WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

федеральное государственное бюджетное учреждение науки

институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

российской академии наук

На правах рукописи

 

Смирнова Ольга Александровна

Влияние белков вируса гепатита С на РЕГУЛЯЦИЮ окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминов

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва

2012

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Научный руководитель:

Старший научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук, кандидат химических наук А.В. Иванов

Официальные оппоненты:

Заведующий Лабораторией иммунорегуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук, доктор биологических наук, профессор Д.В.Купраш

       

Заведующий Лабораторией биоэнергетики клетки Научно-исследовательского Института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова доктор биологических наук Б.В.Черняк

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

Защита диссертации состоится  ____________ 2012 года в ____  час. на заседании

Диссертационного совета Д 002.235.01  при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки  Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан _________________ 2012 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Кандидат химических наук А.М. Крицын

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Вирус гепатита С (ВГС) вызывает одно из наиболее распространенных и опасных заболеваний человека. По данным ВОЗ этим вирусом инфицировано около 170 млн человек. Геном ВГС представляет собой (+)-цепь РНК, содержащую одну рамку считывания, кодирующую единственный полипротеин. В результате его процессинга образуется четыре структурных (белок капсида (C), гликопротеины Е1 и Е2, белок р7) и шесть неструктурных белков (протеиназы NS2 и NS3, РНК-зависимая РНК-полимераза NS5B, регуляторные белки NS4A, NS4B и NS5A). У 80% инфицированных ВГС заболевание переходит в хроническую форму и характеризуется высоким риском развития тяжелых патологий печени, таких как цирроз, фиброз и гепатоклеточная карцинома, а также способствует развитию у больных заболеваний крови (криоглобулинемия и неходжскинская лимфома), почек (глорумелонефрит) и иммунной системы (диабет). В настоящее время терапия хронического гепатита С основана на применении интерферона альфа комбинации с рибавирином, однако данный вид лечения малоэффективен - не более 40% инфицированных ВГС отвечает на терапию. В 2011 г в клиническую практику было введено два ингибитора протеиназы, применение которых в сочетании с интерфероном и рибавиринов позволило повысить эффективность терапии. К настоящему моменту несколько ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы и протеиназы NS3 вируса находятся на последних стадиях клинических испытаний. Стоит подчеркнуть, что все эти лекарственные препараты направлены на борьбу непосредственно с вирусом гепатита С, но не на терапию тяжелых патологий, характерных для хронического гепатита С.

В настоящее время одной из возможных причин развития тяжелых сопутствующих заболеваний, характерных для хронического гепатита С, считается окислительный стресс (ОС). Известно, что ВГС вызывает ОС в инфицированной клетке, что может являться причиной трансформации гепатоцитов. Точный механизм возникновения окислительного стресса при инфекции ВГС до сих пор не выяснен, вклад в этот процесс индивидуальных вирусных белков также не изучен. Несмотря на то, что за последние годы появилось много данных, свидетельствующих о связи ряда вирусных заболеваний с ОС, влияние соответствующих вирусов на систему защиты от стресса до сих пор мало изучено. В связи с этим изучение влияния ВГС и его белков на систему защиты клетки от окислительного стресса, а также более детальное изучение механизмов возникновения последнего и ответа на него представляет собой актуальную задачу.

Биогенные полиамины спермин (Spm), спермидин (Spd) и их предшественник путресцин (Put) присутствуют в клетках в миллимолярных и субмиллимолярных концентрациях и выполняют различные функции, в том числе участвуют в защите клетки от окислительного стресса. Однако о влиянии последнего на метаболизм полиаминов известно мало, а взаимосвязь между инфекцией ВГС и метаболизмом биогенных полиаминов, а также активностями ферментов-регуляторов этого метаболизма ранее вообще не рассматривалась. Соответственно, исследование этих вопросов также представляется весьма актуальным.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение влияния белков вируса гепатита С на регуляцию окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминов. Для достижения данной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

  1. Оценить вклад индивидуальных белков ВГС в индукцию окислительного стресса и изучить механизмы возникновения последнего при экспрессии белков, влияющих на эту индукцию в наибольшей степени.
  2. Выявить белки ВГС, активирующие систему защиты клетки от окислительного стресса, и рассмотреть детальные механизмы активации этой системы при экспрессии данных белков.
  3. Изучить влияние экспрессии белков ВГС на метаболизм биогенных полиаминов.
  4. Оценить возможность применения регуляторов метаболизма полиаминов для подавления репликации РНК ВГС в клеточных системах.

Научная новизна и практическое значение работы.

В работе показано, что белки NS5A, NS4B, E1, E2, а также белок капсида ВГС вызывают окислительный стресс в клетках гепатомы человека Huh7, и последний является наиболее активным индуктором стресса. Впервые продемонстрировано, что N-концевой домен белка капсида активирует экспрессию NADPH-оксидаз, что приводит к усилению продукции супероксид-радикала, тогда как его C-концевой домен 37-191 вызывает активацию экспрессии цитохрома Р450 2Е1 (CYP 2E1) и оксидоредуктина эндоплазматического ретикулума (Ero1) – источников супероксид-радикала и пероксида водорода, соответственно.

Установлено, что белки, E1, E2, NS4B, NS5A и белок капсида активируют систему защиты клетки (Nrf2/ARE каскад) от активных форм кислорода (АФК) по нескольким независимым механизмам. Все эти белки вызывают усиленную экспрессию «ферментов II фазы защиты» путем фосфорилирования фактора транскрипции Nrf2 протеинкиназой С (PKC) по АФК-зависимому механизму. Белок капсида и белок NS5A способны также активировать фактор Nrf2 по механизму, не зависящему от концентрации АФК, при участии фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и казеинкиназы 2 (CK2). Наиболее активным регулятором Nrf2/ARE каскада также является белок капсида, N-концевой домен которого отвечает за индукцию АФК-независимого, а С-концевой – АФК-зависимого механизмов активации системы защиты клетки от окислительного стресса.

Продемонстрировано, что в клетках гепатомы человека Huh7 окислительный стресс, вызванный химическими агентами, приводит к повышению уровней биогенных полиаминов Spm и Spd вследствие усиления экспрессии орнитиндекарбоксилазы (ODC) и спермидин/спермин-N1-ацетилтрансферазы (SSAT), опосредованного факторами транскрипции Nrf2 и NF-kB. ОС, вызванный белком NS5A и белком капсида вируса гепатита С, также вызывает активацию транскрипции генов ODC и SSAT, что, однако, сопровождается снижением активности кодируемых ими ферментов и падением уровня полиаминов.

