WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ПОСТНИКОВА

Ольга Алексеевна

СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ГЕПАТОЦИТОВ, ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ
И ЗВЕЗДЧАТЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ
ПРИ ВИБРАЦИОННОМ И ВИРУСНОМ ВОЗДЕЙСТВИЯХ



03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук

Новосибирск  2012

Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» Сибирского отделения РАМН (Новосибирск) и в ГОБУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Минздрава РФ

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор                Маринкин Игорь Олегович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор                Гуляева Людмила Федоровна

доктор биологических наук                                Клинникова Марина Геннадьевна

доктор биологических наук, профессор                Селятицкая Вера Георгиевна

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Защита диссертации состоится « _____ » ____________ 2013 г. в ____ час. на заседании диссертационного совета Д 001.037.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2)

Автореферат диссертации разослан « _____ » _____________ 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.037.01

доктор биологических наук, профессор                                Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гепатоциты представляют собой огромную клеточную систему, специализированную на выполнение многообразных метаболических и биосинтетических функций. Несмотря на то, что ткань печени на первый взгляд выглядит мономорфной, она гетерогенна с точки зрения и структуры, и функции (Герок В., Блюм Х.Е., 2009). Эта гетерогенность обусловлена кровоснабжением дольки: клетки, локализующиеся в перипортальной зоне, отличаются от клеток перивенулярной зоны по набору ключевых ферментов, рецепторов и субклеточных структур и в связи с этим имеют различные функциональные способности (Kmiec Z., 2001). В большинстве случаев мозаичность повреждений связана с метаболической гетерогенностью гепатоцитов.

Изменения гепатоцитов, интерпретируемые как дистрофические, могут отражать как повреждение их структур и нарушение функции, так, и наоборот, интенсивную функцию клеток, их повышенную метаболическую активность. Особенно наглядно это положение подтверждается при использовании электронно-микроскопической радиоавтографии, что позволяет не только видеть изменения ультраструктуры клетки, но одновременно оценивать ее функциональное состояние. Д.С.Саркисовым (1993) показано, что даже при выраженной жировой дистрофии гепатоцита сохраняется достаточно высокий уровень биосинтетических реакций в ядерном и цитоплазматическом компартментах.

Печень относится к органам, физиологическая и репаративная регенерация которых выражается примерно в одинаковой степени одновременно в двух формах – клеточной и внутриклеточной, т.е. осуществляется как путем увеличения числа клеток, так и гиперплазии ультраструктур в сохранившихся клетках (Court F.G. et al., 2002). Один из важнейших выводов, который можно сделать по регенерации гепатоцитов, состоит в том, что пролиферативная активность зрелых гепатоцитов достаточна для репопуляции печени после парциальной гепатоэктомии. Резервный компартмент стволовых клеток печени активизируется для пролиферации и дифференцировки только в очень специфических условиях, когда пролиферация зрелых гепатоцитов ограничена или заблокирована (Fausto N., 1991; Forbes S., 2002).

Взаимодействия паренхиматозных клеток различных органов и эндотелиоцитов микроциркуляторного русла являются составной частью паренхиматозно-стромальных вза­имоотношений и играют важную роль в развитии физиологических и патологических процессов. Особая актуальность изучения взаимодействий паренхимы и стромы, в том числе элементов микроциркуляторного русла, связана с индукцией и прогрессией опухолевого роста (Thiery J.P., 2002). При изучении метастазирования опухолей молочной железы продемонстрировано явление эпителиально-мезенхимной трансформации, которую рассматривают в качестве одного из механизмов ремоделирования тканей, осуществляемого в критических фазах эмбрионального развития у многих видов животных (Tomaskovic-Crook  E. et al., 2009). Кроме того, запуск механизма эпителиально-мезенхимной трансформации может иметь место и в других патологических процессах, таких как фиброз (Guarino M. et al., 2009; Fabris L., Strazzabosco M., 2011). Эти данные заставляют по-новому видеть проблему дифференцировки дефинитивных клеточных форм (Гаршин В.Г., 1939; Заварзин А.А., 1947).

В этом аспекте известна пластичность эндотелиальных клеток сосудов, являющихся активными участниками ряда ключевых физиологических функций, в том числе транспорта кислорода и питательных веществ к тканям (Patel-Hett S., D'Amore P.A., 2011). Среди других важных функций эндотелиоцитов – регуляция тонуса сосудистой стенки и процессов свертывания крови, участие в ангиогенезе и воспалении, что имеет фундаментальное значение в развитии широкого спектра адаптивных и патологических процессов (Bedi S. et al., 2008).

Влияние эндотелия на окружающие ткани реализуется различными путями: эндотели­альные клетки синтезируют компоненты соединительной ткани и способны регулировать синтез этих компонентов другими клетками, с помощью эндотелия осуществляется регуля­ция тонуса гладкомышечных клеток и, следовательно, показателей кровотока. Эндотелиальные клетки синтезируют компоненты собственной базальной мембраны, в том числе, фибронектин, коллагены, ламинин, эластин и гликозаминогликаны, экспонирующиеся на люминальной поверхности и в экстрацеллюлярном матриксе (Brandao D.F. et al., 2006).

Эндотелиоцитам свойственны тканевая специализация и тканеспецифичный полиморфизм, что определяет наличие нескольких дефинитивных форм структурной организации капилляров: соматических с непрерывной эндотелиальной выстилкой, фенестрированных и синусоидных (Braet F. et al., 2009; Jacobs F. et al., 2009; March S. et al., 2009; Cogger V.C. et al., 2010; Kawasaki T. et al., 2010; Xie G. et al., 2012; Yokomori H. et al., 2012).

Физиологические и патологические вариации функционирования тканей и органов обусловлены высокой пластичностью сосудистой системы и особенно ее микроциркуляторного русла. Эндотелий и адвентиция обладают выраженной способностью к регенерации, являясь «депо» полипотентных камбиальных клеточных элементов стромы (Саркисов Д.С., 1980). По данным электронно-микроскопической радиоавтографии, мельчайшие сосуды являются элементарными структурно-функциональными единицами соединительной ткани, о чем свидетельствуют наивысшая пролиферативная и метаболическая активность перикапиллярных клеток и градиент уменьшения этой активности по мере удаления от сосудистой стенки (Саркисов Д.С., 1993; Колокольчикова Е.Г. и др., 1997).

Установлено, что во взаимоотношениях паренхимы и стромы на территории тканевого микрорайона капилляру принадлежит ключевая роль, он является своеобразным пейсмейкером (Непомнящих Г.И., 1979, 1996; Непомнящих Г.И. и др., 1987).

Звездчатые клетки печени («липоциты», клетки Ито, жиронакапливающие клетки печени) локализуются в пространствах Диссе между гепатоцитами и эндотелиальной выстилкой синусоидов и играют ведущую роль в регуляции гомеостаза ретиноидов, депонируя до 80% витамина А (Balabaud C. et al., 2004; Geerts A., 2004; Ryder S.D., 2004; Senoo H. et al., 2010). Пространство Диссе является зоной наибольшей функциональной ответственности, обеспечивая транссинусоидальный обмен (Balabaud C. et al., 2004; Senoo H., 2004).

Все большее значение придается роли звездчатых клеток в развитии фиброза и цирроза печени (Gabele E. et al., 2003; Forbes S.J., Parola M., 2011; Tacke F., Weiskirchen R., 2012). При получении фиброгенных стимулов «покоящиеся» звездчатые клетки «трансдифференцируются», приобретая миофибробластоподобный фенотип, и могут продуцировать коллаген, протеогликаны и другие компоненты экстрацеллюлярного матрикса (Gutierrez-Reyes G. et al., 2007; Friedman S.L., 2008). Фиброз на уровне центральных вен, синусоидов или портальных сосудов лимитирует нормальную гемодинамику печени, что приводит к уменьшению объема метаболически эффективной паренхимы, в дальнейшем – портальной гипертензии и порто-системному шунтированию. Накопление соединительной ткани в пространствах Диссе нарушает нормальный метаболический обмен между кровью и гепатоцитами, препятствуя клиренсу циркулирующих макромолекул, изменяя межклеточные взаимодействия и приводя к дисфункции клеток печени (Brandao D.F. et al., 2006; Lee Y., Friedman S.L., 2011).

Существуют противоречивые мнения относительно того, способны ли активированные звездчатые клетки возвращаться к покоящемуся фенотипу. Получены данные о том, что фиброгенные звездчатые клетки печени могут частично нивелировать процесс активации, например, при воздействии ретиноидов или при взаимодействии с компонентами экстрацеллюлярного матрикса (Kisseleva T., Brenner D.A., 2007). Решение этого вопроса лежит в основе проблемы обратимости фиброза и разработки терапевтических подходов к лечению цирроза печени (Desmet V.J. et al., 2004; Schuppan D., Afdhal N.H., 2008).

В настоящее время при исследовании состояния печени с помощью современных методов оценивают некоторые вирусологические и иммунологические показатели. Имеется достаточно большое количество исследований по ассоциации полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (Вавилин В.А., 2002), опухолевым заболеваниям и быстро прогрессирующим циррозам печени (Непомнящих Д.Л. и др., 2006). Тем не менее, даже при использовании комплекса молекулярно-генетических методик структурное исследование печени остается необходимым для оценки изменений органа, в том числе, в условиях вибрационного и вирусного воздействий.

Исследования висцеральных органов при вибрационном воздействии единичны и касаются, как правило, лишь экспериментальных моделей, несмотря на то, что полиорганные изменения развиваются вследствие системного поражения микроциркуляторного русла с последующей дисфункцией внутренних органов. В условиях профессиональной вибрации важное место занимает печень как основной метаболический и детоксикационный орган, а также желудок как полый орган, особенно чувствительный к вибрационному воздействию (Сухаревская Т.М. и др., 2000; Измеров Н.Ф. и др., 2004).

