WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ФЕДОРОВА АЛЬБИНА МУБАРАКОВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ПЕРВИЧНОЙ СОМАТОСЕНСОРНОЙ КОРЫ КРЫС ЛИНИИ WAG/Rij, ИМЕЮЩИХ РАЗЛИЧИЯ ГЕНОТИПА ПО ЛОКУСУ Taq 1A DRD2

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология,

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

САРАНСК - 2012

Работа выполнена на кафедре морфологии и физиологии человека и животных Федерального государственного бюджетного образовательного

учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

 

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор 

Калимуллина Лилия Барыевна

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор 

Кузнецова Галина Дмитриевна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Кругляков Павел Павлович

профессор, доктор биологических наук

Шакирова Галия Рафгатовна

 

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская Академия имени С. М. Кирова

Защита диссертации состоится «05» октября 2012 г.

в «10.00» час на заседании диссертационного совета Д 212.117.01 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева» по адресу: 430005, г. Саранск, ул. Большевистская, д.68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» (430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, д. 68). Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» www.mrsu.ru;  e-mail: dsovet@mrsu.ru

Автореферат разослан «_____» _______________2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биол. наук, профессор  Балашов В.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Эпилепсия представляет собой одно из наиболее распространенных неврологических расстройств – многообразие ее проявлений, внезапность развития приступов, тяжелые нарушения сознания и жизненных функций, приводящих к инвалидизации, определяют неизменную актуальность данной проблемы для здравоохранения и фундаментальной медико-биологической науки (Зенков, 2002; Карлов, 2002; Poonam et al., 2009). Около 70% всех форм эпилепсии начинается в детском возрасте, когда происходит становление организма и формирование личности человека, его отношения к окружающему миру и обществу. Это определяет эпилепсию детского возраста как актуальнейшую медико-социальную проблему.

Одной из самых распространенных форм является детская абсансная эпилепсия (ДАЭ) – форма генерализованной эпилепсии, проявляющаяся малыми припадками (petit mal, абсансы) и наличием на ЭЭГ специфического паттерна. В общей популяции больных с эпилепсией ДАЭ встречается в 2-8% случаев и составляет 10-12% всех эпилепсий в возрасте до 16 лет (Белоусова, Ермаков, 2004). Она относится к разряду идиопатических, т. е. таких, при которых нет другой причины эпилепсии, кроме наследственной предрасположенности.

В прошлом столетии было создано четыре теории, наименование которых отражает мнение ее создателей о роли структур мозга, играющих ведущее значение в процессах формирования генерализованной абсансной эпилепсии: центрэнцефалическая, кортикальная, кортикоретикулярная и теория «таламических часов». В настоящее время в результате исследований, выполненных с использованием признанной модели абсансной эпилепсии – крыс линии WAG/Rij (van Luijtelaar, Coenen, 1986; 1997; Midzyanovskaya, Kuznetsova et al., 2001; Chepurnov et al., 2002, Meeren et al., 2002), получены доказательства, что абсансная эпилепсия является кортикоталамическим типом эпилепсии. При этом кортикальный фокус в периоральной области первичной соматосенсорной коре является ведущим в распространении пик-волновой активности по кортикоталамическим нервным сетям в течение спонтанных судорог (Меерен и др, 2004). Несмотря на убедительные аргументы этой теории, структурные и молекулярно-генетические основы формирования пик-волновой активности в кортикальном фокусе практически не исследованы.

В кортикальном фокусе крыс линии WAG/Rij имеет место дисбаланс взаимоотношений между ГАМК- и глутаматергической системами (Luhmann et al., 1995). Одной из причин его возникновения может быть изменение экспрессии длинной и короткой изоформ рецептора дофамина второго типа (DRD2), предопределяемое его полиморфными локусами (Zhang et al., 2004). Нарушение соотношения длинной и короткой изоформ DRD2 является важным фактором в модуляции дофамином ГАМК- и глутаматергической трансмиссии (Centonze et al., 2003, 2004).

Дофаминергическая система вовлечена в патогенез абсансной эпилепсии у крыс линии WAG/Rij (Warter et al., 1988; Kuznetsova et al., 1996, De Bruin et al., 2000; 2001; Deransart et al., 2000, Midzyanovskaya, Kuznetsova, 2001). Предположение о том, что ведущую роль при этом играет изменение функционирования DRD2 (Кузнецова и др., 1996, Базян и др., 2001, Birioukova et al., 2005, Midzyanovskaya, 2006) основано на результатах экспериментов с введением агонистов и антагонистов DRD2.

Установлена роль ряда полиморфных локусов DRD2, включая и Taq 1A, в патогенезе шизофрении и аддиктивных расстройств (Hallikainen et al., 2003, Lawford et al., 2005). У больных эпилепсией полиморфизм DRD2 и его локус Taq 1A не исследован, поэтому влияние его полиморфизмов на процессы эпилептогенеза не выяснено.

       В диагностике судорожной готовности мозга большую роль играют электроэнцефалографические показатели, но какими структурными перестройками они сопровождаются – остается неясным. Клиницисты, занимающиеся изучением биопсийного и аутопсийного материала, могут зарегистрировать только исходные процессы эпилептизации мозга (Гайкова, 2001), механизм же их формирования можно изучить только с помощью эксперимента с использованием животных, болеющих эпилепсией (Погодаев, 1986).

       Все вышеизложенное обосновывает актуальность проведенного нами исследования, в котором мы стремились выявить структурные основы инициации пик-волновой активности нейронов в основном кортикальном фокусе абсансной эпилепсии – периоральном поле первичной соматосенсорной коры у крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2, а также обнаружить структурно-функциональные корреляты регистрируемой пароксизмальной активности.