Впервые показано, что клетки Huh7, несущие полноразмерный репликон ВГС, обладают пониженным уровнем биогенных полиаминов и активностей ферментов их метаболизма, а повышение концентрации спермина и спермидина при помощи низкомолекулярных соединений приводит к ингибированию репликации ВГС и снижению уровня геномной РНК вируса.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 16th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses (Nice, France. October 2009), 17th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses (Pacifico Yokohama, Japan, September 2010), VIII Annual Conference of New Visby Network on Hepatitis C (Vilnius, Lithuania, February 2011), Polyamine Gordon Research Conference (Waterville Valley, New Hampshire, USA, June 2011), 18th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses (Seattle, Washington, USA, September 2011), IX Annual Conference of New Visby Network on Hepatitis C (St. Petersburg, Russia, April 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах и 5 тезисов докладов в материалах конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на _____ страницах,  состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего _____источников. Материал иллюстрирован _____рисунками и _____таблицами.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант 10-04-00047а), гранта Президента Российской Федерации (МК-5035.2011.4), Государственного контракта №11.519.11.2017 в рамках Федеральной Целевой Программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы» и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология». Часть экспериментов проводилась при использовании оборудования ЦКП «Геном» (ИМБ РАН).

Список использованных сокращений

ВГС

Вирус гепатита С

ОС

Окислительный стресс

Spm

Спермин

Spd

Спермидин

Put

Путресцин

АФК

Активные формы кислорода

ODC

Орнитиндекарбоксилаза

SSAT

Спермидин/спермин-N1-ацетилтрансфераза

tBHQ

Трет-бутилгидрохинон

Tm

Туникамицин

PDTC

Пирролидиндитиокарбамат

DCFHDA

Диацетат 2’,7’-дихлорфлуоресцеин

DHE

Дигидроэтидий

NOX

NADPH-оксидаза

TGF

Трансформирующий фактор роста бета

COX-2

Циклооксигеназа 2

Ero

Оксидоредуктин эндоплазматического ретикулума

Nqo1

NAD(P)H:хиноноксидоредуктаза 1 человека

HO1

Гемоксигеназа 1 человека

ARE

Antioxidant Response Element

PRE

Polyamine Response Element

PKC

Протеинкиназа С

PI3K

Фосфоинозитид-3-киназа

CK2

Казеинкиназа 2

Основное содержание работы

Влияние белков гепатита С на индукцию окислительного стресса

Репликация ВГС или экспрессия некоторых его белков (капсида и белка NS5A)  вызывает ОС (Mitsuyoshi, Itoh et al. 2008) по крайней мере по двум параллельным механизмам. Один из них связан с повышением концентраций Са2+ в цитоплазме и митохондриях, что способствует накоплению в клетке активных форм кислорода (Gong, Waris et al. 2001). Другой механизм заключается в активации NADPH-оксидаз 1 и 4 (NOX 1 и 4) – белков, вырабатывающих супероксид-радикал (Boudreau, Emerson et al. 2009). Оба эти механизма связаны в первую очередь с белком капсида и белком NS5A. Предполагается, что в ВГС-инфицированной клетке существуют и иные, пока не выявленные, источники АФК.

Для исследования вклада отдельных белков ВГС в возникновение окислительного стресса нами были сконструированы плазмиды, экспрессирующие каждый из десяти белков ВГС в эукариотических клетках. Все эксперименты проводились в культуре клеток гепатомы человека Huh7 – единственной клеточной культуре, поддерживающей репликацию ВГС. Оценка уровня экспрессии с помощью иммуноблоттинга показала, что белки начинают синтезироваться примерно через 18 ч после трансфекции. Как видно, белок капсида накапливался в клетках в значительно меньшем количестве, чем белки NS5A и NS5B (рис.1А).

Окислительный стресс детектировали, обрабатывая клетки флуоресцентными красителями DCFHDA или DHE. Как видно из рис. 1Б, после трансфекции плазмидами, кодирующими индивидуальные белки ВГС, рост концентрации АФК начинается через 16-18 ч, что совпадает с временем, при котором детектируются индивидуальные белки вируса. Установлено, что белки р7, NS2, NS3, NS4A и NS5B не изменяют уровень АФК в клетке, в то время как экспрессия белка капсида, гликопротеинов Е1 и Е2, а также белков NS4B и NS5A вызывает ОС (Рис. 2А, Б).

Рис. 2. Влияние транзиторной экспрессии белков ВГС на накопление АФК в клетке. (А) Уровень АФК при экспрессии в клетке белков ВГС или обработке клеток 100 мкM tBHQ или 1 мкг/мл Tm через 18 ч после трансфекции. Данные приведены по результатам трех экспериментов, *p<0,05 по сравнению с клетками Huh7, трансфицированными вектором pcDNA3.1(+) и обработанными диметилсульфоксидом. (Б) Специфичность красителя DCFHDA в отношении АФК была подтверждена обработкой клеток 40 мкМ антиоксиданта пирролидиндитиокарбамата (PDTC), приводящей к практически полному исчезновению флуоресценции.

Несмотря на то, что в клетке белка капсида синтезируется в 6-7 раз меньше других белков ВГС, вызывающих ОС, экспрессия этого белка приводит к тому же уровню АФК. Следовательно, белок капсида обладает максимальной способностью активировать продукцию АФК и вносит основной вклад в возникновение ОС при ВГС-инфекции.

Выявление доменов белка капсида ВГС, отвечающих за индукцию окислительного стресса в клетках и активацию ключевых АФК-продуцирующих ферментов

Как указано выше, основной вклад в индукцию окислительного стресса среди всех белков ВГС вносит белок капсида. Для анализа механизмов возникновения стресса были картированы домены белка, отвечающие за нарушение окислительно-восстановительного потенциала в клетке. Для этого нами был сконструирован набор фрагментов белка капсида ВГС. Полноразмерный белок капсида состоит из 191 а.о., и полученная нами панель состояла из форм белка, усеченных с С-конца или N-конца полипептидной цепи. Анализ внутриклеточной локализации этих форм методом конфокальной микроскопии показал, что фрагменты белка капсида, не содержащие С-концевого гидрофобного участка (152-191 а.о.), имеют преимущественно ядерную локализацию, тогда как содержащие этот участок формы локализованы в цитоплазме.

Анализ роли индивидуальных фрагментов белка капсида ВГС в индукции окислительного стресса был проведен при помощи низкомолекулярных флуоресцентных красителей АФК, а также генетически-кодируемого биосенсора пероксида водорода. В качестве низкоспецифичного красителя, детектирующего большинство АФК, использовали DCFHDA, для детекции супероксид-радикала использовали краситель DHE. При помощи красителя DCFHDA было показано, что как N-, так и С-концевые фрагменты белка вызывают накопление АФК в клетке (Рис. 3А). Применение DHE в аналогичном эксперименте подтвердило, что как фрагмент 1-36 а.о., так и 37-191 а.о. усиливают продукцию супероксид-радикала (Рис. 3Б). Анализ уровня пероксида водорода был проведен при помощи белка HyPer, представляющего собой вариант желтого флуоресцентного белка, уровень флуоресценции которого зависит от количества H2O2 в клетке. Было установлено, что полноразмерный белок капсида ВГС действительно вызывает повышение уровня пероксида водорода, причем это его свойство связано с аминокислотными остатками 37-191 (Рис. 3В). Следует подчеркнуть, что использование вариантов белка HyPer, имеющих цитоплазматическую или митохондриальную локализацию, выявило, что повышение уровня H2O2 наблюдается в основном в цитоплазме (Рис. 3В), в то время как в митохондриях оно менее выражено (данные не приведены). Таким образом, можно предположить как наличие нескольких независимых механизмов возникновения окислительного стресса белком капсида ВГС, так и существование нескольких различных источников АФК.