В оценке структурных изменений органов большое значение имеют межорганные взаимодействия, отражающие системность заболеваний (Крылов А.А., 2000; Апросина З.Г. и др., 2002; Плешко Р.И. и др. 2006; Непомнящих Д.Л. и др. 2010). В этом контексте нами продолжено изучение гепато-гастральных отношений, единство которых обеспечивается принадлежностью к пищеварительной системе.

Цель исследования – изучить ультраструктурные основы межклеточных взаимодействий основных популяций печени при вибрационном и вирусном воздействиях для разработки концепции эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий как основе альтеративных и репаративных процессов.

Задачи исследования:

  1. Изучить характер внутриклеточной реорганизации основных клеточных популяций печени (гепатоцитов, эндотелиоцитов, звездчатых клеток) при воздействии производственной вибрации.
  2. Провести структурный анализ клеточных популяций слизистой оболочки желудка в условиях производственной вибрации.
  3. Провести оценку структурных изменений клеточных популяций печени после воздействия экспериментальной вибрации (в течение одного месяца) и в периоде восстановления.
  4. Изучить внутриклеточную реорганизацию основных клеточных популяций печени (гепатоцитов, эндотелиоцитов, звездчатых клеток) при воздействии РНК-содержащего вируса гепатита С (HCV-инфекция).
  5. Провести структурно-функциональное исследование звездчатых клеток печени в онтогенезе (экспериментальная модель) и при вирусном HCV воздействии (клиническая модель).
  6. Изучить особенности морфогенеза эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий в печени при воздействии вибрационного и вирусного факторов.

Научная новизна. Впервые на основе сравнительного изучения характера эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий факторов установлены основные этапы структурно-функциональной перестройки печени при вибрационном и вирусном воздействиях. Представлены основные варианты внутриклеточной реорганизации гепатоцитов эндотелиоцитов и звездчатых клеток печени при реализации физиологических и патологических процессов. Установлено, что к ведущим ультраструктурным изменениям гепатоцитов и эндотелиоцитов относятся редукцией белоксинтезирующих органелл, частичная деструкция митохондриального компартмента, усиление аутофагических процессов. Показано, что снижение белоксинтезирующей и энергетической функций гепатоцитов и угнетение транссинусоидального обмена сопровождаются фиброгенной трансформацией звездчатых клеток, увеличением количества коллагеновых волокон в пространствах Диссе, развитием перицеллюлярного фиброза.

Впервые показано, что тканевая пространственная организация печени при воздействии производственной вибрации имеет особенности в сравнении с вирусными воздействиями. При вибрационном воздействии наблюдается высокая объемная плотность гепатоцитов с «опустошенной» цитоплазмой при уменьшении количества двуядерных гепатоцитов по сравнению с данными показателями при гепатите C, что свидетельствует о снижении регенераторного потенциала паренхимы печени. РНК-содержащий вирус гепатита С повреждает преимущественно цитоплазматические органеллы при сохранении ядерного компартмента.

Определена фиброгенная активация звездчатых клеток печени, характеризующаяся редукцией липидных капель и синхронной экспрессией фибробластоподобных свойств – позитивной иммуногистохимической реакцией на гладкомышечный -актин, гиперплазией гранулярной цитоплазматической сети и перигепатоцеллюлярным формированием коллаге­новых фибрилл. Особенно значительная экспрессия гладкомышечного -актина происходит в фибробластах и миофибробластах портальных зон Несмотря на прогрессирующее уменьшение численной плотности липидосодержащих звездчатых клеток при развитии фиброза, поддерживается функция депониро­вания ретиноидов: при циррозе печени в фиброзных септах и внутри долек сохраняются липидосодержащие звездчатые клетки. Сделано заключение, что звездчатые клетки печени – полиморфная гетерогенная популяция с широким спектром функциональной активности.

Установлено, что основу висцеропатий при вибрационном воздействии составляет синдром, включающий прогрессирующую системную дистрофию и последующую атрофию паренхиматозных клеток, диффузный фиброз стромы, ранние системные изменения микрососудов с атрофией и дисфункцией эндотелиоцитов. В ткани печени развивается субтотальный и тотальный коллапс синусоидов, сопровождающийся фиброгенной трансформацией звездчатых клеток, диффузной атрофией гепатоцитов и коллагенизацией пространств Диссе.

Выделены структурные маркеры цитотоксического поражения гепатоцитов при вирусном гепатите С, ассоциированном опийной зависимостью, – частичная деструкция митохондриального компартмента и гиперплазия агранулярной цитоплазматической сети, ассоциированная с редукцией белоксинтезирующих органелл. В отличие от вирус-ассоциированного, преимущественно перипортального поражения печени, структурное выражение воздействия наркотических веществ реализуется в центролобулярной зоне. Его маркеры – макровезикулярная липидная инфильтрация гепатоцитов, интрагепатоцеллюлярный холестаз, центролобулярные некрозы, присутствие эозинофилов в клеточных инфильтратах, центральный и перисинусоидальный фиброз.

Впервые при сопоставлении данных биохимического анализа, ПЦР и структурных изменений печени установлено отсутствие прямой зависимости между выраженностью структурных изменений печени, активностью HCV-инфекции и выраженностью репликации вируса (его количественного присутствия в образцах крови и/или ткани печени). Показано, что при достаточно высоком уровне виремии доминируют минимальные изменения структуры печени, определяется слабо выраженная степень активности HCV-инфекции.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты раскрывают новые закономерности тканевых, клеточных и внутриклеточных реакций, имеющие большое теоретическое и практическое значение – установлена роль звездчатых клеток печени в развитии фиброза органа, представлены варианты пластичности клеточных популяций печени, описаны механизмы «автономизации» паренхиматозных клеток печени, существенно влияющие на паренхиматозно-синусоидальный обмен в условиях перисинусоидального фиброза и на возможность редукции фиброзных изменений.

Данные проведенного исследования свидетельствуют о важности комплексного морфо­логического изучения биопсий печени для диагностики, дифференциальной диагностики, определения прогноза и тактики терапии хронических заболеваний печени. Результаты исследования целесообразно внести в курс преподавания соответствующих разделов гистологии и патоморфологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. При вибрационном и вирусном воздействиях в клеточных популяциях печени развиваются нарушения клеточной и внутриклеточной регенерации, пластический дефицит, дистрофия, атрофия, элиминация клеток, диффузный реактивный фиброз.
  2. Профессиональная вибрация существенно влияет на структуру и функцию печени – основного метаболического и детоксикационного органа – обнаруживается выраженная атрофия паренхиматозных клеток, фиброз и системные изменения микрососудов с атрофией и дисфункцией эндотелия.
  3. Реорганизация поверхностных и глубоких слоев слизистой оболочки желудка при вибрационном воздействии характеризуется относительно высокими значениями структурной плотности капилляров, но ультраструктурное и радиоавтографическое исследования показывают, что микроциркуляторное русло имеет признаки структурно-функциональной недостаточности.
  4. Наличие РНК HCV в крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфициро­ванных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag) не имеют достоверной связи со степенью актив­ности инфекционного процесса, оцениваемой по структурным изменениям печени и клини­ко-биохимическим тестам.
  5. Структурные признаки активации звездчатых клеток печени – превращение их из «пассивных», накапливающих витамин А, в клетки «миофибробластоподобные» с исчезновением липидных капель и экспрессией гладкомышечного -актина – ассоциируются с прогрессией фиброза и цирроза печени.

Апробация работы. Материалы исследования представлены на 8-й научно-практиче­ской конференции «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1998); 6-й Всероссийской конференции «Патология клетки» (Москва, 2000); научно-практических конференциях «Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине» (Новосибирск, 2000, 2001); 12-й Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2006); 13-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2011» (Санкт-Петербург, 2011); 19-й научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2011); XVII Ежегодном Российском конгрессе «Гепатология сегодня» (Москва, 2012); 14-м Международном Славяно-Балтий­ском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2012» (Санкт-Петербург, 2012); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2012); Ученом совете ФГБУ Научно-исследователь­ского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, из них 15 в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для опубликования результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), результатов собственных исследований (7 глав), обсуждения, выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован таблицами и рисунками (диаграммы, микрофото- и электронограммы).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено комплексное морфофункциональное исследование характера эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий в печени в условиях вибрационного и вирусного воздействия.

Вибрационное воздействие: экспериментальная модель. Исследовали 190 крыс-самцов Вистар массой тела 180 – 200 г. 120 крыс было использовано для изучения воздействия вибрации, 70 – для изучения процессов восстановления. Для исследования эффектов вибрации животные были разделены на 5 групп по 24 особи в каждой группе. Животные 1-й группы подвергались воздействию вибрации однократно (1 ч), 2-й группы – в течение 5 сут, 3-й группы в течение 10 сут, 4-й – 20 сут, 5-й – 30 сут, по 1 часу ежедневно. Применяли ежедневное воздействие общей вертикальной вибрации (частотой 32 Гц при ускорении 50 м/с2) в специальной клетке, установленной на площадке вибратора от вибростенда ВЭДС-100Б в течение 1 ч. Каждая группа состояла из 12 контрольных и 12 опытных животных. Для изучения восстановительного периода животных, подвергнутых воздействию вибрации, выводили из эксперимента на 5-е, 10-е, 20-е и 30-е сутки. Исследование проводилось совместно с проф. Е.Л.Потеряевой (НГМУ).

Вибрационное воздействие – клинические модели: печень, желудок.

1. Проанализированы 112 наблюдений (45 биоптатов печени) с вибрационным синдромом от воздействия локальной (62 человека) и общей (50 человек) вибрации – мужчины в возрасте от 33 до 60 лет: в 70% диагностирована I степень вибрационного синдрома, в 30% – II степень; при воздействии общей вибрации в 71% случаев установлена I степень, в 26% – II степень.