Цель и задачи исследования. Цель работы – выявление структурных основ и электрофизиологических показателей инициации пик-волновой активности в первичной соматосенсорной коры у крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1.выполнить сравнительный цитоархитектонический анализ периорального поля первичной соматосенсорной коры (далее ПСК) крыс линии Вистар (неэпилептическая линия) и крыс двух субпопуляций линии WAG/Rij (модель абсансной эпилепсии) с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2;

       2.выявить особенности структурно-количественных характеристик первичной соматосенсорной коры у двух групп крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2 путем определения удельной площади V-VI слоев, плотности нейронов, глии и глиального индекса в V слое ПСК;

       3.исследовать нейронную организацию первичной соматосенсорной коры крыс линии Вистар (неэпилептическая линия) и выявить ее особенности у крыс двух субпопуляций линии WAG/Rij (модель абсансной эпилепсии) с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2);

       4. оценить на основании ультраструктурного анализа пятого слоя первичной соматосенсорной коры двух групп крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2 синапсоархитектонику и функциональное состояние нейронов, глии и миелиновой оболочки нервных волокон;

       5. выявить различия в структурно-количественной характеристике пик-волновых разрядов (продолжительность, количество, пик-волновой индекс), регистрируемых на электроэнцефалограмме первичной соматосенсорной коры у крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2;

       6.на основании комплексного анализа полученных данных выявить структурные основы инициации пик-волновых разрядов в первичной соматосенсорной коре и структурно-функциональные корреляты, ассоциированные с генотипом исследованного локуса DRD2.

Научная новизна исследования. Впервые описана структура первичной соматосенсорной коры у крыс с абсансной эпилепсии. Впервые комплексом нейрогистологических методов проведен сравнительный анализ цитоархитектоники первичной соматосенсорной коры у крыс линии Вистар (неэпилептическая линия) и двух групп крыс линии WAG/Rij (модель абсансной эпилепсии) с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2), позволивший выявить общие закономерности и особенности ее структурной организации. Впервые, на основе сравнительного структурно-количественного анализа нейронной организации первичной соматосенсорной коры у двух групп крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа DRD2 и крыс линии Вистар, получены данные о значимом снижении представительства тормозных интернейронов (корзинчатых клеток) у эпилептических крыс. Также установлена большая степень снижения количества корзинчатых клеток у крыс с генотипом А1/А1 по сравнению с крысами с генотипом А2/А2. Впервые выполнен анализ синапсоархитектоники и ультраструктуры нейронов, глии, миелиновой оболочки нервных волокон V слоя первичной соматосенсорной коры у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2, выявивший их особенности, находящиеся в корреляции со структурно-количественными характеристиками пик-волновыми разрядами первого типа, регистрируемыми в первичной соматосенсорной коры этих групп крыс. Впервые проведена регистрация электроэнцефалограммы первичной соматосенсорной коры у крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по исследованному локусу DRD2,  и получены данные об ассоциации частоты и продолжительности пик-волновых разрядов первого типа (типичных для абсансной эпилепсии) с генотипом А1/А1 по локусу Taq 1A DRD2. Впервые выявлена ассоциация мультифокальности пик-волновых разрядов и особенностей их частотно-временных характеристик у крыс линии WAG/Rij с генотипом А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные в работе результаты углубляют существующие представления о структурно-функциональной организации первичной соматосенсорной коры  и о патогенезе абсансной эпилепсии и создают теоретический базис для разработки новых комплексных диагностических методов, включающих молекулярно-генетические исследования. Генетический анализ исследованного в работе локуса DRD2 у больных абсансной эпилепсией может объяснить особенности выявляемых электроэнцефалографических показателей, а, следовательно, и клинического течения заболевания. Результаты работы вносят вклад в развитие фармакогенетики эпилепсии, проясняя молекулярно-генетические основы патофизиологических механизмов ее генеза и создавая основу для разработки новых антиабсансных препаратов.

Полученные результаты используются на лекциях и практических занятиях общих курсов «Гистология» и «Физиология человека и животных», занятиях большого нейрофизиологического практикума, спецкурса «Нейрогистология» на кафедре морфологии и физиологии человека Башкирского государственного университета. Издано учебное пособие «Гистология» с грифом УМО по классическому университетскому образованию.





Положения, выносимые на защиту:

1.Генотип полиморфного локуса Taq 1A DRD2 у крыс линии WAG/Rij ассоциирован с особенностями структурно-количественных характеристик цитоархитектоники, нейронной организации, ультраструктуры нейронов и синапсоархитектоники ПСК;

2.Гомозиготность выявленного функционального аллельного полиморфизма DRD2 проявляется особенностями электрографических показателей. Они находят отражение у крыс с генотипом А1/А1 в формировании типичных для абсансной эпилепсии ПВР с локализацией только в ПСК. У крыс с генотипом А2/А2 ПВР характеризуются вариабельностью частотно-временных характеристик, интенсивности пароксизмальной активности и топики в неокортексе крыс.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на IX и X Международном конгрессе морфологов (2008, 2010); на Всероссийской медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье», СПб, 2009-2011; на VI Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов, 2009; на VIII Всероссийской конференции «Нейроэндкринология-2010», СПб, на XXI съезде Физиологического общества имени И. П. Павлова, 2010; на XVII и XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», «Ломоносов-2011»; на Седьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии», Украина, 2011; на VII International Interdisciplinary Congress «Neuroscience for medicine and psychology», 2011; на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы физиологии, психофизиологии и психологии», Уфа, 2009,2010; на заседании Башкирского отделения Всероссийского общества анатомов, гистологов, и эмбриологов (Уфа, 2012) и опубликованы в ведущих российских морфологических и физиологических журналах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, шесть из которых в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований (4 главы), обсуждения полученных результатов и выводов. Указатель литературы содержит сведения о 306 источниках, 90 из которых на русском и 216 на иностранных языках. Иллюстрации представлены 37 рисунками (из них 22 микрофотографии), цифровой материал сгруппирован в 10 таблицах.

