WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ДОЛГОПОЛОВА

Татьяна Викторовна

ВЛИЯНИЕ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА СТРУКТУРУ ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ чувствительности К АЛКОГОЛЮ И ДЕЙСТВИЮ ВИТАМИНА Е

(экспериментально-морфологическое исследование)

14.03.01 анатомия человека

03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени 

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2012

Работа выполнена на кафедре нормальной анатомии человека Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н.Бурденко» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:        доктор медицинских наук, профессор

Семенов Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

Большаков Олег Петрович

доктор медицинских наук, профессор,

ГБОУ ВПО СПбГМУ им. академика И.П.Павлова  Минздравсоцразвития России,

профессор кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии

Дробленков Андрей Всеволодович

доктор медицинских наук, доцент,

ГБОУ ВПО СПбГПМА  Минздравсоцразвития России, кафедра гистологии и эмбриологии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита  состоится «___» ________________ 2012 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.087.01 при Государственном бюджетном образовательном  учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СПбГПМА Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «____» __________________2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета 

д.м.н., профессор Карелина Наталья Рафаиловна

Актуальность исследования

Проблема алкоголизма в настоящее время не теряет своей актуальности, так как ее распространенность в мире грозит оказать необратимое воздействие на генофонд человечества, на его здоровье и на социальные аспекты жизни.

В России по данным Федеральной службы государственной статистики, учитывающим только лишь зарегистрированные случаи, численность лиц, состоящих под наблюдением по заболеванию алкоголизмом и алкогольными психозами в 2006-2010 гг. была весьма значительной и колебалась в пределах 15,1-13,7 на 1000 населения.

По данным отдельных авторов (Заиграев Г.Г., 2002; Зайратьянц О.В., 2002) среди причин, вызывающих преждевременную смерть людей, алкоголизм вышел на 3-е место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Алкоголь является важнейшим деструктивным фактором демографического, социального и экономического развития России. Аномально высокий уровень смертности в России связан, прежде всего, с экстремально высоким уровнем потребления крепких напитков (Халтурина Д.А., 2007), при этом свыше 60% умерших составляют лица из наиболее трудоспо­собной возрастной группы 35-54 лет, независимо от их социальной принад­лежности (Зайратьянц О.В., 2002).

В многочисленных исследованиях разных лет были изучены основные механизмы пато- и морфогенеза алкогольных поражений внутренних органов, в первую очередь, таких органов – мишеней для алкоголя, как печень, поджелудочная железа, сердце, мозг, почки (Иванец Н.Н., Валентик Ю.В., 1988; Пауков B.C., 1996, 1998; Меденцов А.А. с соавт, 2002;  Нужный В.П., 2002 и др.). В экспериментальных исследованиях на животных давно моделируется алкогольная мотивация, а также изучаются биологические механизмы развития алкогольной зависимости (Анохина И.П., 1988; Иванец Н.Н., Валентик Ю.В., 1988 и др.). Однако в подавляющем числе экспериментальных работ по изучению алкогольных поражений не учитывалась чувствительность животных к алкоголю, в значительной мере определяющая динамику заболевания алкоголизмом и, вероятно, степень морфофункциональных нарушений, развивающихся при хронической алкогольной интоксикации.

В ряду исследований по изучению влияния алкоголя на структуры мозга значительное число публикаций посвящено влиянию острой алкоголь­ной интоксикации на гипоталамические структуры, преимуществен­но, на гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальную ось (Барабанчик В.Г., 1988; Inder W.J. et al., 1995; Rivier С., 1996; Lee S. at al, 2000 и др.). Исследования изменений гипоталамо-нейрогипофизарной системы при алкогольной интоксикации (Сивухина Е.Н., 2003; Koehler-Stec E.M. et al., 1998; Navarra P. et al., 1991; Vilpoux C., 2009) не дают детальных представлений об изменениях нейросекреторной активности крупноклеточных ядер гипоталамуса, в том числе – в связи с различным привыканием к алкоголю. В то же время было установлено, что среди многих известных нейропептидов особое значение имеет вазопрессин, который участвует в развитии и поддержании привыкания к этанолу (Navarra P. et al., 1991; Harding A. et al., 1996).

Изучение механизмов повреждающего действия этанола показало, что продукты его метаболизма активируют цепь свободнорадикальных процессов с развитием так называемого оксидативного стресса, приводящего к повреждениям клеточных структур (Нужный В.П., 2002; Nordmann R. et al., 1992; Kurose I et al., 1997). Этот факт определил целесообразность использования естественных и синтетических антиоксидантов в лечении алкогольных поражений (Альтшулер В.Б., 2002; Белозеров Б. Г., 2005; Di Luzio N., 1973; Koch O., 2000; Tiwari V. et al., 2009 и др.). Однако в ряду достаточно многочисленных исследований, выполненных в данном направлении, отсутствуют работы, касающиеся органов нейроэндокринной системы, в то время как было показано (Калмыков А.П., 1998, 2003), что α-токоферол и его синтетический аналог ионол в экспериментальных условиях изменяют функциональное состояние крупноклеточных ядер гипоталамуса.

Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Целью настоящего исследования явилось изучение морфофункциональных особенностей реакций нонапептидэргических ядер гипоталамуса на пролонгированную алкогольную интоксикацию и при ее сочетании с введением -токоферола у крыс с различной толерантностью к алкоголю.

Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Провести органометрическую оценку динамики массы тела, массы головного мозга, гипофиза и надпочечных желез у крыс с различной толерантностью к алкоголю при пролонгированной алкогольной интоксикации и ее сочетании с введением -токоферола.

2. Изучить на светооптическом и ультраструктурном уровнях морфологические особенности гипоталамо-нейрогипофизарной нейросекреторной системы крыс с различной толерантностью к алкоголю при пролонгированной алкогольной интоксикации.

