WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

БАТТУЛИНА НАДЕЖДА ВИКТОРОВНА

ВЛИЯНИЕ ГЕНА TRITHORAX-LIKE (Trl) НА ФОРМИРОВАНИЕ ГЛАЗА DROSOPHILA MELANOGASTER

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2012

Работа выполнена в лаборатории эволюционной биологии клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Научный консультант: кандидат биологических наук Баричева Элина Михайловна

Официальные оппоненты: Захаров Илья Кузьмич доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Демаков Сергей Анатольевич доктор биологических наук, заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», г. Томск.

Защита диссертации состоится «___» ____________ 2012 г. на заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан «___» _____________ 20___ г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение генетических систем, контролирующих формирование тканей и органов многоклеточного организма, является одним из основных направлений современной генетики развития.

Особое значение имеет не только анализ отдельных генов, но и выявление групп генов, скоординировано действующих в процессах клеточной дифференцировки и установлении пространственно упорядоченной организации клеток. Развитие глаза дрозофилы является удобной модельной системой для подобного рода исследований. Этот процесс имеет ряд общих черт с развитием глаза позвоночных, а многие гены и сигнальные пути, вовлеченные в формирование глаза дрозофилы, являются эволюционно-консервативными (Kumar, 2009).

Данные, касающиеся генетического контроля формирования глаза дрозофилы, имеют общебиологическое значение и могут быть использованы для выяснения общих закономерностей органогенеза и у других видов, для которых применение генетических и цитогенетических методов исследования в условиях in vivo имеет значительные ограничения.

Сложный глаз дрозофилы состоит из 700-800 повторяющихся функциональных единиц - омматидиев, образованных клетками нескольких типов. Каждый омматидий состоит из 8 фоторецепторных нейронов (фотонейронов R1–R8), 4-х конусных клеток, секретирующих линзы, и 2-х первичных пигментных клеток. Вокруг омматидиев располагаются вторичные и третичные пигментные клетки, а также механо-сенсорные щетинки (Wolff, Ready, 1993). Формирование глаза дрозофилы является сложным многоэтапным процессом, каждая стадия которого контролируется множеством генов. К настоящему времени хорошо изучена роль сравнительно небольшого их числа, в частности, определены и изучены ключевые гены, ответственные за дифференцировку клеток, формирующих омматидий (Voas, Rebay, 2004). Роль других генов в формировании глаза изучена слабо, хотя есть данные о том, что мутации в них приводят к нарушению структуры глаза (Call et al., 2007). К числу таких генов относится ген Trithorax-like (Trl), кодирующий транскрипционный фактор GAGA. Этот эволюционно-консервативный белок у дрозофилы принимает участие в формировании «открытой» конформации хроматина в различных регуляторных элементах, задействованных в регуляции транскрипции (Farkas et al., 2000; Lehmann, 2004; Mito et al., 2007; Deal et al., 2010; Matharu et al., 2010).

Нарушения поверхности глаза были обнаружены у Trl 13С-мутантов (Farkas et al., 1994) и генетических мозаиков по аллелю Trl s2325 (Call et al., 2007). В дальнейшем в глазах Trl 13С-мутантов было выявлено наличие дополнительных вторичных и третичных пигментных клеток и недостаток щетинок вокруг омматидиев. Подобные дефекты наблюдались и у генетических мозаиков, гомозиготных по аллелю Trl 81.1, у которых дополнительно были обнаружены изменения количества и формы первичных пигментных клеток (Dos-Santos et al., 2008). Необходимо отметить, что интерпретацию полученных авторами результатов затрудняет отсутствие данных об изменении количества продуктов гена Trl в развивающемся глазу мутантов и генетических мозаиков, используемых в перечисленных работах. Поскольку механизмы нарушений структуры глаза у Trl-мутантов выявлены не были, вопрос о роли транскрипционного фактора GAGA в процессе формирования данного органа остается открытым.

Вероятно, белок GAGA вовлечен в регуляцию экспрессии генов, задействованных в развитии глаза дрозофилы. Результаты исследований связывания белка GAGA с последовательностями ДНК генома дрозофилы свидетельствуют о том, что к его потенциальным мишеням относится более 6генов (van Steensel et al., 2003, 2010; de Wit et al., 2008; Schuettengruber et al., 2009). Однако экспериментально доказано участие белка GAGA в контроле экспрессии не более 10 генов, среди которых нет генов, участвующих в формировании глаза. Для выявления генов-мишеней белка GAGA, необходимых для нормального развития глаза дрозофилы, предпочтителен анализ морфологии глаз Trl-мутантов. Результаты анализа клонов клеток, гомозиготных по аморфным Trl-мутациям, которые обычно составляют лишь небольшую часть глазо-антеннального имагинального диска, могут не отражать нарушения всех процессов, в которые вовлечен белок GAGA. Возможно также, что данный белок участвует в регуляции экспрессии генов, продукты которых секретируются, в таком случае гомозиготные по Trl-мутации клетки могут не демонстрировать некоторых нарушений, поскольку они получают секретируемые белки от окружающих клеток, не содержащих мутацию.

Среди аллелей гена Trl, доступных в мировых коллекциях, нет хорошо охарактеризованных мутаций, которые значительно нарушают структуру глаза жизнеспособных мутантов. Нами были получены и описаны две новые гипоморфные мутации - Trl 362 и Trl en82 (Огиенко и др., 2006, 2008), оказывающие такое действие на поверхность глаза. Одна из них - Trl en82, была охарактеризована в ходе данной работы. Эти мутации, приводящие к значительному снижению экспрессии гена Trl, дают уникальную возможность выявить весь спектр изменений структуры глаз Trl-мутантов и определить потенциальные гены-мишени белка GAGA, задействованные в развития глаза дрозофилы. По нашим предварительным данным к таким генам могут относиться lozenge (lz) и BarH1. Данные гены кодируют эволюционноконсервативные транскрипционные факторы, которые участвуют в контроле нескольких процессов в ходе формировании глаза дрозофилы (Higashijima et al., 1992; Daga et al., 1996; Lim, Choi, 2004; Wildonger et al., 2005).