Рис. 3. Влияние транзиторной экспрессии фрагментов белка капсида на накопление в клетке перекиси водорода и супероксид-радикала. Уровень АФК при экспрессии фрагментов белка капсида или обработке клеток 100 мкМ tBHQ через 18 ч после трансфекции, измеренный (А) с помощью DCFHDA - неспецифического флуоресцентного красителя АФК, (Б) DHE - красителя супероксид-радикала или (В) белка HyPer-cyto - сенсора перекиси водорода в цитоплазме. Данные приведены по результатам трех экспериментов, *p<0,05 по сравнению с клетками Huh7, трансфицированными вектором pVax1, #p>0,05 (капсид(1-36) по сравнению с NS5B).

В эукариотических клетках существуют различные источники АФК, в т.ч. органеллы (митохондрии, пероксисомы) и ферменты (NADPH-окcидазы (NOX) и другие) (Bedard and Krause 2007). NADPH-окcидазы являются источником супероксид-радикала (Ago, Kitazono et al. 2004); усиление экспрессии ряда их изоформ (NOX1 и NOX4) может сопровождаться развитием различных патологий, в т.ч. фиброза печени (Paik, Iwaisako et al. 2011), рака мочевого пузыря (Shimada, Fujii et al. 2011) и др. В литературе имеются сообщения об активации этой группы ферментов в клетках, инфицированных ВГС (de Mochel, Seronello et al. 2010). Одной из целей нашей работы стало установление роли белка капсида и его индивидуальных доменов в регуляции экспрессии NADPH-оксидаз NOX1 и NOX4. Было показано, что экспрессия в клетках полноразмерного белка капсида или его фрагментов, содержащих первые 36 а.о. с N-конца, вызывает активацию транскрипции генов NOX1 и NOX4, в то время как белок, лишенный этого домена, не вызывает изменений в уровне их транскрипции (Рис. 4 А,Б). Мы также обнаружили, что N-концевой домен белка капсида активирует и транскрипцию генов трансформирующего фактора роста β (TGFβ) и циклооксигеназы 2 (COX-2) (Рис. 4 В,Г) – белков, экспрессия которых повышена при ВГС-инфекции и которые, по ряду данных, являются регуляторами экспрессии NADPH-оксидаз (Sancho, Martin-Sanz et al. 2011). Наконец, нами было продемонстрировано, что подавление активации NOX1 и NOX4 при помощи коротких интерферирующих РНК ослабляет продукцию АФК, в т.ч. супероксид-радикала (примерно на 30-45%) в клетках, экспрессирующих белок капсида.

Рис. 4. Накопление супероксид-радикала при экспрессии фрагмента 1-36 а.о. белка капсида сопровождается активацией экспрессии NADPH-оксидаз 1 и 4. (А-Г) Уровни мРНК NOX1 (A), NOX4 (Б), TGFβ1 (В) и COX-2 (Г) в клетках, экспрессирующих белок капсида или его фрагменты, измеренные методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Данные приведены по результатам трех экспериментов, * p <0,01 по сравнению с клетками Huh7, трансфицированными вектором pVax1.

Другим возможным источником супероксид-радикала могут выступать цитохромы Р450, в т.ч. изоформа 2Е1 (CYP 2E1), локализованная в эндоплазматическом ретикулуме. Известно, что у больных ВГС уровень экспрессии этой изоформы цитохрома повышен (Gochee, Jonsson, 2003). В нашей работе было установлено, что полноразмерный белок капсида ВГС, а также его С-концевой фрагмент (37-191 а.о.) вызывают усиление экспрессии CYP 2E1 (Рис. 5А). Подавление активности данного цитохрома в клетках, экспрессирующих белок капсида, при помощи ингибитора фермента 4-метилпиразола (4-MP) привело к двукратному снижению уровня супероксид-радикала, что подтвердило участие данного фермента в индукции ОС.

Возможным источником пероксида водорода вне митохондрий могут быть оксидоредуктины (Ero1 и β), локализованные в эндоплазматическом ретикулуме и участвующие в фолдинге белков (Molteni, Fassio, 2004). Оценка уровней транскрипции генов оксидоредуктинов в клетках, экспрессирующих белок капсида ВГС, выявило резкое повышение количества мРНК белка Ero1 (5Б) и, в меньшей степени, Ero1β (Рис 5В). Сходное повышение наблюдалось и при экспрессии С-концевого фрагмента вирусного белка, который, как было показано выше, вызывает усиление продукции H2O2. Таким образом, оксидоредуктины Ero1 и, возможно, Ero1β, являются потенциальными источниками пероксида водорода в ВГС-инфицированных клетках.

Рис. 5. Накопление супероксид-радикала и перекиси водорода в клетках, экспрессирующих фрагмент 37-191 а.о. сопровождается активацией цитохрома Р450 2Е1 и оксидоредуктинов 1α и 1β. Уровни мРНК CYP 2E1 (A), Ero1α (Б) и Ero1β (В) в клетках, экспрессирующих белок капсида или его фрагменты, измеренные методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Данные приведены по результатам трех экспериментов, * p <0,01 по сравнению с клетками Huh7, трансфицированными вектором pVax1.

Анализ состояния системы защиты клетки от окислительного стресса при экспрессии индивидуальных белков ВГС

В эукариотических клетках АФК нейтрализуются низкомолекулярными соединениями – антиоксидантами, а также т.н. «ферментами II фазы защиты» (Aleksunes and Manautou 2007). Экспрессия «ферментов II фазы защиты» и ферментов метаболизма антиоксидантов регулируется общим фактором транскрипции Nrf2, который способен узнавать консервативную последовательность ARE (Antioxidant Response Element) в промоторной области генов соответствующих ферментов. В отсутствие стресса фактор Nrf2 удерживается в цитоплазме белком-партнером Keap1, а при повышении уровня АФК Nrf2 подвергается фосфорилированию, что вызывает его транслокацию в ядро и последующее связывание с ARE-последовательностями в ДНК (Motohashi and Yamamoto 2004).

Нами был проведен анализ влияния индивидуальных белков ВГС на Nrf2/ARE каскад. На начальной стадии исследования в качестве инструмента использовали репортерные плазмиды, кодирующие люциферазу под контролем промотора SV40 с минимальным ARE-элементом гена фермента II фазы защиты -  NAD(P)H:хиноноксидоредуктазы 1 человека (Nqo1) или под контролем полноразмерных промоторов Nqo1 или гемоксигеназы 1 (HO1). Ко-трансфекция репортерной плазмиды pARE-Luc с плазмидами, экспрессирующими индивидуальные белки ВГС, показала, что белок капсида, гликопротеины Е1 и Е2, а также неструктурные белки NS4B и NS5A усиливают ARE-зависимую экспрессию люциферазы (Рис. 6А). Экспрессия в клетке белка NS3 приводила к незначительной активации ARE-зависимой транскрипции, а экспрессия других белков ВГС вовсе не вызывала изменений.

