WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Семанина Екатерина Николаевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA И РАЗРАБОТКА НА ИХ ОСНОВЕ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ

03.02.03 – микробиология

03.01.06 – биотехнология

(в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Саратов – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном

образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители:  доктор биологических наук, профессор

  Васильев Дмитрий Аркадьевич

  кандидат ветеринарных наук, доцент

  Васильева Юлия Борисовна

Официальные оппоненты: 

Щербаков Анатолий Анисимович

доктор биологических наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»,

заведующий лабораторией микробиологии вирусологии и иммунологии

Гильмутдинов Рустам Якубович

доктор биологических наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»,

заведующий кафедрой патологической физиологии

Ведущая организация:  ФГБУ Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, г. Москва

Защита диссертации состоится « » марта 2012 года в 00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» (410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан « » февраля 2012 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор  Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время особое внимание уделяют диагностике малоизученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относится бордетеллёзная инфекция, возбудитель которой у животных обычно не идентифицируется (Gueirard, 1995; Mattoo, 2005; Мастиленко, 2011). Без сомнения Bordetella bronchiseptica играет одну из основных ролей в появлении вторичных инфекций, но анализ литературных данных последних лет показал, что у животных она может выступать как возбудитель самостоятельного заболевания (Jacobs et al., 1993; Coutts et al., 1996; Parton, 2005).

Бордетеллёзом болеют собаки, лошади, свиньи, обезьяны, козы, лисы, кролики, кошки, хорьки, хомяки, крысы, морские свинки, птицы и др. (Goodnow, 1980; Yuk et al., 2000).

Данный микроорганизм является инфекционным агентом, индикации и идентификации которого в нашей стране в настоящее время уделяется все большее внимание. За последние годы  разработана полимеразно-цепная реакция для идентификации возбудителя бордетеллёза (Васильев, Мастиленко, Васильева, 2010), а также бактериологическая схема с применением селективно – диагностической питательной среды УГСХА BBR 57, позволяющая поставить диагноз в течение 96 часов (Васильев, Сверкалова, Васильева, 2010).

В настоящее время установлено, что В. bronchiseptica может вызывать патологию дыхательных путей человека (Woolfrey, 1991; Bauwens, 1992; Gueirard, 1995; Bjornstad, 2005; Mattoo, 2005).

В исследованиях C.R. Helps (2005) было показано, что при исследовании сывороток 126 кошек у 70 % были обнаружены антитела к В. bronchiseptica, а возбудитель был выделен у 5 % из числа исследуемых животных. Эта инфекция чаще всего встречается в многочисленных сообществах кошек домашнего содержания, где в анамнезе животных уже присутствовали респираторные заболевания (Goodnow, 1980; Widney, 2005; Egberink, 2009).

Многие аспекты бордетеллёзной инфекции до сих пор остаются неясными. В значительной степени это обусловлено отсутствием недорогих высокоточных методов диагностики бордетеллёза, что затрудняет получение исчерпывающей эпизоотологической и эпидемиологической  информации. В отечественной ветеринарной практике вопрос выделения фагов B. bronchiseptica и их применение с диагностической це­лью не изучался. Решение этих вопросов представляет научный и практический интерес.

Цель работы – выделить фаги B. bronchiseptica, изучить основные биологические свойства,  разработать технологические параметры и создать биопрепарат для индикации и идентификации B. bronchiseptica.

Задачи работы:

  1. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении  B. bronchiseptica.
  2. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и её спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу) выделенных бактериофагов.
  3. Подобрать оптимальный набор бактериофагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат для диагностики бордетеллёза.
  4. Разработать схему идентификации B. bronchiseptica с помощью бактериофагов.
  5. Разработать биотехнологические параметры изготовления диагностического биопрепарата.
  6. Разработать схему ускоренной индикации B. bronchiseptica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

Научная новизна. Впервые выделены штаммы фагов, активные в отношении B. bronchiseptica. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфология негативных колоний, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, температурная устойчивость, устойчивость к действию хлороформа, изменение литической активности при хранении.

Впервые для целей идентификации бактерий B. bronchiseptica разработан биопрепарат B.br. – 11 УГСХА на основе отобранных фагов.

Впервые разработана и апробирована на объектах внешней среды, патологическом материале, больных животных схема реакции нарастания титра фага для индикации бактерий B. bronchiseptica за 26 часов с использованием биопрепарата бактериофага B.br. – 11 УГСХА. Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата бактериофага B.br. – 11 УГСХА для индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica.