3. Исследовать модифицирующее влияние -токоферола на морфологические изменения гипоталамо-нейрогипофизарной секреторной системы крыс с различной толерантностью к алкоголю при пролонгированной алкогольной интоксикации.

Научная новизна полученных результатов

Впервые проведен сравнительный анализ морфологических изменений гипоталамо-нейрогипофизарной секреторной системы крыс с различной толерантностью к алкоголю при пролонгированнной алкогольной интоксикации и ее сочетании с введением -токоферола.

Установлено, что толерантность к алкоголю определяет выраженность нарушений массы тела, головного мозга, гипофиза и надпочечников при пролонгированной алкогольной интоксикации.

Показаны различия выраженности структурных и функциональных изменений нонапептидэргических НСК и особенности выявленных нарушений в супраоптическом и паравентрикулярном ядрах гипоталамуса при хронической алкогольной интоксикации у животных с различной толерантностью к алкоголю.

Получены данные, свидетельствующие о нормализующем влиянии -токоферола на структурно-функциональное характеристики нонапептидэргических центров гипоталамуса при пролонгированной алкогольной интоксикации. Впервые на ультраструктурном уровне показано, что применение -токоферола у алкоголизированных животных обеспечивает большую сохранность мембранных структур и органоидов НСК, активацию синтеза нейросекреторных гранул и их выведения в терминалях задней доли гипофиза.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования, полученные с использованием традиционных морфологических, морфометрических методик и электронной микроскопии раскрывают новые закономерности функциональной морфологии гипоталамо-нейрогипофизарной секреторной системы при пролонгированной алкогольной интоксикации с учетом толерантности организма к алкоголю.

Полученные морфологические данные о корректирующем влиянии -токоферола на нонапептидэргические НСК гипоталамуса при пролонгированной алкогольной интоксикации имеют прикладное значение в плане разработки методов терапии алкогольной болезни.

Результаты проведенного исследования указывают, что при планировании экспериментальных исследований алкогольных поражений необходим учет степени толерантности лабораторных животных к алкоголю.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Задержка прироста массы тела, головного мозга и гипофиза и увеличение массы надпочечников у животных при пролонгированной алкогольной интоксикации зависит от толерантности к алкоголю.
  2. Выраженность структурно-функциональных нарушений нонапептидэргических нейросекреторных клеток гипоталамуса при пролонгированной алкогольной интоксикации определяется толерантностью животных к алкоголю и различается в супраоптическом и паравентрикулярном ядрах.
  3. Введение α-токоферола на фоне алкогольной интоксикации обеспечивает снижение уровня морфологических изменений нейросекреторных клеток супраоптического и паравентрикулярного ядер.

Апробация работы

Основные результаты диссертационного исследования были доложены на VI Всероссийском съезде морфологов с международным участием (Саратов, 2009), X Конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), на 8-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2011).

Публикация результатов исследования

По результатам диссертационной работы опубликовано 7 научных работ, из них 4 – в ведущих научных рецензируемых журналах и изданиях.

Внедрение результатов исследования

Результаты,  полученные в проведенном исследовании, включены в учебный процесс на кафедрах нормальной анатомии человека, гистологии, психиатрии с наркологией ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко», на кафедре физиологии человека и животных ГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Заключение этического комитета

Методы работы были одобрены этическим комитетом ГБОУ ВПО ВГМА им. Н.Н.Бурденко Минздравсоцразвития России (протокол №1 от 17.06.2010 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), главы материалов и методов исследования (глава 2), главы 3 собственных исследований, включающей 8 разделов, заключения, выводов и указателя литературы. Иллюстративный материал представлен 15 таблицами, 22 фотомонтажами, включающими 46 микрофотографий, и 18 графиками. Указатель литературы включает 175 источников: 87 отечественных и 88 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Проведению экспериментальных исследований предшествовал отбор животных с различной толерантностью к алкоголю. На первоначальном этапе 510 самцам беспородных белых крыс массой 200-250 г в течение 3-х недель предоставляли свободный доступ к корму, воде и 15% раствору этанола. Проводились ежедневные измерения объема потребления каждым животным воды и спиртового раствора.

По окончании периода наблюдений в соответствии с количеством потребления раствора этанола и воды сформировалось 3 основных группы животных (рис.1): 1 группа - 72 крысы, употреблявшие только воду или не более 10% спирта в общем объеме жидкости, выпиваемой за сутки, 2 группа - 76 крыс, предпочитавших исключительно раствор алкоголя с долей его потребления 90-97% от общего объема выпиваемых жидкостей, 3 группа – 362 крысы, употреблявшие в течение суток обе жидкости (от 10% до 85% раствора этанола и, соответственно, от 90% до 15% воды). Таким образом, в изученной популяции самцов беспородных белых крыс доля животных, не потреблявших алкоголь, составила 14,1±1,5%, а животных, перешедших на постоянное потребление алкоголя, – 14,9±1,6%. Для последующих экспериментальных исследований были взяты животные 1-й и 2-й групп (рис.1).

Рис.1. Схема формирования экспериментальных групп

После недели «восстановительного» периода с содержанием на обычном рационе с водой и без алкоголя, все крысы были переведены при прежнем пищевом содержании на потребление 15% раствора этанола с полным исключением воды в течение 30 суток. Таким образом, одна часть крыс подвергалась принудительной алкоголизации, а другая часть – алкогольной интоксикации, которую условно можно определить как «добровольную». Половине животных обеих групп в течение последних 10-ти дней алкоголизации вводили внутрибрюшинно -токоферол (αТФ) в количестве 0,1 мг на 100 г массы тела (в 20% масляном растворе).

Таким образом, в соответствии со схемой основного эксперимента был исследован материал от 188 животных, из которых было сформировано в общей сложности 6 групп: 1-ю группу (виварный контроль) составили 20 интактных крыс, содержавшихся на общем рационе, 20-ти крысам 2-й группы (контроль с αТФ) в течение 10 суток перед окончанием эксперимента вводили раствор ТФ, 3 группа – 36 животных после принудительной алкоголизации, 4 группа – 38 крыс после «добровольной» алкоголизации, 5 группа – 36 крыс после принудительной алкоголизации и введения αТФ, 6 группа – 38 крыс после «добровольной» алкоголизации и введения α- ТФ.