Материал и методы исследования. Исследование проведено на трех группах половозрелых 6-месячных крыс: гомозиготных крысах линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 (n=45) и А2/А2 (n=45) по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (модель абсансной эпилепсии) и крысах линии Вистар (n=30), (неэпилептическая линия). Масса тела экспериментальных крыс составляла 270-350 г. Две субпопуляции крыс линии WAG/Rij получены в результате скрещивания гомозиготных (А1/А1 и А2/А2) по локусу Taq 1A гена DRD2 крыс, выявленных в исходной популяции генетическим анализом, показавшим наличие полиморфизма указанного локуса (Калимуллина и соавторы, 2005). К настоящему моменту крысы прошли 20 поколений.

Животных умерщвляли декапитацией с соблюдением основных требований к эвтаназии, изложенных в Приложении №4 к «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Головной мозг извлекали из полости черепа и фиксировали в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере и после проводки заливали в парафин. Готовили серии фронтальных срезов мозга толщиной 20 мкм и 10 мкм, которые окрашивали по методу Ниссля (Меркулов, 1969).

Особенности нейронной организации ПСК исследованы на фронтальных срезах мозга толщиной 100 мкм обработанных методом Гольджи на половозрелых крысах. Выявившиеся нейроны зарисовывали с помощью рисовального аппарата (РА-4) при увеличении 200х. Непирамидные нейроны идентифицировали, опираясь на критерии, разработанные Wang et al (2002, 2004).

Планиметрирование первичной соматосенсорной коры позволило измерить абсолютные площади ПСК и ее V-VI слоя, и на основании полученных данных рассчитать удельную площадь ее глубоких слоев. Препараты изучали с помощью тринокулярного светового микроскопа серии МС-300 (Австрия), пользуясь объективом 10. Микрофото получали с использованием цифрового фотоаппарата Nicon CoolPix 4500. Полученные изображения экспортировали в компьютер и анализировали с помощью программы JmageJ 1.38 (USA).

Подсчет количества нейронов, содержащих ядрышки, и глии  проводили в V слое ПСК в поле зрения микроскопа МБИ-11 (ЛОМО, Россия) на 10 микронных срезах при увеличении в 400 раз (объектив 40, окуляр 10), площадь поля зрения при этом составляла 0,031 мм2 у крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2. На основании полученных данных определяли величину глиального индекса.

Для проведения электронно-микроскопических исследований первичная соматосенсорная кора  была выделена у крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2 под контролем микроскопа МБС-10 (ЛОМО, СПб, Россия). Кусочки ткани фиксировали путем погружения в охлажденный 2,5%-ный раствор глютаральдегида на фосфатном буфере (рН 7.4) и постфиксировали в 2%-ном растворе OsO4, обезвоживали в этаноле и заливали в Эпон-812. Готовили ультратонкие срезы на ультратоме LKB III, контрастировали цитратом свинца (Reynolds,1963) и анализировали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM 200 EX(75 кВ).

Изучение морфофункционального состояния нейронов соматосенсорной коры у крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2 проводили на фотографиях при увеличении 20000х. Структурно-функциональное состояние нейронов определяли на основании комплексного анализа ультраструктур клеточного ядра и органоидов цитоплазмы, руководствуясь критериями, разработанными Ахмадеевым и Калимуллиной (2005). В клеточном ядре обращали внимание на показатели транскрипционной активности: наличие интерхроматиновых гранул (ИХГ) и перихроматиновых гранул (ПХГ). Анализировали состояние ядрышка, учитывали соотношение эу- и гетерохроматина, особенности ядерной мембраны (ее рельеф, ширину перинуклеарного пространства). Среди органелл цитоплазмы, прежде всего, учитывали характеристики ультраструктуры митохондрий, особенности цитоплазматической сети, комплекса Гольджи.

В ходе анализа количественных характеристик синапсов и межклеточных несинаптических контактов в ПСК у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2  регистрировали следующие параметры: плотность синапсов (на 100мкм2), относительную частоту встречаемости аксо-дендритных, аксо-шипиковых, аксо-соматических, аксо-аксональных и дендро-дендритных синапсов. Также подсчитывали относительную частоту асимметричных, симметричных, перфорированных и инвагинированных синапсов, величину и форму синаптических пузырьков, кривизну постсинаптической мембраны, различных форм межклеточных несинаптических контактов.

Для проведения электрофизиологических исследований использовали стереотаксический метод вживления хронических электродов. Использовали стереотаксический прибор Хорслея-Делла (тип ЭМИБ-I). Операции на крысах проводили в стерильных условиях, в качестве наркоза использовали хлоралгидрат в дозе 400 мг/кг. Координаты исследуемой структуры рассчитывали по атласу мозга крысы Paxinos, Watson (1998). Проводили вживление трех активных электродов с координатами: во фронтальную кору – поле 6 (AP- +3; L-3); в теменную кору – поле 2 (AP-0; L-5); в затылочную кору – поле 17 (AP- -6; L-3). Референтный электрод располагали над мозжечком.