Практическая значимость работы. Выделены и селекционированы бактериофаги, активные в отношении B. bronchiseptica. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе бактериофагов и усовершенствована схема индикации B. bronchiseptica с применением РНФ в течение 26 часов. Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Bordetella bronchiseptica B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА», утвержденная ректором ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (24 октября 2011г).

Результаты исследований биологических свойств бактериофагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА, а также возможность использования бактериофагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА в схеме реакции нарастания титра фага подтверждены актами комиссионных испытаний в ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (12 октября 2011 г).

По материалам диссертационной работы разработаны: «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий Bordetella bronchiseptica методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора» (в соавторстве с Васильевым Д.А., Васильевой Ю.Б.), «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофагов B.br. – 7 УГСХА и B.br.  – 1 УГСХА» (в соавторстве с Васильевым Д.А., Васильевой Ю.Б.) для студентов старших курсов факультета ветеринарной медицины и биотехнологического факультета ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», а также сотрудников медико-биологических научных учреждений и врачей бактериологов, утвержденные ректором ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (24 октября 2011 г). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

  1. Воздействие на бактерии B. bronchiseptica ультрафиолетовым излучением по разработанной схеме способствует выходу профага.
  2. Данные о биологических свойствах фагов B. bronchiseptica позволяют отобрать изоляты для изготовления биопрепарата и использовать его в схеме идентификации возбудителя бордетеллеза за 66 часов.
  3. Разработанная схема индикации B. bronchiseptica в объектах ветеринарного надзора при помощи РНФ с использованием диагностического  биопрепарата B.br. – 11 УГСХА ускоряет определение данного возбудителя до 26 часов.
  4. Разработаны технологические параметры изготовления активного и специфического биопрепарата на основе бордетеллёзных фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены: Всероссийской научно-практической конференции «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск, 2007); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009); Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010).

По теме диссертационной работы в 2011 году получен грант Министерства образования и науки Российской Федерации Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса».

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (№ гос. регистр. 01201161409).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 147 страницах, иллюстрированы 32 таблицами и 14 рисунками. Список использованных литературных источников содержит 109 отечественных и 92 зарубежных автора.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект, материалы и методы исследований

Объекты исследований: референс-штаммы B. bronchiseptica в количестве 5 (№ 1, № 7, № 214, № 22067, № 8344) и 1 штамм Bordetella parapertussis (№ 119); референс-штаммы бактерий других родов, в количестве 24 (Yersinia pseudotuberculosis № 0630, Morganella morganii, Staphylococcus aureus  № АТСС 25923, Escherichia coli № 4, № АТСС 25922, Proteus mirabilis № 1, № 523, № 491, Salmonella  typhimurium № 82, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis № 189, Providencia rettgeri № 104а, № 102д, № 175, Aeromonas hydrophila № 01, № 02, Pseudomonas putida № 12633, № 901, Enterobacter cloacae № 1487, № 10005, Bacillus cereus № 2527, Bacillus subtillis № 6633), полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», которые, в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами; 48 штаммов  B. bronchiseptica, выделенных от собак и кошек (с клиническими проявлениями респираторных заболеваний); 8 штаммов фагов B. bronchiseptica.

Объекты внешней среды: сточные воды, смывы с глотки больных животных, патологический материал от больных и павших животных.

Питательные среды и реактивы: мясопептонный бульон, мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда Эндо, казеиново-угольный агар, бордетелл-агар, кровяной агар и среда Борде-Жангу,  среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург), агар-агар, натрий хлорид, мочевина, перекись водорода, желатин, среда УГСХА BBR 57.

Методы: в работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения и идентификации бактерий (Васильев и др., 2004; Лабинская, 2008; 2010). Основные биохимические свойства штаммов B. bronchiseptica исследовали с использованием тест-системы, разработанной в НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург. Оксидазный тест проводили с применением 1 % раствора N, N-диметил-фенилендиамина (Лабинская, 2010). Тест на каталазную активность проводили с применением 3 % раствора перекиси водорода (Скородумов и др., 2005).