Рис. 6. Экспрессия в клетке белков, Е1, Е2, NS4B, NS5A и белка капсида приводит к активации системы защиты клетки от окислительного стресса. (А, Б) Уровень экспрессии люциферазы под контролем минимального ARE-элемента (А) или полноразмерных промоторов Nqo1 и HO1 (Б) в клетках, экспрессирующих белки ВГС. Данные приведены по результатам трех экспериментов, *<0,01 по сравнению с клетками Huh7, трансфицированными вектором pcDNA3.1(+) и обработанными DMSO. (В) Анализ уровня мРНК Nqo1 и HO1 в клетках, экспрессирующих белки ВГС, методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Данные приведены по результатам трех экспериментов. (Г) Иммуноблоттинг лизатов клеток, экспрессирующих белки ВГС.

Изучение кинетики экспрессии люциферазы показало, что активация промотора начинается через 18 ч и достигает максимума примерно через 28-30 ч после трансфекции (Рис. 1В), что совпадает с кинетикой экспрессии белков ВГС (Рис. 1А), а также с кинетикой накопления АФК в клетке (Рис. 1Б).

Экспрессия белков Е1, Е2, NS4B, NS5A и белка капсида усиливает транскрипцию мРНК ряда Nrf2-зависимых генов (Nqo1 и HO1) (Рис. 6В), что приводит к накоплению в клетке соответствующих белков (Рис. 6Г). Таким образом, эти белки ВГС способны не только вызывать ОС, но и активировать систему защиты от этого стресса.

Механизм активации ARE/Nrf2 каскада в клетках, экспрессирующих белки ВГС

Следующим шагом работы было исследование механизмов активации ответа на ОС в клетках, экспрессирующих индивидуальные белки ВГС. Соответственно, вначале нами была проведена оценка роли АФК в этом процессе. Так, клетки Huh7, ко-трансфицированные репортерной плазмидой pARE-Luc и «пустым» вектором pcDNA3.1(+) и дополнительно обработанные tBHQ, инкубировали с антиоксидантом PDTC. Этот эксперимент показал, что PDTC практически полностью предотвращает активацию ARE-зависимой экспрессии люциферазы в ответ на ОС, вызванный химическим агентом (Рис. 7А). В случае клеток, ко-трансфицированных репортерной плазмидой и плазмидами, экспрессирующими белки ВГС, применение антиоксиданта ингибировало активацию лишь на 40%, причем наименьший эффект был отмечен в случае белка капсида (подавление экспрессии на 20%) (Рис. 7А). Полученные данные указывают на то, что белки ВГС способны активировать ответ на ОС не только по механизму, зависящему от концентрации АФК в клетке, но и по АФК-независимому механизму. Интересным является и тот факт, что аналогичный эффект наблюдался и в случае индукции стресса ЭР туникамицином.

Рис. 7. Белки ВГС активируют Nrf2/ARE каскад, усиливая транскрипцию ARE-зависимых генов и активируя фактор транскрипции Nrf2. (А) Анализ уровня ARE-зависимой экспрессии люциферазы в клетках экспрессирующих белки ВГС и инкубированных с 40 мкМ PDTC (+PDTC) или без антиоксиданта (-PDTC) в течение 12 ч. Данные приведены по результатам трех экспериментов. (Б) Иммуноблоттинг цитоплазматической (Сyt) и ядерной (Nu) фракций лизатов клеток, экспрессирующих белки ВГС.

Известно, что активация транскрипции ARE-зависимых генов предполагает фосфорилирование транскрипционного фактора Nrf2 с последующим его перемещением из цитоплазмы в ядро. Подтверждение активации фактора Nrf2 было получено путем разделения фракций ядерных и цитоплазматических белков и детекцией Nrf2 в них методом иммуноблоттинга. Как видно из рис 7Б, экспрессия белков Е1, Е2, NS4B, NS5A и белка капсида действительно приводит к транслокации фактора транскрипции Nrf2 из цитоплазмы в ядро.

В зависимости от типа клеток и индуктора окислительного стресса в фосфорилировании фактора Nrf2 могут участвовать как минимум шесть различных протеинкиназ: протеинкиназа С (PKC), фосфоинозитид-3-киназа (PI3K), p38 митоген-активируемая протеинкиназа, внеклеточная сигнал-регулируемая киназа (ERK1/2), казеинкиназа 2 (СК2) и мембранная eIF2-киназа (PERK) (Apopa, He et al. 2008, Burdette, Olivarez et al. 2010). Для того, чтобы выяснить, какие именно протеинкиназы фосфорилируют фактор Nrf2 и активируют транскрипцию генов «ферментов II фазы защиты» в случае белков ВГС в клетках Huh7, мы использовали ингибиторы всех этих протеинкиназ, за исключением PERK. Роль протеинкиназ была оценена в экспериментах с репортерными плазмидами pARE-Luc, несущими гены всех белков ВГС. В случае химического агента tBHQ и белка NS5A ВГС был дополнительно измерен уровень мРНК генов Nqo1 и HO1 и проанализирована локализация фактора Nrf2.

Рис. 8. Белки ВГС активируют Nrf2/ARE каскад по двум независимым механизмам. (А, Б) Уровень ARE-зависимой экспрессии люциферазы в клетках, экспрессирующих белки ВГС и обработанных ингибиторами протеинкиназы PI3K (Wortmannin, WORT), протеинкиназы CK2 (DRB) и протеинкиназы PKC (Ro 31-8220, RO) в присутствии (+PDTC) или отсутствие (-PDTC) антиоксиданта. (В, Д) Уровень мРНК ферментов Nqo1 и HO1 в клетках обработанных 100 мкМ tBHQ (В) или экспрессирующих белок NS5A (Д). Клетки обрабатывали антиоксидантом (PDTC), ингибиторами протеинкиназы PKC (Ro 31-8220), протеинкиназы p38 (SB 239063, SB), протеинкиназы ERK1/2 (PD98,059, PD), протеинкиназы CK2 (DRB), протеинкиназы PI3K (Wortmannin, WORT). (Г, Е) Иммуноблоттинг цитоплазматической (Cyt) и ядерной (Nu) фракций лизатов клеток, обработанных 100 мкМ tBHQ (Г) или экспрессирующих белок NS5A (Е). *p<0,01 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO  и tBHQ (В) или по сравнению с клетками Huh7, экспрессирующими белок NS5A и обработанными DMSO (Г).