На восьмой день после операции проводили регистрацию фоновой электроэнцефалограммы. Запись осуществляли в программе EEGView (А. М. Спиридонов) на электроэнцефалографе Bioskript BST-2000 (Германия). Частотный состав электроэнцефалограммы определялся в диапазоне от 1 до 25 Гц, частота опроса (дискретизации) составляла 128 мс, постоянная времени – 0,3с, фильтр высокой частоты – 70 Гц. Для каждой крысы было записано от 4 до 12 файлов. После окончания всех предусмотренных экспериментальных воздействий проводили морфологический контроль.

Данные ЭЭГ обрабатывали с помощью визуального анализа и вейвлет-анализа. Визуальный анализ позволил подсчитать количество одиночных пиков в одном пик-волновом разряде, продолжительность пик-волновых разрядов, пик-волновой индекс, выраженный в % (процент времени, занятый всеми пик-волновыми разрядами в файле регистрации, продолжительность которого принимали за 100%). Количество пик-волновых разрядов определяли в каждом в анализируемом файле.

Для анализа частотно-временных характеристик пик-волновых разрядов использовали вейвлет-преобразование Морле и его модифицированный вариант, предложенный Босняковой и Обуховым (2005) и Габовой и др. (2008), позволяющий выделить динамику частоты разряда.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0.  Достоверность различий осуществляли с помощью параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия U- критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Согласно новой теории, которая получила название «hot spot theory» (Meeren et al., 2004), кортикальный фокус в первичной соматосенсорной коре является ведущим в распространении пик-волновой активности. Основные положения указанной теории разработаны с использованием электрофизиологических методов на крысах линии WAG/Rij. Несмотря на убедительные аргументы этой теории, структурные основы формирования пик-волновой активности в основном кортикальном фокусе практически не исследованы.

Анализ литературы по цитоархитектонике первичной соматосенсорной коры показал, что ее характеристики приводятся при описании сенсомоторной коры, которая включает в себя кроме моторных полей и ряд полей сенсорной коры (поле вибрисс, поля первичной и вторичной сенсорной коры, Чиженкова, 1986, Андреева, Обухов, 1999 Chizhenkova, Chernukhin, 2000, Hanganu et al., 2009 и др.). Результатов детального анализа цитоархитектонических особенностей периорального поля первичной соматосенсорной коры у крысы в литературе мы не нашли.

Изучение цитоархитектоники первичной соматосенсорной коры у крыс линии Вистар (неэпилептическая линия) и крыс линии WAG/Rij (признанная модель абсансной эпилепсии) с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2 позволило установить общие закономерности ее организации. Установлено, что первичной соматосенсорной коры у крыс всех изученных групп на фронтальных срезах мозга находится в области обонятельной борозды (incisura olfactoria). Дорсально к ней примыкает поле баррелей первичной соматосенсорной коры, вентральнее от нее находится вторичная сенсорная кора. На основании цитоархитектонического анализа установлено, что в первичной соматосенсорной коры имеют место явления стратификации и радиальной исчерченности, предопределяющие формирование в ней шести слоев, дифференциация которых менее выражена между вторым и третьем слоями. В составе всех слоев присутствуют пирамидные, непирамидные и глиальные клетки, с большей концентрацией пирамидных клеток в третьем и пятом слоях.

Сравнительный анализ цитоархитектонических особенностей первичной соматосенсорной коры у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2 позволил отметить увеличение содержания непирамидных нейронов в III слое у крыс с генотипом А2/А2 по сравнению с крысами с генотипом А1/А1. Непирамидные клетки отличаются от крупных пирамидных нейронов по своим размерам (они в два раза меньше).

Сравнение данных структурно-количественного анализа первичной соматосенсорной коры позволило установить наличие различий в величинах удельной площади первичной соматосенсорной коры у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2 и удельной площади V-VI слоев. Измерение общей абсолютной площади первичной соматосенсорной коры и V-VI слоев с последующим расчетом величин удельной площади V-VI слоев показало, что удельная площадь больше у крыс с генотипом А2/А2. Выполненные расчеты на больших группах крыс (А1/А1 – 96, и А2/А2 – 107) по величине массы тела и головного мозга животных крыс линии WAG/Rij показали, что масса мозга у крыс с генотипом А2/А2 значимо больше, чем у крыс с генотипом А1/А1, что и предопределяет большие размеры первичной соматосенсорной коры у этой группы животных, а вследствие этого – и большую удельную площадь V-VI слоев первичной соматосенсорной коры. Результаты подсчета плотности пирамидных нейронов и глии в V слое первичной соматосенсорной коры обеих групп крыс показали, что увеличение площади первичной соматосенсорной коры и ее V-VI слоев у крыс с генотипом А2/А2 предопределено не увеличением плотности пирамидных нейронов, а значимым увеличением других компонентов нервной ткани – прежде всего, глии и, возможно, непирамидных клеток и нейропиля этих слоев коры. Можно предположить, что структурно-количественные изменения мозга могут быть выявлены и в других его частях у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2. На это указывают имеющиеся в литературе сведения об уменьшении объемных характеристик среднего мозга (Cerasa et al, 2009), базальных ганглиев (Bartres-Faz et al., 2002), и передней цингулярной коры (Montag et al., 2010) у людей с наличием аллеля А1 (c генотипами А1/А1 и А1/А2) в локусе Taq 1А DRD2, выявленные при использовании нейровизуализационных методов.