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов проводили с помощью методов, предложенных М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), С. Лурия, Д. Дарнелл (1970), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (2006). Постановку РНФ для индикации B. bronchiseptica в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом (1961).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы SPSS statistics 17.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и идентификация B. bronchiseptica

Исследованы морфологические свойства 5 референс-штаммов B. bronchiseptica. Все референс-штаммы B. bronchiseptica были представлены коккобациллярными палочками, окрашивались по Граму отрицательно. В мазках располагаются одиночно, парами, редко короткими цепочками. При посеве в толщу агара, а также методом висячей капли определяется подвижность бордетелл. Все референс-штаммы являлись подвижными при постановке тестов.

При исследовании культуральных свойств показано, что на МПА после 24 часов инкубирования посевов референс-штаммы B. bronchiseptica  образуют выпуклые, гладкие, полупрозрачные мелкие колонии жемчужного цвета. При открытии чашки Петри с засеянными бордетеллами чувствуется специфический заплесневелый запах. При снятии колоний с поверхности агара определяется их слизистая консистенция. Из 5 референс-штаммов B. bronchiseptica № 1, № 7, № 22067, № 214 и № 8344, последний образует самые мелкие колонии диаметром 0,2-0,4 мм.

На мясопептонном бульоне в первые 24 часа культивирования референс-штаммы B. bronchiseptica вызывают равномерное помутнение среды с последующим образованием осадка и пристеночного кольца.

На бордетелл-агаре (производство Hi Media) при температуре 37 С в течение 18-24 ч исследуемые референс-штаммы формируют мелкие, блестящие, прозрачные с ртутным или жемчужным отливом, куполообразные колонии, которые имеют гладкую поверхность.

Результат изучения ферментативных свойств для референс-штаммов  B. bronchiseptica: не гидролизуют желатин, не продуцируют индол, продуцируют оксидазу, каталазу, уреазу. Референс-штаммы не ферментируют углеводы. Восстанавливают нитраты до нитритов.

Нами проведены исследования по выделению бордетелл от домашних животных и из внешней среды. Для этого брали мазки с задней стенки глотки собак и кошек ватными палочками и делали посев на бордетелл-агар с  0,04 % цефазолином или на МПА, с добавлением 0,04 % спиртового раствора генцианвиолета (0,1 мл на каждые 100 мл МПА), методом штриха. Для типирования бордетелл использовали микроскопию с окраской по Граму выросших колоний, культивирование на обычных и селективных средах, тесты на подвижность, оксидазу, индол, ферментацию углеводов. Было исследовано 157 проб, выделено 11 полевых штаммов B. bronchiseptica.

Выделение бактериофагов B. bronchiseptica

Исследование культур B. bronchiseptica на наличие бактериофагов без воздействия индуцирующего фактора. Результаты исследований штаммов  B. bronchiseptica на наличие профага свидетельствуют, что культуры  B. bronchiseptica без воздействия на них индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Проведено 17 опытов, положительных результатов не было.

Выделение фагов B. bronchiseptica из объектов внешней среды и от животных. Вторым этапом наших исследований стало выделение бактериофагов B. bronchiseptica из объектов внешней среды и от животных. Всего нами исследовано 104 пробы, бактериофаги среди них не обнаружены.

Выделение фагов B. bronchiseptica из бактерий при помощи индуцирующего фактора. В третьей серии опытов на культуры B. bronchiseptica воздействовали индуцирующим фактором. В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами.

Схема выделения фагов B. bronchiseptica воздействием на бактерии ультрафиолетовым излучением

Опыты по облучению бактерий УФЛ проводились со всевозможными временными интервалами, а также с  различного расстояния от объекта до лампы.

1 день: посев газоном суточной культуры B. bronchiseptica на мясопептонный агар, подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 5-7 мин. Далее инкубирование чашек Петри с обработанными бактериями в термостате при 37 С в течение суток.

2 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния  1 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат  (37 С) на сутки.

3 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат  (37 С) на сутки.

4 день: смыв выросших колоний мясопептонным бульоном с чашек Петри, помещение в пробирку со штаммами бордетелл. Культивирование в термостате в течение суток.

5 день: обработка хлороформом 1 часть хлороформа и 10 частей фаголизата в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин – 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в стерильную пробирку.

6 день: учет результатов. Присутствие бактериофага определяли по наличию зон лизиса.

После выделения бактериофаги пассировали для повышения их литической активности и в дальнейшем проводили селекцию по морфологическим признакам.

Селекционированные бактериофаги имели прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром 0,5-4,0 мм. Литическая активность составила более 10-6 по Аппельману, и 5,3 х 107 по Грациа корпускул в 1 мл фаголизата.