Для морфологических исследований ГГНС животных по окончании периода алкоголизации под эфирным наркозом подвергали декапитации, вскрывали череп в области свода, извлекали мозг и со стороны основания мозга выделяли область переднего гипоталамуса, а также гипофиз.

Забой животных проводили под эфирным наркозом в одно и то же время суток. После декапитации извлекали и взвешивали головной мозг, гипофиз и надпочечные железы. Массу органов оценивали в абсолютных величинах и рассчитывали в относительных показателях: относительную массу мозга – в % от массы тела, относительную массу гипофиза – в % от массы головного мозга, массу надпочечной железы – в мг на 100 г массы тела.

Иссеченные тканевые блоки переднего гипоталамуса и гипофиз фиксировали в течение 24  часов в жидкости Буэна, затем, после обезвоживания в спиртах восходящей концентрации и проводки по I-II диоксанам, заливали в заливочную смесь «Гистомикс». Морфологические исследования супраоптического (СОЯ), паравентрикулярного (ПВЯ) ядер, области срединного возвышения и гипофиза проводили на фронтальных серийных парафиновых срезах толщиной 6 мкм. Для выявления нейросекреторного материала срезы окрашивали паральдегид-фуксином по Гомори-Габу с докрашиванием гематоксилином Караци.

Границы исследуемой области и топографию СОЯ и крупноклеточных частей ПВЯ проводили в соответствии с топографическими ориентирами, представленными в атласе мозга крысы (Ch. Watson, G. Paxinos, 2005).

При оценке нейросекреторной активности СОЯ и ПВЯ выделяли пять типов нейросекреторных клеток (НСК), отражающих фазность секреторного цикла (Поленов А.Л., 1968, 1974; Поленов А.Л. с соавт, 1993). К I типу относили небольшие по объему темноокрашивающиеся клетки, соответствующие "состоянию покоя". II тип составили крупные светлоокрашивающиеся клетки с высокой функциональной активностью: клетки IIа типа, характеризующиеся значительным количеством гомори-положительных гранул (ГПГ) в цитоплазме, что свидетельствует о преобладании процессов синтеза нейросекрета; в клетках IIб с небольшим количеством ГПГ преобладали процессы выведения нейросекрета в аксоны; тип IIв составляли клетки, имевшие более плотно окрашенную цитоплазму с большим количеством ГПГ, характеризовавшее состояние накопления секреторного материала.  К III типу относили пикноморфные клетки с низкой функциональной активностью и, так называемые, клетки-"тени".

Проводили подсчет НСК разных типов и определяли их процентное соотношение из 200 клеток в каждом ядре отдельного животного. Оценивали также содержание и характер распределения нейросекрета по ходу гипоталамо-гипофизарного тракта (ГГНТ) во внутренней зоне срединного возвышения и в задней доле гипофиза (ЗДГ).

С использованием компьютерного анализатора изображения на базе цифрового оптического микроскопа Leica определяли объемы ядер и ядрышек с помощью программы ImageJ, а также рассчитывали долю полиядрышковых НСК. Калибровку измерений проводили с использованием объект-микрометра ОМП-1 с ценой деления 10 мкм.

Объем ядра рассчитывали по формуле

VЯ =πlb2/6,

где l – больший диаметр, b – меньший диаметр ядра в мкм.

Объем ядрышка определяли как

Vя-ка =πd3/6,

где d – диаметр ядрышка.

В серийных срезах каждого ядра от одного животного проводили по 100 измерений ядер и ядрышек.

Электронномикроскопические исследования были выполнены в лаборатории электронной микроскопии Центра коллективного пользования научным оборудованием Воронежского государственного университета.

Для электронной микроскопии кусочки гипоталамуса и ЗДГ животных подопытных и контрольной групп фиксировали  в 2,5% растворе глютаральдегида на 0,2М 2,4,6-коллидиновом буфере с последующей постфиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия. Обезвоживание производили в ацетоне восходящей концентрации и заливали материал в эпоксидную смолу эпон-812.

Для определения области локализации СОЯ и ПВЯ предварительно под световым микроскопом изучали полутонкие срезы исследуемой ткани толщиной 1 мкм, окрашенные 1% раствором толуидинового синего на 0,1М фосфатном буфере (рН 8,6). Ультратонкие срезы контрастировали лимоннокислым свинцом по Reynolds (1963) и уранилацетатом и исследовали в электронном микроскопе ЭМВ-100Б. Электронномикроскопические изображения регистрировали на фотопластинках для ядерных исследований размером 6х9 см, после чего переводили в цифровое изображение на фотосканере при разрешении 1200 dpi.

Статистическая обработка данных, полученных в процессе исследования, проводилась с использованием пакета статистических программ Statistica 6.0 (StatSoft). Использовались расчеты стандартных статистических показателей: средняя арифметическая, дисперсия, стандартное отклонение, стандартная ошибка средней арифметической и ее доверительный интервал.

Для выбора методик сравнения результатов количественных оценок показателей различных экспериментальных групп проводилась стандартная процедура оценки нормальности распределения выборок: в случае нормального распределения сравнивали средние с использованием t-критерия Стьюдента и дисперсии путем расчета F-критерия Фишера. При отклонении выборок от нормального распределения использовали непараметрические критерии хи-квадрат (Пирсона), Колмогорова-Смирнова и Вальда-Вольфовица. Во всех случаях достоверными считали результаты при уровне значимости не хуже P<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование массы тела животных в течение эксперимента  показало, что  алкогольная интоксикация существенно изменяла динамику данного показателя, а введение  αТФ не приводило у алкоголизированных животных к достоверным изменениям средних величин, вследствие чего динамика этого показателя рассматривалась при сравнении показателей виварного контроля, 3-й и 4-й групп.

