WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 
    1. На правах рукописи

                                                       

Сальников Николай Игоревич

ВЫЯВЛЕНИЕ

И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОМОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БОЛЕЗНИ НАЙРОБИ И ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ РИФТ

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических  наук

Покров – 2012

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

доктор биологических  наук,

профессор

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Цыбанов Содном Жамьянович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, 

г. Покров)

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

(ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, г. Москва)

Балышева Вера Ивановна

Ярыгина Елена Игоревна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир

Защита диссертации состоится «30» ноября 2012 г. в  12.30  часов на заседании диссертационного совета  Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел./факс: 8 (49243) 6-21-25.

       С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

       Автореферат разослан « 25 » октября  2012 г.

Размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru  и на официальном сайте ВАК России  www.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

кандидат биологических наук

Е.А. Балашова

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1



Актуальность

Вирусы болезни Найроби и лихорадки долины Рифт (ЛДР) - представители семейства Bunyaviridae - являются возбудителями опасных  заболеваний животных и человека [1,17].        

Болезнь Найроби инфекционная вирусная болезнь овец, характеризующаяся острым течением, поражением нервной системы, органов кровообращения и дыхания. Представляет опасность для человека, вызывая лихорадку и геморрагические явления. Переносчиками возбудителя являются иксодовые клещи, в изобилии распространенные  в Кении, Уганде, Конго (район озера Киву) и ЮАР (провинция Наталь), где постоянно регистрируется болезнь Найроби [6,10].

Лихорадка долины Рифт – это антропозоонозная, особо опасная вирусная инфекция, распространенная во многих странах Африки и Ближнего Востока. Вирус ЛДР обладает выраженной патогенностью для человека и многих видов диких и домашних копытных животных. Вирус передается через укусы комаров, при контакте с тканями и кровью заболевших животных, а также аэрогенным путем при вдыхании вируссодержащих аэрозолей. Лихорадка долины Рифт наносит огромный экономический ущерб сельскому хозяйству, т.к. обуславливает высокую гибель молодняка, а также приводит к возникновению абортов у 80-100% больных животных. Болезнь зарегистрирована в Кении, Уганде, Южно – Африканской республике, Родезии, Судане, Анголе, Мозамбике, Нигерии, Экваториальной Гвинее и Австралии [2].

Поскольку оба вируса поражают одни и те же виды животных, обладают перекрывающимися ареалами и вызывают инфекции со сходными клиническими проявлениями, дифференциация их друг от друга является актуальной.

    1. Степень разработанности проблемы

Изучению вирусов болезни Найроби и ЛДР посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных исследователей. За рубежом разработаны и широко используются тест – системы для выявления генома вируса ЛДР методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени [7,11,15,16]. Кроме того, в базе данных генетической информации (GenBank) депонировано большое количество полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов и изолятов вируса ЛДР. Помимо молекулярно-генетических, разработано большое количество серологических методов для обнаружения вируса ЛДР и антител к нему. В ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии разработана методика твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющая обнаруживать вирус ЛДР в различных образцах биологического материала (пробах органов, культурах клеток, крови) [3].

В отличие от вируса ЛДР, исследованием генома вируса болезни Найроби занимается лишь небольшая группа сотрудников Центра по контролю и предотвращению особо опасных заболеваний (США). Ими проведены секвенирование и филогенетический анализ азиатских и африканских штаммов вируса болезни Найроби [13]. Однако в научной литературе нет данных о разработке методов генодиагностики вируса болезни Найроби, а также методов дифференциальной диагностики вирусов болезни Найроби и ЛДР.

В данной работе определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов и  проведен филогенетический анализ музейных штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР. Предложены способы выявления генома вируса болезни Найроби методами гнездовой ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Представлена методика дифференциации геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР на основе мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

1.3 Цель и задачи исследования

В связи с вышеуказанным, основной целью исследований являлась разработка средств выявления геномов вирусов  болезни Найроби и лихорадки долины Рифт.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) разработать тест - системы для выявления генома вируса болезни Найроби методами ОТ-ПЦР с электрофоретической  детекцией результатов и в режиме реального времени, определить их чувствительность и специфичность;

2) разработать тест - систему на основе мультиплексной ОТ - ПЦР в режиме реального времени для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР, определить её чувствительность и специфичность;

3) определить нуклеотидные последовательности различных участков генов музейных штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР;

4) провести филогенетический анализ геномов музейных штаммов  вирусов болезни Найроби и ЛДР.