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в установлении роли гена Trithorax-like в процессе формирования глаза D.

melanogaster и выявлении его взаимодействий с генами, участвующими в данном процессе.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. провести молекулярно-генетический анализ аллеля Trl en82;

2. охарактеризовать экспрессию гена Trl в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях у гетерозигот Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85;

3. исследовать влияние мутаций гена Trl на структуру глаза имаго и глазоантеннальных имагинальных дисков 42-часовых куколок мутантов Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85;

4. выяснить влияние мутаций гена Trl на проявление мутаций генов lz и BarH1;

5. изучить экспрессию гена lz в глазо-антеннальных имагинальных дисках у гетерозигот Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85;

6. провести анализ связывания рекомбинантного белка GAGA с потенциальными сайтами, выявленными в 5'-областях генов lz и BarH1.

Научная новизна. Впервые показано, что снижение уровня экспрессии гена Trl в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральном ганглии приводит к изменению количества фотонейронов и конусных клеток в части омматидиев, а также к изменению ориентации некоторых омматидиев в глазу дрозофилы. Установлено, что проявление мутации генов lz и BarHусиливается на фоне мутаций по гену Trl, что свидетельствует о взаимодействии этих генов. Выявлено, что белок GAGA вовлечен в активацию экспрессии гена lz в клетках глазо-антеннальных имагинальных дисков предкуколок.

Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют расширению фундаментальных знаний о процессе формирования глаза насекомых. Поскольку структурные гомологи белков GAGA, Lz и BarHприсутствуют и у позвоночных, то полученные результаты представляют интерес для всех биологов, занимающимися вопросами развития. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций по генетике развития для студентов биологических факультетов.

Вклад автора. Основная часть экспериментальной работы и обработка полученных результатов выполнена автором самостоятельно. Анализ экспрессии генов Trl и lz в норме и у мутантов выполнен при участии Д.А. Карагодина (ИЦиГ СО РАН). Приготовление полутонких срезов глаза дрозофилы проводился совместно с С.И. Байбородиным (ИЦиГ СО РАН).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Мутации, вызывающие снижение экспрессии гена Trl, приводят к широкому спектру нарушений структуры глаза.

2. Мутации гена Trl усиливают проявление мутаций генов lz и BarH1, участвующих в формировании глаза дрозофилы.

3. Снижение экспрессии гена Trl в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях куколок Trl-мутантов коррелирует со снижением количества белка Lz в глазо-антеннальных дисках.

Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены: на XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006 г.); на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007 г.); на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 3, тезисов докладов и материалов конференций – 3.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов, списка литературы. Работа изложена на 135 страницах, содержит таблиц и иллюстрирована 23 рисунками. В списке литературы приведен 2источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Линии D. melanogaster описаны в справочнике (Lindsley, Zimm, 1992), базе данных FlyBase (www.Flybase.org), а также в статьях (Огиенко и др., 2006, 2008).

Иммунохимическое окрашивание имагинальных дисков проводили по методу, предложенному в статье (Bonaccorsi et al., 2000). Использовались антитела N27A1 против белка Armadillo (DSHB) и вторичные антитела – коньюгаты иммуноглобулина G (rabbit anti mouse) с флюорохромом TRITC (Sigma).

Приготовление полутонких срезов глаз дрозофилы проводили по стандартной методике (Batterham et al., 1996).

Морфологический анализ срезов глаз проводили на микроскопе Axioscope 2 plus (Zeiss), глазо-антеннальных имагинальных дисков - на Axio Imeger с приставкой ApoTome (Zeiss), поверхности глаз - на сканирующем электронном микроскопе ТМ–1000 Tabletop (Hitachi). Обработку и анализ фотографий проводили с помощью программ AxioVision Rel. 4.8 (Zeiss) и Adobe Photoshop CS.

Выделение РНК проводили с использованием реагента TRIzol (Gibco BLR), согласно рекомендациям изготовителя.

Нозерн-блот-гибридизацию проводили по протоколу, описанному ранее (Maniatis et al., 1982). Для детекции сигналов использовали фосфоимиджер Pharos FX Plus Molecular Imager. Данные анализировали с помощью программного пакета Quantity One v.4.6.5 (Bio-Rad Laboratories).

Вестерн-блот-анализ проводили по методике, представленной в сборнике (Promega protocols and applications guide, 1991). Использовали антитела против белков Lozenge (DSHB) и -Tubulin (Travares et al., 1996) и вторичные антитела – коньюгаты иммуноглобулина G (rabbit anti mouse) с пероксидазой хрена (Биосан). Детекцию белков проводили с помощью набора реактивов ECL Detection Reagents (Amersham) по методике, описанной в статье (Alexander et al., 2002). Данные, полученные с помощью прибора Chemi Doc XR+ (BioRad), обрабатывали в программе Gel Pro 4.0.

Задержку ДНК-зонда в геле (EMSA) выполняли по методике, предложенной в статье (Ueda et al., 1990). Использовали рекомбинантный белок His-GAGA-519 (Omelina et al., 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для детального исследования влияния гена Trl на процесс формирования глаза в данной работе использовались гипоморфные мутации Trl 362 и Trl en82, приводящие к изменению поверхности глаза. Эти мутации являются наиболее «сильными» из охарактеризованных гипоморфных мутаций гена Trl. Мутация Trl 362, полученная и охарактеризованная ранее А.А. Огиенко с соавторами (20г.), обусловлена встройкой транспозона P(lacW) и прилегающей к нему делецией 96 п.н. в 5'-некодирующей области гена Trl (рис. 1). Аллель Trl en82 был выявлен при поиске генов, взаимодействующих с геном lz, и определен как аллель гена Trl по результатам генетического анализа (М.А. Волошина, персональное сообщение). В данной работе представлена детальная характеристика аллеля Trl en82.