За время эксперимента масса крыс контрольной группы увеличилась на 27,3%, масса животных, подвергнутых принудительной алкоголизации (3-я группа) – на 4,5%,  относительный прирост массы после «добровольной» алкоголизации (4-я группа) составил 10,1%. При  этом, если динамика массы у животных контрольной группы была линейной, то  у животных 4-й и, особенно, 3-й группы динамика массы существенно отклонялась от линейной. Животные контрольной группы характеризовались плавным и равномерным снижением величины относительного прироста массы от 4,5% за каждые 5 суток в начале эксперимента до 3,75% к его окончанию (рис.2).

Рис.2. Динамика относительного прироста массы тела алкоголизированных  животных и крыс контрольной группы

Обозначения: * - достоверные отличия от показателя контрольной группы (Р<0,05)

У животных 3-й группы  в течение начальных 20-ти суток эксперимента прирост массы был незначительным, следующие 20 суток характеризовались интенсивным увеличением относительного прироста от 0,6% до 1,7% за последние 5 суток эксперимента.  У животных 4-й группы, толерантных к алкоголю период малого относительного прироста массы тела был существенно короче, и уже с 10-х суток эксперимента величина относительного прироста  последовательно и прогрессивно увеличивалась до уровня 2,6% за последние пять суток эксперимента.

По вскрытии черепной коробки алкоголизированных крыс наблюдалось полнокровие мозговых оболочек, дряблость консистенции и отечность ткани головного мозга, несколько более выраженные у животных 3-й и 4-й групп.

Определение массы головного мозга у крыс (табл. 1) показало, что абсолютная величина этого показателя у алкоголизированных животных меньше, чем в контрольной группе, при этом достоверно более низкие показатели отмечены у крыс 3-й и 4-й группы. В то же время величина относительной массы мозга у животных после алкогольной интоксикации превысила таковую у крыс контрольной группы. Абсолютная и относительная масса гипофиза животных 3-й группы была наименьшей, тогда как эти показатели гипофиза крыс 4-й группы была достоверно больше, чем в первой, но ниже, чем в контрольной группе.

Таблица 1

Показатели массы тела, головного мозга, гипофиза и надпочечных желез крыс контрольной группы, после принудительной (3 группа) и «добровольной» (4 группа) алкогольной интоксикации (M±m)

Показатели

Контроль

3 группа

4 группа

Масса тела

275,2±1,3

228,1±1,6*

240,0±1,5*#

Масса мозга (мг)

1678,7±13,5

1610,3±13,2*

1610,4±13,5*

Относительная масса мозга (к массе тела, %)

0,610±0,008

0,706±0,011*

0,671±0,011*

Масса гипофиза (мг)

8,59±0,8

7,47±0,06*

7,73±0,07*#

Относительная масса гипофиза (к массе мозга, %)

0,512±0,006

0,464±0,005*

0,480±0,006*

Масса надпочечной железы (мг)

20,1±0,32

25,5±0,38*

22,8±0,36*#

Относительная масса надпочечной железы (в мг/100 г массы тела)

0,073±0,004

0,112±0,006*

0,095±0,005*

Обозначения: * - достоверные (Р<0,05) отличия от показателей контрольной группы, # - достоверные (Р<0,05) различия показателей 3-й и 4-й групп.

Результаты измерений массы надпочечных желез крыс показали, что их абсолютная и относительная величина у животных после алкогольной интоксикации достоверно увеличилась вне зависимости от режима алкоголизации, несколько меньший прирост относительно контроля отмечен у животных 4-й группы.

Обращает внимание, что у алкоголизированных животных существенно возрастала билатеральная асимметрия массы надпочечных желез. Для количественной оценки асимметрии надпочечников использовали формулу расчета коэффициента асимметрии массы, выраженного в процентах АМ(%):

,

где  Мнп – масса правого надпочечника, Мнл – масса левого надпочечника.

Результаты показали, что у животных контрольной группы асимметрия массы надпочечных желез составила в среднем 1,91±0,03%, у крыс 3-й группы – 13,83±0,11%, у крыс 4-й группы – 12,02±0,10%.

Таким образом, хроническая алкогольная интоксикация в течение 30 дней привела к задержке прироста массы тела, головного мозга и гипофиза, увеличению абсолютной и относительной массы надпочечных желез; эти изменения достоверно более выражены при принудительной алкоголизации крыс с пониженной толерантностью к алкоголю, в сравнении с «добровольной» алкоголизацией животных, толерантных к этанолу.

Как показали светооптические исследования, среди НСК СОЯ у интактных животных и крыс контрольной группы после введения αТФ  преобладали НСК IIа типа, характеризующийся высокой активностью синтеза нейросекрета, доминирующим над его выведением и IIб типа с усиленным выведением секрета из перикарионов (табл. 2). Существенно реже обнаруживались клетки в состоянии накопления нейросекрета (IIв тип). Клетки I типа, соответствующие состоянию «покоя» или «самого начала синтеза» нейросекрета, темноокрашенные вследствие значительной базофилии цитоплазмы составляли от 24,0% до 32,0%, пикноморфные клетки (III тип) были единичными. Следует отметить, что введение αТФ приводило к увеличению доли клеток IIб типа (активное выведение нейросекрета).

Таблица 2.

Соотношение нейросекреторных клеток разных типов в гипоталамических центрах крыс контрольной группы после введения α-токоферола в сравнении с показателями интактных животных (в %%).

