi штамм Ty2 4446 и E. coli 0111:B4 обнаружено не было.

pGAPDH Рисунок 1. Изучение специфической активности ЛПС S. typhi штамм Ty2 4446 и E. coli 0111:B4 in vitro.

(А). Анализ методом иммуноблота цитоплазматических и ядерных экстрактов клеток НЕК-hTLR4/CD14-MD2, стимулированных ЛПС (1 мкг/мл) в течение 30 мин.

Использовались антитела к р65, субъединице NF-B, а также к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH), для дополнительного контроля концентрации общего белка.

(Б.) Количественное определение TLR4-зависимой NF-kB активирующей способности ЛПС с использованием клеток НЕК-hTLR4/CD14-MD2.

(В.) Определение активности ЛПС методом ЛАЛ-тест (кинетический турбидиметрический тест).

С тем, чтобы провести сравнительную оценку активности исследуемых ЛПС in vivo, было проведено сравнительное изучение двух известных эффектов, индуцируемых эндотоксинами: секреции провоспалительных медиаторов при парентеральном введении и токсичности.

Для определения уровня секреции провоспалительных факторов, индуцированных ЛПС мышам линии BALB/c, внутримышечно был введен раствор ЛПС S. typhi Ty2 4446 или E. coli 0111:B4; доза на одно животное составляла 10 мкг. В сыворотках крови была определена концентрация IL-6, MCP-1, MIP-1 методом проточной цитофлуориметрии. В соответствии с результатами эксперимента, при внутримышечном введении ЛПС S. typhi уровень секреции провоспалительного цитокина IL-6, а также хемокинов MCP-и MIP-1 был значительно меньше, чем уровень, индуцируемый ЛПС E. coli (рис.

2А.).

Токсичность ЛПС определяли с использованием аутбредных мышей ICR.

Значение LD50 при внутрибрюшинном введении ЛПС S. typhi в 2 два раза превышало LD50, определенное при введении ЛПС E. coli 0111:B4, что свидетельствует о сниженной токсичности ЛПС S. typhi (рис. 2Б.).

Рисунок 2. Сравнительная оценка свойств ЛПС S. typhi Ty2 4446 и E. coli 0111:B4 in vivo.

(А.) Определение концентрации IL-6, MCP-1 и MIP-1 в сыворотке крови мышей в различные временные точки после внутримышечного введения ЛПС S. typhi Ty2 4446 и E. coli 0111:B4 (контроль – фосфатно-солевой буфер, ФСБ).*- p<0,05.

(Б.) Определение LD50 ЛПС S. typhi Ty2 4446 и E. coli 0111:B4. Результаты, полученные методом пробит-анализа, представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что ЛПС S. typhi Ty2 4446 и E. coli 0111:B4 обладают практически одинаковой функциональной активностью. Оба исследованных ЛПС в равной степени индуцируют активацию транскрипционного фактора NF-B, опосредованную Toll-подобным рецептором. Однако в исследованиях in vivo ЛПС E. coli 0111:Bпроявлял большую токсичность, и являлся более мощным индуктором провоспалительных медиаторов, чем ЛПС S. typhi Ty2 4446.

Мы предположили, что обнаруженный факт может быть обусловлен отличиями в химической структуре исследуемых ЛПС.

Прежде всего, мы определили соотношение низкомолекулярных и высокомолекулярных фракций ЛПС в препаратах. Для этого был использован метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, а также, в дополнительной серии экспериментов, в присутствии деоксихолата натрия (рис.3А.). Деоксихолат натрия известен как один из наиболее эффективных агентов, способствующих диссоциации мицелл ЛПС на отдельные молекулы. Полученные электрофореграммы являются типичными для ЛПС энтеробактерий, и представлены характерной «лестницей». По результатам исследования можно сделать вывод, что в составе как ЛПС S. typhi Ty2 4446, так и E. coli 0111:B4 присутствуют высоко- и низкомолекулярные фракции, при этом доля высокомолекулярных фракций больше в ЛПС S. typhi Ty2 4446.

Для более точной оценки распределения молекулярных масс, а также для определения степени ацилирования липида А, липополисахариды были подвергнуты кислотному гидролизу по кетозидной связи, соединяющей кор с липидом А, и разделены ультрацентрифугированием на две фракции:

полисахаридную и липидную.