Проведен сравнительный анализ с гепатитами С (35 человек) и С+В (20 человек).

2. Анализировано 109 наблюдений воздействия локальной (59 человек) и общей (50 человек) вибрации на желудок – мужчины в возрасте от 33 до 60 лет. Стаж работы в контакте с вибрацией колебался от 8 до 38 лет, в среднем составил 19,60 ± 0,66 лет. Для оценки состояния гастроэнтеральной системы проводилось биохимическое исследование крови, фиброгастродуоденоскопия, анализ характера и уровня желудочной секреции. Во всех случаях проведена биопсия слизистой оболочки желудка. 

Вирусное воздействие. Проанализированы 112 наблюдений с HCV-инфекцией (75 мужчин и 37 женщин) в возрасте от 18 до 62 лет; 22 человека были инфицированы при внутривенном употреблении наркотических веществ (опиатов), среди них преобладали мужчины молодого возраста (18 человек). Изучены биохимические показатели крови с определением активности сывороточных ферментов, выявляли серологические маркеры вирусной ин­фекции. Изучение биопсий играло ключевую роль в оценке определения степени и активно­сти инфекционного процесса, базировалось на световой и электронной микроскопии, допол­ненной методами морфометрии, стереологии и иммуногистохимии. При анализе структурных изменений в биоптатах печени использована Лос-Анжелесская классификация хронических гепатитов (Desmet V.J. et al., 1994), выделяющая в качестве ведущей характеристики этиологический фактор, а также определение степени активности HCV-инфекции и стадии развития фиброза. Общую степень активности инфекционного процесса оценивали по трем составляющим: клинической, биохимическим тестам с ведущей ролью цитолитического син­дрома и структурным изменениям печени. 

Оценка структурно-функциональной реорганизации звездчатых клеток печени в онтогенезе и динамике развития фиброза. Экспериментальная модель. Проведен сравнительный анализ популяции звездчатых клеток печени в динамике онтогенеза у 38 крыс-самцов Вистар массой тела от 110 до 480 г. Животные были разделены на 4 возрастные группы: 4, 9, 12 и 24 мес (по 10, 10, 9 и 9 животных соответственно). Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977) и правилами Европейской конвенции по защите животных (Страсбург, 1986); клинический материал изучали с соблюдением положений последней редакции Этических принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000). Проводилась световая микроскопия, включая парафиновые и полутонкие срезы, а также электронная микроскопия и ультраструктурный стереологический анализ поверхностной плотности цитоплазматических органелл звездчатых клеток.

Клиническая модель. Проведено комплексное исследование 100 образцов биоптатов печени при HCV-инфекции на различных стадиях фиброзных изменений, разделенные на 4 равные группы по степени выраженности фиброза. Стадию фиброза печени определяли по 4-балльной шкале, начиная от портального фиброза (I стадия) до цирроза с образованием порто-центральных васкуляризованных септ и нодулярной трансформацией паренхимы. Звездчатые клетки печени и другие матрикс-продуцирующие клеточные элементы выявляли в динамике развития фиброза по экспрессии гладкомышечного -актина.

Методы морфологического и молекулярно-генетического анализа. Световая микроскопия. Для проведения световой микроскопии образцы фиксировали в охлажденном 4%-м растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,2 – 7,4). Далее следовали обезвоживание и заливка в парафин по общепринятой схеме. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию (Меркулов Г.А., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996). Полутонкие срезы окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Исследование проводили в универсальном микроскопе Leica DM 4000B (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Leica DFC 320 и компьютерной программы Leica QWin.

Электронная микроскопия. Использовали фиксацию в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (pH 7,2 – 7,4). Материал дофиксировали в 1% растворе OsO4, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, проводили через ацетон и помещали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие срезы готовили на ультрамикротоме Tesla, окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB III, контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца в парах щелочи натрия и исследовали в электронных микроскопах серии JEM (100 SC и 1010) при ускоряющем напряжении 80 кВт.

Иммуногистохимическое исследование. Экспрессию гладкомышечного -актина в матрикс-продуцирующих клетках печени тестировали с помощью двухшагового непрямого иммунопероксидазного метода со стрептавидин-биотиновой системой визуализации продуктов реакции с негативным контролем. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к гладкомышечному -актину (NovoCastra Lab. Ltd, Великобритания) в разведении 1 : 25; в качестве вторичных антител – универсальные биотинилированные антитела. Продукты иммуногистохимической реакции визуализировали с помощью диаминобензидина, затем срезы докрашивали гематоксилином Майера. При статистической обработке данных применяли критерий Стьюдента; различия сравниваемых параметров считали значимыми, если вероятность ошибки P была меньше 0,05.

Морфометрическое и стереологическое исследование. Морфометрическое исследование печени проведено с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15х на полутонких срезах. Стереологический анализ проводили на двух уровнях структурной организации – тканевом и внутриклеточном. Тканевый стереологический анализ слизистой оболочки желудка экспери­мен­тальных животных и гастробиоптатов проводили с помощью многоцелевой тес­товой системы (n = 21, Р = 42, L = 630 мкм). В качестве первичных стереологических параметров вычисляли структурную плотность покровно-ямочного эпителия, эпителия желез, капилля­ров и соединительной ткани. В качестве параметров, наиболее полно отражающих паренхи­ма­тозно-васкулярные взаимоотношения, определяли поверхностно-объ­емное и объемное отношение капилляров и эпителиальных структур, а также объемное отношение покровно-ямочного эпителия и эпителия желез к соединительной ткани.

Стереологический анализ образцов печени проводили с применением окулярной многоцелевой тестовой системы коротких отрезков (n = 36, Р = 72, L = 650 мкм). При стереологическом исследовании образцов печени оценивали структурную плотность компонентов паренхимы и стромы: гепатоцитов, синусоидов, эндотелиоцитов, стромы, клеточных инфильтратов. После определения первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные параметры, отражающие паренхиматозно-васкулярные взаимоотношения. Численную плотность звездчатых клеток оценивали на полутонких срезах в единице поля зрения, равной 38000 мкм2.

Ультраструктурное стереологическое исследование эпителиоцитов слизистой оболочки желудка крыс проводили, используя многоцелевую тестовую систему коротких отрезков (n = 21, Р = 42, L = 35 мкм). Оценивали объемную и поверхностную плотность ядра и основных цитоплазматических органелл покровно-ямочных, париетальных и главных клеток фундаль­ного отдела желудка, затем рассчитывали поверхностно-объемные отношения органелл.

Внутриклеточный стереологический анализ паренхиматозных клеток печени при вирусном воздействии (HCV и HBV) включал определение структурной плотности цито­плазматических органелл гепатоцитов. Тестовая система состояла из циклоидов суммарной длиной 45 мкм и 70 тестовых точек (Gundersen Н. et al., 1988).

Радиоавтографическое исследование. Для радиоавтографического исследования  in vitro фрагменты биоптатов и осадок, полученный центрифугированием, помещали во флаконы с 5 мл питательной среды № 199 и одним из предшественников  синтеза ДНК или РНК, меченых тритием. Концентрация 3Н-тимидина (удельная радиоактивность 24 Ки/мМ) составляла 100 мкКи/мл, концентрация 3Н-уридина (удельная радиоактивность 26,6 Ки/мМ) - 100 мкКи/мл. Инкубацию проводили в ультратермостате УТ-15 при температуре 37С в течение 1,5 часов. Затем образцы быстро отмывали от инкубационной смеси, фиксировали в 4%-м растворе параформальдегида, постфиксировали в 1%-м растворе OsO4 и обрабатывали по стандартной методике для электронно-микроскопического исследования. Подсчет плотности и индекса метки проводили на полутонких срезах.

Метод ПЦР. Исследования выполнены с помощью диагностических наборов QIAamp Viral PNA kit (Германия), ЗАО «Сибэнзим» (Новосибирск) и коммерческих тест-систем научно-производственной лаборатории при ЦНИИ эпидемиологии (Москва). Для выделения РНК вируса гепатита С из биологических субстратов использовали метод кислофенольной субстрации. Комплементарную кДНК получали путем реакции обратной транскрипции с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Далее проводили стандартную полимеразную цепную реакцию с помощью Taq-полимеразы и специфичных праймеров.

Генотипирование. Генотипирование HCV осуществлялось путем сравнения последовательностей 5'UTR и частей гена выявленных изолятов HCV с данными базы «Генбанк». Оценка уровня виремии проводилась с помощью тест-системы научно-производственной лаборатории ЦНИИ эпидемиологии (Москва). При исследовании пункционной биопсии печени, кроме световой микроскопии, парафиновых и полутонких срезов и электронной микроскопии, проводили иммуногистохимическое исследование парафиновых срезов на выявление NS3Ag HCV и гладкомышечного -актина.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальная модель воздействия вибрации. Структурные изменения внутренних органов экспериментальных животных в период воздействия вибрации имели стереотипный характер. Главными на всех  сроках наблюдения являлись острые нарушения гемодинамики, прежде всего микроциркуляторного русла, сопровождающиеся гиперемией, периваскулярным отеком, геморрагиями и сладж-синдромом. Синхронно с сосудистой дисфункцией возникали дистрофические изменения паренхиматозных клеток, нарастающие с длительностью воздействия вибрации. Воздействие вибрации в течение 5 дней приводило к углублению гемодинамических расстройств. Отмечались однотипные изменения сосудов микроциркуляторного русла в миокарде и надпочечниках, характеризующиеся расширением, особенно венозного отдела, выраженным периваскулярным отеком. Отмечали набухание и десквамацию эндотелиоцитов, внесосудистое расположение эритроцитов, плазматическое пропитывание стенок мелких артерий и разрыхление их адвентиции.

