WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Ефимова Евгения Викторовна

ВЛИЯНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ПОВЕДЕНИЯ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕРАПИИ АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТИ

03.03.01 физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Максим Львович кандидат биологических наук, старший преподаватель Ловать кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Инга Игоревна доктор биологических наук, профессор, ведущий Полетаева научный сотрудник кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Егор Юрьевич доктор биологических наук, ведущий научный Плотников сотрудник НИИ физико химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита диссертации состоится 10 декабря 2012 года в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, строение 12, аудитория М 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В.

Ломоносова.

Автореферат разослан 9 ноября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Б.А.Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Алкоголизм – тяжелое хроническое заболевание, возникающее при систематическом потреблении спиртосодержащих продуктов. Алкоголизм, как заболевание, характеризуется не только психологическим состоянием тяги к алкоголю, но и комплексом физиологических нарушений, таких как измерение работы медиаторных систем мозга, повреждение нейронов от окислительного стресса.

Общепринятый унифицированный подход при терапии, также как и симптоматическое назначение препаратов, восстанавливают физиологические параметры пациентов, однако вероятность алкогольных рецидивов остается высокой. Поэтому поиск новых средств терапии и способов повышения эффективности применения существующих препаратов является очень актуальным.

Одной из возможных причин недостаточно успешной терапии алкоголизма может являться неоднородность данного заболевания. Большая гетерогенность предикторов, проявлений симптоматики и динамики протекания была известна давно. В 80-е годы Клонингером было предложено разделение алкоголизма на два типа: «депрессивный» и «агрессивный» (Bohman et al., 1981; Cloninger et al., 1981). Сходное разделение по типам алкоголизма было показано и для животных (Салимов, 2003). Алкогольная зависимость разных типов характеризуется как различным происхождением (наличие или отсутствие генетической предрасположенности), скоростью развития, выраженностью девиантности поведения, механизмами формирования заболевания. Следовательно, разработка различных подходов и методов лечения с учетом индивидуальных особенностей заболевания может являться одним из способов повышения эффективности терапии.

Поскольку одним из патологических эффектов алкоголя является его нейротоксическое действие, в схемы терапии алкоголизма в последнее время включают нейропротекторы, такие как пирацетам (Malyk, Sadaie, 2010). В группу нейропротекторов объединены разные по структуре препараты, которые часто имеют разные механизмы действия. Нами для работы было выбрано три вещества, для каждого из которых были показаны нейропротекторные свойства:

семакс, Pro-Gly-Pro и SkQ1.

Семакс представляет собой фрагмент адренокортикотропного гормона, не обладающий гормональной активностью. Он вызывает повышение уровня нейротрофических факторов в мозге, также для него показано модулирующее действие на дофаминовую и серотониновую системы (Dolotov et al., 2006). Его N-концевой фрагмент, трипептид Pro-Gly-Pro (PGP), также обладает спектром физиологического действия. PGP, также как и семакс, вызывает повышение уровня нейротрофических факторов, оказывает нейропротекторное действие (Дмитриева и др., 2008). Хотя точный механизм действия семакса и PGP до конца не ясен, показано, что они модулируют работу клеток головного мозга (Вьюнова и др., 2007).

Поскольку значимым повреждающим фактором при хроническом потреблении этанола является окислительный стресс, в схему терапии алкогольной зависимости включают антиоксиданты (Кондратьева, 2007). Однако их максимальная эффективность достигается при использовании больших доз, при которых некоторые препараты могут иметь прооксидантное действие.

Антиоксидант SkQ1 обладает способностью проникать через мембраны и накапливаться в митохондриях. Кроме того, обратимое окисление SkQпозволяет поддерживать его высокое содержание в мембране митохондрий при использовании низких доз. Для SkQ1, в отличие от семакса и PGP не было показано специфических сайтов действия, и оказывается генерализованное действие на организм.

Исследования влияния семакса, PGP и SkQ1 на влечение к алкоголю и изменения поведения, происходящие при отмене алкоголя, ранее не проводились.

Цель работы: Оценить связь параметров поведения хронически алкоголизированных крыс, а также пациентов, больных алкоголизмом, с выраженностью антиалкогольного эффекта нейропротекторных препаратов семакс, PGP и SkQ1.

В связи с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Оценить действие нейропротектора семакс в разных дозах на показатели поведения хронически алкоголизированных самцов крыс стока Wistar на фоне алкогольной депривации и на уровень потребления этанола. Охарактеризовать связь исходного уровня потребления этанола, а также индивидуальных особенностей поведения, с выраженностью антиалкогольного действия семакса.

2. Оценить влияние исходных психофизиологических параметров больных алкоголизмом на длительность алкогольной ремиссии после выписки и выраженность терапевтического действия семакса.

3. Оценить действие разных доз трипептида PGP на показатели поведения хронически алкоголизированных крыс Wistar на фоне алкогольной депривации, а также на уровень потребления этанола. Охарактеризовать связь индивидуальных особенностей поведения крыс c выраженностью действия PGP.

4. Оценить действие антиоксиданта SKQ1 на показатели поведения хронически алкоголизированных крыс Wistar на фоне алкогольной депривации, а также на уровень потребления этанола. Охарактеризовать связь индивидуальных особенностей поведения крыс c выраженностью действия SkQ1.

Научная новизна полученных результатов: В работе было показано, что введение препарата семакс в дозе 50 мкг/кг, интраназально, в течение 5 дней оказывает положительное действие на параметры поведения хронически алкоголизированных животных на фоне отмены этанола. Применение данного препарата в дозе 200 мкг/кг, 10 дней, вызывает повышение двигательной активности и увеличение потребления этанола у хронически алкоголизированных крыс. Помимо этого был продемонстрирован собственный эффект фрагмента препарата семакс PGP: В высоких дозах PGP (50 мкг/кг, в течение 5 дней) увеличивал потребление этанола предварительно алкоголизированными животными в первые дни после алкогольной депривации.