Для оценки распределения молекулярных масс в полисахаридной фракции, был использован эксклюзионный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии. Исследуемая смесь полисахаридов была нанесена на колонку TSKgel GMPWXL, 7,8х30,0 см, предварительно откалиброванную набором стандартов, представляющих собой полиэтиленгликоли/полиэтиленоксиды с известной молекулярной массой. В соответствии с результатами эксперимента, полисахариды ЛПС S. typhi Ty2 4446 и ЛПС E. coli 0111:B4 содержат высоко- и низкомолекулярные фракции, при этом доля высокомолекулярных фракций больше в полисахаридной фракции, выделенной из ЛПС S. typhi Ty2 4446 (рис.

3Б.).

Строение липида А ЛПС было определено методом MALDI-масс спектрометрии с использованием полученной после кислотного гидролиза липидной фракции. В дополнительной серии экспериментов массспектрометрическому анализу были подвергнуты продукты аммонолиза липидной фракции, с целью уточнить расположение кислотных остатков в липидных фрагментах ЛПС. Используя полученные в этих экспериментах данные, а также принимая во внимание известные структуры липидов А энтеробактерий, было определено, что исследуемые образцы липидов А отличаются степенью ацилирования (рис. 3В.). Следует отметить, что в ЛПС, выделенных из бактерий, присутствует некоторое количество гипоацилированных (вследствие незавершенного синтеза) липидов А (Tirsoaga A et al., 2007). В нашем случае доля гексаацилированных форм, обладающих максимальной биологической активностью, была существенна выше в липидах А, выделенных из ЛПС E. coli 0111:B4, в то время как липиды А, выделенные из S. typhi Ty2 4446 были представлены, в основном, гипоацилированными формами; доля гексаацилированных липидов в этом случае была минимальна.

Полученные данные позволили объяснить, почему, проявляя одинаковую способность активировать Toll-подобный рецептор 4, ЛПС E. coli 0111:B4 и S.

typhi Ty2 4446 обладают различной токсичностью и способностью индуцировать секрецию медиаторов воспаления. Так, известно, что пентаацилированные ЛПС являются лигандами TLR4, однако обладают значительно меньшей способностью индуцировать реакции, характерные для эндотоксинов (Rietschel et al., 1993).

Б.

B.

Рисунок 3. Изучение физико-химических свойств ЛПС S. typhi Ty2 4446 и E. coli 0111:B4.

А. Электрофорез исследуемых ЛПС в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (слева) и деоксихолата натрия (справа). Нагрузка на трек составляла 100 мкг ЛПС. Трек 1 – ЛПС S. typhi Ty2 4446, трек 2 - E. coli 0111:B4.

Б. Оценка распределения молекулярных масс в полисахаридных фракциях исследуемых ЛПС методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием рефрактометрического детектирования.

В. Присутствие форм различной степени ацилирования в липидных фракциях, выделенных из исследуемых ЛПС. Представлены репрезентативные спектры, полученные методом MALDI-масс-спектрометрии. Обозначения: 1 – тетраацилированные формы, 2 – пентаацилированные формы, 3 – гексаацилированные формы.

Определение влияния местного нанесения ЛПС на скорость репарации ран кожи биомеханическим методом Задача следующего этапа исследования заключалась в определении влияния местного нанесения ЛПС S. typhi на процесс репарации ран кожи. В качестве интегрального показателя, характеризующего эффективность процесса репарации, была выбрана механическая прочность раны.

После моделирования резаной раны (рис. 4А.), животные были разделены на четыре группы. Начиная с первого постоперационого дня, на область раневого дефекта ежедневно в течение 21 дня наносилось по 0,15 г геля, состоящего из натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, глицерина и воды, свободной от эндтоксинов, и содержащего ЛПС в концентрации 0,2 мг/г, 2 мг/г, 10 мг/г или геля-плацебо (содержащего все компоненты, за исключением ЛПС).

Механическая прочность раневых дефектов была определена с использованием тензиометра Instron 5848 Microtester (Instron, Великобритания) в соответствии с известной методикой (Muehlberger et al., 2005). Максимальная сила, достигаемая до потери целостности раневого дефекта, фиксировалась автоматически в ньютонах (Н).