1.4 Научная новизна работы

Впервые определены нуклеотидные последовательности  генов N и Gn  четырех штаммов вируса болезни Найроби  (NSD-X, МК, ММ, ММ/К-05), депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и установлено, что геномы этих штаммов  филогенетически близки геному африканского штамма NSD 708 (степень нуклеотидной идентичности относительно гена N составляет  88 - 90 %, а относительно гена Gn - 97 - 98 %).

Впервые определены нуклеотидные последовательности генов NSs и Gc  четырех штаммов вируса  ЛДР (RVF(s)13, RVF(s)113, RVF 2002/09-ПС, 1974-ВНИИВВиМ),  депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и  установлено, что геномы этих штаммов филогенетически близки геномам эпизоотического вирулентного  штамма  Entebbe и аттенуированного штамма Smithburn (степень нуклеотидной идентичности между последовательностями генов NSs и Gc  составляет  99,0 – 99,7 %).

Впервые разработана  тест-система  для выявления генома вируса болезни Найроби методом гнездовой ОТ-ПЦР, авторство изобретения которой подтверждено  патентом  РФ № 2416647 (бюллетень № 11 от 20 апреля 2011 г.).

Впервые разработаны тест – система для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени и  тест-система  для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной  ОТ - ПЦР в режиме реального времени.

1.5  Практическая значимость работы

Разработаны "Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Найроби методом гнездовой  полимеразной цепной реакции", "Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Найроби методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени", "Методические положения по выявлению РНК вирусов болезни Найроби и лихорадки долины Рифт методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени", утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым А.М. 16.11.2011, 30.11.2011 и 10.11.2011, соответственно.

1.6 Публикации результатов

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринарная патология», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.7 Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2009-2011 гг.).

       Материалы диссертации доложены на конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины", посвященной 50-летию ВНИИВВиМ (г. Покров, 2009 г.), Всероссийской научно – практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика -2010" (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции "Высокие технологии, прикладные и фундаментальные исследования в фармакологии, физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2011 г.), 4ом, 5ом и 6ом Международных  конгрессах EPIZONE (г. Сент-Мало, Франция, 2010г.; г. Арнем, Нидерланды, 2011; г. Брайтон, Великобритания, 2012).





    1. Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

       В соответствии с формулой специальности 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) – область науки об использовании живых организмов, культур клеток и биологических процессов в производстве с целью получения полезных продуктов для народного хозяйства, медицины и ветеринарии, целенаправленно улучшающих воздействие на окружающую среду и формирование экологически доброкачественной среды обитания человека и животных. В диссертационной работе проведены исследования по созданию тест-систем на основе ПЦР и её модификаций, позволяющие выявлять геномы вирусов болезни Найроби и ЛДР в различных пробах биологического и патологического материала. К данным тест-системам разработаны рекомбинантные положительные контроли, при  создании которых применялись методы клонирования ДНК в составе плазмидных векторов в клетках Escherichia coli. проведено секвенирование фрагментов S - и M - сегментов геномов штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также их филогенетический анализ.

       Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности – 1, 9, 11.

    1. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на  98 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 27 отечественных и 110 иностранных источников, дополнена приложениями. Диссертация содержит  14 таблиц и 17 рисунков. В приложениях представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту

  1. 1. Высокоспецифичные и чувствительные тест-системы для выявления генома вируса болезни Найроби методами гнездовой ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
  2. 2. Высокоспецифичная и чувствительная тест-система для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
  3. 3. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей  генов N и Gn  штаммов  ММ, ММ/К-05, МК, NSD-X  вируса  болезни Найроби.
  4. 4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей  генов NSs и Gc,  штаммов RVF(s)13, RVF(s)113, RVF 2002/09-ПС, 1974-ВНИИВВиМ вируса  ЛДР.

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: зав. сектором изучения АЧС, к.б.н., Малоголовкин А.С. (освоение молекулярно-биологических методов); ведущий научный сотрудник лаборатории Биотехнологии, к.б.н. Капустина О.В.; зав. НЭО, к.в.н. Живодеров С.П. (эксперименты по заражению животных).