В более низких дозах (15 мкг/кг, в течение 5 дней) стимулирующее действие пептида на потребление этанола было отставленным. В работе была впервые показана гетерогенность действия семакса и PGP в зависимости от исходных параметров поведения: антиалкогольный эффект был наиболее выражен у животных, обладавших более высокой двигательной активностью до введения препаратов. Для семакса сходная гетерогенность действия была показана в клиническом исследовании. Применение антиоксиданта SkQ1 достоверно снижало потребление этанола, однако связи исходных индивидуальных особенностей поведения животных до введения препаратов с эффективностью действия препарата не выявлено не было.

Научно-практическая значимость работы: В работе показано, что семакс, PGP, а также SkQ1 оказывают влияние на потребление этанола животными, что может быть важно для поиска мишеней при терапии патологической зависимости от алкоголя и понимания механизмов алкогольной зависимости в целом. Показанная неоднородность действия семакса и PGP в зависимости от индивидуальных параметров поведения, дает основания рекомендовать учитывать возможные различия в механизмах их действия при тестировании препаратов, предназначенных для лечения алкоголизма. Кроме того, на основании данных, полученных в настоящей работе, предлагается проводить индивидуальное типирование пациентов с алкогольной зависимостью с целью адекватного назначения нейропротекторных препаратов, что может позволить увеличить эффективность терапии алкогольной зависимости. Применение в клинике препарата семакс можно рекомендовать в низких дозах для пациентов с характеристиками первого типа алкоголизма по Клонингеру («депрессивный»).

Апробация диссертации: Основные результаты работы представлены на международных научных конференциях «Ломоносов 2008» и «Ломоносов 2009» (Москва, 2008, 2009); IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009); ХХI съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Калуга, 2010); Aquitaine Conferences on Neurosciences (Аркашон, Франция, 2010); The new Frontier in Addiction Treatment: Evidence-Bacsed Policy and Practice (Вашингтон, США, 2010); всероссийская молодежная школа «Нейротехнологии 2010. Биоэкономика, основанная на знаниях: политика инновационного пути развития биотехнологии» (Бекасово, Московская обл., 2010); 10th ECNP regional meeting (Санкт-Петербург, 2011); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011). Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им.

М.В. Ломоносова (2012).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 работ, из которых 2 в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 1страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 147 источников, из них отечественных. Диссертация содержит 30 рисунков и 4 таблицы.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследования на животных. Работа была выполнена на самцах крыс Wistar возрастом 5-7 недель на момент поступления. Всего в работе было использовано 321 животное в 5 сериях экспериментов (см. табл.1). Все серии экспериментов проводились по одной схеме. В каждой серии экспериментов использовалось две контрольные группы: группа интактного контроля и группа алкоголизированного контроля. Предварительная алкоголизация крыс проводилась в течение 5 месяцев по методике свободного выбора между водой и 15% раствором этанола (Буров, Ведерникова, 1985). Интактные животные на весь период алкоголизации имели доступ только к поилке с водой, при этом все прочие условия содержания были идентичными. После предварительной алкоголизации всех животных помещали в индивидуальные камеры размером 25x20x20 см для оценки потребления этанола при свободном выборе. Интактных животных также помещали в индивидуальные камеры, однако спирт этим животным не предоставлялся. Предварительная оценка потребления 15% этанола проводилась в течение 1,5 месяцев. После этого для всех животных проводилась предварительная оценка поведения без отмены доступа к алкоголю, а также взвешивание. Алкоголизированных животных делили на группы, которые были сформированы таким образом, что между ними не было достоверных различий по параметрам поведения, весу и среднему уровню потребления этанола.

После формирования групп животных лишали доступа к этанолу, после чего, начиная со второго дня депривации, осуществляли введение препаратов.

Для выявления возможных признаков отмены алкоголя на поведение проводили блок тестов. Депривация длилась 11-21 дней, в зависимости от схемы введения препаратов.

После окончания введения препаратов всем животным, в том числе крысам из группы интактного контроля, предоставлялся 15% этанол в условиях свободного выбора. Далее в течение 1,5 месяца проводилось измерение его потребления. По окончании этого срока проводили эвтаназию с применением углекислого газа. Во второй и пятой сериях после эвтаназии методом декапитации у животных извлекали ткани стриатума, в которых определялся уровень биогенных аминов.

Статистическая обработка данных.

Для оценки связи индивидуальных особенностей поведения с уровнем потребления 15% этанола после введения исследованных веществ были посчитаны коэффициенты корреляции Спирмена. В нашем исследовании для подсчетов корреляций мы с начала вычисляли разницу в потреблении этанола до и после введения веществ для каждого животного:

Изменение в потреблении = среднее потребление ДО – среднее потребление ПОСЛЕ Затем рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена между изменением в потреблении алкоголя и параметрами предварительного поведения животных.

Коэффициенты корреляции считали отдельно для контрольной и опытной групп.