Нами было установлено, что при местном нанесении ЛПС механическая прочность раневых дефектов дозозависимо увеличивается. При нанесении на рану геля ЛПС концентрации 2 мг/г и 10 мг/г на всех сроках наблюдения было выявлено статистически значимое отличие механической прочности ран контрольной и опытной групп, при этом наибольшие отличия зафиксированы при обработке раны гелем ЛПС концентрации 10 мг/г (рис. 4Б.). Однако при нанесении на рану геля ЛПС концентрации 0,2 мг/г отсутствовало статистически значимое отличие механической прочности ран контрольной и опытной групп.  Рисунок 4. Влияние местного применения ЛПС на прочность раневого дефекта.

(А.) Моделирование резаной раны.

(Б.) Местное применение ЛПС дозозависимо увеличивает прочность раневого дефекта.

*p<0.05, по сравнению с группой плацебо. Временные точки представлены с момента первого нанесения препаратов. Сила, необходимая для разрыва интактной (неповрежденной) кожи составляла 8.29 ± 1.05 Н.

Исследование влияния местного нанесения ЛПС на процесс воспаления и инфильтрацию лейкоцитов Для определения влияния местного нанесения ЛПС на течение раневого процесса на тканевом уровне, была проведена серия экспериментов, целью которых было оценить процессы воспаления, ангиогенеза, фиброплазии и эпителизации с использованием гистологических срезов раневых дефектов, окрашенных гематоксилином и эозином, а также процесса колагенообразования с использованием гистологических срезов, окрашенных по Массону.

В соответствии с полученными результатами, местное нанесение ЛПС способствовало быстрому завершению процесса воспаления (по сравнению с группой плацебо) (рис. 5А.). Так, через семь дней после начала терапии, в группе плацебо наблюдалась более интенсивная инфильтрация полиморфноядерных клеток, отмечались отечные явления.

С тем, чтобы оценить интенсивность и кинетику лейкоцитарной инфильтрации в области раневого дефекта, гистологические срезы были иммуногистохимически окрашены с использованием моноклональных антител к Ly6G (маркеру нейтрофилов) или F4/80 (маркеру макрофагов) (рис. 5Б.).

Морфометрический анализ состоял в оценке численной плотности F4/80 и Ly6G положительных клеток в пяти полях зрения в области раневого дефекта при увеличении х400. В соответствии с полученными результатами, местное применение ЛПС стимулировало раннюю инфильтрацию макрофагов в края раны (рис. 5Г.). Через сутки после первого нанесения препаратов, количество макрофагов в поле зрения в экспериментальной группе было примерно вдвое больше, чем в контрольной. К 3-ему и 7-му дням инфлюкс макрофагов в обеих группах был сходным. Пик инфильтрации нейтрофилами приходился на первые сутки. В экспериментальной группе количество нейтрофилов начало уменьшаться на 3-й день, а к 7-му дню их количество было незначительным. В контрольной группе инфильтрация области раны нейтрофилами на 3-й и 7-й день была более интенсивной, при этом различия между группами были статистически значимыми. Возможно, обнаруженная более интенсивная инфильтрация тканей раневого дефекта макрофагами при нанесении ЛПС является одним из факторов, опосредующих ускоренную репарацию. Полагают, что макрофаги играют ключевую роль в раневом процессе и являются его регуляторами (Park and Barbul, 2004). Их функция заключается в предупреждение инфекции и в деструкции некротического дебриса за счет фагоцитоза, секреции активных радикалов кислорода и азота, антимикробных пептидов и протеолитических ферментов, а так же стимуляции процессов образования новых капилляров, фиброплазии и эпителизации. Макрофаги секретируют широкий спектр цитокинов, которые действуют паракринно или способствуют рекрутированию и активации фибробластов, эндотелиальных, эпителиальных клеток, и некоторых других клеточных популяций (Mahdavian-Delavary et al., 2011).