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирусы

В работе использованы штаммы  вируса болезни Найроби  (ММ, ММ/К-05, МК, NSD-Х)  и вируса ЛДР (1974-ВНИИВВиМ, RVF 2002/09-ПС, RVF(s)113, RVF(s)13), находящиеся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Клиническим материалом служили кровь и пробы органов (мозг, печень, сердце, легкие, селезенка, лимфатические узлы) от экспериментально инфицированных животных.

В качестве гетерологичных образцов использовали пробы культур клеток,  инфицированных вирусам болезней Акабане, Ибараки, блютанга. В качестве отрицательных контролей использовали пробы крови и органов от клинически здоровых животных, а также интактные культуры клеток. 

2.1.2 Животные

Для экспериментального заражения вирусами болезни Найроби и ЛДР использовали клинически здоровых овец и белых мышей из сектора подготовки животных ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.3 Плазмиды и бактериальные штаммы

Для клонирования использовали коммерческие наборы Qiagen PCR Cloning Kit (Qiagen, Германия) и  Ins TAclone PCR cloning kit (Fermentas, Латвия). В качестве векторов для клонирования использовали плазмиды pDrive (Qiagen, Германия) и pTZ57R/T(Fermentas, Латвия) и клетки Escherichia coli штамм TOP 10.

2.2 Методы

2.2.1 Выделение РНК

Выделение РНК методом нуклеосорбции проводили по методике, описанной R. Boom (1990) в нашей модификации, выделение фенольно-детергентным методом – по методике P. Chomczynski и N. Sacchi (1987) [8,9]. 

2.2.2 Синтез кДНК

Реакцию обратной транскрипции проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 10 пмоль обратного праймера; 0,03 ммоль дНТФ; 0,07 ммоль MgCl2; 1,88 ммоль КCl; 1,25 ммоль Трис-HCl (pH 7,5); 0,25 ммоль дитиотрейтола; 30 ед. MMLV-ревертазы. В пробирки с реакционной смесью под масло вносили по 5 мкл РНК, далее пробирки инкубировали на термостате в течение 30 мин при температуре 42С и 5 мин при температуре 88С.

2.2.3 Постановка полимеразной цепной реакции

Для постановки классического варианта ПЦР использовали амплификаторы "Терцик-МС2" (ЗАО "НПФ ДНК-технология", Россия) и "Palm Cycler" (Corbett Research, Австралия). Реакцию проводили в смеси объемом 25 мкл следующего состава: 10 пмоль каждого праймера; 0,03 ммоль дНТФ; 0,07 ммоль MgCl2; 1,88 ммоль КCl; 1,25 ммоль Трис-HCl (pH 7,5); 3 ед. Taq-полимеразы и 5 мкл кДНК.

2.2.4 Анализ продуктов ПЦР

Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофореза ДНК в 1,5 - 2% агарозном геле, содержащем 0,4-0,5 мкг/мл интеркалирующего красителя бромистого этидия. Электрофорез проводили, используя трис-ацетатный или трис- боратный буфер при напряженности электрического поля 8-10 В/см в течение 20-30 минут.

2.2.5 Выделение и очистка продуктов ПЦР

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили с помощью этанольной преципитации непосредственно из реакционной смеси, а также из агарозного геля методами фенольной экстракции после механического разрушения геля, а также нуклеосорбции после растворения геля буфером на основе иодида натрия [5,14].

2.2.6 Нуклеотидное секвенирование

Секвенирование очищенных амплифицированных фрагментов ДНК проводили с использованием  реактивов "Big Dye v. 3.1. Terminator"  и "5Sequencing buffer" (Applied Biosystems, США) в соответствие с прилагаемой инструкцией. Реакцию ставили в параллелях с прямыми и обратными праймерами.

2.2.7 Клонирование фрагментов генов

Фрагменты генов, амплифицированные методом ОТ-ПЦР лигировали с T-векторами в соответствии с инструкциями к наборам. Методом электропорации трансформировали рекомбинантной плазмидой компетентные клетки E. coli, штамм Top 10 (Invitrogen, США).  Методом щелочного лизиса из 1,5 - 2 мл бактериальной культуры каждого клона выделяли плазмидную ДНК, которую затем проверяли методом ПЦР на наличие вставки требуемой нуклеотидной последовательности [5,14].