При продолжительном воздействии вибрации нарушение гемодинамики носило выраженный характер: полнокровие всех сосудов, внесосудистые скопления свежих эритроцитов, периваскулярный и интерстициальный отек, в отдельных сосудах – отслоение эндотелия, утолщение стенок мелких артерий. Продолжительное воздействие вибрации сопровождалось менее значительным увеличением количества капилляров на площади 1 мм2 по сравнению с однократным воздействием (до 56,0 ± 3,41) и степени капилляризации (0,18 ± 0,04).

При исследовании ультраструктурных изменений печени крыс на 5-й день вибрационного воздействия в синусоидах обнаруживались признаки диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром) (Вашкинель В.К., Петров М.Н., 1982). Нередко агглютинированные скопления тромбоцитов полностью перекрывали просветы синусоидов. Обнаружены некробиотические изменения в части эндотелиоцитов с поврежденными плазмолеммами. На 30 сут воздействия вибрации отмечена тенденция к развитию атрофии гепатоцитов, почечных клубочков, желудка, а также фрагментация и атрофия кардиомиоцитов и скелетных мышц. Ведущим феноменом в ультраструктурной реорганизации являлись системные изменения эндотелия – резкое истончение, фрагментация и деструкция эндотелиальной выстилки микрососудов, наиболее выраженная на поздних сроках. 

Ультраструктурные изменения в печени крыс на 30-й день вибрационных воздействий характеризовались более выраженными, чем на предыдущих этапах опыта, проявлениями ДВС-синдрома в синусоидах. Наблюдались признаки всех трех стадий образования тромбов. Часто обнаруживались явления «закупорки» синусоидов агрегатами агглютинированных тромбоцитов в участках разрушенной эндотелиальной выстилки, где также нередко были видны дегранулированные и распавшиеся тромбоциты, входящие в конгломераты с агглютинированными эритроцитами и нитями фибринами, наблюдались явления сладжирования эритроцитов.

Таким образом, в условиях эксперимента можно проследить определенную фазность в реакции микроциркуляторной системы на вибрационное воздействие и однотипность морфо­логических изменений сосудов различных органов (миокарда, печени, почек и надпочечни­ков). Полнокровие микроциркуляторного русла с компенсаторным увеличением количества капилляров и степени капилляризации является одним из ранних последствий однократного воздействия вибрации.

В восстановительный период после воздействия вибрации отмечалась положительная динамика: постепенно уменьшалась выраженность гемодинамических нарушений, сокращалось количество паренхиматозных и эпителиальных клеток с признаками дистрофии; на 30 сут после окончания воздействия вибрации многие клеточные популяции восстановили нормальную структуру и функции. В гепатоцитах отмечено возрастание количества свободных и прикрепленных рибосом и полисом, восстановление ультраструктурной организации митохондрий, гиперплазия элементов гранулярной цитоплазматической сети, увеличение числа микроворсинок на васкулярном полюсе. Обращала на себя внимание ультраструктурная реорганизация микроциркуляторного русла: отмечены признаки гиперплазии цитоплазматических органелл эндотелицитов и гепатоцитов, увеличение количества микровезикул и выростов люминальной поверхности эндотелиальной выстилки, что свидетельствует о повышении функциональной активности микрососудов.

Таким образом, у экспериментальных животных, подвергшихся длительному воздействию общей вибрации, выявлены признаки системных нарушений микроциркуляции, сопровождающиеся развитием ДВС-синдрома, некробиотическими изменениями эндотелиоцитов и нарушением структурно-функциональных свойств эритроцитов и тромбоцитов. При структурном анализе внутренних органов животных выявлены стереотипные дистрофически-атрофические изменения паренхиматозного и эндотелиального компартмента, носящие обратимый характер. 

Клиническая модель воздействия производственной вибрации на структуру и функцию печени. Отличительная макроскопическая особенность биоптатов печени при вибрационном воздействии – бледный, почти белый цвет образца. При микроскопии обращало на себя внимание состояние синусоидальной системы печеночных долек: тотальный или субтотальный коллапс синусоидов, диффузная атрофия гепатоцитов при значительном снижении содержания гликогена. В цитоплазме клеток отмечалось различное количество гранул желчного пигмента и мелко- и средневезикулярные липидные включения; небольшая часть гепатоцитов – с опустошенной цитоплазмой. Обращал на себя внимание перисинусоидальный фиброз, сопровождающийся гиперплазией фиброгенных звездчатых клеток; портальные тракты были умеренно расширены и фиброзированы.

При изучении биоптатов печени отмечалась гетерогенность ультраструктурной организации гепатоцитов. Большинство паренхиматозных клеток печени характеризовалось парциальной или тотальной опустошенностью цитоплазмы, содержащей перинуклеарные короткие одиночные цистерны гранулярной цитоплазматической сети и контактирующие с ними мелкие митохондрии. Минимальная часть гепатоцитов отличалась сравнительно высокой насыщенностью мембранными органеллами, среди которых имелись расширенные короткие профили гранулярной цитоплазматической сети, мелкие митохондрии с плотным матриксом, единичные лизосомы и многочисленные полиморфные резидуальные тельца. В некоторых гепатоцитах локализовались гранулы с желчными пигментами, а также мелкие цистерны и везикулы гладкой цитоплазматической сети, концентрирующиеся у билиарного полюса клеток. Эндотелиоциты синусоидов отличались высокой осмиофильностью цитоплазмы и низким уровнем транссинусоидального обмена. Пространства Диссе содержали фрагменты разрушенных мембранных структур и коллагеновые фибриллы. Звездчатые клетки печени имели переходный и фибробластоподобный фенотип с индукцией белоксинтезирующей активности. Таким образом, длительное воздействие производственной вибрации сопровождалось коллапсом синусоидов и, как следствие, нарушением транссинусоидального обмена и прогрессирующей атрофией и гибелью гепатоцитов.

Исследование тканевой пространственной организации биоптатов печени при воздействии производственной вибрации выявило отличительные особенности в сравнении с гепатитами C и C+B. Обращали на себя внимание достаточно высокая объемная плотность гепатоцитов с опустошенной цитоплазмой (клеточно-инволютивная дистрофия) при вибрационном воздействии (рис. 1) и уменьшение количества двуядерных гепатоцитов по сравнению с вирусными гепатитами, что в целом свидетельствует о снижении регенераторного потенциала паренхимы печени при вибрационном воздействии.

Большинство вторичных стереологических параметров принимали близкие средние значения, в том числе при оценке васкулярно-паренхиматозных взаимоотношений (рис. 2). Отличались показатели объемно-объемного паренхиматозно-стромального взаимоотношения, среднее значение которого при вибрационном воздействии имело выраженную тенденцию роста по сравнению с близкими между собой показателями групп вирусных гепатитов. Это связано, по-видимому, с невысокими значениями объемной плотности соединительнотканного компартмента печени при вибрационном воздействии, в отличие от вирусных гепатитов, где наблюдается развитие фиброза органа.

Рис. 1. Объемная плотность гепатоцитов с явлениями клеточно-инволютивной дистрофии
() и численная плотность двуядерных гепатоцитов в единице поля зрения () при вирусном С (1), С+В (2) и вибрационном воздействиях (3).

Рис. 2. Объемно-объемные паренхиматозно-стромальные () и васкулярно-паренхиматоз­ные () взаимоотношения при вирусном С (1), С+В (2) и вибрационном воздействии (3).

В целом, паренхиматозный и эндотелиальный компартменты печени при вибрационном воздействии имели ультраструктурные признаки атрофических изменений, выражающиеся в редукции белоксинтезирующих структур, и сопровождающиеся усилением фиброгенной активности звездчатых клеток печени с дисфункцией синусоидов вследствие «блокады» пространства Диссе.

Клиническая модель воздействия вибрационного фактора на структуру и функцию желудка. При светомикроскопическом исследовании гастробиоптатов выявлены диффузные изменения фундального и пилорического отделов желудка: истончение слизистой оболочки, дистрофия и атрофия покровного эпителия, атрофия желез и диффузный фиброз стромы, выраженный в большей степени в глубоких слоях. В большинстве случаев была нарушена дифференцировка эпителия по типу кишечной метаплазии, и в единичных случаях – дисплазии. Структурные модификации микроциркуляторного русла характеризовались различной шириной просвета капилляров, с преобладанием микроварикозных расширений, усилением извилистости отдельных сосудистых петель и повышенной агрегацией эрит­роцитов. Характерны значительная истонченность стенки микроциркуляторного русла и гиперхромность ядер эндотелиальных клеток и перицитов.

С увеличением стажа работы в профессии, продолжительности и степени выраженности вибрационного воздействия (рис. 3) усиливались дистрофически-атрофические изменения паренхимы желудка, особенно желез, интенсивно развивались фиброз стромы и деградация микроциркуляторного русла. Существенные изменения выявлены в ультраструктурной организации капилляров: преобладали сосуды с резко истонченной осмиофильной эндотелиальной выстилкой и единичными пиноцитозными везикулами, что свидетельствовало о снижении функциональной активности.

Фундальный отдел

Пилорический отдел

Рис. 3. Структурные изменения слизистой оболочки желудка при вибрационном воздействии (%).

При морфологическом исследовании выявлены наиболее характерные особенности состояния слизистой оболочки желудка при вибрационной болезни: значительная дистрофия и атрофия желез, диффузный фиброз стромы, выраженный в большей степени в глубоких слоях, преобладание в клеточном инфильтрате лимфоцитов и плазмоцитов, отсутствие или неадекватность воспалительной реакции, носящей, вероятнее всего, факультативный характер.

В целом, при длительном воздействии производственной вибрации возникал комплекс структурных изменений стенки желудка: недостаточность микроциркуляторного русла, атрофия покровно-ямочного эпителия и желез, развитие диффузного фиброза стромы и ремоделирование слизистой оболочки.