Исследование влияния местного нанесения ЛПС на процессы коллагенообразования и эпителизации раневых дефектов кожи Местное применение ЛПС положительно влияло на процесс эпителизации (рис. 5А.). Так, уже через неделю после нанесения ран в экспериментальной группе отмечалась полная эпителизация раневого дефекта акантотически утолщенным эпидермисом, в то время как в группе плацебо наблюдались язвенные дефекты эпидермиса. К концу второй недели эксперимента в экспериментальной группе количество слоев эпидермиса составляло 2-3 слоя, что соответствует толщине эпидермиса интактных животных, тогда как в группе плацебо отмечалось наличие акантотически утолщенного эпидермиса. К третьей неделе количество слоев эпидермиса во всех группах составляло 2-3 слоя, что соответствовало толщине эпидермиса интактных животных.

Морфология и интенсивность окраски коллагеновых волокон в области раневого дефекта была оценена на гистологических срезах, окрашенных по Массону (рис. 5В.). На образцах первой недели интенсивность окраски коллагеновых волокон снижена для всех групп. На образцах второй недели для экспериментальной группы отмечалось появление больших по диаметру, расположенных параллельно поверхности эпидермиса коллагеновых волокон, имеющих более интенсивную окраску по Массону, по сравнению с группой плацебо. На образцах экспериментальной группы к третьей неделе при окраске по Массону отмечалось наличие коллагеновых волокон, имеющих одинаковую с волокнами дермы вне раневого дефекта интенсивность окраски и толщину.

Примечательно, что объем рубцовой ткани при нанесении ЛПС был значительно меньше, чем в группе плацебо.

Исследование влияния местного нанесения ЛПС на ангиогенез и количество фибробластов в области раневого дефекта Оценка ангиогенеза и количества фибробластов в области раневого дефекта была выполнена с использованием гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином. Морфометрический анализ состоял в оценке численной плотности фибробластов, а также капилляров в пяти произвольно выбранных полях зрения в области раневого дефекта при увеличении х400.

Кровеносный сосуд не учитывался в качестве капилляра, если имел эластиновую мембрану, клетки гладкой мускулатуры или более трех эритроцитов в просвете (Basu et al., 2009).

Согласно полученным данным, местное нанесение ЛПС способствовало увеличению количества фибробластов на ранних сроках заживления ран (первая неделя), при этом на второй и третьей неделе отмечалось резкое уменьшение количества фибробластов (рис. 6А.). При нанесении плацебо максимум численной плотности фибробластов приходился на вторую неделю, при этом количество фибробластов к концу третьей неделе оставалось высоким, что может свидетельствовать о задержке процесса репарации.

Местное нанесение ЛПС дозозависимо стимулировала процесс ангиогенеза на ранних сроках заживления ран, в то время как при терапии плацебо максимальное количество капилляров в раневом дефекте наблюдалось только через две недели после нанесения раны (рис. 6Б.). Следует отметить, что интенсивность ангиогенеза является одним из маркеров эффективности репарации, поскольку новообразованные капилляры снабжают клетки и грануляционной тканью, кислородом и питательными веществами.

Рисунок 5. Гистологические исследования влияния местного нанесения ЛПС на процесс воспаления, инфильтрацию лейкоцитов, коллагенообразование и эпителизацию раневых дефектов. Временные точки представлены с момента первого нанесения препаратов.

Использовали гель с концентрацией ЛПС 10 мг/г и гель плацебо.

(А.) Репрезентативные фотографии гистологических срезов, окрашенных гематоксилинэозином. Линия масштаба равна 500 мкм.

(Б.) Репрезентативные фотографии гистологических срезов, окрашенных с использованием антител к F4/80 и Ly6G. Линия масщтаба равна 40 мкм.

(В.) Репрезентативные фотографии гистологических срезов, окрашенных по Массону.

Линия масштаба равна 100 мкм.

(Г.) Анализ численной плотности F4/80 положительных клеток (макрофагов) и Ly6G положительных клеток (нейтрофилов) в области раневого дефекта. *p<0.1 неделя 1 неделя Рисунок 6. Исследование местного нанесения ЛПС на количество фибробластов (А.) и процесс ангиогенеза (Б.) в области раневых дефектов. Временные точки представлены с момента первого нанесения препаратов. *p<0.05, по сравнению с группой плацебо.