Таблица Деприв Поведение до Поведение на фоне Серия Группа Введение веществ ация депривации депривации (сутки) Физ. Раствор, Интактный интраназально, контроль, n=ежедневно, 10 дней Физ. Раствор, Алк. контроль, интраназально, Серия 1: n=ежедневно, 10 дней Введение "открытое поле", "семакс-50 семакс в дозе 50 мкг/кг, препарата 12 "открытое ПКЛ, мкг/кг 5 дней", ежедневно, семакс в дней поле" "подвешивание за n=10 интраназально, 5 дней разных хвост" "семакс-50 семакс в дозе 50 мкг/кг режимах (3-4 сутки) мкг/кг 10 ежедневно, дней", n=10 интраназально, 10 дней "семакс-200 семакс в дозе 200 мкг/кг,, мкг/кг 10 ежедневно, дней", n=10 интраназально, 10 дней Физ. Раствор, Интактный интраназально, "открытое поле", Серия 2:

контроль, n="открытое ежедневно, 5 дней СТК, Введения поле", ПКЛ, Физ. Раствор, неизбегаемое препарата Алк. контроль, неизбегаемое интраназально, плавание семакс в n=33 плавание дней ежедневно, 5 дней (3-4 сутки) дозе мкг/кг, "семакс-50 семакс в дозе 50 мкг/кг, 5 дней мкг/кг 5 дней", ежедневно, Измерение концентрации био.

n=34 интраназально, 5 дней аминов в ткани стриатума Физ. Раствор, ПКЛ (4 сутки), Интактный интраназально, "открытое поле" контроль, n=ежедневно, 5 дней "открытое поле с Серия 3:

Физ. Раствор, СТК, ЗКЛ, внесением нового Алк. контроль, Введение интраназально, неизбегаемое предмета" n=PGP в дозе дней ежедневно, 5 дней плавание (9-10 сутки) 15мкг/кг неизбегаемое PGP в дозе 15 мкг/кг, "PGP плавание ежедневно, 15мкг/кг", n=(13 сутки), интраназально, 5 дней Физ. Раствор, Интактный интраназально, контроль, n=Серия 4: ежедневно, 5 дней "открытое поле", Введение Физ. Раствор, ПКЛ, Алк. контроль, PGP в интраназально, ЗКЛ неизбегаемое n=24 дней дозе50 ежедневно, 5 дней плавание мкг/кг PGP в дозе 50 мкг/кг, (5-7 сутки) "PGP ежедневно, мкг/кг", n=интраназально, 5 дней Интактный Физ. Раствор, п/о, через "открытое поле", контроль, n=10 день, 20 дней ПКЛ, "открытое Алк. контроль, Физ. Раствор, п/о, через неизбегаемое Серия 5:

поле" n=16 день, 20 дней плавание Введение дней (3-4 сутки) SkQSkQ1, 250, SkQ1 в дозе 250 нмоль/кг, Измерение концентрации био.

n=17 нМоль/кг через день, п/о, 20 дней аминов в ткани стриатума Тесты для оценки поведения животных.

Тест неизбегаемого плавания по Порсольту (Porsolt et al., 1977) проводили для выявления склонности животных к развитию депрессивноподобного состояния. Каждое животное помещали на 10 минут в прозрачный сосуд диаметром 18 см, высотой 50 см заполненный водой (t воды 21-23оС) до отметки на высоте 30 см. Регистрировалась продолжительность активного (энергичные движения всеми лапами) и пассивного (слабые гребки задними лапами) плавания, а также иммобилизации (полная неподвижность всех конечностей и хвоста). Другим тестом, который использовали для определения депрессивно-подобного поведения, был тест «подвешивание за хвост» (Chermat et al, 1986). При помощи лейкопластыря и проволоки крыс подвешивали за середину хвоста на высоте 50 см над горизонтальной поверхностью. В течение 5 минут фиксировали суммарное время иммобилизации (полная неподвижность крыс), а также число дефекаций.

Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) (Pellow, File, 1986) использовался для выявления компонентов тревожности и исследовательской активности в поведении животных. Установка состоит из закрытых и двух открытых лучей, расположенных напротив друг друга (длина луча 45 см), высота бортиков закрытых лучей равна 20 см. Вся установка приподнята на 70 см над уровнем пола. Крысу помещали в центр лабиринта, головой к открытому лучу. В течение 5 минут программой видеотрекинга автоматически регистрировались следующие параметры: общая длина пройденного пути (в см), время движения (при скорости более 30 см/сек), время неподвижности (при скорости менее 2 см/сек), средняя и максимальная скорости (см/сек), количество эпизодов движения и неподвижности. Такой же набор параметров, а также латентный период захода и длительность пребывания регистрировалась для центрального сектора, открытого и закрытого рукавов по отдельности. Визуально фиксировали число стоек в закрытых лучах, суммарное время груминга, число дефекаций, число актов поведения риска, число выглядываний из закрытых лучей в открытые.

Другим тестом, который использовали для выявления компонентов тревожности в поведении животных, был тест «светло-темная камера» (СТК).

(Bourin, Hascoet, 2003). Прибор состоит из двух отсеков, соединенных между собой отверстием размером 10х10 см, расположенном на уровне пола камеры.

Светлый отсек размером 20x50 см и темный размером 24x20 см. Животное помещали в светлый отсек головой от входа в темный отсек. Общее время регистрации было 3 минуты. Регистрировался латентный период захода в темный отсек, общее время в темном отсеке, общее время в светлом отсеке, число выглядываний из темного отсека в светлый, число стоек, суммарное время груминга в светлом отсеке, а также число дефекаций.

Тест «открытое поле» (File, Wardill, 1975) использовали для измерения двигательной и ориентировочно-исследовательской активности. Поскольку в некоторых экспериментах было необходимо провести тест «открытое поле» дважды, с интервалом несколько дней, тестирование проводили в двух сходных, но разных установках, чтобы, таким образом, при каждом тестировании животное попадало в новую для него обстановку. Один прибор представлял собой затемненную камеру 90х90 см с 16 отверстиями в днище диаметром 3.5 см. Другой прибор имел круглую форму диаметром 90 см, с отверстиями в днище. Крысу помещали в центр арены и осуществляли регистрацию поведения в течение 5 мин. Программой видеотрекинга регистрировали следующие параметры: общая длина пройденного пути (в см), время движения (при скорости более 30 см/сек), время неподвижности (при скорости менее 2 см/сек), средняя и максимальная скорость, количество эпизодов движения и неподвижности. Такой же набор параметров, а также латентный период захода и время нахождения регистрировали для пребывания в центральной зоне. Пересечение центром массы животного внутреннего сектора размером 35 см интерпретировалось программой как посещение центральной зоны. Визуально регистрировалось суммарное время груминга, число стоек и число дефекаций.