2.2.8 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием алгоритма ''Clustal W''  программы ''Bio Edit 7.0.0''. Для разработки олигонуклеотидных праймеров и зондов использовали программы ''Oligo 6.0'' и ''Primer Express''. Специфичность рассчитанных олигонуклеотидов проверяли при помощи интернет – сервиса  BLAST (http://www.ncbi.gov.nlm.com). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы "Mega 5.05''.

2.2.9. Статистическая обработка полученных результатов

Полученные результаты подвергали статистической обработке общепринятыми методами, используемыми в биологии. Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента – Фишера [4].

3 Результаты собственных исследований

3.1 Разработка тест - системы для выявления генома вируса болезни Найроби на основе гнездовой ОТ - ПЦР        

На первом этапе работы провели анализ доступных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей геномов  различных штаммов вируса болезни Найроби. В качестве мишени для отжига праймеров была выбрана нуклеотидная последовательность гена нуклеокапсидного белка (N) малого (S) сегмента генома. Для проведения реакции обратной транскрипции и амплификации выбранного участка генома рассчитаны 2 пары праймеров. Первая (внешняя) пара праймеров (NSD F1-NSD R1)  фланкирует на последовательности геномной РНК участок размером 930 п.о., а вторая (внутренняя) пара (NSD F2-NSD R2) - участок размером 360 п.о., расположенный внутри первого участка.

Для проверки специфичности рассчитанных праймеров была проведена амплификация участка геномной РНК вируса болезни Найроби  (штамм ММ/К-05). Синтез кДНК проводили по описанной выше методике с использованием праймера NSD R1. Электрофорез продуктов  амплификации показал, что во 2-ом раунде синтезируется фрагмент рассчитанного размера – 360 п.о. (Рис.1).

 

       

Для определения специфичности разработанной тест-системы  исследовали препараты РНК, выделенной из образцов биологического и патологического материала, содержащего вирус болезни Найроби, гетерологичные вирусы, а также из интактных образцов.

Ложноположительных и ложноотрицательных результатов при этом получено не было (Рис.2).

       

       

       

Аналитическую чувствительность  определяли амплификацией РНК вируса, выделенной из последовательных десятикратных  разведений вируссодержащей  жидкости культуры клеток почки сайги, инфицированной вирусом болезни Найроби (штамм ММ/К-05). В ходе опыта РНК вируса болезни Найроби была выявлена в разведениях культурального материала от 100 до 106, при этом  титр максимального  выявленного разведения  вируса составил  0,2  lg ТЦД 50/см3.       На базе лаборатории Биофизики проведены комиссионные испытания тест – системы, а также разработаны методические положения по ее применению, утвержденные  академиком – секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым А.М. 16.11.2011 г.

3.2 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ - ПЦР  в режиме реального времени

Для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ - ПЦР в режиме реального времени  подобраны  олигонуклеотидные  праймеры, фланкирующие фрагмент размером 105 п.о. гена нуклеокапсидного белка N. Для детекции продуктов амплификации в режиме реального времени подобран зонд технологии Taq –man, содержащий на 5'-конце излучатель флуоресценции HEX, а на 3'-конце – гаситель BHQ2.

Оптимизацию условий постановки ОТ-ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием в качестве мишеней для отжига праймеров препараты РНК, выделенные из вируссодержащей жидкости культуры клеток почки сайги, инфицированной вирусом болезни Найроби (шт.  ММ/К-05) и 20% суспензии мозга белых мышей-сосунков, инфицированных вирусом болезни Найроби (штамм ММ). Эмпирическим путем были подобраны оптимальная температура отжига праймеров - 63°С, концентрации MgCl2 (3,3 мкМ), дНТФ (0,3 мкМ), зонда (0,12 пмоль/мкл) и праймеров (0,4 пмоль/мкл) в реакционной смеси для амплификации. Амплификацию с детекцией результатов в реальном времени проводили с использованием детектирующих термоциклеров  ''IQ-5'' (BioRad, США) и  ''Rotor Gene 6000'' (Corbett Research, Австралия).

Для конструирования положительного контроля амплификации к тест–системе для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени  использовали фрагмент S-сегмента генома размером 866 п.о. вируса болезни Найроби (штамм ММ/К-05), содержащий нуклеотидные последовательности, комплементарные  праймерам ExC U, ExC D и зонду ExC Z. Данный фрагмент клонировали в составе плазмидного вектора  pDrive (Qiagen, Германия).