Полногеномное изучение изменения экспрессии генов в области раневого дефекта Для детального изучения влияния местного применения ЛПС на раневый процесс, нами был проведен анализ изменения спектра экспрессии генов (около 35000 генов) в области раневого дефекта с использованием микрочипов и оборудования фирмы Affymetrix, США. В эксперименте использовали гель, содержащий ЛПС в концентрации 10 мг/г, и гель плацебо (в качестве контроля).

Биоптаты кожи, содержащей раневые дефекты, были отобраны через 2,5 часа и через 48 часов после нанесения препаратов. Проведенный анализ полученных результатов показал, что нанесение ЛПС на раневую поверхность приводит к достоверному увеличению экспрессии в 1,5 раза и более свыше 300 генов (временная точка 2,5 часа) и 150 генов (временная точка 48 часов).

В таблице 1 приведен перечень генов, экспрессия которых может оказывать влияние на процесс репарации кожи.

Прежде всего, следует отметить повышение экспрессии генов, кодирующих белки семейства NF-B, а именно NFkb1, NFkb2, Relb и Rel. Примечательно, что повышается экспрессия генов факторов, участвующих в активации NF-B как по каноническому, так и по неканоническому пути. Так же повышается экспрессия генов ряда факторов, участвующих в активации NF-B.

Наряду с увеличением экспрессии генов молекул, свидетельствующих об активации NF-B, отмечено повышение экспрессии генов факторов, на разных этапах биохимического каскада ингибирующих активацию NF-B, в том числе генов, кодирующих белки IB.

Примечательно, что через 48 часов после первого нанесения ЛПС только два гена, вовлеченные в биохимический каскад активации NF-b, демонстрировали повышенную экспрессию: Tnf и Tifab.

Отмечено повышение ряда провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, и хемокинов, принадлежащих к CC- и СХС-семействам, а также некоторых рецепторов цитокинов. Также повышена экспрессия супрессоров сигнальных путей, активируемых цитокинами: Socs1, Socs3 и Cish, обеспечивающих отрицательную регуляцию секреции провоспалительных цитокинов (в частности, цитокинов семейства IL-6). Через 48 часов после первого нанесения ЛПС повышена экспрессия гена Tnf (кодирующего TNF-), и ряда хемокинов (преимущественно СС-семейства).

Отмечено повышение уровня экспрессии генов молекул адгезии, играющих существенную роль в рекрутировании лейкоцитов из циркулирующей крови в ткань к месту повреждения.

Другую группу генов, экспрессия которых повышалась в ответ на нанесение ЛПС на раневую поверхность, составляют гены, кодирующие белки, вовлеченные в антибактериальный, противовирусный иммунный ответ и иммунный ответ против простейших.

Таблица 1. Изменение экспрессии генов в области раневого дефекта в ответ на нанесение ЛПС*.

Временная точка: 2,5 часа Временная точка: 48 часов Краткое название гена Краткое название гена Гены белков семейства NF-B Nfkb1, Nfkb2, Relb, Rel (с-Rel) Гены белков семейства IB Nfkbia, Nfkbie, Nfkbiz, BclГены белков, участвующих в активации или ингибирующих активацию NF-B Tlr2, Nod2, Tnfrsf1b, Cd40, Ltb, Tnf Tlr9, Tnf (Tnfa), Tifab (Tnfa), Tifa, Traf1, Irak2, Irak3, Ikbke, Tnip1, Tnfaip3 (A20) Гены хемокинов, цитокинов и их рецепторов Ccl2, Ccl4, Ccl5, Ccl7, Ccl12, Cxcl1, Ccl2, Ccl5, Ccl11, Ccl12, Ccl21a,, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11, Csf3, Il1a, Il1f9, Cxcl9, Cxcl10, Csf2ra, Tnfrsf14, Il10ra, Il6, Il10, Il10ra, Il15, Il19, Il23a, Il27 Vegfa Гены супрессоров сигнальных путей, активируемых цитокинами Socs1 Socs3 Cish Гены молекул адгезии Icam1, Vcam1, Sele, Selp Гены, кодирующие белки, вовлеченные в антибактериальный, противовирусный иммунный ответ и иммунный ответ против простейших Ncf1, Nos2 (iNOS), Cybb, Mx1, Mx2, Mx1, Mx2, Irgm1, GbpIrgm2, Iigp1, Ifi47, Gbp1, Gbp2, Gbp3, Gbp4, Gbp5, Gbp6, Gbp*Краткие названия генов приведены в соответствии с общепринятой номенклатурой (Guidelines for Nomenclature of Genes, Genetic Markers, Alleles, and Mutations in Mouse and Rat, 2011); в скобках указаны синонимы.