Типы

нейросекреторных

клеток

Супраоптическое ядро

P±p (%)

Паравентрикулярное ядро

P±p (%)

Интактные

животные

Контрольная группа после введения αТФ

Интактные

животные

Контрольная группа после введения αТФ

I

32,0±1,2%

28,0±1,3%*

25,0±1,1%

24,0±1,2%

IIа

30,0±1,1%

30,0±1,3%

41,0±1,3%

32,0±1,4%*

IIб

31,0±1,1%

38,0±1,3%*

29,0±1,2%

38,0±1,4%*

IIв

5,0±0,3%

3,0±0,3%*

4,0±0,3%

4,0±0,3%

III

2,0±1,8%

1,0±0,5%

1,0±0,5%

2,0±0,8%

Обозначения: * - достоверные отличия от аналогичного показателя интактных животных (РСт≤0,05).

Во внутренней зоне срединного возвышения по ходу ГГНТ выявлялись мелкие и единичные крупные расширения волокон, содержащие нейросекреторный материал. ЗДГ содержала небольшое количество нейросекреторного материала в тельцах Герринга средних размеров.

Анализ результатов морфометрических исследований показал, что средние значения объемов ядер и ядрышек так же, как и доля полиядрышковых клеток, в СОЯ существенно не отличались от соответствующих значений у интактных животных (табл. 3). Анализ гистограмм распределения объемов ядер НСК СОЯ и ПВЯ также продемонстрировал сходство показателей виварного контроля и контрольных животных после введения αТФ.

Таблица 3.

Соотношение морфометрических показателей НСК СОЯ и ПВЯ крыс контрольной группы после введения αТФ в сравнении с показателями интактных животных.

Показатель

Супраоптическое ядро

Паравентрикулярное ядро

Интактные животные

Контрольная группа после введения αТФ

Интактные животные

Контрольная группа после введения αТФ

Объемы ядер (мкм3)

826,6±7,3

836,8±8,4

770,4±7,2

730,2±7,4*

Объемы ядрышек (мкм3)

17,7±0,1

18,9±0,2*

15,1±0,1

16,7±0,2*

Доля полиядрышковых клеток (в %%)

4,2±0,6%

4,5±0,6

12,0±1,0%

12,3±1,1%

Обозначения: * - достоверные отличия от аналогичного показателя интактных животных (РСт≤0,05)

Электронномикроскопические исследования животных обеих контрольных групп свидетельствовали о преобладании в СОЯ и ПВЯ светлых НСК, отличавшихся значительным объемом и низкой электронной плотностью ядра и цитоплазмы (рис.3). В кариоплазме зерна хроматина расположены диффузно с некоторой концентрацией под ядерной оболочкой, образующей незначительные инвагинации. В ядрышке отчетливо дифференцируются гранулярный и фибриллярный компоненты.

Рис.3. Ультраструктура НСК СОЯ крысы контрольной группы.

Обозначения: Я – ядро, ЭГ – элементарные гранулы, Л – лизосомы, М – митохондрии, кГ – комплекс Гольджи, ПР - полирибосомы; Ув. 16300.

Большая часть гранул эндоплазматической сети располагается в периферической зоне клеток, значительное число рибосом фиксировано на мембранах, встречаются свободные полирибосомы. В зоне комплекса Гольджи выявляются элементарные гранулы нейросекрета с электроноплотным  центральным веществом, окруженным светлым ободком, кнаружи от которого расположена тонкая липопротеидная мембрана. Митохондрии округлые или, чаще, овальные, с типичной структурой, гомогенным, умеренно плотным матриксом. В цитоплазме выявляются единичные мелкие лизосомы (рис.3).

При электронномикроскопическом исследовании ЗДГ в большинстве нейросекреторных окончаний содержатся многочисленные нейросекреторные гранулы, среди которых преобладают зернистые. Элементарные гранулы встречаются реже, число распадающихся гранул незначительно (рис.4).

Рис. 4. Ультраструктура фрагмента ЗДГ крысы контрольной группы.

ЗГ – зернистые гранулы, РГ - распадающиеся гранулы; Ув. 40000.

При изучении морфофункционального состояния ГГНС крыс 3-й и 4-й групп после 30-ти суток алкогольной интоксикации, отмечались выраженные изменения по сравнению с нормой. В СОЯ и ПВЯ животных этих групп в сравнении с контрольной группой было достоверно снижено количество НСК в состоянии покоя (I тип), существенно уменьшено число функционально активных НСК IIа и IIб типов, свидетельствующие о подавлении активности синтеза нейросекрета; увеличение процентного содержания НСК в состоянии накопления нейросекреторного материала (IIв типа) являлось признаком выраженного торможения выведения нейрогормонов по аксонам; достоверно возрастало количество пикноморфных клеток (табл. 4, рис. 5а).

В цитоплазме многих НСК отмечалась обширная вакуолизация. Секреторный материал выявлялся по ходу отростков, как между клетками, так и в вентральной области ядер, где крупные расширения аксонов были плотно заполнены гомориположительным материалом (рис. 5а).

Обращают внимание достоверные различия реакции СОЯ и ПВЯ на алкогольную интоксикацию у животных с различной толерантностью к алкоголю: отмеченные отличия от контроля в НСК СОЯ сильнее выражены у животных 3-й группы, а в ПВЯ – более значительны у животных 4-й группы.

Таблица 4.

Соотношение НСК разных типов в СОЯ и ПВЯ алкоголизированных крыс III и IV группы в сравнении с показателями интактных животных (в %%).