Сравнение данных структурно-количественного анализа позволило установить наличие различий у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2 в плотности нейронов, представительстве глии и величине глиального индекса в V слое ПСК. Полученные результаты показали, что плотность нейронов у крыс с генотипом А1/А1 значимо больше, чем у крыс с генотипом А2/А2 (соответственно 9,65±0,18 и 8,11±0,19, р<0,05), у крыс с генотипом А2/А2 значимо увеличено содержание глии (21,39±0,44 против 16,14±0,20, р<0,01), что приводит к значимо большему глиальному индексу у крыс с генотипом А2/А2 (2,70±0,06 против 2,01±0,05, р<0,001).

У крыс с генотипом А1/А1 нами обнаружено меньшее количество клеток глии, чем у крыс группы А2/А2, что, вероятно, отражает снижение способности глии устранять калий из межклеточного пространства, и может рассматривается как один из факторов эпилепсии.

Большой интерес для выяснения механизмов эпилептогенеза представляют имеющиеся в литературе сведения о формировании комплексов нейронов и астроцитов (Ахмадеев, Нагаева, 2007). Поэтому при подсчете числа астроцитов в единице объема ткани мозга, кроме астроцитов, лежащих между нейронами, мы учитывали количество астроцитов – сателлитов. У крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 нам выявить различия в представительстве сателлитной глии не удалось. Кроме количественных изменений со стороны глии, при проведении электронно-микроскопического исследования мы обратили внимание на явления гипертрофии астроцитов.

Рис. 1. Плотность нейронов и глии в первичной соматосенсорной коре у крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2

Исследование нейронной организации первичной соматосенсорной коры крыс трех групп позволило установить, что общий принцип строения у крыс разных линий тождественен как по набору, так и пространственному расположению пирамидных и непирамидных нейронов. Во всех слоях первичной соматосенсорной коры выявлены разные типы непирамидных клеток, наиболее часто среди которых представлены клетки Ретциуса-Кахала, корзинчатые нейроны и нейроны Мартинотти.

Подсчет числа корзинчатых (крупных, малых и ячеистых) нейронов во втором-третьем и четвертом слоях суммарно показал, что по представительству этих нейронов между линиями крыс существуют значимые различия. У крыс линии Вистар количество корзинчатых нейронов в среднем составило 14,36±1,63 клетки, у крыс линии WAG/Rij с генотипом А2/А2 – 8,00±1,42, у крыс с генотипом А1/А1 – 4,91±0,62, что отражает существующие значимые различия. Если сравнить количество корзинчатых нейронов у крыс линии Вистар и суммарные показатель по обеим группам крыс линии WAG/Rij, то различия высоко значимы (t=2,91, p=0,015). Это свидетельствует о том, что у крыс с абсансной эпилепсией значимо снижено количество корзинчатых нейронов.

Согласно современной кортикоталамической теории (Меерен и др., 2004) первоначальный «ведущий» спайк всегда появляется в относительно ограниченной области – периоральном поле соматосенсорной коры. Спонтанные разряды небольшого числа пирамидных клеток V слоя коры могут в таких условиях быстро покинуть данную область и распространиться.

Нами проведена оценка структурно-функциональных характеристик пирамидных нейронов пятого слоя. Пирамидные нейроны имели светлое, богатое эухроматином клеточное ядро с центрально расположенным компактным ядрышком. Перинуклеарное пространство в таких нейронах было узким, поверхность ядерной мембраны содержала небольшие складки. В кариоплазме присутствовали перихроматиновые гранулы около краевого гетерохроматина. Умеренное количество митохондрий равномерно заполняли перикарион. Они были диффузно распределены по перикариону клетки, имели умеренно плотный матрикс, четкие кристы. В цитоплазме определялись первичные лизосомы и единичные липофусциновые гранулы. Эти ультраструктурные особенности свидетельствовали о том, что для этой группы нейронов характерно состояние спокойного режима функционирования, которое при анализе структурно-функциональных характеристик нейронов, мы условно обозначили как «состояние покоя».

Структурно-функциональное состояние пирамидных нейронов определяли как на основании ультраструктуры клеточного ядра, так и органоидов цитоплазмы. Ультраструктурный анализ функционального состояния нейронов проводили на всем массиве полученных данных по обеим группам крыс линии WAG/Rij, в последующем было подсчитано процентное соотношение различных функциональных состояний нейронов, выявленных в группе крыс с генотипом А1/А1 и с генотипом А2/А2. Нас в первую очередь, интересовало у какой группы крыс (с генотипом А1/А1 или с генотипом А2/А2) будет больше нейронов в состоянии высокой функциональной активности.

Согласно полученным данным у крыс с генотипом А1/А1 процент нейронов, находящихся в состоянии «пика активности» достоверно выше по сравнению с крысами с генотипом А2/А2 (23% и 14% соответственно, р<0,05). Эти данные свидетельствуют о том, что нейроны V слоя первичной соматосенсорной коры у крыс с генотипом А1/А1 «работают» более интенсивно по сравнению с крысами с генотипом А2/А2. Это позволяет предполагать, что их электрическая активность должна быть выше. Но играет ли это роль в формировании пик-волновой активности было выяснено с помощью регистрации ЭЭГ показателей слоя первичной соматосенсорной коры у двух изучаемых нами групп крыс линии WAG/Rij.