Специфичность тест-системы оценивали путем исследования препаратов РНК вирусов болезни Найроби, лихорадки долины Рифт, блютанга, болезней Акабане и Ибараки, а также препаратов нуклеиновых кислот, выделенных из крови интактных овец, коз и коров. Положительные результаты были получены только для препаратов РНК вируса болезни Найроби, что свидетельствует о специфичности разработанной тест-системы (Рис.4).

Аналитическую чувствительность ПЦР определяли, исследуя препараты РНК, выделенные из последовательных десятикратных разведений вируссодержащей  жидкости культуры клеток почки сайги, содержащей  вирус  болезни Найроби с  титром инфекционной активности - 6,2 ± 0,2 lg ТЦД50/см3. Рассчитанное значение аналитической чувствительности  метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени составило 0,2  lg ТЦД 50/см 3 (Рис. 5).

       На базе лаборатории Биофизики проведены комиссионные испытания тест – системы, а также разработаны методические положения по ее применению, утвержденные академиком – секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 30.11.2011 г.

       

       

       

       

3.3 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов болезни Найроби  и лихорадки долины Рифт методом мультиплексной ОТ - ПЦР в режиме реального времени

На основе анализа имеющихся в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей различных штаммов вируса болезни Найроби и ЛДР были  подобраны и синтезированы 2 пары олигонуклеотидных праймеров, комплементарные генам нуклеокапсидных белков N обоих вирусов (праймеры NSD U и NSD D гибридизуются с  геномом вируса болезни Найроби, праймеры RVF U и RVF D - с геномом вируса ЛДР). Для детекции накопления продуктов амплификации генома вируса болезни Найроби использован  олигонуклеотидный зонд  NSD Z, меченый флуорофором Cy5, а генома вируса ЛДР - зонд RVF Z, меченый флуорофором FAM.

Оптимизацию условий постановки ОТ-ПЦР  в режиме реального времени проводили с использованием в качестве мишеней для отжига праймеров препараты РНК вирусов болезни Найроби  и  ЛДР. Реакцию обратной транскрипции проводили по описанной выше методике с использованием праймеров NSD D и RVF D. Амплификацию с детекцией результатов в реальном времени проводили с использованием детектирующих термоциклеров  ''IQ-5'' (Bio-Rad, США) и  ''Rotor Gene 6000'' (Corbett Research, Австралия).

Для конструирования рекомбинантных положительных контролей к  тест-системе на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени использовали амплифицированные фрагменты S- сегментов геномов вирусов болезни Найроби (штамм ММ/К-05) и ЛДР (штамм RVF-2002/09-ПС), соответственно.

Аналитическую чувствительность мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени  определяли, исследуя препараты РНК, выделенные из последовательных десятикратных разведений  образцов культурального материала  (культуры клеток почки сайги), содержащего  вирусы болезни Найроби (штамм ММ/К-05) и ЛДР (штамм RVF 2002/09-ПС). Пределом чувствительности считали максимальное разведение, при котором регистрировали положительный результат.

Рассчитанное значение аналитической чувствительности  метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени  для вируса болезни Найроби составило 2,2 ± 0,2 lg ТЦД 50/см3, для вируса ЛДР - 2,5 ± 0,3  lg ТЦД 50/см 3.

Специфичность тест-системы оценивали путем исследования препаратов РНК вирусов болезни Найроби, лихорадки долины Рифт, гетерологичных вирусов, а также препаратов нуклеиновых кислот, выделенных из интактных образцов (Рис.6 и 7).

 

Исследованные препараты РНК гетерологичных вирусов и интактные образцы оказались отрицательными на наличие геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР.  Кроме того, было показано, что праймеры и зонд, комплементарные геному вируса болезни Найроби, не взаимодействовали с геномом вируса ЛДР, и наоборот.

На базе лаборатории Биофизики проведены комиссионные испытания тест – системы, а также разработаны методические положения по ее применению, утвержденные академиком – секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым А.М. 10.11.2011 г.