Типы

НСК

Интактные животные

Алкоголизированные крысы  (3-я группа)

Алкоголизированные крысы (4-я группа)

Супраоптическое ядро P ± p (%)

I

32,0±1,2%

5,0±0,2%*

12,0±0,3%*#

IIа

30,0±0,6%

25,0±0,5%*

23,0±0,4%*

IIб

31,0±0,6%

10,0±0,3%*

16,0±0,4%*#

IIв

5,0±0,3%

42,0±0,5%*

39,0±0,5%*

III

2,0±0,2%

18,0±0,4%*

10,0±0,3%*#

Паравентрикулярное ядро P ± p (%)

I

25,0±0,6%

7,0±0,3%*

15,0±0,4%*#

IIа

41,0±0,6%

23,0±0,4%*

10,0±0,3%*#

IIб

29,0±0,6%

18,0±0,4%*

10,0±0,3%*#

IIв

4,0±0,3%

40,0±0,5%*

54,0±0,5%*#

III

1,0±0,2%

12,0±0,3%*

11,0±0,3%*

Обозначения: * - достоверные отличия от аналогичного показателя интактных животных (РСт≤0,05), # - достоверные различия между показателями 3-й и 4-й групп

а

б

Рис. 5. НСК ПВЯ (а) и ЗДГ (б) алкоголизированных крыс 3-й группы: НСК в состоянии накопления с гиперхромными ядрами, многочисленными вакуолями в перикарионах (1); извитые аксоны заполнены нейросекретом (2); в ЗДГ крупные конгломераты нейросекрета (3), расширенные сосуды со стазами (4), умеренный периваскулярный отек. Окраска: паральдегид–фуксин+гематоксилин. а - Ув.300, б – Ув.600.

Во внутренней зоне срединного возвышения прослеживалось значительное количество нейросекрета в виде  мелких глыбок в отростках по ходу ГГНТ, наряду с этим в большом количестве обнаруживались крупные скопления нейросекреторного материала. У преобладающего числа животных ЗДГ была переполнена секреторным материалом, встречались сосуды, переполненные форменными элементами крови, стазы (рис. 5б).

Результаты морфометрических исследований свидетельстввовали о достоверном уменьшении объемов ядер и ядрышек НСК; эти показатели, как и доля полиядрышковых клеток, достоверно различались в ПВЯ животных 3-й и 4-й групп (табл. 5).

Таблица 5.

Соотношение морфометрических показателей НСК СОЯ и ПВЯ алкоголизированных крыс III и IV группы в сравнении с показателями интактных животных (I группа).

Показатель

I группа

III группа

IV группа

Супраоптическое ядро

Объемы ядер (мкм3)

826,6±7,3

603,7±7,9*

612,7±6,3*

Объемы ядрышек (мкм3)

15,1±0,1

12,0±0,3*

12,8±0,3*

Доля полиядрышковых клеток (в %%)

4,2±0,6%

6,4±0,8*

7,7±1,0*

Паравентрикулярное ядро

Объемы ядер (мкм3)

770,4±7,2

590,1±8,5*

524,8±5,5*#

Объемы ядрышек (мкм3)

16,7±0,1

9,0±0,3*

10,8±0,2*#

Доля полиядрышковых клеток (в %%)

12,0±1,0%

6,3±1,1%*

15,8±1,2%*#

Обозначения: * - достоверные отличия от аналогичного показателя интактных животных (РСт≤0,05), # - достоверные различия между показателями 3-й и 4-й групп

Существенные особенности реакции НСК СОЯ и ПВЯ у животных с различной толерантностью к алкоголю иллюстрируются графиками распределения объемов ядер (рис. 6): у крыс, толерантных к алкоголю, более значительное смещение распределение объемов выражено для НСК ПВЯ, в то время как в НСК СОЯ у животных с пониженной толерантностью к алкоголю смещение кривой распределения в сторону меньших объемов было более значительным и сочеталось с изменением бимодального распределения на асимметричное одномодальное.

У крыс III и IV групп, независимо от степени их толерантности к алкоголю, обнаруживались выраженные изменения. При электронной микроскопии выявлялись как светлые, так и часто встречающиеся у животных этих групп темные НСК (рис.7а,б), окруженные многочисленными глиальными и сосудистыми элементами. Ядра темных клеток содержат большое количество крупных плотных конгломератов хроматина. Ядрышки расположены эксцентрично, иногда имеют вакуолизированный вид. Цитоплазма повышенной электронной плотности с большим числом органоидов. Цистерны эндоплазматической сети расширены, что придает соответствующим участкам цитоплазмы ажурный рисунок.

Рис. 6. Распределение объемов ядер НСК СОЯ (а) и ПВЯ (б) крыс после принудительной (III группа) и «добровольной» алкоголизации (IV группа) в сравнении с виварным контролем (ВК - I группа).

По оси абсцисс – величины средин интервальных рядов (в мкм3), по оси ординат – частота; * - достоверные отличия от соответствующего показателя ВК (РСт≤0,05)

В большей части светлых клеток СОЯ и ПВЯ животных III и IV групп участки цитоплазмы обеднены органоидами (рис.7в), гранулярная эндоплазматическая сеть с неупорядоченной организацией, ее цистерны неравномерно расширены (рис.7б), количество связанных рибосом уменьшено. В межканальцевой гиалопдазме располагаются свободные рибосомы и полисомы. В зоне комплекса Гольджи в непосредственной связи с его мембранами и вакуолями располагаются элементарные нейросекреторные гранулы (рис.7г),  их миграция в периферические участки цитоплазмы в НСК не выявляется. Большинство митохондрий крупные, набухшие, с разрушенными или частично дезинтегрированными кристами (рис.7в). В матриксе отдельных митохондрий появляются мембранные комплексы в виде концентрически закрученных образований (рис.7в).

В ЗДГ животных III и IV групп часто выявлялись темные нейросекреторные окончания полигональной формы с высоким содержанием нейросекреторных гранул. Рядом с такими окончаниями располагались «пустые» нейросекреторные волокна с единичными митохондриями, имеющими разрушенные кристы. Большинство гранул имели гомогенный электроноплотный центр, окруженный оболочкой (элементарные гранулы). Зернистые гранулы, размеры которых превышают величину элементарных встречались реже, распадающиеся и остаточные гранулы были единичными.

Таким образом, алкогольная интоксикация приводила к существенным ультраструктурным повреждениям НСК, касающимся, в первую очередь, мембранного компартмента с нарушениями формирования нейросекреторных гранул, их накопления и выделения в нейрогипофизе.