Данные нашего эксперимента показывают, что облучение бактерий УФЛ по предложенной схеме способствует выходу профага из клеток B. bronchiseptica.

В процессе работы по выделению бактериофагов с применением УФЛ в общей сложности нами было проведено 29 экспериментов. Описанным выше методом нам удалось выделить 8 фагов B. bronchiseptica из 14 штаммов бактерий. Выяснилось, что 6 штаммов бактерий B. bronchiseptica не проявили лизогенных свойств.

Характеристика биологических свойств выделенных бактериофагов

Морфология негативных колоний

Негативные колонии, образуемые бактериофагами, по наличию зоны неполного лизиса, вторичного роста и величине колоний можно разделить на два типа (Борисов, 1976). К первому типу относятся негативные колонии круглые, прозрачные, диаметром более 3 мм, с зоной неполного лизиса по периферии шириной 0,5 – 4 мм или без неё: B.br. – 7 УГСХА, B.br. –22067 УГСХА, B.br. – 214 УГСХА.

Колонии второго типа круглые, прозрачные или полупрозрачные, с ровными краями, диаметром до 2 мм: B.br. – 1 УГСХА, B.br. – 10 УГСХА,  B.br. – 11 УГСХА, B.br. – 13 УГСХА и B.br. – 8344 УГСХА.

Литическая активность бактериофагов B. bronchiseptica

Литическую активность селекционированных фагов определяли по методам Аппельмана и Грациа (Гольдфарб, 1961).

Активность исследуемых бактериофагов варьировала от 5,3 х 107 до 4,3 х 109. По исследованным параметрам для конструирования диагностического набора фагов отобраны наиболее активные их них: B. bronchiseptica - 1 УГСХА по Аппельману 10-7, по Грациа 3,1 х 108 и B. bronchiseptica - 7 УГСХА  по Аппельману 10-8, по Грациа 4,3 х 109.

Спектр литического действия бактериофагов B. bronchiseptica

Для изучения спектра литического действия выделенных фагов мы использовали 53 культуры бактерий B. bronchiseptica.

По результатам исследований наибольшим совместным спектром литического действия обладали бактериофаги B. bronchiseptica - 1 УГСХА и B. bronchiseptica - 7 УГСХА. Они лизировали 92,5 % имеющихся штаммов.

Учитывая литическую активность и спектр литического действия бактериофагов B. bronchiseptica для дальнейших исследований нами было отобрано 2 фага – B. bronchiseptica – 1 УГСХА и  B. bronchiseptica – 7 УГСХА.

Специфичность действия исследуемых фагов B. bronchiseptica

В качестве гетерологичных культур использовали микроорганизмы указанные в материалах и методах.

Бактериофаги B. br. - 1 УГСХА и B. br. - 7 УГСХА не вызывали лизис ни одной из испытуемых культур других видов бактерий.

Температурная устойчивость фагов B. br. 1 УГСХА и B. br. 7 УГСХА

В результате исследований было установлено, что прогревание фагов B. br. – 1 УГСХА и B. br. – 7 УГСХА при температуре 60 С в течении 30 минут не оказало влияния на активность фагов, бактерии погибали при данной температуре. Нагревание бактериофагов свыше 65 С приводило к потере их активности.

Устойчивость бактериофагов к воздействию хлороформом

В результате проведенных исследований установлено, что бактерии инактивируются при действии хлороформа при 10 минутной обработке. Бактериофаги  B.br. – 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 30 минут. Наблюдалось снижение активности фагов при обработке хлороформом свыше 30 минут с 2,2 х 108 до 3,2 х 107 у B.br. – 1 УГСХА и с 2,1 х 109  до 5,3 х 107 у B.br. - 7 УГСХА по методу Грациа. Активность бактериофагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА восстанавливалась после одного пассажа.

Разработка параметров ускоренной идентификации B. bronchiseptica

с помощью бактериофагов

Используя строгую специфичность селекционированных бактериофагов по отношению к штаммам B. bronchiseptica, мы разработали схему ускоренной идентификации этих микроорганизмов (рис. 1).

При наличии в мазках грамотрицательных палочек, располагающихся одиночно или короткими цепочками, проводили типирование бактерий бактериологическим методом и с помощью бактериофагов B.br. – 1 УГСХА и  B.br. – 7 УГСХА.