1. Молекулярная и цитогенетическая характеристика мутации Trl enС помощью ПЦР и последующего секвенирования продуктов амплификации было установлено, что мутация Trl en82 вызвана встройкой транспозона размером 1,4 т.п.н. в 5'-некодирующую область гена Trl (в позиции 2997 п.н., согласно последовательности GenBank #AJ225042) вблизи первого старта транскрипции (позиция 3067 п.н.) (рис. 1). Транспозон представляет собой делеционный вариант Р-элемента (удален участок с 810 по 2344 п.н., согласно последовательности GenBank #X06779), встроенный в обратной ориентации относительно гена Trl (Огиенко и др. 2008). Кроме того, анализ нуклеотидной последовательности кодирующей области гена Trl у мутантов Trl en82 выявил делецию 6 п.н. в экзоне 6 гена (9343-9348 п.н. GenBank #AJ225042). Данная делеция, не нарушая рамки считывания, удаляет два глутаминовых кодона в последовательности, кодирующей глутамин-богатый домен (поли-Q-домен) одной из двух изоформ белка GAGA - GAGA -581. Две изоформы GAGA различаются структурой поли-Q-домена, который необходим для обеспечения транс-активационных функций (Vaquero et al., 2000), а также для формирования комплексов, состоящих из изоформ белка (Wilkins, Lis, 1999).

Рис. 1. Схема расположения мутаций гена Trl, используемых в работе. Треугольниками обозначены встройки транспозонов в аллелях Trl en82 и Trl 362. Стрелками указана ориентация транспозонов. Черным прямоугольником и крестом обозначены делеции в аллелях Trl 362 и Trl en82, соответственно. Изогнутыми стрелками отмечены сайты инициации транскрипции гена Trl, заштрихованным прямоугольником - минимальный промотор гена (Kosoy et al., 2002).

Выделены две группы транскриптов: транскрипты первой группы кодируют изоформу GAGA519; второй - GAGA-581. Светлые прямоугольники соответствуют некодирующим районам, темные – кодирующим. На схеме не представлены варианты первого некодирующего экзона гена Trl.

Цитогенетический анализ показал, что мутация Trl en82 в гомозиготе или в гетерозиготе с нуль-аллелем Trl R85 приводит к таким же дефектам в онтогенезе дрозофилы, как и другие гипоморфные мутации гена Trl. В частности, действие данной мутации на оогенез в целом сходно с действием мутации Trl 362 (Огиенко и др., 2006). У гетерозигот Trl en82/Trl R85 в яйцевых камерах нарушается процесс миграции фолликулярных и бордюрных клеток. Также выявляется нарушение формирования цитоплазматических актиновых филаментов в питающих клетках.

У яиц, отложенных самками Trl en82/Trl R85, наблюдаются дефекты структуры и расположения дорзальных выростов хориона (Огиенко и др., 2008; Омелина и др., 2011).

2. Анализ экспрессии гена Trl в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях предкуколок дрозофилы Для установления картины экспрессии гена Trl в развивающемся глазу дрозофилы методом Нозерн-блот-гибридизации был проведен анализ транскриптов данного гена в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозговентральных ганглиях 0-часовых предкуколок дикого типа и гетерозигот Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85. Как показано на рис. 2, в РНК, выделенной из данных органов куколок дрозофил дикого типа (Oregon R), отчетливо выявляются два транскрипта размером 2,5 и 3 т.н. У Trl-мутантов также выявляются два транскрипта тех же размеров. Однако относительное количество транскриптов гена Trl у мутантов Trl 362/Trl R85 и Trl en82/Trl R85 снижено в 2,5-раза по сравнению с нормой (Павлова и др., 2010).

Рис. 2. Транскрипция гена Trl у мутантов Trl 362/Trl R85 и Trl en82/Trl R85. Нозерн-блоты содержат суммарную РНК, выделенную из глазо-антеннальных имагинальных дисков и мозго-вентральных ганглиев 0-часовых предкуколок мутантов Trl 362/Trl R85 (а), Trl en82/Trl R85 (б) и мух дикого типа - Oregon R.

При гибридизации блота с Р-меченным ДНК-зондом, содержащим константные экзоны гена Trl, выявляются два транскрипта размером 2,5 и 3 т.н. Гибридизация с зондом к гену RpL19 используется в качестве контроля нанесения.

Для анализа влияния снижения количества продуктов гена Trl на формирование глаза дрозофилы была исследована поверхность и внутренняя структура глаза гетерозигот Trl 362/Trl Rи Trl en82/Trl R85.

3. Анализ нарушений структуры глаза у Trl-мутантов 3.1. Анализ поверхности глаза В норме поверхность глаза дрозофилы представляет собой правильно организованные ряды шестиугольных линз, которые образованы секретом конусных клеток омматидиев. Вокруг каждой линзы располагаются три механосенсорные щетинки (рис. 3а, г). У Trl-мутантов отсутствует примерно щетинок, тогда как в контроле отсутствие щетинок в должной позиции наблюдается в 7 раз реже. В анализе не учитывались щетинки вокруг двух рядов Рис. 3. Нарушения поверхности глаза имаго Trl-мутантов. a, г – глаз мухи дикого типа.

Линзы располагаются ровными рядами. На схеме (г, вкладка) показано, что линза имеет форму шестиугольника, в трех вершинах которого располагаются щетинки; б, д - глаз мутанта Trl en82/Trl R85; в, е – глаз мутанта Trl 362/Trl R85. (б, в, д, е) В глазах мутантов присутствуют линзы неправильной формы, наблюдается недостаток щетинок. (д, е) Пунктиром отмечено нарушение четкости рядов из линз, вызванное: (д) изменением формы некоторых линз и недостатком одной линзы; (е) внедрением между рядами дополнительных линз. Масштаб: 100 мкм (а–в), 25 мкм (г–е).

линз, находящихся на периферии глаза, поскольку они часто отсутствуют в глазах мух дикого типа (Ready et al., 1976).

У гетерозигот Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85 были выявлены и другие дефекты поверхности глаза, которые ранее не были описаны для Trl-мутантов. Вопервых, у мутантов наблюдалось нарушение в организации рядов линз (рис. 3д, е). Это может быть вызвано отсутствием некоторых омматидиев и сформированных ими линз, появлением дополнительных омматидиев и линз, внедряющихся между регулярными рядами, а также изменением размера и формы некоторых линз. Во-вторых, было отмечено, что размер глаз у Trlмутантов несколько меньше, чем у мух дикого типа. Количество линз (омматидиев) в глазах мутантов примерно на 10 % меньше, чем у мух дикого типа Oregon R (Павлова и др., 2010).