Рис.7. Ультраструктура НСК гипоталамических нейросекреторных ядер крыс после пролонгированной алкогольной интоксикации.

Темные клетки СОЯ (а) и ПВЯ (б) с повышенной электронной плотностью ядра (Я) и цитоплазмы, крупными ядрышками (Яко); расширенные цистерны эндоплазматической сети (ЭПС); митохондрии (М) с разрушенными кристами; в – обеднение цитоплазмы органоидами, деструкция митохондрий, п – полисомы; г – расширение элементов комплекса Гольджи (кГ), пониженная плотность центральной осмиофильной субстанции нейросекреторных гранул (нг). а – Ув.10000; б – Ув.20000; в,г – Ув.40000.

Анализ результатов исследований состояния нонапептидэргических центров гипоталамуса алкоголизированных крыс после введения αТФ V и VI групп характеризовал изменения в процентном отношении НСК разных типов в сторону увеличения светлоокрашивающихся, функционально активных форм IIа и IIб типов (рис. 8). При этом доля НСК IIв типа, соответствующих состоянию накопления нейросекрета, и пикноморфных НСК III типа в сравнении с алколизированными животными, которым αТФ не вводился, существенно уменьшилась как в СОЯ, так и более значительно в ПВЯ. Сопоставление частот типов НСК (рис. 8) исследованных групп показывает, что НСК СОЯ и ПВЯ животных VI группы наиболее значительно приближаются по своим показателям к уровням групп виварного контроля и контроля с αТФ.

СОЯ

ПВЯ

Рис.8. Соотношение частот типов НСК в СОЯ и ПВЯ  животных исследованных групп.

Введение αТФ животным V и VI групп, получавшим 15% раствор этанола, существенно снижало вакуолизацию цитоплазмы НСК; деструктивные формы и клетки с признаками апоптоза встречались значительно реже, чем у алкоголизированных крыс, которым αТФ не вводился.

По ходу аксонов ГГНТ и в терминалях ЗДГ крупные скопления секреторного материала были единичными; преобладали мелкодисперсные формы нейросекрета, что являлось признаком активации его выведения.

Средние значения объемов ядер НСК у животных  V и VI групп после введения αТФ достоверно увеличивались по сравнению с соответствующими показателями крыс, потреблявших 15% раствор этанола, приближаясь к показателям интактных животных (рис. 9).

Рис. 9. Средние объемы ядер НСК животных исследованных групп

* - достоверные отличия от соответствующего показателя 1 группы (РСт≤0,05)

Распределение объемов ядер НСК у алкоголизированных животных, получавших αТФ, приближалось к таковому у животных I и II групп, однако по значениям частот по данным расчета критериев Колмогорова-Смирнова и Вальда-Вольфовица имело достоверные (Р<0,05) отличия и от групп контроля, и от показателей III и IV групп. 

Аналогичным образом увеличивались объемы ядрышек НСК, однако доля полиядрышковых клеток оставалась без существенных изменений относительно показателей алкоголизированных животных (рис.10). Описываемые изменения морфометрических параметров характеризовали относительную активацию синтетической активности НСК, одинаково выраженную в СОЯ и в ПВЯ.

Рис.10. Средние величины объемов ядрышек (в мкм3) НСК СОЯ и ПВЯ и доля полиядрышковых НСК (в %) у животных исследованных групп

* - достоверные отличия от соответствующего показателя 1 группы (РСт≤0,05)

Электронномикроскопическое исследование НСК СОЯ и ПВЯ крыс V и VI групп показало, что в сравнении с описанной выше характеристикой материала алкоголизированных животных III и IV групп морфологическая организация большинства НСК характеризуется большим количеством сохранных органоидов. В цитоплазме большинства светлых НСК определяются хорошо сформированные канальцы эндоплазматической сети, на элементах которой расположено большое количество рибосом, количество полисом увеличено. Элементы хорошо дифференцированного комплекса Гольджи, локализованного в перинуклеарной зоне цитоплазмы, представлены канальцами и вакуолями, обнаруживаются нейросекреторные гранулы (рис.11а), отмечается их миграция в периферические участки цитоплазмы. Форма, величина и количество митохондрий вариабельны, превалируют митохондрии средних размеров с матриксом умеренной электронной плотности и небольшим количеством крист. Характерной особенностью НСК крыс V и VI групп является наличие ядер с извитым контуром кариолеммы и переходом ядерной оболочки в эндоплазматическую сеть (рис. 11б).

Рис. 11. Ультраструктура НСК после алкогольной интоксикации и введения αТФ.

а – оформление нейросекреторных гранул (НГ) в комплексе Гольджи (кГ), Я – ядро, М – митохондрия, большое количество полисом (П); б – образование элементов эндоплазматической сети (ЭПС) из наружной мембраны кариолеммы (Кл). а – Ув.13700, б – Ув.10000.

В ЗДГ определяются аксоны и терминали НСК, в аксоплазме которых в умеренном количестве обнаруживаются нейросекреторные гранулы, среди которых доминируют зернистые и распадающиеся, элементарные гранулы более редки. В терминалях содержится заметное количество синаптических пузырьков, которые распределены диффузно среди нейросекреторных гранул или концентрируются в местах контакта терминалей с питуицитами и капиллярами. В аксоплазме в значительном количестве определяются митохондрии с матриксом умеренной электронной плотности и сохранными кристами

Таким образом, введение αТФ в течение последних 10-ти дней алкоголизации животных с повышенной толерантностью к алкоголю обеспечивало уменьшение количества деструктивных форм НСК по сравнению с таковым у крыс, алкоголизированных без введения антиоксиданта; изредка встречались признаки застойных явлений на фоне активации процессов выведения нейрогормонов в кровоток. Введение αТФ приводило к относительной нормализации соотношения типов НСК, уменьшало признаки застоя выведения нейросекрета в гипоталамо-гипофизарном нейросекреторном тракте и в ЗДГ.