       Как видно из Рис. 8, при индукции стресса tBHQ ARE-зависимая транскрипция (Рис. 8А,В) и перемещение фактора Nrf2 (Рис. 8Д) в ядро регулируется протеинкиназой С. При обработке клеток антиоксидантом ингибитор PKC не оказывал никакого эффекта на активацию системы защиты клетки от окислительного стресса: не наблюдалось усиления транскрипции ARE-зависимых генов и транскрипционный фактор Nrf2 оставался в цитоплазме (Рис. 8А,Г,Е). В случае экспрессии в клетках белков капсида (Рис. 8А) и NS5A (Рис. 8А,Г) ARE-зависимая транскрипция регулировалась тремя протеинкиназами: PI3K, CK2 и PKC. При этом обработка клеток антиоксидантом не оказывала никакого дополнительного влияния в случае протеинкиназ CK2 и PI3K, в то время как ингибитор PKC был эффективен только в отсутствие антиоксиданта (Рис. 8А). При экспрессии в клетке гликопротеинов Е1 и Е2, белка NS4B или туникамицина – контрольного индуктора стресса ЭР, регуляция ARE-зависимой экспрессии люциферазы осуществлялась протеинкиназой PKC (Рис. 8А). Однако, так как обработка клеток антиоксидантом не приводила к полному подавлению ARE-зависимой экспрессии люциферазы, можно предположить наличие еще одной неустановленной протеинкиназы, отвечающей за активацию ответа на ОС по АФК-независимому механизму. Согласно литературным данным, таким ферментом может быть протеинкиназа PERK, которая активируется при возникновении стресса ЭР (Cullinan, Zhang et al. 2003). Однако проверить это предположение представляется затруднительным из-за отсутствия ее коммерчески-доступных химических ингибиторов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в клетках гепатомы человека Huh7 ОС вызывает активацию ARE-зависимой транскрипции при участии протеинкиназы PKC. В то же время, белки ВГС обладают способностью активировать Nrf2/ARE каскад и без участия АФК, и в этом случае ключевыми регуляторами являются протеинкиназы CK2 и PI3K (в случае белков NS5A и капсида), а также PERK (в случае гликопротеинов Е1, Е2 и белка NS4B).

Выявление доменов белка капсида ВГС, отвечающих за активацию системы защиты от окислительного стресса, и анализ ее механизмов

Для установления домена белка капсида, отвечающего за активацию системы защиты от окислительного стресса, использовали весь арсенал методов, описанных выше. Было показано, что экспрессия как N-, так и С-концевых фрагментов белка капсида ВГС приводит к транслокации фактора транскрипции Nrf2 из цитоплазмы в ядро (Рис. 9В), что вызывает активацию системы защиты от ОС. В экспериментах по оценке эффективности транскрипции при помощи репортерных плазмид (Рис. 9А) или методом ОТ-ПЦР в реальном времени (данные не приведены) была отмечена слабая (двухкратная) активация в случае С-концевого фрагмента белка. В то же время анализ уровней экспрессии «ферментов II фазы защиты» методом вестерн-блоттинга выявил сходное увеличение уровня Nqo1 и HO-1 обоими фрагментами белка капсида (Рис. 9Б).

Рис. 9. Экспрессия в клетке фрагментов белка капсида приводит к активации системы защиты клетки от окислительного стресса. (А) Анализ уровня экспрессии люциферазы под контролем минимального ARE-элемента в клетках, экспрессирующих фрагменты белка капсида. Данные приведены по результатам трех экспериментов. (Б) Иммуноблоттинг лизатов клеток, экспрессирующих белки ВГС. (В) Иммуноблоттинг цитоплазматической (Cyt) и ядерной (Nu) фракций лизатов клеток, экспрессирующих усеченные формы белка капсида

Для исследования механизма активации транскрипции генов системы защиты от окислительного стресса применялся подход с использованием ингибиторов протеинкиназ и антиоксиданта, описанный раннее для полноразмерных белков ВГС (Рис. 10).

Рис. 10. Фрагмент 1-36 а.о. белка капсида активирует ARE-зависимую экспрессию по АФК-независимому механизму, в то время как фрагмент 37-191 а.о. белка осуществляет регуляцию по АФК-зависимому механизму. Анализ ARE-зависимой экспрессии люциферазы в клетках, экспрессирующих полноразмерный (А), N-концевой (Б) и С-концевой (В) фрагменты белка капсида. Клетки обрабатывали ингибиторами протеинкиназ PKC, CK2, PI3K или антиоксидантом PDTC. Данные приведены по результатам трех экспериментов, *p<0,05 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO

Установлено, что при экспрессии С-концевого фрагмента белка капсида (37-191 а.о.) ARE-зависимая транскрипция регулируется протеинкиназой PKC (Рис. 10В), а в случае N-концевого фрагмента (1-36 а.о.) - протеинкиназами PI3K и CK2 (Рис. 10Б). Антиоксидант PDTC предотвращал активацию транскрипции лишь в случае С-концевого фрагмента белка капсида (Рис. 10В) или полноразмерного белка (Рис. 10А). Суммируя эти данные, можно сделать вывод, что АФК-зависимый и АФК-независимый механизмы активации Nrf2/ARE каскада белком капсида ВГС реализуются его различными доменами.

Влияние окислительного стресса на метаболизм биогенных полиаминов спермина и спермидина

Биогенные полиамины спермин и спермидин принимают участие во многих внутриклеточных процессах, в том числе в защите клетки от окислительного стресса, непосредственно нейтрализуя АФК (Sa, Sirisoma et al. 1998). Метаболизм полиаминов регулируется в основном двумя ферментами: орнитиндекарбоксилазой (ODC) и спермидин/спермин-N1-ацетилтрансферазой (SSAT), катализирующими скорость-лимитирующие стадии их биосинтеза и деградации, соответственно (Pegg, 2009). До сих пор ОС рассматривался в основном как следствие изменений в метаболизме полиаминов, в то время как обратная задача, а именно влияние стресса на метаболизм полиаминов, оставалась практически неизученной. Крайне немногочисленные литературные данные свидетельствуют о возможности повышения внутриклеточной активности SSAT при окислительном стрессе в клетках рака молочной железы (Chopra and Wallace 1996), а также об активации транскрипции гена ODC (Otieno and Kensler 2000) и ускорении деградации этого белка (Asher, Bercovich et al. 2005). Однако практически неизвестными остаются изменения метаболизма биогенных полиаминов в ответ на ОС, вызываемый в клетках печени химическими индукторами или белками различных вирусов, а также молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений.

На первом этапе этой части работы было проведено исследование изменений метаболизма полиаминов в клетках гепатомы человека Huh7 в ответ на ОС, вызванный химическими индукторами (tBHQ, H2O2). Измерение уровней индивидуальных полиаминов показало увеличение концентрации спермина, спермидина и путресцина, причем изменение уровня последнего было наиболее выражено (Табл. 1). Повышение содержания полиаминов сопровождалось возрастанием внутриклеточных активностей ODC и SSAT. Так, что при окислительном стрессе в клетках Huh7 активности ODC и SSAT увеличивались в 10-30 и 3-5 раз, соответственно (рис. 11А,Б). Это изменение сопровождалось повышением уровней мРНК обоих ферментов (Рис. 11 В,Г), что свидетельствовало о регуляции экспрессии SSAT и ODC на уровне транскрипции их генов.

Таблица 1. Уровни полиаминов в лизатах клеток Huh7, обработанных 100 мкМ tBHQ или 200 мкМ H2O2 в течение 18 ч.