Внутренняя структура глаза Trl-мутантов была проанализирована на поперечных срезах глаз имаго и оптических срезах глазо-антеннальных имагинальных дисков куколок мутантов.

3.2. Анализ полутонких срезов глаз имаго дрозофилы При анализе серий полутонких срезов глаз гетерозигот Trl 362/Trl R85 и Trl en82/Trl R85 у части омматидиев были выявлены изменения количества и расположения фотонейронов, которые не были отмечены при исследовании Trlмутантов другими исследователями (табл. 1, с. 13). В норме на каждом срезе глаза во всех омматидиях наблюдается только 7 из 8 фотонейронов (рис. 4а), поскольку тело фотонейрона R7 располагается над клеткой R8. Каждый фотонейрон содержит уплотненную структуру – рабдомер, представляющий собой около 60 тыс. светочувствительных микроворсинок, распределенных на центральной поверхности тела фотонейрона по всей его длине. Рабдомеры внешних фотонейронов R1-R6 образуют трапециевидную структуру, в центре которой располагается меньший по размеру рабдомер фотонейрона R7 (рис. 4а) или R8, в зависимости от глубины среза (Wolff, Ready, 1993). У мух дикого типа аномалий в расположении и количестве фотонейронов выявлено не было (табл.

1).

Рис. 4. Изменения количества фотонейронов в омматидиях гетерозигот Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85. а – омматидий мухи дикого типа;

б-е - омматидии Trl-мутантов. Цифрами 1-указаны фотонейроны R1-R7, соответственно.

(б) Присутствует дополнительный внешний фотонейрон (отмечен звездочкой). (в-д) Недостаток внешних фотонейронов R1-R6. (д, е) наблюдается дополнительный фотонейрон, по расположению и морфологии рабдомера напоминающий R7 (отмечен стрелкой).

У Trl-мутантов примерно в 2 % омматидиев обнаружено отличное от нормы количество внешних фотонейронов R1-R6 (табл. 1). Чаше встречались омматидии с меньшим (3-5) количеством данных клеток (рис. 4в-д).

Иногда в омматидиях наблюдался дополнительный внешний фотонейрон (рис.

4б). С частотой менее чем 0,5 % в омматидиях наблюдался дополнительный фотонейрон, по размеру и расположению рабдомера похожий на фотонейрон R(рис. 4д, е). Менее чем в 2 % омматидиев Trl-мутантов рабдомер фотонейрона R7 не выявлялся на одном или нескольких срезах, однако, он чаще всего появлялся на других срезах этой серии. Это свидетельствует о его прерывистости или укорочении.

Впервые у Trl-мутантов выявлено изменение ориентации омматидиев. В норме омматидии ориентированы так, что трапециевидные структуры из рабдомеров R1-R6 располагаются под углом 90°±20° к экватору - условной горизонтальной линии в середине глаза (рис. 5а, б) (Reifegerste, Moses, 1999;

Mirkovic, Mlodzik, 2006). Около 10 % омматидиев мутантов Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85 характеризуются отклонением трапециевидной структуры из рабдомеров R1-R6 более чем на 20° от нормального расположения (Павлова и др., 2010). Данное нарушение продемонстрировано на примере среза глаза мутанта Trl 362/Trl R85 (рис. 5в, г).

Рис. 5. Нарушение ориентации омматидиев в глазах Trl-мутантов. а – срез глаза мухи дикого типа; в - срез глаза мутанта Trl 362/Trl R85; б, г - схемы, изображающие ориентацию омматидиев на срезах.

Линией изображен экватор, относительно которого в дорзальной и вентральной частях глаза омматидии располагаются зеркально. (а, б) В норме трапециевидные структуры из рабдомеров располагаются под углом 90°±20° к горизонтали, отмечены черным. (в, г) У мутантов Trl 362/Trl R85 в некоторых омматидиях трапециевидные структуры из рабдомеров отклоняются от нормального положения, отмечены пунктиром. Кругом обозначен омматидий с нарушением числа рабдомеров.

Иногда наблюдалось сильное отклонение, практически поворот на 180° (рис. 5г), что свидетельствует о нарушении процесса ротации кластера фотонейронов, в норме происходящем в глазо-антеннальном диске (Mirkovic, Mlodzik, 2006).

3.3. Анализ глазо-антеннальных имагинальных дисков Trl-мутантов Для изучения влияния гена Trl на структуру и распределение конусных и пигментных клеток были проанализированы оптические срезы глазоантеннальных имагинальных дисков куколок Trl-мутантов на стадии 42 часа после окукливания. К этому моменту все клетки глаза занимают свои окончательные позиции. В норме в вершине омматидия выявляются 4 конусные клетки, окруженные двумя первичными пигментными клетками одинакового размера (рис. 6а). Вокруг них располагаются 6 вторичных пигментных клеток, образуя гексагональную ячейку. В каждой из шести вершин этой структуры лежит одна третичная пигментная клетка или механо-сенсорная щетинка (Cagan, Ready, 1989).

При анализе дисков гетерозигот Trl 362/Trl R85 и Trl en82/Trl R85 были выявлены как нарушения в количестве всех типов пигментных клеток и щетинок, описанные ранее у Trl-мутантов (Dos-Santos et al., 2008), так и новый тип нарушений – изменение количества и расположения конусных клеток (Павлова и др., 2010).

Часть омматидиев (~ 3 %) анализируемых Trl-мутантов содержит отличное от 4-х количество конусных клеток (табл. 1). Чаше встречались омматидии, в которых было 3 конусные клетки, в некоторых омматидиях их было 2 или 5 (рис.

6д, е). С частотой около 1 % в омматидиях наблюдалось отличное от нормы расположение конусных клеток. Изменялась ориентация контактов между этими клетками и сами контакты, в частности, одна из клеток могла значительно сократить контакт с соседней конусной клеткой (рис. 6ж, з).