Стереологический анализ тканевой организации слизистой оболочки фундального отдела желудка проведен в аспекте сравнения вибрационного воздействия и хронического гастрита. Обнаружено сходство показателей поверхностно-объемного отношения покровного эпителия, эпителия желез и капилляров к эпителию поверхностного и глубокого слоев слизистой оболочки, что означало отсутствие принципиальных различий в ее архитектонике (рис. 4). При вибрационом воздействии выявлены высокие значения объемной и поверхностной плотности покровного и железистого эпителия, а также капилляров в сравнении с хроническими гастритами, что обусловлено значительной атрофией слизистой оболочки. Обращают на себя внимание меньшее среднее значение поверхностно-объемного отношения капилляров при вибрационном воздействии, близость показателей поверхностно-объемного отношения капилляров и эпителия, снижение объемно-объемного отношения капилляров глубокого слоя к железистому эпителию, что в совокупности с достоверно более низкими показателями структурной плотности капилляров в глубоком слое слизистой оболочки косвенно свидетельствует о недостаточности микроциркуляторного русла, более значительной в глубоких слоях слизистой оболочки.

Виброгенные изменения развиваются, начинаясь с глубоких слоев слизистой оболочки, о чем свидетельствуют первичные стереологические параметры. Тканевая пространственная реорганизация поверхностных и глубоких слоев слизистой оболочки желудка при виб-рационном воздействии характеризуется сравнительно высокими значениями структурной плотности капилляров, однако на фоне возрастания стереологических показателей эпителиальных структур и с учетом ультраструктурных особенностей эндотелиоцитов, микроциркуляторное русло имеет признаки структурно-функциональной недостаточности.

Рис. 4. Поверхностно-объемное отношение капилляров () и капилляров к эпителию () слизистой оболочки фундального отдела желудка при хроническом гастрите (1), гастропатиях смешанного (2) и вибрационного (3) генеза.

Морфологическое исследование печени при вирусной HCV-инфекции. При морфологическом исследовании биоптатов печени минимальной степени активности (А1) инфекционного процесса соответствовали очаговые дистрофические изменения гепатоцитов и отсутствие очагов некроза и некробиоза. При слабо выраженной степени активности (А2) дистрофия гепатоцитов носила более распространенный характер, очаги некроза и некробиоза отсутствовали. При умеренной степени активности (А3) дистрофия гепатоцитов сочеталась с моноцеллюлярными или более крупными, но единичными, очагами некроза, некробиоза или постнекротическими гранулемами. Выраженная степень активности (А4) ассоциировалась с наличием некротической компоненты – внутридольковыми очагами некроза и некробиоза. Из 112 наблюдений в 21 случае установлена минимальная степень активности, в 62 – слабо выраженная, в 26 – умеренная, и лишь в трех случаях выраженная степень активности.

Морфогенез гепатита C рассматривался по трем взаимосвязанным составляющим: поражение гепатоцитов, реакция непаренхиматозных клеточных популяций печени и ремоделирование соединительной ткани – развитие фиброза. Ведущей и универсальной реакцией паренхиматозных клеток печени при любом повреждающем воздействии является дистрофия, иногда приводящая к некробиозу и некрозу гепатоцитов, в частности, в результате накопления в цитоплазме железа, меди, и компонентов желчи. Вторая составляющая морфогенеза – клеточная инфильтрация (реакция иммунокомпетентных клеток на вирусную инфекцию), связанная с миграцией и пролиферацией Т-лимфоцитов, формирующих агрегаты в портальных трактах с последующим распространением в паренхиму. Третий компонент морфогенеза – фиброз печени как результат комплекса деструктивно-пролиферативных реакций в динамике инфекционно-вирусного процесса.

При гепатите С преобладала особая форма повреждения гепатоцитов, характеризовавшаяся редукцией цитоплазматических органелл и визуальной картиной «опустошенности» клеток. Основу данной формы дистрофии составляла не альтерация и последующий некроз гепатоцитов, а снижение процессов восстановления «изношенных» цитоплазматических органелл за счет угнетения синтеза структурных белков. Этот вид дистрофии оказался доминирующим при HCV-инфекции. Микроскопически клеточно-инволютивная дистрофия проявлялась фокальной или почти тотальной опустошенностью цитоплазматического матрикса при сохранении интактного ядра и перинуклеарных комплексов цитоплазматических органелл, определяющих возможность последующей внутриклеточной регенерации, что позволяет считать это состояние клетки обратимым. В инфицированной клетке наблюдались фокальные очаги деструкции мембранных цитоплазматических органелл с последующим формированием гетерогенных резидуальных телец, обнаруживаемых впоследствии в пространстве Диссе.

Значительная доля HCV-инфицированных лиц наркозависимы. В таких случаях морфогенез структурных реакций печени определялся сочетанием эффектов вирусного и токсического факторов – некоторые тканевые и ультраструктурные изменения имели особенности, связанные, вероятно, с метаболизмом наркотических веществ. В частности, обнаружена специфичность фиброзных изменений печени с преимущественным фиброзом центральных вен и центролобулярной зоны (метаболический фиброз) даже при минимальном фиброзе портальной и перипортальной ткани. В половине образцов на фоне микровезикулярной липидной инфильтрации выявлена макровезикулярная липидная дистрофия гепатоцитов – один из универсальных маркеров токсического воздействия. Гиперплазия агранулярной цитоплазматической сети и появление гигантских митохондрий указывают на напряжение антитоксической функции печени.

При изучении биоптатов печени лиц с HCV-инфекцией, ассоциированной с наркоманией, отмечено преобладание слабо выраженной степени активности процесса и фиброза независимо от давности инфицирования, и большая частота формирования лимфоидных фолликулов. Последнее, возможно, обусловлено многократным реинфицированием наркозависимых вирусом гепатита С, отличающимся генотипическим разнообразием. В 60% случаев в составе клеточного инфильтрата портальных зон и в просветах синусоидов встречались эозинофилы, присутствие которых относят к маркерам лекарственного либо паразитарного поражения печени (Серов В.В., Лапиш К., 1989).

Одним из основных функционально-биохимических маркеров активности HCV-инфекции является уровень сывороточных трансаминаз, в первую очередь, аланиновой аминотрансферазы (АлАТ). По выраженности цитолитического синдрома (уровню АлАТ) выделено 5 групп – АлАТ в пределах нормы (25 ± 1,8 ед./л), минимально повышенная (64,7 ± 2,3 ед./л), слабо повышенная (141,1 ± 6,5 ед/л), умеренно выраженная (304,7 ± 15,3 ед./л) и выраженная (709,9 ± 105,3 ед./л). Повышение уровня АлАТ сопровождалось, как правило, нарастанием тяжести клинических синдромов, а также гепатомегалии.

В целом, показатели АлАТ колебались от 10 до 689 ед./л (112,62 ± 10,15 ед./л). При наличии репликации вируса в образцах крови уровень АлАТ составил 115,98 ± 11,42;  в отсутствие репликации – 97,54 ± 19,98 ед./л. Результаты статистического анализа показали, что существует положительная корреляция (R = 0,66) между показателями АлАТ и выраженностью структурных изменений печени, но при детальном анализе обнаружено, что эта зависимость ослабляется при возрастании степени активности инфекционного процесса (R2 = 0,52) (рис. 5).

Преимущественно невысокий уровень АлАТ при HCV-инфекции можно объяснить тем, что АлАТ является внутриклеточным ферментом, и увеличение его показателей отражает цитолиз гепатоцитов, то есть гибель клетки путем колликвационного некроза; при HCV-инфекции крайне редко развивались некрозы такого типа.

Рис. 5. Зависимость степени активности HCV-инфекции (1 – минимальная; 2 – слабо выраженная; 3 – умеренная; 4 – выраженная) по биоптатам печени (%) от уровня АлАТ.

Выявление РНК HCV в различных биологических субстратах. При моноинфекции РНК HCV выявлена в сыворотке крови в 77% случаев, в мононуклеарных клетках крови – в 73%; в сыворотке и мононуклеарах одновременно – в 55% наблюдений. В 18% случаев РНК HCV обнаружена в клеточных элементах при отсутствии в сыворотке крови. Кроме того, ПЦР на РНК HCV была положительна в образцах слюны у 7 человек из 34, в моче – у 5, у 3 человек  – в обоих субстратах.

Анализ сопоставления маркеров репликации вируса, по данным полимеразной цепной реакции (ПЦР), и степени активности инфекционно-вирусного процесса показал, что при наличии РНК HCV в сыворотке и/или мононуклеарных клетках крови в 70% случаев обнаружена минимальная (14,3%) и слабо выраженная (55,8%) степень активности процесса. Статистический анализ не выявил корреляционной связи между наличием репликации вируса в образцах крови и выраженностью структурных изменений в биоптатах печени.

ПЦР на РНК HCV в образцах крови (сыворотка и мононуклеарные клетки) и ткани печени имела положительный результат в 67% случаев, в образцах крови – в 15% случаев, в образцах печени – в 12%, маркеры репликации отсутствовали у 6% пациентов. При наличии РНК HCV в крови и ткани печени степень активности патологического процесса была преимущественно минимальной или слабо выраженной (68% случаев), так же как и при наличии репликации вируса в биоптате печени при отрицательных данных ПЦР в образцах крови. Кроме того, даже в отсутствие репликации вируса во всех субстратах регистрировалась более высокая (А3) степень активности.

При полуколичественном анализе экспрессии антигена NS3Ag HCV обнаружено, что поражение печени при  HCV-инфекции не зависит от числа инфицированных гепатоцитов: в 71% случаев обнаружено минимальная и слабовыраженная степень активности патологического процесса. В подавляющем большинстве случаев репликация HCV в нативной ткани печени (80%) и образцах крови (83%) по данным ПЦР сопровождалась иммуногистохимическим выявлением NS3Ag.