 

Нмоль полиамина / мг ДНК

Путресцин

Спермидин

Спермин

H2O

0,7 ± 0,1

23,6 ± 3,8

59,4 ± 8,0

tBHQ

30,6 ± 4,4

148 ± 22

173 ± 27

H2O2

7,2 ± 1,6

167 ± 20

240 ± 20

Рис. 11. Окислительный стресс в клетках Huh7 вызывает активацию ODC и SSAT и усиливает транскрипцию их генов. (А,Б) Активность ODC (A) и SSAT (Б) в лизатах клеток Huh7 обработанных 100 мкМ tBHQ или 200 мкМ H2O2 в течении 18 ч. (В,Г) Уровень мРНК ODC (В) и SSAT (Г) в клетках Huh7, обработанных tBHQ или H2O2, определенный методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Данные приведены по результатам трех экспериментов, р*<0,01 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO. (Д) Иммуноблоттинг лизатов клеток, обработанных tBHQ или H2O2.

Таким образом, ОС в клетках гепатомы человека Huh7 вызывает ускорение как биосинтеза, так и деградации биогенных полиаминов, что в конечном итоге приводит к повышению уровня спермина, спермидина и путресцина в клетке.

Механизм регуляции активности основных ферментов метаболизма полиаминов при окислительном стрессе

Регуляция активности SSAT и ODC осуществляется в ответ на множество стимулов. Ранее было показано, что активация транскрипции гена SSAT в ответ на изменение внутриклеточного содержания полиаминов регулируется фактором транскрипции Nrf2, который принимает участие и в регуляции системы защиты клетки от окислительного стресса. В данной работе была оценена роль этого фактора в активации транскрипции генов SSAT и ODC в ответ на стресс, вызванный химическими агентами. Для этого был исследован уровень транскрипции генов ODC и SSAT при нормальном (экспрессия эндогенного фактора) и повышенном (гиперэкспрессия, приводящая к образованию активированного фактора) уровне Nrf2 (Рис. 12А). Было показано, что гиперэкспрессия фактора Nrf2 в клетках вызывает усиление транскрипции генов ODC и SSAT в 3-5 раз. Дополнительная обработка таких клеток индукторами окислительного стресса не приводила к дополнительной активации транскрипции гена ODC (Рис. 12Б), но усиливала транскрипцию гена SSAT (Рис. 12В). Из этих данных можно сделать два вывода. Во-первых. ген ODC является Nrf2-зависимым. Во-вторых, усиление транскрипции гена ODC при окислительном стрессе достигается при участии только фактора Nrf2, тогда как усиление транскрипции гена SSAT опосредованно как Nrf2, так и другим(и) фактором(и) транскрипции.

Рис. 12. Фактор транскрипции Nrf2 участвует в активации транскрипции ODC и SSAT. (А) Иммуноблоттинг лизатов клеток, гиперэкпрессирующих транскрипционный фактор Nrf2; клетки дополнительно обрабатывали 100 мкМ tBHQ или 200 мкМ H2O2 в течение 18 ч. В качестве отрицательного контроля использовали лизаты клеток Huh7 без гиперэкспрессии фактора Nrf2. (Б,В) Уровень мРНК ODC (Б) и SSAT (В) в клетках Huh7, экспрессирующих фактор транскрипции Nrf2 и дополнительно обработанных tBHQ или H2O2. Данные приведены по результатам трех экспериментов, р*<0,05 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO

Мы также провели анализ роли сайтов связывания транскрипционных факторов в промоторе гена SSAT при активации ее транскрипции в ответ на ОС. Наиболее вероятными факторами, регулирующими транскрипцию этого гена, являются Nrf2 и NF-kB (Babbar, Gerner et al. 2006). В промоторе гена SSAT ранее был идентифицирован PRE-элемент (Polyamine Response Element), с которым взаимодействует фактор Nrf2, а также три сайта связывания фактора NF-kB (Tomitori, Nenoi et al. 2002). Для установления роли отдельных сайтов мы использовали серию репортерных плазмид, несущих ген люциферазы под контролем полноразмерного (1700 п.о.) или усеченного (777 п.о.) промотора гена SSAT, а также форм последнего с удаленным одним или двумя сайтами связывания фактора NF-kB (Рис. 13).

Рис. 13. Репортерные плазмиды, кодирующие люциферазу под контролем промотора SSAT. (А) Регион промотора SSAT, содержащий сайт связывания факторов транскрипции Nrf2 и NF-κB. (Б) Схематическое изображение вариантов промоторной области SSAT, клонированных в репортерный вектор pGL3-Basic.

Как и в экспериментах по измерению уровня мРНК SSAT, гиперэкспрессия фактора Nrf2 приводила к усилению экспрессии люциферазы в случае плазмиды с полноразмерным промотором SSAT(1700)-luc (Рис. 14A). В то же время этот эффект отсутствовал при использовании плазмиды SSAT(777)-luc с укороченным промотором, лишенным в т.ч. PRE элемента (Рис. 14Б) При этом обработка клеток индукторами окислительного стресса приводила к усилению экспрессии люциферазы в случае обоих конструктов (Рис. 14А,Б). Это свидетельствует о наличии других факторов транскрипции кроме Nrf2, регулирующих экспрессию SSAT при окислительном стрессе, а также о том, что сайты связывания этих факторов находятся в проксимальной области промотора (-777 - +36 п.о.).

Рис. 14 Факторы транскрипции Nrf2 и NF-B участвуют в активации транскрипции гена ssat в клетках Huh7. (А,Б) Анализ активности промотора гена SSAT в клетках Huh7 при базальной экспрессии (pcDNA3.1) или гиперэкспрессии (pcDNA4-Nrf2) транскрипционного фактора Nrf2. Клетки трансфицировали репортерными плазмидами SSAT(1700)-luc (А) или SSAT(777)-luc (Б). (В) Иммуноблоттинг лизатов клеток Huh7, обработанных 100 мкМ tBHQ в течение 6 или 24 ч, или 200 мкМ Н2О2 в течение 24 ч. (Г) Анализ роли сайтов связывания фактора NF-B, находящихся в промоторе гена SSAT при обработке клеток Huh7 tBHQ или H2O2 в течении 18 ч. Данные приведены по результатам трех экспериментов, р*<0,05 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO

Для оценки роли фактора транскрипции NF-kB в регуляции экспрессии гена SSAT в ответ на ОС, нами был измерен уровень белка в ядре при стрессе, а также использованы варианты репортерной плазмиды SSAT(777)-luc, у которых один из двух или оба сайта связывания этого фактора были заменены на случайные последовательности. Было показано, что обработка клеток индукторами окислительного стресса приводит к накоплению субъединицы р65 фактора NF-kB в ядре, что свидетельствует о активации этого фактора (Рис 14В). Удаление сайтов связывания фактора NF-kB в репортерных конструктах выявило, что только один сайт, расположенный в области -304 - -280 п.о. от точки старта транскрипции, участвует в активации транскрипции гена SSAT (Рис. 14Г).

Таким образом, в работе было установлено, что возникновение в клетках гепатомы человека Huh7 окислительного стресса приводит к активации как минимум двух транскрипционных факторов, активирующих экспрессию ключевых ферментов метаболизма полиаминов ODC и SSAT.