Кроме того, в экспериментах использовали тест «открытое поле с внесением новый предметов». В этом варианте теста на следующий день после проведения первого теста «открытое поле» животным проводили повторное тестирование, при этом в арене было установлено два новых предмета. После каждого животного сама арена, а также оба предмета обрабатывались дезинфицирующим средством для удаления запаховый меток.

Помимо стандартных параметров, регистрируемый в тесте «открытое поле», регистрировалось число подходов к новым объектам, а также время и число заходов в квадранты. Возрастание числа подходов к новым объектам и нахождение около объектов (в квадрантах с предметами) указывает на возрастание исследовательской активности.

Тест «закрытый крестообразный лабиринт» (ЗКЛ). (Салимов, 2003) применялся как альтернатива теста норковая камера для анализа двигательной и исследовательской активности. Экспериментальная установка представляет собой 5 квадратных камер с непрозрачными стенками размером 25х25х25 см, расположенных крестообразно (лучи). Лучи соединены с центральной камерой входами размером 10x10 см. В течение 5 минут регистрировалась последовательность захода в лучи, время первого полного обхода, число левых и правых поворотов, число полных обходов, эпизодов стереотипии (челночные переходы), возвратов, стоек, дефекаций, суммарное время груминга. Программой видеотрекинга регистрировали следующие параметры:

общая длина пройденного пути (в см), время движения (при скорости более см/сек), время неподвижности (при скорости менее 2 см/сек), средняя и максимальная скорость, количество эпизодов движения и неподвижности для всего лабиринта, а также отдельно для центрального отсека.

7. Биохимический анализ тканей.

После декапитации у животных извлекали мозг, который помещался на лед.

Из мозга извлекались ткани переднего стриатума, которые помещались в жидкий азот. Время между эвтаназией животного и помещением стриатума в жидкий азот было не более 1 минуты. Пробы хранились при -700С.

Анализ содержания биоаминов проводили в лаборатории нейрохимической фармакологии НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН методом ВЭЖХ.

Определялась концентрация веществ: дофамина (ДА), серотонина (5НТ), норадреналина, 3.4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), 5-оксииндолоуксусная кислота (5-ОИУК).

Клиническое исследование препарата семакс.

Исследование проводилось в отделении клинической фармакологии клиники Национальный научный центр наркологии МЗСР РФ, сотрудниками д.б.н. Винниковой М.А. и к.б.н. Козыревой А.В. Длительность лечения в клинике составила 30 дней. Исследование проводилось двойным слепым методом. В исследование включались пациенты, проходившие лечение в клинике, мужчины в возрасте 25-50 лет с алкогольной зависимостью.

Семакс назначался ежедневно с первого дня развития алкогольного абстинентного синдрома по 1 капле в каждый носовой ход 3 раза в день с интервалом 4-5 часов (1 капля содержит 500 мкг вещества), третье назначение осуществлялось не позднее 17-00. Длительность приема в общей сложности составляла 14 дней.

Оценка психопатологических, соматовегетативных, неврологических проявлений, а также побочных эффектов производилась в 0, 3, 7, 10, 21 и дни исследования. Оцениваемые параметры: осознаваемая потребность в алкоголе, моторное возбуждение, напряженность, тревожность, дисфория (форма болезненно-пониженного настроения, характеризующееся злобностью, раздражительностью), подавленность, эмоциональная лабильность, заторможенность, расстройство сна, чувство вины, истощаемость, раздражительность, неустойчивость внимания, пониженный эмоциональный фон, разбитость, повышение артериального давления, покраснение лица, склер, потливость, жажда, тахикардия, обложенность языка, желтушность кожи, склер, головная боль, нистагм, атаксия, нарушение координации, тремор. Оценка производилась по 4х бальной системе: 0 - отсутствие симптома, 1 – симптом слабо выражен, 2 – средне выражен. 3 – выражен значительно.

По прошествии 14 месяцев после лечения производили оценку катамнеза алкогольных рецидивов, путем опроса пациентов или родственников для выяснения длительности ремиссии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Введение препарата семакс в течение 10 дней в дозах 50 и 200 мкг/кг.

Поведение на фоне алкогольной депривации. В тесте «открытое поле» у животных, которым интаназально вводили семакс в течение 10 дней в дозе 2мкг/кг, длина пройденного пути и время движения были статистически значимо выше по сравнению с алкоголизированным контролем (на 39% и 34% соответственно, p<0.05), а время замирания достоверно ниже (на 43%, p<0.05) (Рис. 1). Двигательная активность при введении семакса в данной дозе в течение 10 дней была выше не только по сравнению с алкоголизированным, но и с интактным контролем. При этом в тесте «подвешивание за хвост» у этих животных было ниже время иммобилизации (на 22%) и число дефекаций (на 46%, p<0.05) по сравнению с группой алкоголизированного контроля, что говорит о снижении депрессивно-подобного поведения (Рис. 1 Б). В тесте ПКЛ у опытной группы было выше время неподвижности (60%, р<0.05) и меньше число посещений центральной зоны (58.5%, р<0.05) по сравнению с алкоголизированным контролем, приближая параметры поведения к их значениям у интактного контроля.