Изучение кинетики секреции цитокинов, хемокинов и ростовых факторов в области раневого дефекта при нанесении ЛПС Полногеномное изучение изменения экспрессии генов в ответ на местное нанесение ЛПС позволило детально оценить ответ макроорганизма на присутствие в области раневого дефекта эндотоксина. На следующем этапе исследования было необходимо изучить локальные изменения уровня секреции и кинетики секреции медиаторов, вовлеченных в процессы иммунного ответа и репарации кожи.

В соответствии с полученными данными, представленными на рисунке 7А., уровень секреции хемокинов -семейства (СС-хемокинов), в частности, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1, CCL7/MCP-3, и CCL5/RANTES в экспериментальной группе был значительно выше, чем в контрольной; вместе с тем, статистически значимых отличий в уровне секреции хемокинов -семейства (СХС-хемокинов) между двумя группами обнаружено не было.

Известна ключевая роль провоспалительных цитокинов в раневом процессе. Кроме того, хорошо известно, что ЛПС является одним из наиболее мощных индукторов секреции провоспалительных цитокинов (Werner and Grose, 2003). Согласно полученным данным, местное нанесение ЛПС статистически значимо увеличивало уровень секреции LIF и IL-1 только в начальный, достаточно короткий период после первого нанесения ЛПС (временные точки часа, LIF; и 4 часа и 10 часов, IL-1). Секреция IL-6 в экспериментальной группе была статистически значимо повышена вплоть до 3-х суток после начала терапии (рис. 7Б.).

Обнаружено повышение уровня секреции ростовых факторов в области раневого дефекта: TGF-1, FGF2, VEGF, EGF, регулирующих процессы ангиогенеза, фиброплазии, синтеза коллагена, эпителизации (рис. 7В.) Доклиническое изучение безопасности местного накожного применения лекарственного средства, содержащего ЛПС На заключительном этапе мы поставили перед собой задачу выяснить, насколько безопасным является местное применение ЛПС. Для этого были произведены опытные партии геля, содержащего ЛПС, в условиях производства, удовлетворяющего требованиям GMP (ЗАО «Фармацевтическое научнопроизводственное предприятие «Ретиноиды», г. Москва). С использованием произведенных опытных партий, были проведены доклинические исследования в филиале Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, г. Пущино. Спектр доклинических исследований был ограничен, и включал исследования острой и хронической токсичности, так как используемый активный компонент (ЛПС S. typhi штамм Ty2 4446) является действующим компонентом зарегистрированного препарата «Пирогенал».

Исследования были проведены в соответствии со стандартными методиками (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева, 2005).

В результате проведенных доклинических исследований геля, содержащего ЛПС S. typhi в концентрации 10 мг/г, было показано, что при его местном нанесении на неповрежденную кожу, а также на кожу с раневым дефектом токсические реакции отсутствуют; токсические реакции проявляются лишь при нанесении ЛПС на раневый дефект в дозах, в 70 раз превышающих дозы, использованные в наших экспериментах.

Рисунок 7. Изменение кинетики секреции хемокинов (А.), провоспалительных цитокинов (Б.) и факторов роста (В.) в области раневого дефекта в ответ на местное нанесение ЛПС.

Временные точки представлены с момента первого нанесения препаратов.*p<0.05.

Таким образом, в результате работы была впервые показана способность бактериального липополисахарида при местном нанесении на область раневого дефекта кожи индуцировать широкий спектр реакций, приводящих, в конечном итоге, к стимуляции процесса репарации. Полученные результаты расширяют знания о роли врожденного иммунитета в репаративных процессах.