Влияние белков ВГС на метаболизм биогенных полиаминов

Считается, что изменения метаболизма биогенных полиаминов спермина и спермидина связаны с возникновением и развитием различных видов раковых заболеваний. Ранее было показано, что увеличение уровня путресцина способствует трансформации гепатоцитов (Wang, Feith et al. 2007), а гиперэкспрессия ODC и SSAT у трансгенных животных приводит к возникновению различных видов опухолей (Coleman, Pegg et al. 2002). Однако возможные нарушения метаболизма полиаминов при вирусных инфекциях изучены недостаточно. Поэтому следующей задачей нашей работы было исследование влияния белков ВГС на метаболизм биогенных полиаминов и определение роли окислительного стресса в этом процессе.

Оценка влияния транзиторной (кратковременной) экспрессии индивидуальных белков ВГС на транскрипцию генов ODC и SSAT была проведена методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Установлено, что только два белка ВГС, а именно капсида и NS5A, заметно активируют транскрипцию этих генов (Рис. 15А). Интересно отметить, что усиление транскрипции не сопровождается увеличением внутриклеточной ферментативной активности SSAT и ODC (Рис. 15Б,В). Напротив, уровень активности ODC уменьшался в два раза в случае белка капсида и в девять раз в случае белка NS5A. При этом оба вирусных белка не оказывали существенного влияния на активность SSAT.

Рис. 15. Белки капсида и NS5A активируют транскрипцию генов ODC и SSAT и понижают активность ODCв клетке. (А) Уровень мРНК ODC и SSAT в клетках, экспрессирующих белки ВГС. (Б,В) Активность ODC (Б) и SSAT (В) в лизатах клеток, экспрессирующих белки капсида и NS5A. Данные приведены по результатам трех экспериментов.

Уменьшение активности ODC в клетках, экспрессирующих белки капсида и NS5A, не сопровождалось значительными изменениями в концентрации полиаминов (Табл. 2). Из полученных данных можно сделать вывод, что регуляция активности ферментов метаболизма полиаминов при экспрессии белков ВГС осуществляется не на уровне транскрипции (как происходит в случае обработки клеток индукторами окислительного стресса), а на других уровнях.

Таблица 2. Уровни полиаминов в клетках Huh7, экспрессирующих белок капсида и белок NS5A.

 

нмоль полиамина / мг ДНК

Путресцин

Спермидин

Спермин

pcDNA3.1

0,7 ± 0,1

23,6 ± 3,8

59,4 ± 8,0

Белок капсида

2,5 ± 1,9

30,2 ± 11,9

70,5 ± 27,2

NS5A

3,2 ± 0,5

25,6 ± 6,3

84,6 ± 25,9

Стоит отметить, что описанные выше изменения метаболизма полиаминов были показаны для случая кратковременной экспрессии белков ВГС (28-72 часа). Для оценки изменений в метаболизме спермина и спермидина при более длительной экспрессии вирусных белков была использована стабильная линия клеток Huh7, несущих полноразмерный репликон ВГС и содержащая все белки вируса, в т.ч. NS5A и белок капсида. В этой системе нами установлено пониженное содержание биогенных полиаминов, по сравнению с контрольной линии гепатомы Huh7 (Табл. 3). Уровни активности ODC и SSAT в клетках, несущих репликон ВГС, были также ниже контрольных значений (Табл. 3).

Таблица 3. Уровень полиаминов и активность ODC и SSAT в клетках Huh7 и клетках, несущих полноразмерный репликон ВГС (Huh7/ВГС)

 

нмоль полиамина / мг ДНК

Активность фермента (пмоль/ч/мг белка

Спермидин

Спермин

ODC

SSAT

Huh7

55,3 ± 10,8

49,6 ± 8,3

9,3 ± 1,2

33,1 ± 2,6

Huh7/ВГС

38,7 ± 6,1

27,9 ± 10,6

4,3 ± 1,1

8,6 ± 0,8

Полученные данные свидетельствуют о том, что метаболизм полиаминов в стабильной линии клеткок, несущей полноразмерный репликон ВГС, замедлен. Возможно, что именно подобные изменения являются одной из причин наблюдающегося замедления роста клеток.

Синтетические регуляторы метаболизма полиаминов как ингибиторы репликации ВГС

Заключительной частью диссертационной работы стала оценка потенциала синтетических соединений – регуляторов ферментов метаболизма полиаминов как потенциальных анти-ВГС агентов. В качестве таких соединений были выбраны 2-дифторметилорнитин (DFMO) и 3-аминоокси-1-аминопропан (APA) – ингибиторы ODC, N1,N11-диэтилнорcпермин (DenSpm), N1-циклогептилметил-N11-этилнорспермин (CHENS) и N1-циклопропилметил-N11-этилнорспермин (CPENS) – индукторы SSAT, а также N,N1-бис(2,3-бутандиенил)-1,4-диаминобутан (MDL) – ингибитор полиаминоксидазы (APAO) и сперминоксидазы (SMO), участвующих в деградации полиаминов (Casero and Pegg 2010). Оценку противовирусной активности соединений проводили в системе полноразмерного репликона ВГС измерением уровня РНК ВГС методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Как видно из рис. 16А, DenSpm оказывал умеренное усиливающее действие на репликацию ВГС, его аналоги CHENS и СPENS практически не влияли на репликацию ВГС, тогда как DFMO и APA, а также MDL обладали сильным ингибирующим действием, понижая титр вирусной РНК на два порядка.

Рис. 16. Обработка клеток, несущих репликон, ингибиторами ферментов метаболизма полиаминов приводит к резкому падению уровня РНК ВГС. (А,Б) Уровень вирусной РНК в клетках, несущих репликон ВГС и, обработанных индукторами SSAT: 50 мкМ DenSpm, 20 мкМ CHENS, 20 мМ CPENS (A), ингибиторами ODC, 1 мМ DFMO, 20 мкМ APA или 20 мкМ ингибитора полиаминоксидаз MDL (Б) в течении 72 ч. Данные приведены по результатам трех экспериментов.

Таблица 4. Уровень полиаминов и активность ODC и SSAT в клетках Huh7 и клетках, несущих полноразмерный репликон ВГС (Huh7/ВГС). Клетки обрабатывали 20 мкМ DenSpm  в течении 48 ч, 1 мМ DFMO, 20 мкМ MDL в течении 24ч.