Результаты проведенных опытов демонстрируют возможность идентификации B. bronchiseptica с помощью фагов B.br. – 1 УГСХА и  B.br. – 7 УГСХА, срок исследования по сравнению с бактериологическим методом при этом сокращается со 96 до 66 часов при меньшем расходе лабораторной посуды, питательных сред, реактивов.

Рис. 1.  Выделение  бактерий B. bronchiseptica и ускоренная идентификация с помощью бактериофагов в сравнении со схемой бактериологического исследования

Разработка технологических параметров изготовления и контроля

диагностического фагового биопрепарата

Характеристика индикаторных культур

Бордетеллёзные индикаторные бактериофаги получали путем культивирования в мясопептонном бульоне с B. bronchiseptica. В качестве индикаторной культурой для фагов B.br. – 7 УГСХА и B.br. – 1 УГСХА использовали штамм B. bronchiseptica № 8344, обладающий характерными для своего вида морфологическими, биохимическими и культуральными свойствами.

Штаммы фагов поддерживали на индикаторной культуре B. bronchiseptica № 8344 в мясопептонном бульоне. Для повышения активности бактериофагов проводили пассажи. Опытным путем определяли оптимальное соотношение времени пассажа по литической  активности фагов.

Установлено, что оптимальное время контакта культуры с фагами B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА составляет 7 часов. Этот режим мы использовали в дальнейших исследованиях.

Определение оптимальных количественных параметров соотношения фаговых корпускул и клеток бактерий B. bronchiseptica

Результаты проведенных исследований показали, что литическая активность бордетеллёзных фагов при разных соотношениях индикаторной культуры и фага была одинаково высокая и соответствовала 1,3 х 107 – 3,1 х 108 фаговых корпускул в 1,0 см3.

Оптимальное соотношение количества фагов B.br. – 7 УГСХА, B.br. – 1 УГСХА и культуры составляет 1:2, литическая активность фагов при этом составляет 2,1 х 108, 4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл соответственно.

Определение оптимального температурного режима культивирования бактериофагов B. bronchiseptica

Литическая активность фага B.br. – 1 УГСХА по методу Аппельмана при температуре 25 С,  37 С  и 42 С  составила 10-6,10-7 и 10-6;  по методу Грациа – 1,3 х 107, 3,1 х 108 и 1,1 х 107, соответственно. Титр фага B.br. – 7 УГСХА составил по методу Аппельмана 10-7, 10 -8 и 10-7– при 25 С, 37 С  и 42 С; по методу Грациа 1,4 х 108, 4,3 х 109 и 2,6 х 108 активных корпускул в 1 мл соответственно.

На основании полученных данных можно сделать вывод: оптимальным для культивирования фагов B. bronchiseptica является температура 37 С.

Хранение бактериофагов

Изучение изменения литической активности бактериофагов с истечением времени связано с изысканием оптимальных условий хранения и кратности пересева производственных штаммов, а также со сроком годности фаговых препаратов. Селекционированные бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и  B.br. – 7 УГСХА хранились во флаконах, при температуре 4 С в виде лизатов бульонных культур, без консерванта. Литическую активность определяли по истечении 3, 6, 9 и 12 месяцев. Анализируя результаты проведенных исследований, можно сделать вывод, что по истечении 12 месяцев бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА не изменили своей литической активности и они могут использоваться в качестве диагностического биопрепарата.

Контроль бактериофагов

Из полученного объема отбирали пробу каждого фага по 50 мл для определения чистоты физических свойств, титра фага по отношению к индикаторной культуре, спектра литической активности и специфичности.

Индикаторные фаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА не содержали посторонних примесей, фаголизаты были прозрачными, светло-желтого цвета, на питательных средах с посевами рост бактериальной микрофлоры и грибов отсутствовал, литическую активность индикаторных бактериофагов  B.br. – 7 УГСХА и B.br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельмана и Грациа (литическая активность индикаторных фагов составила от 10-7 по методу Аппельмана и от 3,1 х 108 до 4,3 х 109 по Грациа), спектр литического действия фага B.br. – 7 УГСХА составил 81,1 %, фага B.br. – 1 УГСХА – 47,2 % из числа изучаемых штаммов, совместный спектр лизиса гомологичных бактерий составил 92,5 %. По результатам изучения специфичности установлено, что индикаторные бордетеллёзные фаги являются неактивными в отношении штаммов других видов, родов.