Рис. 6. Нарушения количества и расположения конусных и первичных пигментных клеток у гетерозигот Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85. (а) Схема расположения клеток на апикальной поверхности глазо-антеннального имагинального диска 42-х часовых куколок дрозофилы дикого типа. Коричневым цветом отмечены 4 конусные клетки (КК), сиреневым - 2 первичные пигментные клетки (ППК), голубым – вторичные пигментные клетки, желтым – третичные пигментные клетки, зеленым – щетинки. (б-з) Омматидии Trl-мутантов. В них присутствуют:

(б) дополнительная ППК; (в) всего одна ППК; (г) 2 ППК неодинакового размера со смещенными контактами; (д) 3 КК; (e) 5 КК; (ж) 4 КК с измененной ориентацией контактов; (з) 4 КК с нарушением контактов между ними. Окрашивание антителами к белку Armadillo (Arm).

У гетерозигот Trl 362/Trl R85 и Trl en82/Trl R85 около 2 % омматидиев содержат отличное от нормы количество первичных пигментных клеток. Чаще встречались омматидии с тремя такими клетками, иногда – с одной (рис. 6б, в).

В некоторых омматидиях (<0,6 %) первичные пигментные клетки различались по размеру. Это сопровождалось отклонением одного или обоих контактов между этими клетками от нормального расположения (рис. 6г).

У анализируемых Trl -мутантов часто изменено количество и других пигментных клеток (вторичных и третичных), окружающих омматидии (рис. 7).

В норме в области между омматидиями, ограниченной тремя щетинками, лежат 4 пигментные клетки. У гетерозигот Trl 362/Trl R85 и Trl en82/Trl R85 с частотами 43 и 29 %, соответственно, вместо 4 присутствовало 5 или 6 пигментных клеток (просмотрено, соответственно, 277 и 181 область). В норме избыток предшественников этих клеток удаляется апоптозом. По литературным данным у мутантов Trl 13С снижена доля апоптирующих предшественников пигментных клеток (Dos-Santos et al., 2008).

У мутантов Trl 362/Trl R85 и Trl en82/Trl R85 на поверхности глаза наблюдается нарушение распределения щетинок, окружающих омматидии. При анализе глазных дисков 42-часовых куколок было выявлено, что у Trl -мутантов на месте щетинки часто располагается третичная пигментная клетка, а иногда на месте третичной пигментной клетки располагается щетинка (рис. 7в, г).

Таким образом, у гетерозигот Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85, характеризующихся снижением экспрессии гена Trl, выявлены разнообразные дефекты в структуре глаз. Впервые у Trl-мутантов отмечены нарушения количества и расположения фотонейронов и конусных клеток. Вероятно, эти нарушения не были выявлены другими исследователями (Dos-Santos et al., 2008) Рис. 7. Нарушение распределения пигментных клеток и щетинок вокруг омматидиев Trlмутантов. Фотографии оптических срезов верхней поверхности глазо-антеннальных имагинальных дисков 42-х часовых куколок: (а) дикого типа; (в) мутантов Trl en82/Trl R85. Схемы расположения пигментных клеток (ПК) и щетинок в глазо-антеннальных дисках, представленных на фотографиях: (б) в норме; (г) у мутантов. (а, б) В норме между тремя щетинками лежат 3 вторичные ПК и 1 третичная ПК, отмеченные на схеме синим и желтым цветом, соответственно. (в, г) У Trl-мутантов присутствуют дополнительные ПК, на схеме они отмечены красным цветом. У мутантов наблюдаются нарушения в распределении щетинок и третичных ПК. На месте щетинки часто располагается третичная ПК (отмечено широкой стрелкой), а иногда на месте третичной ПК располагается щетинка (черная стрелка). Иногда рядом со щетинкой присутствует дополнительная щетинка (белая стрелка). Окрашивание антителами к белку Arm.

из-за того, что у используемых ими мутантов и мозаиков уровень экспрессии гена Trl снижен меньше, чем у мутантов, исследованных в данной работе. Для мутантов Trl 13С (несущих встройку транспозона P (bluetail) во втором интроне гена) существуют лишь данные о качественном снижение экспрессии гена Trl в яичниках, где дополнительно выявляется и аберрантный транскрипт (Bhat et al., 1996; Катохин и др., 2001). Для аморфной мутации Trl 81.1, полученной с помощью этилметансульфоната (Greenberg, Schedl, 2001), вообще нет данных о вызываемом ею нарушении кртины транскрипции гена Trl. В статье Дос-сантоса и соавторов также нет доказательств полного отсутствия белка GAGA в клетках Trl 81.1/Trl 81.1. Не исключено, что в этих клетках синтезируется некоторое количество белка и/или в них сохраняется белок GAGA, полученный от гетерозиготных клеток-предшественниц.

Большая часть описанных выше нарушений (недостаток конусных и первичных пигментных клеток, изменение количества внешних фотонейронов R1-R6 и фотонейронов R7, избыток вторичных и третичных пигментных клеток и недостаток щетинок вокруг омматидиев) характерна для мутантов по гену lz (Batterham et al., 1996; Crew et al., 1997; Wildonger et al., 2005). Это может говорить о том, что недостаток транскрипционного фактора GAGA сказывается на уровне экспрессии гена lz. В пользу того что, данный ген может являться мишенью белка GAGA, свидетельствует также тот факт, что мутация Trl enбыла выявлена как энхансер проявления фенотипа температуро-чувствительной мутации lz ts1. В то время как у мутантов lz ts1, выращенных при 25С, поверхность глаз практически не отличается от нормы, у мутантов lz ts1;Trl en82/+ при тех же условиях выращивания были отмечены значительные нарушения (М.А. Волошина, персональное сообщение).

4. Взаимодействие генов Trithorax-like и lozenge В данной работе продемонстрировано, что проявление мутации lz ts1 при 25С значительно усиливается на фоне гипоморфных аллелей Trl en82 или Trl 362 в гетерозиготе с нуль-аллелем Trl R85. У «двойных» мутантов lz ts1;Trl 362/Trl R85 и lz ts1;Trl en82/Trl R85 на заднем краю глаза большинство линз имеет ненормальную форму и/или размер (рис. 8б, г, ж, и), тогда как у мутантов lz ts1, выращенных при 25С, так же как у Trl-мутантов, в этом районе лишь некоторые линзы характеризуется такими нарушениями (рис. 3, рис. 8а, е).