Рис.1. Влияние десятидневного введения препарата семакс в дозе 50 и 200 мкг/кг на параметры поведения в тесте «открытое поле» (А) и «подвешивание за хвост» (Б) хронически алкоголизированных крыс на фоне алкогольной депривации в процентах к интактному контролю (* - р<0.05 к алкоголизированному контролю, # - р<0.05 к интактному контролю).

У животных, которым вводили семакс в дозе 50 мкг/кг в течение 5 и дней на фоне депривации, значения как параметров двигательной активности, так и показателей «время иммобилизации» в тесте неизбегаемого плавания, приближалось к уровню группы интактного контроля и не имело значимых от него отличий. Однако, различия с группой алкоголизированного контроля также не достигали уровня статистической значимости.

Таким образом, введение семакса в дозе 200 мкг/кг вызывало увеличение двигательной и исследовательской активности. При введении семакса в меньших дозах наблюдалась тенденция к увеличению двигательной активности и нормализации параметров поведения алкоголизированных животных на фоне алкогольной депривации.

Потребление этанола. У животных, которым на фоне отмены алкоголя ежедневно в течение 5 дней интраназально вводили семакс в дозе мкг/кг, потребление этанола было несколько ниже (на 21%) по сравнению с группой алкоголизированного контроля (Рис. 2). Введение той же дозы пептида в течение 10 дней не оказывало подавляющего влияния на потребление этанола, более того, наблюдалась определенная тенденция к увеличению потребления алкоголя животными. У крыс, которым вводили семакс в дозе 200 мкг/кг в течение 10 дней, потребление этанола статистически значимо повышалось относительно как интактного, так и алкоголизированного контроля.

Таким образом, наиболее выраженное стимулирующее действие на Рис. 2. Потребление 15% этанола после введения препарата семакс в разных режимах хронически поведение было выявлено при алкоголизованными крысами, (* - р<0.05 к алкоголизированному контролю) десятидневном введении семакса в дозе 200 мкг/кг, при этом у животных достоверно повышалось потребление этанола. В данной серии экспериментов при введении семакса в дозе 50 мкг/кг, в течение 5 дней, наблюдалась тенденция как к снижению уровня потребления алкоголя, так и к нормализации параметров поведения.

Введения препарата семакс в течение 5 дней в дозе 50 мкг/кг На основании результатов серии 1 для более подробного изучения действия препарата на хронически алкоголизированных крыс мы провели дополнительное исследование пятидневного введения семакса в дозе мкг/кг. Для начала мы оценили влияние уровня потребления 15% этанола до введения веществ на поведение во время алкогольной депривации крыс контрольной группы и группы «семакс». Для этого группа алкоголизированного контроля и группа «семакс» были условно разделены по потреблению 15% этанола на три подгруппы каждая:

1. подгруппа: животные с низким уровнем потреблением этанола - среднесуточное потребление этанола меньше 9 мл 15% этанола на крысу 2. подгруппа: животные со средним уровнем потребления этанола – среднесуточное потребление от 9 до 11 мл 15% этанола на крысу 3. подгруппа: животные с высоким уровнем потребления этанола - среднесуточное потребление больше 11 мл 15% этанола на крысу Далее было проведено сравнение между контрольными и опытными подгруппами с соответствующим уровнем потребления алкоголя.

Поведение на фоне алкогольной депривации. У животных с низким потреблением этанола в группе, получавшей семакс, была статистически значимо выше двигательная и исследовательская активность по сравнению с группой интактного контроля (длина пройденного пути в 1,5 раза выше,, p<0.05) в тесте «открытое поле». В других тестах для этих подгрупп отличий не наблюдалось.

У опытной подгруппы крыс со средним уровнем потребления была ниже двигательная активность в тесте «открытое поле» по сравнению с контрольными алкоголизированными животными. Данные параметры были близки к значениям интактного контроля (длина пройденного пути и время движения составили 81 и 73% от алкоголизированного контроля соответственно). Тревожность (количество выходов в центральную зону теста «открытое поле» и время замирания) при этом, напротив, практически не отличалась от подгруппы алкоголизированного контроля.

У подгруппы с высоким уровнем потребления этанола под действием семакса достоверных изменений двигательной активности и показателей депрессивности выявлено не было.

Потребление этанола.

У подгруппы животных с низким уровнем потребления этанола, введение семакса не меняло потребления этанола. В группе животных с исходно средним уровнем потребления этанола под действием препарата семакс потребление этанола было статистически значимо ниже, (на 21% в среднем за период 30 дней, р<0,05) по сравнению с соответствующей подгруппой алкоголизированного контроля. Для группы с исходно высоким уровнем потребления статистически значимых отличий между контрольной и опытной группой выявлено не было, но в первые 10 дней после окончания алкогольной депривации в опытной группе имелась тенденция к снижению потребления (Рис. 3).

Таким образом, пятидневное введение семакса в дозе 50 мкг/кг оказало наиболее выраженный эффект на подгруппу со средним потреблением этанола, Рис. 3. Потребление 15% этанола после введения препарата семакс в дозе 50 мкг/кг 5 дней уменьшая потребление этанола хронически алкоголизованными крысами с разным уровнем потребления, (* - р<0.05 к и приводя к нормализации алкоголизированному контролю) поведенческих показателей.

Введение препарата семакс в течение 5 дней в дозе 50 мкг/кг на содержание биогенных аминов в тканях стриатума крыс.

По завершении эксперимента было проведено измерение уровня биоаминов в тканях стриатума. Измерялся уровень следующих аминов:

дофамина (ДА), серотонина (5НТ), норадреналина, 3.4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), 5-оксииндолоуксусной кислоты (ОИУК).