Между пирамидными нейронами находились астроциты и олигодендроциты. Нами выявлены протоплазматические и фибриллярные астроциты. Протоплазматические астроциты равномерно распределены между нейронами, они с помощью своих отростков экранируют синапсы и стенки сосудов, некоторые из них располагаются на поверхности тел нейронов. Средний размер тела астроцитов составляет 6-7 мкм. Некоторая часть астроцитов имела размер тела 8-12 мкм, что свидетельствовало об их гипертрофии. Фибриллярные астроциты чаще имели полигональную форму тела и клеточное ядро веретеновидной формы с множественными складками ядерной мембраны. Олигодендроциты выделялись среди других глиальных элементов большей электронной плотностью цитоплазмы и клеточного ядра.

Важные сведения о взаимодействии нейронов дает исследование синапсоархитектоники. Подсчет плотности синапсов на единицу площади не выявил различий между крысами WAG/Rij, имеющими различия в генотипе (А1/А1 – 12,7±2,1, А2/А2 – 9,43±1,3, p>0,05). Исследование характеристик синапсов на пирамидных нейронах и в прилежащем к ним нейропиле показало, что у крыс с генотипом А1/А1 преобладающим типом синапсов являются аксо-шипиковые, у крыс с генотипом А2/А2 – аксо-дендритные. Кроме того у крыс с генотипом А2/А2 больше аксо-соматических синапсов (5,4% против 3,7 у крыс с генотипом А1/А1). Эти различия, вероятно, можно объяснить наличием у крыс с генотипом А2/А2 статистически значимого большего количества корзинчатых нейронов, которые формируют синапсы преимущественно на телах и основных стволах дендритов. Корзинчатые нейроны составляют 50% всех интернейронов II-III слоев неокортекса, при этом 73% приходится на их форму, которая получила название ячеистых корзинчатых нейронов.

Анализ ЭЭГ является ключевым в диагностике как эпилепсии, так и различных ее проявлений (абсансов, локализации судорожного очага). Нами проведена регистрация ЭЭГ первичной соматосенсорной коры, теменной и затылочной областях коры крыс линии WAG/Rij. Основные результаты работы сводятся к следующему:

  1. у крыс с генотипом А1/А1 пик-волновые разряды носят характер разрядов первого типа и регистрируются только в первичной соматосенсорной коре, в то время как у крыс с генотипом А2/А2, наряду с ними, имеют место разряды второго типа;
  2. у крыс с генотипом А1/А1 частота в самом начале разряда «пик-волна» была наиболее высокой в лобных отделах коры. У крыс с генотипом А2/А2 начальный период повышенной частоты в лобных областях коры в большинстве случаев отсутствовал;
  3. снижение амплитуды пик-волновых разрядов у крыс А2/А2 происходит быстрее – стремительно со скоростью 1 Гц/с или более;
  4. существуют различия паттернов пик-волновых разрядов по времени появления максимальной частоты – у крыс А1/А1 она регистрируется в начале разряда, у крыс А2/А2 – в середине или его конце;
  5. у крыс с генотипом А1/А1 пик-волновые разряды широко генерализованы по коре, отражением чего является их регистрация во всех использованных отведениях, тогда как «атипичные» разряды крыс с генотипом А2/А2 встречаются или только во фронтальной коре, или во фронтальной и теменной коре, не распространяясь в затылочную область.

Анализ численных характеристик пик-волновых разрядов у крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2 показал, что: 1.крысы А1/А1 имеют достоверно большую продолжительность пик-волновых разрядов по сравнению с крысами группы А2/А2 (р<0,001); 2.количество пик-волновых разрядов на ЭЭГ крыс с генотипом А2/А2 вдвое меньше (4,21±0,41 против 8,6±0,66), чем у крыс А1/А1, (р<0,001);3.большая продолжительность пик-волновых разрядов и увеличение их количества у крыс А1/А1 предопределяют большую величину пик-волнового индекса (р<0,01) (табл.1).

Таблица №1. Математико-статистическое сравнение количественных характеристик пик-волновых разрядов первого типа у крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2

параметр

Длительность,

сек

Количество,

шт

Пик-волновой индекс, %

Генотип

А1/А1

А2/А2

А1/А1

А2/А2

А1/А1

А2/А2

M±St.err.

5,6±0,34

3,72±0,14

8,6±0,66

4,21±0,41

9,5±0,82

2,71±0,25

t

4,29

5,08

6,71

p

р<0,001

р<0,001

р<0,01

Полученные результаты показывают наличие как качественных, так и количественных различий в характеристиках пик-волновых разрядов у двух исследованных групп крыс, имеющих различия генотипа по локусу Taq 1A DRD2. Качественные различия (только пик-волновые разряды первого типа у крыс с генотипом А1/А1 и их разнообразие у крыс с генотипом А2/А2), на наш взгляд, обусловлены особенностями структурной организации эпилептической системы у крыс разных групп. Количественные различия, проявляющиеся в выраженности пик-волновых разрядов первого типа у крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2, есть следствие изменения модулирующего влияния дофамина на активность глутаматергической и ГАМКергической систем мозга.

Однако, выявленное разнообразие паттернов пик-волновых разрядов у крыс с генотипом А2/А2 позволяет предполагать, что эпилептическая система у них сложнее, и включает в себя, кроме первичной соматосенсорной коры, другие структуры мозга. Возможно, появление пик-волновых разрядов второго типа является отражением изменения таламо-кортикальных взаимоотношений за счет вовлечения в состав эпилептической системы не только ретикулярного, но и других ядер таламуса, а также ствола мозга.

Характерным признаком типичных разрядов абсансной эпилепсии является возникновение в лобной области коры в самом начале разряда короткой вспышки активности с более высокой частотой, чем остальной разряд. Только после этого другие  участки коры вовлекаются в ритмическую активность. Эти данные хорошо согласуются с современным представлением о ведущей роли лобных отделов коры в формировании пик-волновых разрядов при абсансной эпилепсии.