ВЫВОДЫ 1. Исследованы физико-химические, иммунобиологические и токсикологические свойства используемого в работе липополисахарида S. typhi штамм Ty2 4446. Показано, что ЛПС S. typhi штамм Ty2 4446 представлен преимущественно гипоацилированными формами и обладает сниженной токсичностью, в два раза меньшей, чем классический ЛПС E. coli.

2. Показано, что местное нанесение липополисахарида S. typhi на область раневого дефекта стимулирует процессы репарации кожи: дозозависимо увеличивает механическую прочность раневого дефекта, дозозависимо стимулирует ангиогенез и способствует увеличению количества фибробластов на ранних сроках раневого процесса; стимулирует коллагенообразование, уменьшает продолжительность воспалительной фазы раневого процесса и ускоряет эпителизацию раны.

3. Проведено полногеномное изучение изменения экспрессии генов при аппликации бактериального ЛПС S. typhi на раневый дефект кожи. Показано, что местное нанесение ЛПС на область раны увеличивает экспрессию свыше 3генов, в том числе генов факторов, участвующих в биохимическом каскаде активации транскрипционного фактора NF-B; генов цитокинов, хемокинов, и их рецепторов; генов молекул адгезии; генов, кодирующих белки, вовлеченные в антибактериальный, противовирусный иммунный ответ и иммунный ответ против простейших.

4. Показано, что местное нанесение ЛПС S. typhi приводит к избирательному повышению секреции (до 30 раз) спектра медиаторов, вовлеченных в процесс репарации, в том числе хемокинов СС-семейства, провоспалительных цитокинов и факторов роста в области раневого дефекта;

определена кинетика секреции указанных медиаторов.

5. Показано, что местное нанесение ЛПС S. typhi увеличивает в 2 раза количество макрофагов в тканях раны на ранних стадиях раневого процесса, а на более поздних стадиях приводит к уменьшению инфильтрации раны нейтрофилами.

6. По результатам доклинических исследований разработанной лекарственной формы показано, что нанесение ЛПС S. typhi не приводит к развитию системных токсических эффектов в использованных в исследовании дозах, при нанесении на неповрежденную и поврежденную кожу.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Костарной А.В., Логунов Д.Ю., Тухватулин А.И., Колесникова В.А., Малофеева Т.П., Филиппова Н.Е., Народицкий Б.С. Возможности эффективной регенерации кожи при местной стимуляции врожденного иммунитета // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2011.– № 10. – С. 62-65.

2. Костарной А.В., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В.,Ганчева П.Г., Народицкий Б.С. Влияние липополисахарида S. typhi на эпителизацию ран кожи и секрецию эпидермального фактора роста // Медицинская иммунология. – 2012. – том 14. – № 3. – С. 223-226.

3. Костарной А. В., Голубицкий Г. Б., Басова Е. М., Будко Е. В., Иванов В. М.

Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа многокомпонентных лекарственных препаратов // Журнал аналитической химии.

– 2008. – том 63. – № 6. – С. 566-580.

4. Костарной А.В., Ганчева П.Г., Логунов Д.Ю., Филиппова Н.Е., Народицкий Б.С., Влияние местного применения бактериального липополисахарида на процессы регенерации кожи // Материалы XIV-го Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». – В журн.: Медицинская иммунология,. – 2011. – том 13. – № 4-5. – С. 318-319.

5. Kostarnoy AV, Gancheva PG, Logunov DY, Verkhovskaya LV, Scheblyakov DV, Tukhvatulin AI, Filippova NE, Naroditsky BS, Gintsburg AL. Influence of topical bacterial lipopolysaccharide application on injured skin on inflammatory reactions and wound healing // Program & Abstracts of Endotoxin and Innate Immunity Society Meeting 2012 / Homeostatic Inflammation Symposium (IEIIS2012). – Tokyo. –2012. – P. 153.

6. Патент 2447082 Российская Федерация, МПК C07K14/195. Способ стимуляции регенерации дефектов кожи и слизистых оболочек и лекарственное средство для его реализации / Костарной А.В., Логунов Д.Ю., Малофеева Т.П., Колесникова В.П., Тухватулин А. И., Токарская Е.А., Филиппова Н.Е., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. – № 2010153012/10; заявл. 19.01. 11; опубл. 10.04.12, Бюл. № 10 – 22 с.: ил.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.