Для уточнения того, что именно недостаток белка GAGA приводит к сильному нарушению структуры глаз мутантов lz ts1;Trl 362/Trl R85 и lz ts1;Trl en82/Trl R85, были проведены эксперименты по «спасению фенотипа» данных мутантов. В их геном с помощью генетических скрещиваний были введены две копии трансгена hsp83:Trl-519, обеспечивающего наработку белка GAGA-519 в большинстве клеток дрозофилы при комнатной температуре (Greenberg, Schedl, 2001). Введение трансгенов привело почти к полному восстановлению нормальной поверхности глаз мутантов (рис. 8в, д, з, к) (Павлова, Карагодин, 2009).

Рис. 8. Усиление проявления мутации lz ts1 на фоне мутаций по гену Trl и «спасение фенотипа» мутантов lz ts1/Y;Trl en82/Trl R85 и lz ts1/Y;Trl 362/Trl R85. Фотографии глаз самцов: (а, е) lz ts1/Y; (б, ж) lz ts1/Y;Trl en82/Trl R85; (в, з) lz ts1/Y; 519; Trl en82/Trl R85; (г, и) lz ts1/Y;Trl 362/Trl R85; (д, к) lz ts1/Y; 519;

Trl 362/Trl R85. 519 – трансген hsp83:Trl-519, экспрессирующий белок GAGA-519. (б, ж, г, и) На заднем краю глаз «двойных» мутантов многие линзы имеют ненормальную форму и размер, наблюдаются слитые (белая стрелка) и плохо сформированные линзы (черная стрелка). (в, з, д, к) «Спасение фенотипа» мутантов lz ts1/Y;Trl en82/Trl R85 и lz ts1/Y;Trl 362/Trl R85: введение в их геном двух копий трансгена hsp83:Trl-519 приводит к формированию поверхности глаза, характерной для одиночных мутантов lz ts1. Масштаб: 100 мкм (а–д), 25 мкм (е–к).

Было выявлено, что на фоне мутаций гена Trl происходит усиление фенотипа и другой гипоморфной мутации гена lz - lz К. У «двойных» мутантов lz K/Y;Trl 362/Trl R85 и lz K/Y;Trl en82/Trl R85 значительно уменьшен размер глаза и сильнее изменена поверхность глаза, по сравнению с мутантами по одному из генов. Введение двух копий трансгена hsp83:Trl-519 в геном «двойных» мутантов приводит к формированию глаз, характерных для мутантов lz К.

Для более детального исследования взаимодействия генов Trl и lz был проведен анализ внутренней структуры глаз мутантов lz ts1 и «двойных» мутантов lz ts1;Trl 362/Trl R85 и lz ts1;Trl en82/Trl R85.

4.1. Анализ внутренней структуры глаз у lz ts1 и «двойных» мутантов lz ts1;Trl 362/Trl R85 и lz ts1;Trl en82/Trl RВ литературе не было детального описания внутренней структуры глаз «слабых» lz-мутантов, в том числе, и мутантов lz ts1, развивающихся при 25С. В результате данной работы у этих мутантов были выявлены те же нарушения, что и у Trl-мутантов (табл. 1) (Павлова, Карагодин, 2009). Нарушение ориентации омматидиев и наличие дополнительных первичных пигментных клеток для lzмутантов были выявлены впервые. По-видимому, у исследованных «сильных» мутантов по гену lz данные нарушения маскируется другими, более явными дефектами.

У «двойных» мутантов lz ts1;Trl 362/Trl R85 и lz ts1;Trl en82/Trl R85 встречаемость большей части структурных нарушений омматидия оказалась достоверно выше, чем у lz ts1- и Trl-мутантов (табл. 1). Исключением стали такие нарушения, как избыток фотонейронов R1-R6 и наличие дополнительного фотонейрона R7. К наиболее ярким нарушениям относятся: изменение ориентации омматидия (2535 %); уменьшение количества конусных клеток (19-23 %); недостаток числа внешних фотонейронов R1-R6 (7-12 %); изменение непрерывности или длинны рабдомера фотонейрона R7 (4-8 %).

Наличие генетического взаимодействия между генами lz и Trl может свидетельствовать о том, что белок GAGA участвует в регуляции экспрессии гена lz. Для проверки данного предположения был проведен анализ экспрессии гена lozenge у Trl-мутантов.

Таблица 1. Нарушения внутренней структуры глаз мутантов по генам lz и Trl Встречаемость нарушений у мух следующих генотипов, (%) Тип нарушения +/Y; +/Y; lz ts1/Y; lz ts1/Y; lz ts1/Y;

Trl 362/Trl R85 Trl en82/Trl R85 Trl 362/Trl R85 Trl en82/Trl R85 +/+ Недостаток внешних 0,8±0,1,7±0,4aaa 0,9±0,3bbb 5,0±0,9ссс 12,1±1,6ddd фотонейронов Избыток внешних 0,7±0,4 1,2±0,5 0±0,0,2±0,1a 0,7±0,3bbb фотонейронов Дополнительный 0,1±0,1 1,1±0,4 0,1±0,0,5±0,2aa 3,3±0,9ddd фотонейрон RОтсутствие рабдомера R7 на 0,4±0,0,4±0,2aa 2,2±0,5bbb 3,9±0,8ссс 7,6±1,3ddd срезе Изменена ориентация 9,1±1,11,7±1,0aaa 7,3±1,0bbb 25,6±2,2ссс 35,7±3,0ddd омматидия Просмотрено омматидиев (глаз) у имаго на срезах:

1107 (7) 967 (5) 561 (5) 422 (6) 762 (4) Уменьшено число 2,0±0,4,3±0,4aaa 2,6±0,3bbb 23,1±1,3ссс 19,0±0,8ddd конусных клеток Изменена ориентация контактов между 2,4±0,0,8±0,2aaa 0,4±0,1bbb 11,2±1,0ссс 4,4±0,4ddd конусными клетками Нарушены контакты между 0,2±0,1 0,4±0,1 0,6±0,8,4±0,8ссс 3,0±0,4ddd конусными клетками Изменено количество первичных 0,6±0,2,4±0,3aaa 1,4±0,2bbb 7,7±0,8ссс 3,0±0,4ddd пигментных клеток Изменен размер первичных 1,4±0,0,6±0,2aaa 0,2±0,1b 5,9±0,7ссс 3,1±0,4ddd пигментных клеток Просмотрено омматидиев (дисков) куколок:

2679 (16) 2841 (12) 1094 (9) 2354 (15) 2085 (11) Примечание. У мух Oregon R (контроль) нарушения количества и расположения фотонейронов не выявлены (просмотрено 905 омматидиев, 5 глаз). У них наблюдались лишь изменение контактов между конусными клетками (0,2±0,1 %) и изменение количества первичных пигментных клеток (0,3±0,2 %) (просмотрено 1027 омматидиев, дисков). Показана достоверность различий между частотами нарушений: (a) у мутантов Trl 362/Trl R85 и у мух Oregon R; (b) у мутантов Trl en82/Trl R85 и у мух Oregon R; (c) у мутантов lz ts1/Y; Trl 362/Trl R85 и lz ts1/Y; (d) у мутантов lz ts1/Y;Trl en82/Trl R85 и lz ts1/Y.

Достоверность различий определялась с помощью критерия Фишера. aaa - Р>0,999;

aa - Р>0,99; a - Р> 0,95. Аналогично для b, c, d.

4.2. Анализ экспрессии гена lozenge у гетерозигот Trl 362/Trl R85 и Trl en82/Trl RДля анализа экспрессии гена lz в глазо-антеннальных имагинальных дисках Trl-мутантов были использованы Нозерн-блот-гибридизация, ОТ-ПЦР и Вестерн-блот-анализ. Чувствительности первых двух методов в нашем случае оказалось недостаточно для выявления продуктов гена lz. Методом Вестернблот-гибридизации удалось сравнить количество белка Lz в имагинальных дисках белых предкуколок мух дикого типа и мутантов по гену Trl. Было установлено, что у мутантов Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85 относительное количество белка Lz снижено до уровня 50 и 80 % от нормы, соответственно (рис. 9). Как видно на приведенной фотографии, белок Lz в клетках глазоантеннальных имагинальных дисков представлен в виде двух основных изоформ. Молекулярный вес этих изоформ, определенный нами по электрофоретической подвижности, составляет приблизительно 75 и 82 кДа, эти значения близки к предсказанному молекулярному весу двух известных изоформ белка Lz (73.2 и 84.7 кДа).

Рис. 9. Результаты иммуно-блот гибридизации антител против белка Lz с белковыми экстрактами из глазо-антеннальных имагинальных дисков предкуколок дрозофилы следующих генотипов: OregonR, Trl en82/Trl R85 и Trl362/TrlR85. Отмечено положение белка BSA, молекулярный вес которого составляет 66 кДа. Во всех образцах выявляется по два сигнала, соответствующие двум известным изоформам белка Lz. Внизу представлена гибридизация этого же блота с антителами против белка -Tub, используемого в качестве внутреннего контроля.

Таким образом, у Trl-мутанов, характеризующихся снижением экспрессии гена Trl в развивающемся глазу, выявлено значительное снижение количества белка Lz.

Это свидетельствует о том, что в норме транскрипционный фактор GAGA вовлечен в положительную регуляцию экспрессии гена lz.

5. Генетическое взаимодействие генов Trl и BarHВероятно, действие белка GAGA в развитии глаза может также заключаться и в негативной регуляции экспрессии гена BarH1. Об этом свидетельствует усиление эффекта, вызываемого сверхэкспрессией данного гена - дупликацией B1, на фоне Trl-мутации. Глаз гетерозигот B1/+ содержит в среднем 3омматидиев, что примерно вдвое меньше, чем в норме. У мух, гомозиготных или гемизиготных по мутации В1, формируется узкий глаз, уменьшенный в переднезаднем направлении, состоящий из ~ 90 омматидиев (Kojima et al., 1991). Глаза дигетерозигот В1/+;Trl 362/Trl R85 и В1/+;Trl en82/Trl R85 по форме и размеру такие же, что и у гомозигот B1. Кроме уменьшения размера глаза, у дигетерозигот почти полностью отсутствуют щетинки, в норме располагающиеся вокруг омматидиев, что отличает их от глаз мутантов B1 (рис. 10).

Фенотип мутантов B1 связан c замедлением и остановкой продвижения морфогенетической бороздки - своеобразной подвижной границей между Рис. 10. Усиление проявления мутантного фенотипа дупликации Bгена BarH1 на фоне мутаций по гену Trl. (а) Глаз самки B1/+. (б) Глаз самки B1/B1. (в) Глаз самки B1/+;

Trl en82/Trl R85. Масштаб: 100 мкм.

недифференцированными клетками глазного диска и формирующимися омматидиями (Kojima et al., 1991). Об участии белка GAGA в контроле продвижения морфогенетической бороздки посредством подавления экспрессии гена BarH1 либо посредством регуляции экспрессии других генов, задействованных в данном процессе, может свидетельствовать нарушение формирования регулярных рядов омматидиев, наблюдаемые нами у Trlмутантов.

6. Анализ связывания рекомбинантного белка GAGA с последовательностями в 5’-областях генов lz и BarHВ 5’-областях генов lz и BarH1 нами были выявлены потенциальные сайты связывания белка GAGA, что может быть свидетельством того, что уровень экспрессии этих генов напрямую регулируется данным белком. Консенсусным сайтом для белка GAGA является последовательность GAGAG (Omichinski et al., 1997). В 5’-области гена lz был обнаружен GA-богатый участок — agaaGAGcaaGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG, расположенный в районе -281 — 251 п.н. относительно старта транскрипции гена. В 5’-области гена BarHвыявлен сайт gaaaccgggGAGAGACtttatttca, расположенный в районе -319 — -2п.н. относительно старта транскрипции данного гена. Методом задержки ДНКзонда в геле было подтверждено связывание рекомбинантного белка GAGA с данными последовательностями (рис. 11).