У крыс с исходно низким потреблением этанола отличий в концентрации биоаминов в ткани стриатума между интактным контролем и алкоголизированными крысами, как в контрольной, так и в опытной группах найдено не было. В опытной группе было достоверно большее соотношение ДОФУК/ДА (121%, p<0.05) по сравнению с алкоголизированным контролем что может свидетельствовать об интенсификации обмена дофамина в опытной группе, возможно, обусловленной действием семакса.

Наиболее выраженные изменения в уровне биогенных аминов и их метаболитов наблюдались у животных со средним уровнем потребления этанола. Так, у контрольных алкоголизированных животных этой подгруппы Алкоголизированный контроль, n=Семакс, n=Рис. 4 Влияние пятикратного введения препарата семакс в дозе 50 мкг/кг на концентрацию моноаминов в стриатуме у животных со средним потреблением этанола (в процентах от интактного контроля). * - p<0,05 к интактному контролю, # - p<0,05 к алкоголизированному контролю по сравнению с животными группы «интактный контроль» наблюдался более низкий уровень ДА (72%, p<0.05) и статистически недостоверное увеличение ДОФУК/ДА (138%) и ГВК/ДА (148%), что может указывать на ускорение катаболизма ДА. В группе животных, получавших семакс, уровень ДА и соотношение ГВК/ДА были статистически значимо выше (141% и 176% соответственно, p<0.05), чем у контрольных алкоголизированных животных этой подгруппы. При этом уровень ДОФУК и его отношение к ДА не отличались от значений интактного контроля.

Таким образом, у алкоголизированных крыс со средним уровнем потребления после введения семакса показатели обмена ДА в стриатуме приближались к значениям группы интактного контроля.

В подгруппах с высоким потреблением алкоголя все изменения уровня биоаминов были статистически незначимы и имели одинаковую направленность у опытной и контрольной групп. Вероятно, это связано с тем, что длительное потребление алкоголя у животных с выраженным влечением к алкоголю сопровождается большими нейрохимическими изменениями и курсовое введение семакса по используемой схеме (5 дней, в дозе 50 мкг/кг) не может их компенсировать.

Таким образом, наиболее выраженные изменения в метаболизме биоаминов наблюдались в группе животных со средним уровнем потребления этанола, для которой была показана максимальное антиалкогольное действие семакса в дозе 50 мкг/кг. При этом влияние семакса на уровень биогенных аминов и их метаболитов у животных со средним уровнем потребления этанола можно оценить как носящее нормализующий характер.

Введение пептида PGP в дозах 15 мкг/кг и 50 мк/кг, 5 дней.

Поведение на фоне алкогольной депривации. Введение PGP в дозе мкг/кг не привело к существенным изменения в тесте «открытое поле» у животных на 5 сутки депривации. В тесте «открытое поле» с внесением новых предметов в группе «PGP 15 мкг/кг» крысы демонстрировали достоверно меньше количество подходов к новым предметам (2,1±0,98 для PGP, 6,5±2,для алкоголизированного контроля). Это может быть связано с повышением уровня тревожности животных. Введение PGP в дозе 50 мкг/кг не оказало влияния на поведение на фоне депривации: параметры не отличаются от таковых у алкоголизированного контроля.

Потребление этанола. Введение PGP в дозе 15 мкг/кг, не оказывало выраженного влияния на потребление этанола в первые десять дней после предоставления этанола. На 11-20 день после депривации потребление алкоголя животными, которым вводили PGP в дозе 15мкг/кг, было статистически значимо выше, чем у животных контрольных групп (на 35%, р<0.05) (Рис. 5 А). Введение PGP в дозе 50 мкг/кг вызывало статистически значимое повышение потребления этанола у хронически алкоголизированных животных в первые пять дней после предоставления этанола (на 49,5%,, р<0.05). После этого периода значения потребления не отличались от контрольных групп (Рис. 5 Б).

Поскольку в больших дозах и семакс и PGP повышают потребление этанола, можно предположить, что, данный аспект поведения крыс модулируется пептидом PGP. Так как для семакса проалкогольное действие наблюдается при использовании его в большой дозе, показанный эффект Рис. 5. Потребление 15% этанола после введения PGP в дозе 15 мкг/кг (А) и мкг/кг(Б) 5 дней хронически алкоголизованными крысами (* - р<0.05 к алкоголизированному контролю) может быть связан с накоплением в организме фракции PGP, поскольку PGP обладает устойчивостью к протеолитическим ферментам.

При этом PGP в большой дозе не оказывал никакого влияния на поведение. Семакс же, напротив, в обоих дозах имел схожую направленность эффекта, вызывая повышение активности у крыс.

Можно предположить, что пептид PGP модулирует потребление алкоголя, воздействуя через эндогенные нейропротекторые соединения (такие как нейротрофические факторы); влияние же семакса на поведение животных во время алкогольной депривации может определяться его АКТГ фрагментом.

Точный механизм действия пептида PGP, в том числе на алкогольную мотивацию животных, требует дальнейших исследований.

Введение антиоксиданта SkQПоведение крыс на фоне алкогольной депривации. Введение SkQ1 в дозе 250 нмоль/кг, перорально в течение 20 дней, через день, не влияло на двигательную активность алкоголизированных животных в тестах «открытое поле» и ПКЛ. При этом в тесте «открытое поле» показатели числа заходов в центральную зону (на 153%, p<0,05), время в движении (на 200%, p<0,05) и количество актов движения (на 73%) в центральной зоне были выше по сравнению с алкоголизированным контролем. Также имелась тенденция к большему числу стоек (на 41%) и меньшему времени груминга (на 26%) по сравнению с алкоголизированным контролем. В целом представленные данные могут указывать об анксиолитическом действии SkQ1 на поведение животных во время алкогольной депривации. В тесте неизбегаемого плавания после введения SkQ1 время иммобилизации было ниже, чем у алкоголизированного и интактного контроля (57% от интактного контроля, p<0,05), что указывает на снижение депрессивно-подобного поведения у животных.