Таким образом, выявленные пик-волновые разряды первого типа у крыс с генотипом А1/А1 характерны для абсансной эпилепсии, они формируются в структурах кортикоталамического круга. Пик-волновые разряды второго типа и «атипические» разряды выявлены только у крыс с генотипом А2/А2, что указывает на присущие им особенности процессов эпилептогенеза.

Выводы

1.Цитоархитектонический анализ периорального поля первичной соматосенсорной коры крыс линии Вистар (неэпилептическая линия) и крыс двух субпопуляций линии WAG/Rij (модель абсансной эпилепсии) с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) выявил:

а) наличие у крыс всех исследованных групп явлений стратификации и радиальной исчерченности первичной соматосенсорной коры, определяющей формирование шести слоев неокортекса, с нечеткой дифференциацией II-III слоев и преобладанием площади V-VI слоев;

б) увеличение содержания непирамидных нейронов в III слое у субпопуляции крыс линии WAG/Rij с генотипом А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2 по сравнению с крысами с генотипом А1/А1;

2. Изучение структурно-количественных характеристик первичной соматосенсорной коры у двух групп крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2 позволило получить данные, свидетельствующие о:

а) статистически значимом увеличении удельной площади V+VI слоев у крыс линии WAG/Rij с генотипом А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2;

б) наличии статистически значимых различий в плотности нейронов в ПСК, у крыс с генотипом А1/А1 она больше (p<0,05);

в) наличии значимого повышения количества глии (p<0,01) и величин глиального индекса у крыс с генотипом А2/А2 (p<0,001) по сравнению с крысами с генотипом А1/А1.

3.Исследование нейронной организации первичной соматосенсорной коры крыс линии Вистар (неэпилептическая линия) и крыс двух субпопуляций линии WAG/Rij (модель абсансной эпилепсии) с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) показало:

а) наличие эктопии малых пирамидных клеток третьего слоя во второй и четвертый слои;

б) крупные пирамидные клетки локализованы в V слое и могут встречаться в составе VI слоя;

в) апикальные дендриты пирамидных клеток V слоя, располагаясь параллельно друг другу, формируют пучки, достигающие зонального слоя;

г) во всех слоях первичной соматосенсорной коры выявлены разные типы непирамидных клеток, наиболее часто среди которых представлены клетки Ретциуса-Кахала, корзинчатые нейроны и нейроны Мартинотти;

д) имеет место статистически значимое увеличение числа корзинчатых клеток во II-III-IV слоях у крыс линии WAG/Rij с генотипом А2/А2 по сравнению с крысами с генотипом А1/А1.

4. Электронно-микроскопическое исследование пятого слоя первичной соматосенсорной коры у двух групп крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2 показало:

а) значимое увеличение числа нейронов в состоянии «пика активности» у крыс с генотипом А1/А1 по сравнению с крысами с генотипом А2/А2;

б) преобладание симметричных синапсов на телах нейронов и основных стволах дендритов у крыс с генотипом А2/А2 по сравнению с крысами с генотипом А1/А1;

в) у крыс с генотипом А1/А1 по сравнению с крысами с генотипом А2/А2 выявлено большее число асимметричных синапсов с перфорацией и вогнутой кривизной постсинаптической мембраны, что свидетельствует о потенциации синаптической передачи.

5. У крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2 в ЭЭГ первичной соматосенсорной коры регистрируются пик-волновые разряды первого типа, которые имеют большую продолжительность (р<0,01) и частоту (р<0,001) возникновения у крыс с генотипом А1/А1.

6. У крыс с генотипом А2/А2 по локусу Taq 1A DRD2 наряду с типичными для абсансной эпилепсии пик-волновыми разрядами в первичной соматосенсорной коры выявлены атипические разряды, а также пик-волновые разряды второго типа в затылочной области коры.

7.Генотип А1/А1 локуса Taq 1A DRD2 ассоциирован с формированием пик-волновых разрядов в первичной соматосенсорной коры крыс линии WAG/Rij, структурными основами большей продолжительности и частоты которых по сравнению с крысами с генотипом А2/А2 являются уменьшение количества корзинчатых нейронов во II-III слоях первичной соматосенсорной коры, меньшее число симметричных синапсов на телах нейронов и основных стволах дендритов и большее число асимметричных синапсов с перфорацией и вогнутой кривизной постсинаптической мембраны.

Список публикаций по теме диссертации:

  1. Фенотипические характеристики крыс различного возраста с модификацией DRD2 / Н.Ф. Леушкина, А.М. Мусина, А.Я. Ханнанова, А.В. Ахмадеев, Л.Б. Калимуллина // Морфология. – 2008. – Т.133, №2: Съезд АГЭ. – С. 77.
  2. Мусина, А. М. Анализ индекса пик-волновых разрядов электроэнцефалограммы (ЭЭГ) мозга новых молекулярно-генетических моделей абсансной эпилепсии / А.М. Мусина, Л.Б. Калимуллина // Актуальные вопросы физиологии, психофизиологии и психологии: сб. науч. ст. Всероссийской заочной научно-практической конференции. – Уфа, 2009. – С. 63-66.
  3. Мусина, А.М. Цитоархитектоника соматосенсорной коры / А.М. Мусина  // Мат-лы Всеросс. Медико-биол. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье». – СПб., 2009. – С. 258-259.
  4. Мусина, А.М. Исследование структурно-количественных характеристик соматосенсорной коры крыс с модификацией гена рецептора дофамина DRD2 / А.М. Мусина, Л.Б. Калимуллина // Морфология. 2009. Т.136, №4: VI Всероссийский съезд анатомов, гистологов и эмбриологов. С. 103.
  5. Мусина, А.М. Количественные характеристики нейроно-глиальных взаимоотношений в соматосенсорной коре у крыс линии WAG/Rij /А. М. Мусина // Морфология. 2010. Т.137, № 4: Материалы докладов X конгресса международной ассоциации морфологов.  С. 136.
  6. Мусина, А.М. Показатели пик-волновой активности (SWD) соматосенсорной коры у крыс с модификацией рецептора дофамина DRD2 / А.М. Мусина // Ломоносов-2010: мат-лы XVII Международная науч. конф. – М., 2010. – С. 235-236.
  7. Мусина, А.М. Исследование роли дофаминергической системы в механизмах эпилептогенеза / А. М. Мусина // Мат-лы VIII Всероссийская конф. «Нейроэндкринология-2010». – СПб., 2010. – С. 107-108.
  8. Нейробиологические и молекулярно-генетические маркеры различных стратегий поведения / Л.Б. Калимуллина, А.В. Ахмадеев, Н.Ф. Леушкина, А.М. Мусина, А.Я. Ханнанова, Г.Д. Кузнецова, Э.К. Хуснутдинова // Материалы XXI съезд физиологического общества имени И. П. Павлова. – М.- Калуга, 2010. – С. 257.
  9. Мусина, А.М. Особенности электроэнцефалограммы (ЭЭГ) двух групп крыс, имеющих различия в локусе TAG 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) / А.М. Мусина // Актуальные вопросы физиологии, психофизиологии и психологии: сб. науч. ст. Всероссийская заочная научно-практической конференция. – Уфа, 2010. – С. 66-71.
  10. Мусина, А.М. Разряды первого и второго типов на электроэнцефалограмме крыс с модификацией рецептора дофамина второго типа (DRD2) / А.М. Мусина // Фундаментальная и клиническая медицина: мат-лы Тринадцатая Всеросс. медико-биол. Конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье». – СПб., 2010. – С.135.
  11. Мусина, А.М. Особенности частотно-временной динамики пик-волновых разрядов у крыс линии WAG/RIJ с модификацией рецептора дофамина второго типа (DRD2) / А.М. Мусина // Фундаментальная и клиническая медицина. – Человек и его здоровье: мат-лы Тринадцатая Всеросс. медико-биол. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье». – СПб., 2010. – С. 136.
  12. Мусина, А.М. Частотно-временная характеристика пик-волновых разрядов в электроэнцефалограмме крыс с различиями в аллельной структуре гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) / А.М. Мусина, Л.Б. Калимуллина // Фундаментальные исследования. 2010. №6.  С. 7-13.
  13. Мусина, А. М. Сравнительный количественный анализ удельной площади периорального поля первичной соматосенсорной коры у крыс с различиями в генотипе по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа DRD2 / А.М. Мусина // Фундаментальные исследования. 2010. №11. С. 13-16.
  14. Мусина, А.М. Полиморфизм DRD2 и пик-волновые разряды на фоновой электроэнцефалограмме крыс при абсансной и смешанной эпилепсии / А.М. Мусина // Ломоносов-2011: Мат-лы XVIII Международная науч. конф. – М., 2011. – С. 217.
  15. Кудояров, Э. Р. Сравнительный анализ количественных характеристик пик-волновой активности, регистрируемых в формациях новой и древней коры крыс линии WAG/Rij. / Э.Р. Кудояров, А.М. Мусина // Фундаментальная наука и клиническая медицина – Человек и его здоровье: мат-лы XIV Всеросс. медико-биол. Конф. молодых исследователей (с международным участием). – СПб., 2011. – С. 142-143.
  16. Мусина, А.М. Влияние полиморфизма DRD2 на генерацию пик-волновых разрядов в различных областях коры у крыс с абсансной эпилепсией. / А.М. Мусина // Фундаментальная наука и клиническая медицина – Человек и его здоровье: мат-лы XIV Всеросс. медико-биол. конф. молодых исследователей (с международным участием). – СПб., 2011. – С.186-187.
  17. Мусина, А. М. Исследование роли полиморфизма DRD2 в формирование разрядов первого второго типов у крыс с абсансной и смешанной эпилепсией / А.М. Мусина. Л.Б. Калимуллина // «Нейронаука для медицины и психологии»: мат-лы Седьмой международный междисциплинарный конгресс  – Судак (Крым, Украина), 2011. – С.305.
  18. Mussina, A.M. Investigation of the role of drd2 polymorphism in the formation of discharge of the first and second type in rats with mixed and absans epilepsy / A.M. Mussina, L.B. Kalimullina // VII International interdisciplinary congress «Neuroscience for medicine and psychology» – Sudak (Crimea, Ukraine), 2011. – P. 305-306.
  19. Мусина, А.М. Характеристика пик-волновых разрядов второго типа, регистрируемых при абсансной эпилепсии / А.М. Мусина // Фундаментальные исследования. 2011. № 11(часть 2). С.337-340.
  20. Калимуллина Л.Б.  Экспериментальные подходы к исследованию роли генотипа по локусу TAG 1A дофаминового D2-рецептора в эпилептогенезе. / Л.Б. Калимуллина, А.М. Мусина, Г.Д. Кузнецова // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2012. Т.98, №2. С. 117-125.

Учебное пособие

Ахмадеев А.В., Мусина А.М., Калимуллина Л.Б. Гистология. Уфа,

БашГУ, 2011. Гриф УМО МГУ.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.