Заключение Снижение экспрессии гена lz на фоне недостатка продуктов гена Trl и результаты in vitro связывания белка GAGA с сайтом из 5’-области гена lz говорят о возможности непосредственного участия GAGA-белка в активации данного гена. Мы полагаем, что снижение количества белка Lz является основной причиной изменений структуры глаз Trl-мутантов. В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что многие нарушения в глазах Trl- Рис. 11. Связывание рекомбинантного белка GAGA с олигонуклеотидами: (1) 5’-ttGGCATAGAGAGGGAGAGAGGCGTCA-3’, включающим сайт из района bxd гена Ultrabithorax - положительный контроль (Horard et al., 2000); (2) (TTTG)6 - отрицательный контроль;

(3) 5’-ttAGAAGAGCAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-3’, включающим сайт из 5’-области гена lz;

(4) 5’-ttGAAACCGGGGAGAGACTTTATTTCA-3’, включающим сайт из 5’-области гена BarH1.

мутантов и мутантов lz ts1 схожи и значительно усиливаются у «двойных» мутантов. Снижение количества транскрипционного фактора Lz может сказываться на картине экспрессии ряда генов, задействованных в формировании глаза. К таким генам относятся sparkling, prospero, seven-up и BarH1, кодирующие транскрипционные факторы (Daga et al., 1996; Flores et al., 2000; Xu et al., 2000). Недостаток белка Lz может также влиять на действие EGFR/Ras1-сигнального пути, поскольку данный белок взаимодействует с его ядерным эффектором – транскрипционным фактором Pointed, и активирует в некоторых клетках гены argos и klumpfuss, кодирующие негативные регуляторы данного каскада (Behan et al., 2005; Wildonger et al., 2005). Известно, что EGFR/Ras1-каскад задействован в запуске дифференцировки фотонейронов, конусных и пигментных клеток, в установлении ориентации омматидия, а также в блокировке клеточной смерти (Freeman, 1997; Bergmann et al., 1998; Gaengel et al., 2003).

Еще одним геном-мишенью белка GAGA, участвующим в развитии глаза, по-видимому, является ген BarH1, на что указывает наличие генетического взаимодействия между генами Trl и BarH1, а также связывание рекомбинантного белка GAGA с сайтом в 5’-области гена BarH1.

ВЫВОДЫ 1) Проведен молекулярно-генетический анализ новой гипоморфной мутации гена Trithorax-like – аллеля Trl en82. Установлено, что данная мутация обусловлена встройкой делеционного варианта Р-элемента размером 1,т.п.н. в 5’-некодирующую область гена Trl и делецией 6 п.н. в шестом экзоне гена. Делеция удаляет два глутаминовых кодона в последовательности, кодирующей глутамин-богатый домен изоформы белка GAGA-581.

2) Выявлено снижение экспрессии гена Trl в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозго-вентральных ганглиях у гетерозигот Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85. Относительное количество транскриптов у этих мутантов в 2,5-3 раза меньше, чем в норме.

3) Впервые показано, что ген Trl задействован в контроле формирования фотонейронов и конусных клеток омматидия, в установлении ориентации омматидиев и в формировании рядов омматидиев.

4) Выявлено взаимодействие гена Trl c генами lz и BarH1 в процессе формирования глаза:

а) на фоне мутаций гена Trl усиливается проявление мутаций генов lz и BarH1, влияющих на структуру поверхности глаза, а также на его размер и форму;

б) у мутантов lz ts1;Trl en82/Trl R85 и lz ts1;Trl 362/Trl R85, по сравнению с lz ts1- и Trl-мутантами, значительно выше доля омматидиев с меньшим количеством фотонейронов или конусных клеток, а также омматидиев с измененной ориентацией.

5) Обнаружено, что на фоне снижения экспрессии гена Trl происходит снижение количества белка Lz в глазо-антеннальных имагинальных дисках 0-часовых предкуколок гетерозигот Trl en82/Trl R85 и Trl 362/Trl R85.

6) Установлено, что рекомбинантный белок GAGA in vitro связывается c сайтами, выявленными в 5’-областях генов lz и BarH1.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Огиенко А.А., Карагодин Д.А., Павлова (Баттулина) Н.В., Федорова С.А., Волошина М.А., Баричева Э.М. Молекулярно-генетическая характеристика новой гипоморфной мутации гена Trithorax–like и анализ ее влияния на оогенез Drosophila melanogaster // Онтогенез. 2008. Т. 39. № 2. C. 134-142.

2. Павлова Н.В., Карагодин Д.А., Байбородин С.И., Баричева Э.М. Анализ структуры глаза мутантов по гену Trithorax–like Drosophila melanogaster // Информационный вестник ВОГиС. 2010. Т. 14. № 3. C. 558-568.

3. Омелина Е.С., Павлова Н.В., Огиенко А.А., Баричева Э.М. Для формирования дорзальных выростов хориона Drosophila melanogaster требуется белок GAGA // Доклады Академии наук. 2011. Т. 436. № 5. С.

696-698.

4. Павлова Н.В. Молекулярно-генетическая характеристика нового гипоморфного аллеля гена Trithorax–like Drosophila melanogaster и анализ его взаимодействия с геном lozenge // Материалы XLIV международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология / Новосибирск: Новосибирский государственный университет. 2006. C. 132.

5. Павлова Н.В., Карагодин Д.А. Анализ влияния нового гипоморфного аллеля гена Trithorax–like (Trl en82) на структуру глаза и оогенез Drosophila melanogaster // Проблемы молекулярной и клеточной биологии: Сб. матер.

Международной молодежной научно-методической конференции. 9-мая 2007 г. / Томск: Томский государственный университет. 2007. с. 135.

6. Павлова Н.В., Карагодин Д.А. Анализ влияния мутаций по гену Trithorax–like на формирование глаза Drosophila melanogaster // V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 21-28 июня 2009. Часть II. М.: ИОГен им. Н.И. Вавилова. C. 381.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.