Получив положительные результаты контроля, фаголизаты B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА разлили по 5,0 мл в стерильные флаконы и герметично закрыли. На флаконы наклеили этикетки с указанием наименования фага, литической активности бактериофагов, даты упаковки.

Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага

Определение количественного показателя РНФ

Установлено, что результат реакции является положительным (увеличение количества корпускул фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. 7 УГСХА более чем в 5 раз) в пробах при контаминации мясопептонного бульона бактериями B. bronchiseptica в концентрации 103 микробных клеток в 1 мл.

Определение оптимального времени постановки РНФ

В исследованиях использовали воду, смывы с глотки, фекалии, контаминированные бактериями B. bronchiseptica в концентрации 105, 104, 103, 102, 101 м.к. в 1 мл.

Опыты по изучению чувствительности реакции в зависимости от времени контакта исследуемого материала с фагом показали, что РНФ с 7-часовой экспозицией материала с фагами B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА позволяет провести индикацию бактерий вида B. bronchiseptica в концентрации 104 м.к./мл за 19 часов.

В результате исследований установлено, что метод РНФ с предварительным подращиванием исследуемого материала в течение 7 часов позволяет обнаружить бактерии B. bronchiseptica в количестве 103 м.к./мл, время проведения исследований составляет 26 часов.

Использование РНФ для выявления B. bronchiseptica у домашних животных и в объектах внешней среды

Исследование с помощью РНФ проб физиологического раствора, искусственно контаминированного B. bronchiseptica

Пробы физиологического раствора в объеме 5 мл вносили в колбы, содержащие по 50 мл МПБ, и контаминировали B. bronchiseptica в концентрации от 101 до 105 м.к./мл. Индикаторной культурой для фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА является B. bronchiseptica № 8344.

По результатам проведенных исследований нами установлено, что увеличение титра фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 103 микробных клеток бордетелл в 1 мл физиологического раствора. Время исследований составило 26 часов.

Исследование с помощью РНФ смывов, с глотки собак и кошек, искусственно контаминированных B. bronchiseptica

У собак и кошек брали смыв физиологическим раствором с глотки, в объеме 5 мл. Вносили в колбы, содержащие по 50 мл МПБ и контаминировали  B. bronchiseptica в концентрации от 101 до 105 м.к./мл. По результатам проведенных исследований установлено, что увеличение титра фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 103 микробных клеток бордетелл в 1 мл исследуемых смывов с глотки собак и кошек. Исследование составило 26 часов.

Исследование с помощью РНФ фекалий, искусственно  контаминированных  B. bronchiseptica

Пробы фекалий весом 5 г вносили в стерильные колбы, содержащие по 50 мл МПБ и контаминировали B. bronchiseptica в концентрации от 101 до 105 м.к./мл.

По результатам проведенных исследований установлено, что увеличение титра фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 104 микробных клеток бордетелл в 1 г фекалий. Чувствительность реакции снизилась до этого уровня из-за обильного обсеменения фекалий посторонней микрофлорой, что повлияло на условия оптимального взаимодействия фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА с B. bronchiseptica.

Мы провели повторное исследование исходных проб фекалий с увеличением времени экспозиции материала с фагом до 16 часов, это позволило повысить чувствительность РНФ до 103 м.к./мл, без выделения чистой культуры, при наличии посторонней микрофлоры.