Huh7

 

нмоль полиамина / мг ДНК

активность, пмоль/ч/мг белка

Спермидин

Спермин

ODC

SSAT

Huh7

55,3 ± 10,8

49,6 ± 8,3

9,3 ± 1,2

33,1 ± 2,6

Huh7+DenSpm

41,8 ± 9,5

17,9 ± 3,9

4,7 ± 3,2

217,5 ± 18,6

Huh7+DFMO

47,0 ± 10,1

37,2 ± 5,4

5,5 ± 0,6

2,7 ± 1,5

Huh7+MDL

63,5 ± 13,8

51,2 ± 13,7

4,4 ± 0,7

2,3 ± 0,2

Huh7/ВГС

Huh7/ВГС

38,7 ± 6,1

27,9 ± 10,6

4,3 ± 1,1

8,6 ± 0,8

Huh7/ВГС+DenSpm

33,3 ± 8,3

14,1 ± 7,4

38,7 ± 2,1

190,3 ± 10,7

Huh7/ВГС+DFMO

177,3 ± 42,2

140,1 ± 52,1

7,1 ± 1,5

1,2 ± 0,1

Huh7/ВГС+MDL

227,6 ± 39,4

177,6 ± 27,8

17,4 ± 3,3

1,2 ± 0,2

Интересно, что обработка несущих репликон клеток DFMO или MDL приводила к резкому повышению уровней спермина и спермидина, чего не наблюдалось в контрольных клетках гепатомы Huh7 (Табл. 4), а также не сопровождалась сильным снижением активности ODC в случае DFMO. Причины подобных изменений метаболизма полиаминов пока неясны. Тем не менее, можно утверждать, что экспрессия в клетке белков ВГС приводит к замедлению метаболизма полиаминов и небольшому снижению концентраций спермина и спермидина, тогда как повышение уровня этих соединений при помощи синтетических регуляторов способствует подавлению репликации ВГС.

Выводы

  1. Белки NS5A, NS4B, E1, E2, а также белок капсида вируса гепатита С вызывают окислительный стресс в клетках в клетках гепатомы человека Huh7; наиболее активным регулятором которого является белок капсида. N-концевой домен белка капсида активирует экспрессию NADPH-оксидаз 1 и 4, что приводит к усилению продукции супероксид-радикала, тогда как его C-концевой домен вызывает активацию экспрессии цитохрома Р450 2Е1 (CYP 2E1) и оксидоредуктина (Ero1) – источников супероксид-радикала и пероксида водорода, соответственно.
  2. Белки E1, E2, NS4B, NS5A и белок капсида активируют систему защиты клетки (Nrf2/ARE каскад) от активных форм кислорода (АФК) в клетках Huh7 по нескольким независимым механизмам. Все эти белки вызывают усиленную экспрессию «ферментов II фазы защиты» путем фосфорилирования фактора транскрипции Nrf2 протеинкиназой С (PKC) по АФК-зависимому механизму. Белок капсида и белок NS5A способны также активировать фактор Nrf2 по механизму, не зависящему от концентрации АФК, при участии фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и казеинкиназы 2 (CK2). В случае белков Е1, Е2 и NS4B активация Nrf2 по АФК-независимому механизму предположительно опосредовано протеинкиназой PERK. Наиболее активным регулятором Nrf2/ARE каскада является белок капсида, N-концевой домен которого отвечает за индукцию АФК-независимого, а С-концевой – АФК-зависимого механизмов защиты.
  3. В клетках гепатомы человека Huh7 окислительный стресс, вызванный химическими агентами, приводит к повышению уровней биогенных полиаминов спермина и спермидина вследствие усиления экспрессии орнитиндекарбоксилазы (ODC) и спермидин/спермин-N1-ацетилтрансферазы (SSAT), опосредованного факторами транскрипции Nrf2 и NF-kB. Окислительный стресс, вызванный белком капсида и белком NS5A вируса гепатита С, также вызывает активацию транскрипции генов ODC и SSAT, что, однако, сопровождается снижением активности кодируемых ими ферментов и падением уровня полиаминов в клетке.
  4. Клетки Huh7, несущие полноразмерный репликон ВГС, обладают сниженным уровнем биогенных полиаминов и активностей ферментов их метаболизма, а повышение концентрации спермина и спермидина приводит к ингибированию репликации ВГС и снижению уровня геномной РНК вируса.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

Статьи в журналах

  1. Smirnova O.A., Isaguliants M.G., Hyvonen M.T., Keinanen T.A., Tunitskaya V.L., Vepsalainen J., Alhonen L., Kochetkov S.N., Ivanov A.V. Chemically induced oxidative stress increases polyamine levels by activating the transcription of ornithine decarboxylase and spermidine/spermine-N1-acetyltransferase in human hepatoma HUH7 cells. Biochimie (2012) Published ahead of print
  2. Ivanov A.V., Smirnova O.A., Ivanova O.N., Masalova O.V., Kochetkov S.N., Isaguliants M.G. Hepatitis C Virus Proteins Activate NRF2/ARE Pathway by Distinct ROS-Dependent and Independent Mechanisms in HUH7 cells. PLoS One,  6, e24957, (2011).
  3. Masalova O., Lesnova E., Pichugin A., Melnikova T., Grabovetsky V., Petrakova N., Smirnova O., Ivanov A., Zaberezhny A., Ataullakhanov R., Isaguliants M., Kushch A. The successful immune response against hepatitis C nonstructural protein 5A (NS5A) requires heterologous DNA/protein immunization. Vaccine, 28, p. 1987-1996, (2010)
  4. Смирнова О.А., Иванов А.В., Иванова О.Н., Валуев-Эллистон В.Т., Кочетков С.Н. Клеточные системы защиты от окислительного стресса и стресса эндоплазматического ретикулума: механизмы регуляции и влияние вируса гепатита С. Молекулярная биология, 45, 1, стр. 110-122, (2011).
  5. Масалова О.В., Леснова Е.И., Грабовецкий В.В., Смирнова О.А., Уланова Т.И., Бурков А.Н., Иванов А.В., Забережный А.В., Атаулханов Р.И., Кущ А.А. ДНК-иммунизация плазмидой, содержащей ген неструктурного белка NS5A вируса гепатита С, индуцирует эффективный клеточный иммунный ответ. Молекулярная биология,  44, 2, стр 275-283, (2010).

Тезисы конференций

  1. Ivanov A., Smirnova O., Alekseeva E., Ivanova O., Somninskaya I., Kochetkov S. Isaguliants M. Induction of the antioxidant Nrf2/ARE defence pathway by HCV core is controlled by amino acids 1-36. 18th International Symphosium on Hepatitis C virus and related viruses, Seattle, Washington, USA, 8-12 September 2011, abstract book p.188.
  2. Smirnova O., Isaguliants M., Ivanova O., Khomutov A., Kochetkov S., Ivanov A. Hepatitis C virus core and NS5A proteins modulate expression of ODC and SSAT thus affecting polyamine metabolism. 18th International Symphosium on Hepatitis C virus and related viruses, Seattle, Washington, USA, 8-12 September 2011, abstract book p.195.
  3. Ivanov A., Smirnova O., Isaguliants M., Ivanova O., Kochetkov S. Hepatitis C virus proteins activate Nrf2/ARE pathway by distinct ROS-dependent and independent mechanisms. 17th International Symphosuim on Hepatitis C and related viruses, Pacifico Yokohama, Japan, 10-14 September, 2010, abstract book p.75.
  4. Ivanov A., Smirnova O., Isaguliants M., Ivanova O., Kochetkov S. Regulation of polyamine catabolism by hepatitis C virus proteins. 16th International Symphosium on Hepatitis C and related viruses, Nice, France, 3-7 October, 2009, abstract book p. 124.
  5. Smirnova O., Ivanov A., Isaguliants M., Ivanova O., Kochetkov S. Hepatitis c virus proteins activate cellular system of defence against oxidative stress. 16th International Symphosium on Hepatitis C and related viruses, Nice, France, 3-7 October, 2009, abstract book p. 129.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.