Генотипирование HCV. Большинство пациентов (53% случаев) инфицированы вирусом гепатита 1b, 30% – генотипа 2  и 14%  – генотипа 3a. При генотипах 1b и 3a почти в 100% случаев определялась умеренная виремия. При генотипе 2 в 10% наблюдений имела место низкая виремия, однако именно этот генотип ассоциировался с более высокими показателями активности патологического процесса (46% случаев) (рис. 6).

Рис. 6. Генотипирование HCV и степень активности гепатита С.

В целом, обнаружены следующие основные закономерности, характеризующие морфогенез HCV-инфекции:

- Наличие РНК вируса гепатита С в крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag HCV) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по клинико-биохимическим данным и структурным изменениям печени.

- При высоком уровне виремии (от 106 до 108 копий HCV в 1 мл плазмы) доминируют незначительные изменения структуры печени: в 60% случаев выявлена слабо выраженная степень активности HCV-инфекции (r = 0,631, р < 0,001) (рис. 7).

- Отсутствие зависимости между репликацией HCV и степенью поражения печени при HCV-инфекции связано с выраженной антивирусной реакцией гепатоцитов, фенотипически проявляющейся клеточно-инволютивной дистрофией.

В целом, поражение печени при HCV-инфекции не имеет прямого отношения ни к количеству инфицированных гепатоцитов, ни к репликации HCV. Ведущими моментами в интерпретации этого феномена могут быть особенности биологии вируса гепатита С.

Рис. 7. Уровень виремии HCV и степень активности гепатита С.

Структура и функция звездчатых клеток печени в онтогенезе. В онтогенезе крыс Вистар происходит ремоделирование пространств Диссе – активация звездчатых клеток печени, превращение их из липоцитов, накапливающих витамин А, в фиброгенные клетки. В переходных звездчатых клетках при сохранении одиночных липидных капель увеличивался объем цитоплазмы, и активизировалась белоксинтезирующая функция с увеличением коли­чества свободных рибосом, полисом и канальцев гранулярной цитоплазматической сети. Деградация липидных капель осуществлялась путем формирования аутофагосом.

В динамике онтогенеза у крыс Вистар в звездчатых клетках выявлены ультраструктурные стереологические маркеры индукции белоксинтезирующей функции, обратно коррелирующие с выраженностью функции депонирования ретиноидов. Прогрессирующие дисфункции митохондрий гепатоцитов и более выраженная фиброгенная активность звездчатых клеток являются ключевыми факторами фиброза печени у крыс в возрасте 24 мес.

Стереологический анализ ультраструктурной организации звездчатых клеток печени крыс в онтогенезе продемонстрировал уменьшение поверхностной плотности липидных включений, имеющее достоверные отличия (р<0,05) в возрасте 24 мес: 4 мес – 396,8±11,6 м2/см3; 9 мес – 376,8±21,2; 12 мес – 286,3±13,5 и 24 мес – 243,3±12,7 м2/см3. Соответствующие четырем возрастным группам показатели поверхностной плотности профилей гранулярной цитоплазматической сети звездчатых клеток печени демонстрировали неуклонный рост: 28,1±4,3; 32,4±5,1; 38,9±6,2 и 52,7±4,9 м2/см3. Таким образом, в динамике онтогенеза в звездчатых клетках печени выявлены ультраструктурные стереологические маркеры индукции белоксинтезирующей функции, обратно коррелирующие с выраженностью функции депонирования ретиноидов. Это свидетельствует о том, что в динамике онтогенеза при снижении энергетического потенциала гепатоцитов у крыс в возрасте 24 мес синхронно индуцируется фиброгенная трансформация звездчатых клеток печени, обусловливающая инволютивные изменения и фиброзную трансформацию печени.

В онтогенезе у крыс Вистар звездчатые клетки печени в состоянии фиброгенной активации экспрессируют переходный, или смешанный, фенотип: уменьшение числа и последующее исчезновение липидных капель с синхронной сменой звездчатой формы на фибробластоподобную полигональную и увеличением размеров клетки с синхронной гиперплазией гранулярной цитоплазматической сети и увеличением числа митохондрий. Прогрессирующая в онтогенезе дисфункция митохондрий гепатоцитов, ассоциированная с окислительным стрессом, и более выраженная фиброгенная активность звездчатых клеток являются ключевыми факторами фиброза печени.

Структурно-функциональная характеристика звездчатых клеток печени в ди­намике фиброза. При гепатите С на начальных стадиях фиброза (0, I) популяция звездчатых клеток печени отличалась выраженным полиморфизмом – варьировали размеры, форма, количество липидных капель и их тинкториальные свойства: обращали на себя внимание различия в осмиофильности липидосодержащего материала в разных клетках. Численная плотность звездчатых клеток, визуализируемых в препаратах по наличию цитоплазмати­ческих липидных капель, составляла 5,01±0,18 в единице поля зрения.

На стадиях фиброза II и III ультраструктура большинства звездчатых клеток приобретала так называемый смешанный, или переходный, фенотип – одновременное присутствие морфологических признаков и липидосодержащей, и фибробластоподобной клетки. В таких липоцитах ядра имели глубокие инвагинации нуклеолеммы, более крупное ядрышко, увеличенный объем цитоплазмы с липидными каплями. Одновременно резко возрастало количество митохондрий, свободных рибосом, полисом и канальцев гранулярной цито­плазматической сети. Как правило, отмечался контакт липидных капель и митохондрий, свидетельствующий об «утилизации» липидов. Во многих клетках деградация липидных капель осуществлялась путем формирования аутофагосом, которые затем элиминировались. В некоторых случаях отмечалась гиперплазия звездчатых клеток смешанного фенотипа.

Матрикс-продуцирующие звездчатые клетки, наиболее многочисленные на стадии цирроза печени, характеризовались исчезновением липидных гранул, отростчатой фибро­бластоподобной формой, развитым белоксинтезирующим компартментом и формированием в цитоплазме фибриллярных структур; перицеллюлярно в пространствах Диссе локализовались многочисленные пучки коллагеновых фибрилл.

При прогрессировании HCV-инфекции, сопровождавшимся внутридольковым перисинусоидальным фиброзом, отмечалась активация звездчатых клеток печени, превращение их из так называемых «пассивных», накапливающих витамин А, в клетки фиброгенные и пролиферирующие. Звездчатые клетки печени отличались выраженным полиморфизмом, варьировались как ихразмеры, форма, количество липидных капель и тинкториальные свойства. На начальных стадиях фиброза численная плотность звездчатых клеток печени, визуализируемых по наличию цитоплазматических липидных капель, составляла 4,98±0,17 при HCV-инфекции и 2,45±0,06 клеток – при HCV+HBV-инфекции (р<0,05).

На стадии трансформации в цирроз печени происходило значительное уменьшение численной плотности липидосодержащих звездчатых клеток, свидетельствующее об их фиброгенной трансформации. Однако при сформированном циррозе печени в единичных случаях встречались участки паренхимы печени с перисинусоидальными липидосодержащими звездчатыми клетками. Кроме того, в одном из биоптатов в перипортальной фиброзной ткани обнаружены многочисленные липоциты, что, вероятно, свидетельствует о важной роли звездчатых клеток в метаболизме ретиноидов в организме даже на стадии цирроза органа. Ультраструктурный анализ дополнил светомикроскопическую характеристику звездчатых клеток, в том числе, отмечены неравномерность в электронной плотности липидных гранул, иногда с формированием более электронно-плотного ободка по периферии, очаговая пролиферация и появление двуядерных липоцитов.

Степень выраженности перигепатоцеллюлярного фиброза при HCV-инфекции имела достоверную обратную корреляцию с численной плотностью липидосодержащих звездчатых клеток – их численная плотность на стадии фиброза III и при циррозе органа составляла 0,20 ± 0,03 в единице поля зрения, что достоверно меньше (р<0,05), чем на стадиях фиброза 0 – I (4,98±0,17) и II (2,02 ± 0,04) (рис. 8).

Фиброгенная активность матрикс-продуцирующих клеток тестирована с помощью иммуногистохимического исследования по экспрессии гладкомышечного -актина. Продукты иммуногистохимической реакции различной интенсивности обнаруживались в цитоплазме активированных звездчатых клеток, локализующихся внутри печеночных долек. Особенно значительная экспрессия гладкомышечного -актина отмечалась в цитоплазме фибробластов и миофибробластов портальных зон, гладкомышечных клетках сосудов и миофибробластах вокруг центральных вен.

В целом, фиброгенная активация звездчатых клеток включала следующие признаки: уменьшение числа и последующее исчезновение липидных капель, очаговую пролиферацию липоцитов, гиперплазию гранулярной цитоплазматической сети, экспрессию фибробластоподобных белков, в том числе гладкомышечного -актина, и формирование экстрацеллюлярных коллагеновых фибрилл.

Рис. 8. Численная плотность звездчатых клеток при различной выраженности перигепатоцеллюлярного фиброза.

Таким образом, при прогрессировании фиброза в условиях HCV-инфекции значимо уменьшалась численная плотность липидосодержащих звездчатых клеток, при этом часть популяции сохраняла так называемый «покоящийся» фенотип для осуществления метаболической функции. Миофибробластоподобные звездчатые клетки печени в состоянии фиброгенной активации характеризовались следующими структурно-функциональными особенностями: уменьшением числа и последующим исчезновением липидных капель, гиперплазией гранулярной цитоплазматической сети и митохондрий, очаговой пролиферацией, иммуногистохимической экспрессией фибробластоподобных белков, в том числе гладкомышечного -актина, и формированием перицеллюлярных коллагеновых фибрилл в пространствах Диссе. Эти данные свидетельствуют о том, что звездчатые клетки печени представляют собой не статичную, а динамичную популяцию, принимающую непосредственное участие в ремоделировании внутридолькового перигепатоцеллюлярного матрикса.