ВЫВОДЫ

    1. Крупноклеточные части супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса животных контрольной группы характеризуются преобладанием нейросекреторных клеток в фазах синтеза, выведения нейросекрета и в состоянии «покоя» с активным смещением нейросекрета по аксонам гипоталамо-гипофизарного нейросекреторного тракта в срединном возвышении и выведением нейрогормонов из задней доли гипофиза в портальный кровоток; нейроны супраоптического ядра характеризуются бимодальным распределением объемов ядер с модами, соответствующими 800-899 мкм3 и 1000-1099 мкм3, а распределение ядер нейронов паравентрикулярного ядра - одномодальное и асимметричное с максимумом в диапазоне 400-499 мкм3.
    2. Алкогольная интоксикация в течение 30 дней приводит, в сравнении с контрольными животными, к задержке прироста массы тела, головного мозга и гипофиза, увеличению абсолютной и относительной массы надпочечников; эти изменения достоверно более выражены при принудительной алкоголизации крыс с пониженной толерантностью к алкоголю в сравнении с «добровольной» алкоголизацией животных, толерантных к этанолу.
    3. Введение α-токоферола интактным животным обеспечивает возрастание доли нейросекреторных клеток IIб типа с активным выведением нейросекрета, увеличение объемов ядер и ядрышек нейросекреторных клеток паравентрикулярного ядра при отсутствии изменений в крупноклеточных нейронах супраоптического ядра.
    4. Пролонгированная алкогольная интоксикация вызывает появление дистрофических форм нейросекреторных клеток, обширную множественную вакуолизацию цитоплазмы, деструкцию мембранного компартмента и органоидов нейросекреторных клеток супраоптического ядра и паравентрикулярного ядра, уменьшение объемов ядер и ядрышек нейросекреторных клеток; эти изменения менее выражены у животных с повышенной толерантностью к алкоголю.
    5. Супраоптические и паравентрикулярные ядра животных после «добровольной» алкогольной интоксикации животных с пониженной чувствительностью к алкоголю, в сравнении с принудительно алкоголизированными крысами имели существенные различия по соотношениям типов нейросекреторных клеток, отражающим их секреторную активность, а по цитометрическим показателям и доле полиядрышковых клеток достоверными отличиями характеризовались нейросекреторные клетки паравентрикулярных ядер.
    6. Введение α-токоферола в течение последних 10-ти дней алкоголизации животных обеспечивало снижение количества деструктивных форм нейросекреторных клеток по сравнению с таковым у крыс, алкоголизированных без введения антиоксиданта, относительную нормализацию соотношений типов нейросекреторных клеток супраоптических и паравентрикулярных ядер и их морфометрических показателей, уменьшение морфологических признаков задержки выведения нейросекреторных гранул в гипоталамо-гипофизарном нейросекреторном тракте и в задней доле гипофиза. Нормализующее влияние α-токоферола на ультрастуктурном уровне характеризовалось большей сохранностью мембранных структур и органоидов нейросекреторных клеток, активацией синтеза нейросекреторных гранул и их выведения в терминалях в задней доле гипофиза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в ведущих научных рецензируемых изданиях

  1. Семенов С.Н. Модифицирующее действие -токоферола на изменения гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы крыс при пролонгированной алкогольной интоксикации / С.Н.Семенов, Н.Д.Полякова-Семенова, А.Г.Кварацхелия, Т.В. Долгополова // Морфология. – 2009.– Т.136, №4. – С.125.
  2. Семенов С.Н. Изменения гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы крыс при пролонгированной алкогольной интоксикации / С.Н.Семенов, Н.Д.Полякова-Семенова, Т.В. Долгополова // Морфология.– 2010. – Т.137, №4. – С. 171.
  3. Долгополова Т.В. Динамика массы тела, головного мозга, гипофиза и надпочечных желез при хронической алкогольной интоксикации у крыс с различной толерантностью к алкоголю / Т.В. Долгополова, А.Г.Кварацхелия, С.Н.Семенов // Вестник новых медицинских технологий. – 2011. – Т.18, №2. – С.140-141.
  4. Долгополова Т.В. Особенности структурно-функциональных изменений крупноклеточных ядер гипоталамуса при пролонгированной алкогольной интоксикации и введении -токоферола у крыс с различной толерантностью к алкоголю // Т.В. Долгополова, Н.Д.Полякова-Семенова, С.Н.Семенов // Вестник новых медицинских технологий. – 2011. – Т.18, №2. – С.141-142

Статьи, материалы конференций

  1. Долгополова Т.В. Морфофункциональные изменения гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы крыс при пролонгированной алкогольной интоксикации / Т.В.Долгополова, С.Н.Семенов, А.Г.Кварацхелия // Однораловские морфологические чтения: сб. науч. трудов. – Вып. 8. – Воронеж, 2009. – С. 196-199.
  2. Полякова-Семенова Н.Д. Реакция пептидэргических центров гипоталамуса крыс алкоголизированных животных на введение -токоферола и пирацетама / Н.Д.Полякова-Семенова, Т.В.Долгополова, С.Н.Семенов // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегиональный сб.науч. работ. – Воронеж, 2010. – Вып.12. – С.172-175.
  3. Семенов С.Н. Реакция пептидэргических центров гипоталамуса на пролонгированную алкогольную интоксикацию крыс с различной толерантностью к алкоголю / С.Н.Семенов, Т.В.Долгополова // Ретиноиды. Альманах. – Вып.32. – М.: ЗАО «Ретиноиды»,  2011. – С.81-85.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

αТФ - -токоферол

ГГНС – гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система

ГГНТ – гипоталамо-гипофизарный нейросекреторный тракт

ГПГ - гомори-положительныех гранулы

ЗДГ – задняя доля гипофиза

НСК – нейросекреторная клетка

ПВЯ – паравентрикулярное ядро

СОЯ – супраоптическое ядро




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.