3.4 Выявление генома вируса болезни Найроби в пробах органов от экспериментально зараженных белых мышей

Для определения возможности выявления генома вирусов болезни Найроби и ЛДР в пробах органов инфицированных животных были проведены эксперименты по заражению животных. С этой целью 10 белых мышей - сосунков были интрацеребрально заражены вирусом болезни Найроби (штамм ММ) в дозе 1000 MicLD50. На 3 сутки после заражения мышей убивали, от каждой были взяты пробы мозга, печени и сердца. При исследовании этих проб методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени был выявлен  геном вируса болезни Найроби.        

3.5  Выявление генома вируса болезни Найроби в пробах крови и органов от экспериментально зараженных вакцинированных и невакцинированных овец

В эксперименте использованы четыре овцы. Первую и вторую овцу прививали вакциной, изготовленной из аттенуированного штамма ММ вируса болезни Найроби, третья и четвертая овцы были контрольными. Через 14 дней после иммунизации провели заражение вакцинированных и контрольных овец вирусом болезни Найроби (вирулентный штамм NSD-X). После инфицирования у контрольных овец (№№ 3 и 4) развилась лихорадка и  в крови был выявлен геном вируса болезни Найроби. Впоследствии у овцы № 4 появились характерные клинические признаки болезни (диарея, угнетение, отказ от корма) и на 6 сутки она пала. У овцы № 3 болезнь протекала в более мягкой форме, и после 8 - дневной лихорадки животное выздоровело. Геном вируса болезни Найроби в пробах крови этой овцы выявляли с 4 до 7 суток после заражения; начиная с 8 суток (т.е. после падения температуры) геном возбудителя не выявляли) (Рис. 8).

С помощью разработанной тест – системы были исследованы пробы органов от павшей овцы. Геном вируса болезни Найроби был обнаружен в пробах сердца, печени, почек, легких, селезенки, слепой кишки и брыжеечных лимфатических  узлов (Рис. 9). Вакцинированные овцы на протяжении всего времени наблюдения оставались здоровыми. В пробах крови от этих овец геном вируса болезни не обнаруживали, что свидетельствует об отсутствии репродукции вируса в их организме. 

 

3.6. Секвенирование и филогенетический анализ геномов музейных штаммов вируса болезни Найроби

Для проведения филогенетического анализа были использованы гены нуклеокапсидного белка (N) и гликопротеина (Gn) штаммов  NSD-X, МК, ММ, ММ/К-05 вируса болезни Найроби, депонированных в коллекции музейных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

В результате проведенных исследований были определены нуклеотидные последовательности фрагмента (930 п.о.) гена N и фрагмента гена Gn (783 п.о.), которые  были проанализированы в программе Mega 5.0. Филогенетические деревья (Рис. 10 и 11) строили по методу максимальной экономии, достоверность распределения последовательностей по группам оценивали бутстрэп – анализом со 100-кратной повторностью. Кроме того в работе были использованы геномные последовательности различных штаммов вируса болезни Найроби, доступные в базе данных генетической информации GenBank.

Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей обоих генов показал, что штаммы вируса болезни Найроби могут быть разделены на 2 группы: штаммы, выделенные в Африке, и штаммы, выделенные в Азии. Музейный вирулентный штамм NSD-Х входит в африканскую группу, что согласуется с паспортными данными на этот штамм (был выделен Монтгомери из крови больных овец в Кении в 1960 г.). Штамму NSD-Х филогенетически наиболее близок кластер, включающий аттенуированные штаммы  ММ, ММ/К-05 и МК. Генетические различия между нуклеотидными последовательностями геномов этих штаммов минимальны и составляют 0,5 - 1%.

3.7  Секвенирование и филогенетический анализ геномов музейных штаммов вируса лихорадки долины Рифт

Для проведения филогенетического анализа были выбраны гены неструктурного  белка (NSs) (622  п.о.) и гликопротеина Gс (956 п.о.) музейных штаммов  RVF(s) 13, RVF(s)113, RVF 2002/09-ПС, 1974 ВНИИВВиМ вируса ЛДР, депонированные в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Филогенетические деревья (Рис. 10 и 11) строили по методу максимальной экономии, достоверность распределения последовательностей по группам оценивали бутстрэп – анализом со 100-кратной повторностью (Рис. 12 и 13).