Выводы

  1. Многократным воздействием ультрафиолетовыми лучами на бактериальную клетку B. bronchiseptica по предложенной схеме (1 день: t = 5-7 мин; l = 1м. 2 день: t = 7-10 мин; l = 1м. 3 день: t = 7-10 мин; l = 0,5м), выделено 8 штаммов бактериофагов.
  2. Установлены биологические свойства выделенных фагов B. bronchiseptica.  Литическая активность их варьировала от 10-6 до 10-9 по методу Аппельмана и от 5,3 х 107 до 4,3 х 109 по методу Грациа, а спектр литического действия составил от 20,8 % до 81,1 %. Выделенные бактериофаги строго специфичны по отношению к  B. bronchiseptica и не лизируют бактерии других видов и родов; проявляют устойчивость при обработке хлороформом (1:10) в течение 30 минут и выдерживают 30 минутное нагревание при 60 С.
  3. Отобранные бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА лизировали 92,5 % изученных культур B. bronchiseptica, обладали высокой литической активностью по Аппельману 10-7 – 10-8 , по Грациа 3,1 х 108 – 4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл и имели оптимальные для изготовления биопрепарата свойства.
  4. Фагоидентификация B. bronchiseptica с помощью индикаторных бактериофагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА позволяет идентифицировать гомологичные бактерии за 66 часов, бактериологический метод выделения  B. bronchiseptica составляет 96 часов.
  5. Разработанны технологические параметры изготовления и контроля диагностического биопрепарата «B.br. – 11 УГСХА» на основе выделенных и изученных фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА.
  6. Разработаны  параметры постановки реакции нарастания титра фага для ускоренной индикации B. bronchiseptica в объектах внешней среды. Метод РНФ с использованием биопрепарата «B.br. – 11 УГСХА» на основе фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА позволяет обнаружить указанные бактерии в концентрации от 103 м.к. в 1 мл исследуемого материала за 26 часов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Никульшина Ю.Б., Сверкалова Д.Г., Никулина (Семанина) Е.Н. Разработка методов индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica, выделенных у домашних животных // Ветеринарная патология. 2007. № 2. С. 156–159.
  2. Выделение бактерий рода Bordetella bronchiseptica от домашних животных / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Никулина (Семанина) [и др.] // Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК»: материалы междунар. науч. практ. конф. Москва: МГАУ, 2007. С. 281–284.
  3. Технология конструирования селективной среды для Bordetella bronchiseptica. / Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Никульшина, Д.Н. Хлынов, Е.Н. Никулина (Семанина) // Молодёжь и наука XXI века: материалы II-й Открытой Всероссийской конф. молодых ученых. Ульяновск, 2007. Ч.1. С. 219–222.
  4. Бордетеллёз кошек и собак / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Т.А. Степанова, Е.Г. Семанин, А.С. Казакова, Е.Н. Никулина (Семанина) // Молодёжь и наука XXI века: материалы II-й Открытой Всероссийской конф. молодых ученых. Ульяновск, 2007. Ч.1. С. 222–225.
  5. Поиск селективных компонентов для выделения Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, И.Н. Головин, А.П. Казакова, Т.А. Степанова, Д.Н. Хлынов, Е.Н. Никулина (Семанина), Е.Г. Семанин // материалы 60-ой науч. студ. конф. Ульяновск, 2007. С. 97–100.
  6. Изучение морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств бордетелл / Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Никульшина, Т.А. Степанова, Е.Н. Никулина (Семанина) // материалы 60-ой науч. студ. конф. Ульяновск, 2007. С. 94–97.
  7. Изучение возможности зооантропонозной передачи бордетеллёза / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Д.Н. Хлынов, Е.Н. Никулина (Семанина) [и др.] // тр. Всероссийского совета молодых ученых аграрных образовательных и науч. учреждений. М.: Академия кадрового обеспечения АПК, 2008. Т.1. С. 152–155.
  8. Разработка лабораторных методов диагностики бордетеллёза / Е.Н. Семанина, Е.Г. Семанин, Д.А. Васильев [и др.] // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения: материалы междунар. науч. практ. конф. Ульяновск, 2009. Т.4. С.132–134.
  9. Семанина Е.Н. Разработка биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов для диагностики, лечения и профилактики бордетеллёзной инфекции животных и людей // Актуальные проблемы физической и функциональной электроники: материалы 12-й региональной научн. школы-семинара. Ульяновск, 2009. Т.2. С. 140–141.
  10. Метод выделения фагов Bordetella bronchiseptica при помощи ультрафиолетового облучения / Е.Н. Семанина, Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев [и др.] // Ветеринарная медицина домашних животных: сб. статей. Казань, 2010. Вып.7. С. 244–246.
  11. Семанина Е.Н., Васильева Ю.Б., Васильев Д.А. Выделение фагов Bordetella bronchiseptica // Молодежь и наука XXI века: материалы междунар. науч. практ. конф. молодых ученых. Ульяновск, 2010. Т.3. С. 60–62.
  12. Семанина Е.Н., Васильева Ю.Б., Васильев Д.А. Выделение бактериофагов Bordetella bronchiseptica // Биологически активные вещества микроорганизмов: Всероссийский симпозиум с междунар. участием. Москва. МГУ имени М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 27-29 января 2011. М.: МАКС Пресс, 2011. С. 25.
  13. Изучение основных биологических свойств бактериофагов Bordetella bronchiseptica, выделенных методом индукции / Д.А. Васильев, Е.Н. Семанина, С.Н. Золотухин [и др.] / Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2011. №1 (13). С. 59–62.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.