Анализ проведенных исследований позволил сделать вывод о том, что в структурных реакциях органов и тканей при хронических воспалительных процессах нередко отсутствуют классические признаки, которые позволили бы интерпретировать найденные изменения как воспалительные. Стали доминировать процессы, имеющие морфологический фенотип дистрофий, диффузный характер и тенденцию перехода в атрофию. Ультраструктурный анализ показал, что основу этой дистрофии составляет редукция белоксинтезирующих органелл, свидетельствующая о снижении регенераторных реакций, что подтверждено радиоавтографическим изучением синтеза ДНК и РНК.

Комплексное морфологическое изучение позволило выделить новую форму хронических заболеваний, названную первично дистрофической (Непомнящих Г.И., 1996). В соответствии с этим, среди хронических процессов выделены следующие морфогенетические варианты: первично дистрофические, первично воспалительные и смешанные. Решающим стимулом в подходе к этой дифференцировке явилось отсутствие в значительном числе исследованных биоптатов классических морфологических признаков хронических воспалительных процессов.

На основании морфологического анализа сформулированы основные признаки первично дистрофических процессов: поражение клеток имеет фенотип дистрофии, основа которой – не альтерация цитоплазматических органелл, а их недовоспроизводство; в финале – атрофия клеток и безнекротическая элиминация или десквамация; воспалительно-клеточная инфильтрация отсутствует или неадекватна имеющимся структурным измене­ниям; диффузный реактивный склероз стромы. В целом, структурные изменения имеют инволютивный, дегенеративно-дистрофический характер, напоминающий процесс старения, своеобразное старение на клеточном уровне.

В последние годы частота дистрофически-атрофических процессов в органах и тканях, особенно в слизистых оболочках различных локализаций, значительно увеличилась. Веро­ятно, в современных условиях формируются качественно новые типы реакций, отражающие взаимодействие организма с различными неблагоприятными факторами внешней среды – химического (ксенобиотики), биологического (вирусы) и физического (вибрация, радиация) характера, оказывающими цитопатические действие на клетки паренхимы.

ВЫВОДЫ

1. При вибрационном и вирусном воздействиях в результате эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий развиваются скоррелированные изменения ультраструктуры гепатоцитов, эндотелиоцитов синусоидов и звездачтых клеток печени. К ведущим ультраструктурным изменениям гепатоцитов и эндотелиоцитов относятся редукцией белоксинтезирующих органелл, частичная деструкция митохондриального компартмента, усиление аутофагических процессов. Снижение белоксинтезирующей и энергетической функций гепатоцитов и угнетение транссинусоидального обмена сопровождаются фиброгенной трансформацией звездчатых клеток, увеличением количества коллагеновых волокон в пространствах Диссе, развитием перицеллюлярного фиброза.

2. Воздействие вибрации в эксперименте сопровождается острым нарушением гемодинамики, преимущественно микроциркуляторного русла. Синхронно с сосудистой дисфункцией развивается дистрофия паренхиматозных клеток печени и желудка, нарастающая с увеличением длительности воздействия. В восстановительном периоде (через 30 суток после воздействия вибрации) отмечается положительная динамика – реорганизация микроциркуляторного русла и восстановление структуры клеточных популяций. К концу эксперимента в клетках хорошо развита гранулярная и гладкая цитоплазматическая сеть, формируются многочисленные митохондрии.

3. Основу структурных изменений печени при производственной вибрации составляют прогрессирующая тотальная дистрофия, последующая атрофия паренхиматозных клеток, диффузный фиброз стромы, ранние системные изменения микрососудов с атрофией и дисфункцией эндотелиоцитов. В печени развивается коллапс синусоидов, сопровождающийся фиброгенной трансформацией звездчатых клеток, диффузной атрофией гепатоцитов и коллагенизацией пространств Диссе.

4. Тканевая пространственная организация печени при воздействии производственной вибрации имеет особенности в сравнении с вирусными воздействиями. При вибрационном воздействии наблюдается высокая объемная плотность гепатоцитов с «опустошенной» цитоплазмой при уменьшении количества двуядерных гепатоцитов по сравнению с данными показателями при гепатите C, что свидетельствует о снижении регенераторного потенциала паренхимы печени. РНК-содержащий вирус гепатита С повреждает преимущественно цитоплазматические органеллы при сохранении ядерного компартмента.

5. Комплекс структурных изменений стенки желудка в условиях длительного вибрационного воздействия представлен атрофическими и дистрофическими изменения микроциркуляторного русла и покровно-ямочного эпителия и желез, развитием диффузного фиброза стромы, что обусловливает значительное ремоделирование слизистой оболочки. Ультраструктурные изменения эпителиоцитов слизистой оболочки желудка при вибрационном воздействии носят стереотипный характер, однако выраженность ультраструктурных перестроек наиболее значительна в условиях значительного фиброзирования. Изменения ультраструктурной организации капилляров свидетельствуют о снижении их функциональной активности: преобладают сосуды с истонченной осмиофильной эндотелиальной выстилкой и единичными пиноцитозными везикулами.

6. Изменения стенки желудка, вызванные вибрацией, развиваются, начинаясь с глубоких слоев слизистой оболочки, о чем свидетельствуют первичные стереологические параметры. При воздействии производственной вибрации большинство показателей структурной плотности эпителия, стромы и капилляров глубокого слоя имеют меньшие значения, чем в поверхностном слое. Тканевая пространственная реорганизация поверхностных и глубоких слоев слизистой оболочки желудка при вибрационном воздействии характеризуется сравнительно высокими значениями структурной плотности капилляров, однако на фоне возрастания стереологических показателей эпителиальных структур и с учетом ультраструктурных и функциональных особенностей эндотелиоцитов, микроциркуляторное русло имеет признаки структурно-функциональной недостаточности.

7. Степень активности HCV-инфекции не ассоциирована непосредственно с выраженностью репликации вируса – наличие РНК вируса гепатита С в образцах крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag HCV) не имеет достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по структурным изменениям печени и клинико-биохимическим тестам. При достаточно высоком уровне виремии (от 106 до 108 копий РНК HCV в 1 мл плазмы) доминируют минимальные изменения структуры печени; в 60% случаев (r=0,631, p <0,01) определяется слабо выраженная степень активности HCV-инфекции.

8. При сравнительном стереологическом исследовании паренхиматозных клеток печени при HCV-инфекции большинство цитоплазматических органелл гепатоцитов имеют равные показатели структурной плотности независимо от степени активности инфекционного процесса. HCV-инфекция ассоциирована с тенденцией к увеличению объемной плотности липидных включений. Высокая степень активности HCV-инфекции обусловливает меньшую выраженность «опустошения» гепатоцитов за счет большей структурной плотности белоксинтезирующих органелл.

9. Ультраструктурные маркеры гепатотоксического (опийного) воздействия – макровезикулярная липидная инфильтрация гепатоцитов, интрагепатоцеллюлярный холестаз, центролобулярные некрозы, присутствие эозинофилов в клеточных инфильтратах и центральный (метаболический) и перисинусоидальный фиброз. Внутриклеточная перестройка гепатоцитов заключается также в гиперплазии агранулярной цитоплазматической сети, ассоциированной с редукцией белоксинтезирующих органелл, а также деструкцией и компенсаторной гиперплазией митохондриального компартмента.

10. В онтогенезе крыс Вистар центральным событием ремоделирования пространств Диссе является появление в них активированных звездчатых клеток, превращение их из липоцитов, накапливающих витамин А, в фиброгенные клетки. В динамике онтогенеза у крыс Вистар в звездчатых клетках выявляются ультраструктурные стереологические маркеры индукции белоксинтезирующей функции, обратно коррелирующие с выраженностью функции депонирования ретиноидов. Прогрессирующая дисфункция митохондрий гепатоцитов и более выраженная фиброгенная активность звездчатых клеток являются ключевыми факторами развития фиброза печени у крыс в возрасте 24 мес.