Потребление этанола.

Введение препарата SKQ1 снижало уровень потребления 15% этанола у хронически алкоголизированных животных, причем антиалкогольный эффект был выражен в течение месяца после окончания введения препарата (уровень потребления этанола за месяц был на 40% ниже по сравнению с алкоголизированным контролем, Рис. 6. Потребление 15% этанола после введения SkQ1 в дозе 250 нмоль/кг хронически p<0.05) (Рис. 7).

алкоголизованными крысами (* - р<0.05 к алкоголизированному контролю) Уровень биогенных аминов в ткани стриатума у животных группы «SkQ1» не отличался от алкоголизированного контроля.

Таким образом, введение SkQ1 вызывало у животных снижение компонентов тревожности и депрессивно-подобного поведения, уменьшая поведенческие признаки алкогольной депривации. Это может косвенно объясняться его протекторным антиоксидантным действием на организм.

Однако, механизм реализации столь выраженного и длительного антиалкогольного эффекта SkQ1, продемонстрированного в настоящей работе, требует дальнейшего изучения.

Корреляционный анализ связи изменения потребления этанола после введения препаратов с исходными параметрами поведения алкоголизированных животных.

Проведен статистический анализ индивидуальных данных животных во всех сериях экспериментов: посчитаны коэффициенты корреляции Спирмена с целью оценки влияния исходных индивидуальных особенностей поведения на изменение потребления 15% этанола после введения веществ.

Положительная корреляция означала, что данный параметр был выше у таких животных, у которых потребление этанола после введения препаратов снижалось.

Табл. 2 Значения коэффициентов корреляции по Спирмену между изменением потребления этанола после введения семакса в дозе 50 мкг/кг пятикратно и исходными параметрами поведения. * - p<0.05.

Коэффициент корреляции по тест открытое поле Спирмену (R) длина пройденного пути 0,количество эпизодов замирания -0,54* время движения в центе 0,35* тест ПКЛ количество выходов на открытые лучи 0,45* количество поведений риска 0,41* время в движении 0,длина пути в закрытых лучах 0,37* время движения на открытых лучах 0,длина пути на открытых лучах 0,средняя скорость на открытых лучах 0,36* количество эпизодов движения на открытых лучах 0,36* При введении семакса в дозе 50 мкг/кг в течение 5 дней в серии 2 корреляции между исходным уровнем потребления и изменением потребления после введения семакса выявлено не было. Совокупность параметров представленных в Табл. 2, говорит о том, что семакс оказывал антиалкогольное действие на животных с большей локомоторной активностью (меньше эпизодов замирания, больше время движения в центре) при алкоголизации. Также имеются положительные корреляции с количеством эпизодов поведения риска (R=0,41, p<0.05 ) и количества выходов на открытые лучи (R=0,45, p<0.01), однако это может быть связано с увеличением общей двигательной активности животных, а не со сниженной тревожностью. Для теста неизбегаемого плавания по Порсольту статистически значимых корреляций не было выявлено. Таким образом, исходно повышенный уровень двигательной активности алкоголизированных животных коррелировал с антиалкогольным эффектом препарата. Такие же корреляции были получены и в серии 1Для животных, которым вводили PGP в серии 3, были также посчитаны коэффициенты корреляции между поведением алкоголизированных животных до введения PGP и изменением в потреблении 15% этанола после введения препаратов. В тесте ЗКЛ были выявлены корреляции между изменением потребления этанола и временем замирания животных (R= -0,65, p<0.05) и временем движения (R= 0,73, p<0.05).

У животных, которым вводили SkQ1, статистически значимых корреляций между снижением потребления этанола и параметрами поведения в тесте «открытое поле» до введения веществ не было. Таким образом, связи между антиалкогольным эффектом SkQ1 и индивидуальными особенностями параметрами исходного поведения животных выявлено не было.

Клиническое исследование препарата семакс Группа пациентов больных алкоголизмом, которым давали семакс, по времени ремиссии разбилась на две подгруппы (Рис. 8). В подгруппе с ранним временем срыва (меньше 1 месяца) наблюдалась повышенная раздражительность (p<0.05), дисфория, эмоциональная лабильность (p<0.05), что может указывать на второй тип алкоголизма по классификации Клонингера, который характеризуется наличием агрессивного и асоциального поведения. У пациентов с длительной ремиссией (больше месяцев) данные параметры были ниже, кроме того, наблюдалось повышенное артериальное давление (p<0.05). Поскольку Рис. 7. Различия в исходных психо-вегетативных показателях между пациентами, которым давали стрессирующие факторы семакс срыв у которых произошел раньше 1 месяца, и пациентами, длительность ремиссии у которых являются одними из больше 6 месяцев. * - р<0,05 между группами.

основных причин гипертензии (Манук и др., 1986), это может быть косвенным подтверждением того, что данные пациенты могут быть отнесены к первому типу по Клонингеру, алкогольная зависимость у которого формируется под действием окружающей среды и различных стрессогенных факторов, к которым пациенты обнаруживают меньшую устойчивость. Таким образом, можно видеть, что применение препарата семакс, вероятно, имеет разную эффективность при терапии пациентов с разными типами алкоголизма;

антиалкогольный эффект наблюдался у пациентов с предположительно первым типом заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследованные нами вещества оказывали влияние на потребление этанола хронически алкоголизированными животными. При этом эффект семакса и PGP был наиболее выражен у животных с исходно более высокой двигательной активностью на фоне алкоголизации. С другой стороны, параметры поведения животных не оказывали влияния на антиалкогольный эффект антиоксиданта SkQ1.