На обеих дендрограммах музейные штаммы вируса ЛДР входят в один кластер со штаммами Smithburn и Entebbe, что согласуется с данными об их происхождении. Однако анализ последовательностей гена Gс позволяет более точно проследить филогенетические взаимоотношения между этими штаммами: штаммы RVF(s)13 и RVF(s)113 наиболее близки со штаммом  Smithburn, чем со штаммами RVF 2002/09-ПС  и  1974-ВНИИВВиМ.

       

Рисунок 12.  Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена NSs  вируса ЛДР (метод максимальной экономии)

Рисунок 13.  Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена Gc  вируса ЛДР (метод максимальной экономии)

4. ВЫВОДЫ

1.Разработаны тест-системы для выявления генома вируса болезни Найроби методом гнездовой ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени с аналитической чувствительностью 0,2 lg ТЦД 50/см3, позволяющие выявлять геном вируса болезни Найроби в крови и пробах органов от инфицированных или павших животных, а также в инфицированных культурах клеток.

2. Разработана тест-система для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющая выявлять геномы вирусов болезни Найроби и ЛДР, а также одновременно дифференцировать их между собой и другими представителями семейства Bunyaviridae. Рассчитанное значение аналитической чувствительности  метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени  для вируса болезни Найроби составило 2,2 ± 0,2 lg ТЦД50/см3, для вируса ЛДР - 2,5 ± 0,3  lg ТЦД50/см3.

3. Установлено, что в крови  экспериментально зараженных овец геном вируса болезни Найроби  возможно выявлять с 3 по 8 сутки после инфицирования.

4. На основе данных нуклеотидного секвенирования фрагментов генов N  и Gn вируса болезни Найроби и филогенетического анализа установлена гомология  геномов музейных штаммов Х, ММ, ММ/К-05 и МК с геномом африканского  штамма  NSD 708 (степень нуклеотидной идентичности относительно гена N составляет 88 - 90 %, относительно гена Gn -  97 - 98 %) .

5.  На основе данных нуклеотидного секвенирования фрагментов генов NSs и Gc  вируса ЛДР и филогенетического анализа установлена гомология геномов музейных штаммов 1974 - ВНИИВВиМ, RVF 2002/09-ПС, RVF(s)113, RVF(s)13  с геномами штаммамов Smithburn и Entebbe (степень нуклеотидной идентичности 99,0 – 99,7 %).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Специфические оригинальные олигонуклеотидные праймеры могут быть использованы для определения нуклеотидных последовательностей сегментов генома  вирусов Найроби и ЛДР, проведения генетической характеристики штаммов и изолятов указанных возбудителей, создания генетических паспортов вакцинных штаммов и рекомендуются для практического применения в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

«Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Найроби  методом гнездовой полимеразной  цепной реакции», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины  Россельхозакадемии Смирновым А.М. 16.11.2011 г.; «Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Найроби методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины  Россельхозакадемии Смирновым А.М. 30.11.2011 г.,  «Методические положения по выявлению РНК вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины  Россельхозакадемии Смирновым А.М. 10.11.2011 г., предлагаются для  диагностики болезни Найроби и лихорадки долины Рифт в специализированных ПЦР-лабораториях.

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арбовирусы и заболевания человека // Доклад научной группы ВОЗ (технический доклад № 369).- Женева, 1968.- С.30-3.

2. Белов, А.В. Тест-система  на  основе  ПЦР  в  реальном  времени  для выявления вируса ЛДР / А.В. Белов,  Т.В. Гребенникова,  А.Д. Забережный,  А.М. Бутенко, Т.И. Алипер // Ветеринария. - 2007. - № 6. - С.53-55.

3. Вергун, Л.Ю. Способ и набор для обнаружения вируса лихорадки долины Рифт в биологическом материале / Л.Ю. Вергун, И.Ф. Вишняков // патент на изобретение № 2122210; заявлено 26.05.1994; опубл. 20.11.1998.

4. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин.- М., 1990. - 352 с.

  5. Маниатис, Т., Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: пер. с англ. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М.: Мир, 1984. – 480 с.

6.  Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, И.В. Фомина - М., ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

7.  Bird, H.B. Highly Sensitive and broadly reactive quantitative reverse transcription-PCR assay for high-throughput detection of  Rift Valley Fever virus/ B.H. Bird, D.A. Bawiec, T.G. Ksiazek [et al.] // J. of Cl. Microbiology. -2007. - V.45, № 11. - Р. 3506 –3513.

8. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom  [et al.] // J. of Cl. Microbiology. -1990. - V. 28, № 3.-P.495 – 503.

9. Chomczynski, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi //Anal. Biochem. – 1987. - Vol.162, № 1.- P.156-159.

10.  Davies, F.G. Nairobi sheep disease / F.G. Davies - Parasitologia.-1997.- V.39,  № 2, Р. 95- 8.

11.  Garcia, S. Quantitative real-time PCR detection of  Rift valley fever virus and its application to evaluation of antiviral compounds / S. Garcia, J.M. Crance, A. Billecocq [et al.] // J. of Cl. Microbiology. -2001. - V.39, № 12. - Р. 4456 - 446.

12. Geering, W.A. Nairobi sheep disease in exotic diseases of animals/ W.A. Geering, A.J. Forman, M.J. Nunn //Aust. Gov. Publishing Service, Canberra. - 1995. - Р. 159 - 172.

13.  Marczinke,  B. I. Nairobi sheep disease virus, an important tick-borne pathogen of sheep and goats in Africa, is also present in Asia / B.I. Marczinke, S.T. Nichol // Virology. - 2002.-V.303.-№ 1 - P. 146 - 151.

14. Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, D.W. Russell  - Cold  Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.-V.1. -749 p.

15. Sall, A.A. Single tube and nested RT-PCR for detection of RVFV in human and animal sera //A.A. Sall, J. Thonnon, O.K. Sene / J. Virol. Methods. - 2001. - V.91.-P. 85-92.

16. Sall, A.A. Use of RT-PCR in early diagnosis of Rift valley fever / A.A. Sall, E.A. Macondo, O.K. Sene  [et al.] // Clin. and Diagn. Lab. Immunol. - 2002. -V.9, № 3. - P.713-715.

17. Walter, Ch.T. Recent advances in the molecular and cellular biology of bunyaviruses / Ch. T. Walter, J. N. Barr // Journal of General Virology.-2011.-V.92.-P. 2467 - 2484.

7. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сальников, Н.И. Выявление генома вируса болезни Найроби методом гнездовой ОТ-ПЦР / Н.И.Сальников, А.С. Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых/ ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. – Покров, 2009. – С.114-118.

2. Application of genome analysis methods for identification of Nairobi sheep disease agent / N.I. Salnikov, A.S. Malogolovkin, S.Zh. Tsybanov, D.V. Kolbasov//4th Annual meeting Epizone «Bridges to the future» Saint - Malo, France, 2010. - P.180.

3. Выявление геномов вирусов болезни Найроби и лихорадки долины Рифт  методом  ОТ – ПЦР в режиме  «реального времени» / Н.И. Сальников, А.С. Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // Молекулярная диагностика -2010: материалы Международной конференции. - М., 2010. -  Т. 2. - С. 166 -168.

4. Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест –система для выявления генома вируса болезни Найроби овец методом обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации / Н.И. Сальников,  А.С. Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов, А.Г. Гузалова, Д.В. Колбасов // Патент на изобретение № 2416647; заявлено 09.11.2009; опубл. 20.04.2011., Бюл. № 11. - 8 с.

5. Тест-система для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ-ПЦР в  режиме реального времени / Н.И. Сальников, С.П. Живодеров, Н.В. Малоголовкина, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // Ветеринарная патология. - М.-2011.-№ 4.-С.54-57.

6. Тест-системы на основе ОТ-ПЦР в режиме реальном времени для диагностики особо опасных экзотических буньявирусных инфекций/ Н.И. Сальников, Е.О. Жабон, Е.А. Балашова, С.Ж. Цыбанов // Высокие технологии, прикладные и фундаментальные исследования в фармакологии, физиологии и медицине: материалы Международной научно - практической  конференции.-Санкт-Петербург, 2011.-Т.2.-С.290-291.

7. Разработка и совершенствование методов диагностики лихорадки долины Рифт / О.В. Капустина, Т.Э. Южук, Н.И. Сальников, В.Н. Пономарев, М.Б. Колосова // Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных: материалы Всероссийской научно - практической конференции с международным участием / ООО «Экспо-Медиа». - Ставрополь, 2012.- С.172-173.

8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

г. Покров Владимирской области

Тираж 80 экз.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.