11. Структурная характеристика звездчатых клеток печени в динамике фиброза при HCV-инфекции включает в себя следующие признаки: уменьшение числа и последующее исчезновение липидных капель, очаговую гиперплазию липоцитов, гиперплазию гранулярной цитоплазматической сети, экспрессию фибробластоподобных характеристик, в том числе гладкомышечного -актина, и формирование экстрацеллюлярных коллагеновых фибрилл. Степень выраженности перигепатоцеллюлярного фиброза при HCV-инфекции, по данным морфометрического анализа, имела достоверную обратную корреляцию с численной плотностью липидосодержащих звездчатых клеток – на стадии фиброза III и при циррозе органа она составляла 0,20±0,03 в единице поля зрения, что достоверно меньше (р<0,05), чем на стадиях фиброза 0 – I (5,01±0,18) и II (2,02 ± 0,04).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Непомнящих Д.Л., Мигуськина Е.И., Постникова О.А. Сравнительная оценка эффективности препаратов альфа-интерферона и традиционного лечения больных хроническими вирусными гепатитами // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докладов 8-й научно-практической конференции врачей. – Новосибирск, 1998. – С. 406.
  2. Непомнящих Д.Л., Постникова О.А., Мигуськина Е.И. Патоморфологическое исследование хронических гепатитов по биопсиям печени // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докладов 8-й научно-практической конференции врачей. – Новосибирск, 1998. – С. 407 – 408.
  3. Непомнящих Д.Л., Мезенцева Г.А., Сасин А.В., Айдагулова С.В., Нохрина Ж.В., Постникова О.А., Долговых А.К. Роль биопсии печени в диагностике хронических вирусных гепатитов // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы научно-практической конференции. – Новосибирск, 2000. – С. 87 – 88. 
  4. Непомнящих Г.И., Непомнящих Л.М., Айдагулова С.В., Постникова О.А. Ультраструктура гепатоцитов при действии вирусов гепатита В и С // Материалы VI Всероссийской конференции по патологии клетки. – Москва, 2000. – С. 205. 
  5. Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Мигуськина Е.И., Сасин А.В., Мезенцева Г.А., Постникова О.А., Нохрина Ж.В., Бабошкина Ю.В. Особенности структурных реакций печени при хронических вирусных гепатитах у опий-зависимых пациентов // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы научно-практической конференции ГНОКБ. – Новосибирск, 2001. – С. 279.
  6. Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Капустина В.И., Постникова О.А. Ультраструктурное и иммуногистохимическое исследование звездчатых клеток печени в динамике фиброза и цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 142, № 12. С. 681 686.
  7. Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., Kapustina V.I., Postnikova O.A. Ultrastructural and immunohistochemical study of hepatic stellate cells over the course of infectious viral fibrosis and cirrhosis of the liver // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2006. – Vol. 142, № 6. – P. 723 – 728.
  8. Непомнящих Г.И., Трубникова Н.В., Волкова Д.В., Постникова О.А., Кожевникова О.В. Морфологические особенности эпителия бронхов при бронхиальной астме, ассоциированной с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. 2006. №. 20. С. 26 27.
  9. Непомнящих Д.Л., Виноградова Е.В., Постникова О.А., Капустина В.И. Клинические и патоморфологические особенности цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. 2006. № 20. С. 28 31.
  10. Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Постникова О.А., Понамарчук О.И. Клинико-морфологический анализ микст-гепатита С+В при серонегативном варианте HCV-инфекции // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2006. – Т. 16, № 5. Приложение № 28. Материалы 12-й Российской гастроэнтерологической недели. – С. 84. № 312.
  11. Непомнящих Г.И., Трубникова Н.В., Волкова Д.В., Бакарев М.А., Постникова О.А. Пато­морфология слизистой оболочки бронхов при бронхиальной астме, ассоциированной с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью // Сибирский научный вестник. – 2007. – Вып. X. – С. 24 – 27.
  12. Непомнящих Д.Л., Бурковская В.А., Айдагулова С.В., Бакарев М.А., Постникова О.А., Капустина В.И., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Структурные модификации эпителия гастроэнтеральной системы при иммунозависимом гранулематозе // Бюллетень эксперимен­тальной биологии и медицины. 2010. Т. 150, № 10. С. 467 471.
  13. Nepomnyashchikh D.L., Burkovskaya V.A., Aidagulova S.V., Bakarev M.A., Postnikova O.A., Kapustina V.I., Nohrina Zh.V., Vinogradova E.V. Structural Modification of the Gastrointestinal Epithelium during Immune-Dependent Granulomatosis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2011. – Vol. 150, № 4. – P. 490 – 494.
  14. Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Бакарев М.А., Постникова О.А., Непомнящих Д.Л. Роль биопсии печени в исследовании хронического гепатита С // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. – 2011. – № 2-3. Материалы 13-го Международного Славяно-Балтийско­го научного форума «Санкт-Петербург – Гастро-2011». – С. М64.
  15. Непомнящих Д.Л., Бакарев М.А., Постникова О.А. Роль Helicobacter pylori в гастропатологии. Дискуссионные вопросы // Тезисы 19-й научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии. – Томск, 2011. – С. 53 – 57.
  16. Непомнящих Д.Л., Вавилин В.А., Айдагулова С.В., Макарова С.И., Караваева Ю.Ю., Щепотина Е.Г., Постникова О.А. Полиморфизм цитохрома Р450 2D6 – молекулярно-генетический маркер прогрессирования цирроза печени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т. 152, № 11. С. 568 571.
  17. Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Бакарев М.А., Постникова О.А., Капустина В.И., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Роль Helicobacter pylori в гастропатологии. Дискуссионные вопросы // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. – 2011. – № 25. – С. 27 – 31.
  18. Постникова О.А., Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Виноградова Е.В., Капустина В.И., Нохрина Ж.В. Структурно-функциональная характеристика звездчатых клеток печени в динамике фиброза // Фундаментальные исследования. 2011. № 10. С. 359 362.
  19. Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Постникова О.А., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Хронический микст-гепатит С+В: Клинические варианты // Фундаментальные исследования. 2011. № 10. С. 457 461.
  20. Вавилин В.А., Непомнящих Д.Л., Макарова С.И., Айдагулова С.В., Караваева Ю.Ю., Щепотина Е.Г., Постникова О.А., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Ляхович В.В. Молекулярно-генетический маркер прогрессирования цирроза печени – полиморфизм цитохрома Р450 2D6 // Сибирский научный вестник. – 2011. – Вып. XV. – С. 17 – 20.
  21. Непомнящих Г.И., Домникова Н.П., Бакарев М.А., Постникова О.А. Структурный анализ печени при острых лейкозах и лимфопролиферативных заболеваниях // Сибирский научный вестник. – 2011. – Вып. XV. – С. 49 – 53.
  22. Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Бакарев М.А., Постникова О.А., Капустина В.И., Виноградова Е.В., Нохрина Ж.В. Роль Helicobacter pylori в этиологии и патогенезе хрони­ческих заболеваний желудка // Сибирский научный вестник. – 2011. – Вып. XV. – С. 53 – 57.
  23. Постникова О.А., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Виноградова Е.В., Караваева Ю.Ю., Нохрина Ж.В. Комплексное патоморфологическое, электронно-микроскопическое и стереологическое исследование биоптатов печени при хронической микст-инфекции HCV+HBV // Сибирский научный вестник. – 2011. – Вып. XV. – С. 70 – 73.
  24. Постникова О.А., Айдагулова С.В., Капустина В.И. Ультраструктурный и стереологический анализ звездчатых клеток печени в онтогенезе // Сибирский научный вестник. – 2011. – Вып. XV. – С. 74 – 77.
  25. Капустина В.И., Постникова О.А., Айдагулова С.В. Электронно-микроскопический и стереологический анализ популяции звездчатых клеток в онтогенезе // Фундаментальные исследования. 2011. № 11. С. 170 173.
  26. Постникова О.А., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Караваева Ю.Ю. Ультраструктурное и стереологическое исследование печени при хронической микст-инфекции HCV+HBV // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т. 152, № 12. С. 713 716.
  27. Непомнящих Д.Л., Постникова О.А., Боброва С.В., Айдагулова С.В. Вибрационная гепато- и гастропатия: клинико-морфологическое и стереологическое исследование // Сибирский медицинский журнал. 2011. Т. 26, № 4.   С. 152 155. 
  28. Непомнящих Г.И., Постникова О.А., Домникова Н.П., Бакарев М.А. Морфологический анализ патологии печени при острых лейкозах и лимфопролиферативных заболеваниях // Сибирский онкологический журнал. 2012. Т. 49, № 1.   С. 26 30.
  29. Постникова О.А., Непомнящих Д.Л., Бакарев М.А., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Айдагулова С.В., Савченко С.А. Хронический вирусный гепатит в сочетании с описторхозом: Патоморфологическое исследование // Сибирский медицинский журнал. 2012. Т. 27, № 1. С. 119 122.
  30. Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Постникова О.А., Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Морфогенез хронического гепатита С и цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. 2012. № 2. С. 13 21.
  31. Непомнящих Г.И., Постникова О.А., Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В. Перспективы исследования полиморфизма цитохрома P450 2D6 как молекулярно-генетического маркера прогрессирования цирроза печени // Росийский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2012. – Т. 22, № 2. Приложение № 39. Материалы XVII Ежегодного Российского конгресса «Гепатология сегодня». – С. 58.
  32. Nepomnyashchikh D.L., Vavilin V.A., Aidagulova S.V., Makarova S.I., Karavaeva Yu.Yu., Shchepotina E.G., Postnikova O.A. Cytochrome P450 2D6 polymorphism is a molecular marker of  liver cirrhosis progression // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2012. – Vol. 152, № 5. – P. 633 – 636.
  33. Postnikova O.A., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., Nohrina Zh.V., Vinogradova E.V., Karavaeva Yu.Yu. Ultrastructural and stereological study of the liver in chronic mixed HCV+HBV infection // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2012. – Vol. 152, № 6. – P. 764 – 767.
  34. Постникова О.А., Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Капустина В.И., Непомнящих Д.Л. // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Новосибирск, 2012. – С. 234 – 235.
  35. Непомнящих Д.Л., Постникова О.А., Айдагулова С.В., Караваева Ю.Ю., Виноградова Е.В., Нохрина Ж.В., Савченко С.А. // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Новосибирск, 2012. – С. 364 – 366.
  36. Непомнящих Г.И., Вавилин В.А., Караваева Ю.Ю., Постникова О.А., Непомнящих Д.Л. Роль полиморфизма генов цитохрома P450 2D6 в развитии фиброза и цирроза печени // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. – 2012. – № 2-3. Материалы 14-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург – Гастро-2012». – С. М65.
  37. Непомнящих Г.И., Мезенцева Г.А., Постникова О.А., Русинова С.Г. Структурные изменения эпителиоцитов при карциномах желудка // Фундаментальные исследования. 2012. № 5 (1). С. 91 95.
  38. Непомнящих Г.И., Постникова О.А., Бакарев М.А., Непомнящих Д.Л., Капустина В.И. Структурно-функциональные особенности липидосодержащих гепатоцитов при гепатите С // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. Т. 153, № 5. С. 751 754.
  39. Постникова О.А., Непомнящих Г.И., Юданов А.В., Непомнящих Д.Л., Капустина В.И. Внутриклеточный холестаз в условиях HCV- и HBV-инфекции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. Т. 153, № 6. С. 881 885.

Соискатель                                                                О.А. Постникова




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.