Можно предположить, что для тех веществ (семакс, PGP), которые оказывают модулирующее действие на медиаторные системы мозга, вероятно, важную роль играют индивидуальные особенности параметров поведения на фоне алкоголизации. В то же время, для вещества (SkQ1) с неспецифическим периферическим механизмом действия такого эффекта выявлено не было.

ВЫВОДЫ 1. Пятидневное ежедневное интраназальное введение семакса на фоне алкогольной депривации в дозе 50 мкг/кг уменьшало выраженность изменений в поведении на фоне алкогольной депривации, а также снижало уровень потребления этанола хронически алкоголизированными крысами.

При увеличении дозы семакса до 200 мкг/кг в течение 10 дней, наблюдалась моторная гиперактивность, потребление 15% этанола увеличивалось.

2. Пятидневное ежедневное интраназальное введение трипептида Pro-Gly-Pro увеличивало потребление этанола у хронически алкоголизированных крыс: в дозе 15 мкг/кг эффект был отставленным (рост потребления начинался с 10-х суток предоставления этанола); в дозе 50 мкг/кг пептид повышал потребление этанола только в течение первых 5-ти суток.

3. Анализ индивидуальных параметров поведения показал, что антиалкогольный эффект семакса и PGP наблюдался у животных, характеризующихся более высокой двигательной активностью.

4. Применение семакса в составе комплексной терапии алкоголизма в клинике оказалось эффективным у пациентов, с низким уровнем раздражительности, эмоциональной лабильности и повышенным артериальным давлением.

5. Введение антиоксиданта SkQ1 в дозе 250 нмоль/кг п/о, на фоне отмены этанола, в течение 20 дней через день, ослабляло поведенческие признаки отмены этанола и снижало потребление 15% этанола при свободном выборе.

Связи между антиалкогольным эффектом SkQ1 и исходными индивидуальными особенностями поведения крыс не выявлено.

6. На модели хронической алкоголизации крыс, а также на основании анализа клинических данных было показано, что эффективность антиалкогольного действия препаратов может быть связана с индивидуальными особенностями поведения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Грозная А.А., Ефимова Е.В. Влияние комплексного введения препаратов Семакс и Полиоксидоний на поведенческие параметры и потребление этанола у крыс со сформированной алкогольной мотивацией // Тез. докл. международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2008». Москва. 2008.

2. Lovat M.L., Vinnikova M.A., Kozyreva A.V., Efimova E.V., Groznaya A.A. The influence of the individual features of the patients on the efficacy of some nootropic agents in clinic of chronic alcoholism. 21st ECNP Congress 30 August - 3 September 2008 Barcelona, Spain. Citation: The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology, V. 18(4), P. 583.

3. Грозная А.А., Ефимова Е.В., Буник В.И., Ловать М.Л. Влияние оксоглутаратдегидрогеназы на поведение и на активность фермента в мозге крыс в норме и при острой алкоголизации // Тез. докл. XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2009». Москва. 2009.

4. Ефимова Е.В., Грозная А.А. Гетерогенность терапевтического действия препарата «Семакс» в экспериментах на предварительно алкоголизированных белых беспородных крысах // Тез. докл. XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2009». Москва. 2009.

5. Ефимова Е.В., Ловать М.Л., Грозная А.А., Калабушев С.Н. Влияние исходного уровня потребления этанола на эффективность антиалкогольного действия пептидного ноотропа семакс у хронически алкоголизированных крыс // Тез. докл. IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань. 2009.

6. Ефимова Е.В., Калабушев С.Н., Грозная А.А., Ловать М.Л. Влияние препарата семакс на систему биоаминов у хронически алкоголизированных крыс // Тез. докл. ХХI Съезда физиологического общества имени И.П. Павлова. Калуга. 207. Efimova E.V., Kushnir E.A., Kalabushev S.N., Lovat M.L. Individual approach to administration of drugs in alcoholism treatment: a comparison of mitochondrial antioxidant SKQ1 and peptide noothrope Semax. Aquitaine Conferences on Neurosciences. Arcachon. France. 208. E.V. Efimova*, A.A. Groznaja, E.A. Kushnir, M.L. Lovat The influence of peptide Semax on albino rats with different types of alcoholism. The new Frontier in Addiction Treatment:

Evidence-Bacsed Policy and Practice. Washington. USA. 209. Trofimova L, Lovat M, Groznaya A, Efimova E, Dunaeva T, Maslova M, Graf A, Bunik V.

Behavioral impact of the regulation of the brain 2-oxoglutarate dehydrogenase complex by synthetic phosphonate analog of 2-oxoglutarate: implications into the role of the complex in neurodegenerative diseases. International Journal of Alzheimer's Disease. 2010; 2010: 749010. Efimova E.V., Kushnir E.A., Kalabushev S.N., Lovat M.L. Effect of mitochondrial antioxidant SKQ-1 on the behavior of albino rats after acute ethanol intoxication. The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology, V. 21(2), P. 167-168.

11. Ефимова Е. В., Ловать М.Л. Сравнение действия препарата Семакс (АКТГ 4-7 - Pro-GlyPro) и пептида Pro-Gly-Pro на потребление этанола и поведение самцов белых крыс со сформированной алкогольной зависимостью. Тез. докл. V Российского симпозиума «Белки и пептиды». Петрозаводск. 2011.

12. Ефимова Е.В., Грозная А.А., Ловать М.Л. Влияние совместного введения ноотропа семакс и иммуномодулятора полиоксидоний на потребление этанола и параметры поведения предваритально алкоголизированных самцов крыс. Технологии живых систем. 2012. (в печати)






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.