WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ГУРЬЯНОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ

СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКА YB-1

03.01.03 – Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка РАН.

Научный консультант:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Овчинников Лев Павлович

Официальные оппоненты:

Тер-Аванесян Михаил Давидович, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН, заведующий лабораторией молекулярной генетики.

Никонов Станислав Владимирович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН, главный научный сотрудник.

Ведущая организация:

НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова».

Защита состоится «18» октября 2012 г. в 14:00 на заседании диссертационного совета Д002.038.01 при ИБК РАН по адресу:

142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН.

Автореферат разослан «18» сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мультифункциональный Y-бокссвязывающий белок 1 (YB-1) входит в семейство белков с доменом холодового шока. В цитоплазме YB-1 упаковывает и стабилизирует мРНК, регулирует ее трансляционную активность. В ядре YB-1 может участвовать в репликации и репарации ДНК, выступает в качестве фактора транскрипции, а также принимает участие в регуляции альтернативного сплайсинга. Кроме нуклеиновых кислот, YB-1 может взаимодействовать с множеством различных белков.

На клеточном уровне YB-1 участвует в регуляции пролиферации, дифференцировки и ответа на стрессовые воздействия. Нокаут гена YB-1 у мышей вызывает серьезные нарушения эмбрионального развития, что приводит к пренатальной или постнатальной ранней гибели.

Внутриклеточное содержание YB-1 часто увеличивается в раковых клетках, поэтому этот белок рассматривается в качестве одного из маркеров злокачественных опухолей (Елисеева и др., 2011).

YB-1 содержит 324 аминокислотных остатка, среди которых преобладают остатки аргинина (12%), глицина (12%), пролина (11%), аланина (9%) и глутамата (8%). Преобладание положительно заряженных остатков определяет высокое значение изоэлектрической точки pI 9,(Minich et al, 1993). Белок состоит из трех доменов: N-концевого аланин/пролин-богатого (A/P) домена, высококонсервативного домена холодового шока (CSD) и C-концевого домена (CTD), отличающегося наличием чередующихся кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислот. К настоящему времени известна только структура CSD, определенная методом ядерного магнитного резонанса (Kloks et al, 2002). Домен представляет собой -бочонок, образованный пятью -тяжами. CSD содержит мотивы РНП-1 и РНП-2, благодаря которым способен специфично и неспецифично связываться с нуклеиновыми кислотами. CSD также участвует в связывании ряда белковых партнеров YB-1. Согласно данным ЯМР, CSD YB-1 имеет низкую стабильность: при 25 °С в растворе только около 70% молекул CSD находятся в нативном состоянии (Kloks et al., 2004), в то время как температура плавления белка-гомолога Ec-CspA из Escherichia coli, по данным микрокалориметрии, составляет 56 °С (Petrosian & Makhatadze, 2000). Такое различие в стабильности CSD про- и эукариот связывают с наличием в CSD белка YB-1 длинной подвижной петли, которая отсутствует в прокариотических белках.

О структуре доменов A/P и CTD известно мало. Ряд данных указывает на отсутствие регулярной вторичной структуры в этих доменах. Так, гомологичный белок FRGY2 со сходным аминокислотным составом имеет спектр КД, характерный для полипролиновой спирали второго типа (Manival et al., 2001). Кроме того, сообщалось, что согласно предсказаниям неструктурированных участков с использованием разных алгоритмов белок YB-1 на 87% неупорядочен (Tompa & Csermely, 2004). В A/P-домене был обнаружен участок связывания актина (Ruzanov et al., 1999). CTD характеризуется большим содержанием положительно заряженных аминокислот и обладает высоким неспецифическим сродством к нуклеиновым кислотам. В этом домене сосредоточено большинство участков взаимодействия с белковыми партнерами YB-1, а также сигнал ядерной локализации, сайт удержания в цитоплазме и место расщепления белка 20S протеасомой (Елисеева и др., 2011).

В нашей группе было обнаружено, что в растворе белок YB-способен образовывать олигомеры массой до 800 кДа (Evdokimova et al., 1995). С помощью электронной и атомно-силовой микроскопии было определено, что адсорбированные на подложку олигомеры имеют округлую форму, диаметр 35-40 нм и высоту 9-10 нм (Skabkin et al., 2004).

Образование олигомеров происходит, по-видимому, за счет взаимодействия противоположно заряженных кластеров аминокислот в CTD разных молекул белка. Интересно, что при насыщении мРНК белком YB-1 наблюдаются похожие олигомеры, при этом мРНК, по-видимому, находится на поверхности олигомеров.

Цель и задачи исследования. Представленная работа посвящена изучению структуры белка YB-1 в олигомерных комплексах в растворе и в составе фибриллярных структур. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) определить вторичную структуру YB-1 в растворе; 2) исследовать термодинамические параметры белка YB-1; 3) оценить компактность белка и размер и морфологию олигомерных комплексов в растворе; 4) определить участок белка YB-1, отвечающий за образование фибрилл; 5) проверить способность белка YB-1 и его фрагментов образовывать фибриллы при разных концентрациях солей; 6) проверить наличие признаков амилоидной структуры в фибриллах YB-1; 7) исследовать процесс формирования фибрилл YB-1.

Научная новизна работы. Данным исследованием установлено, что в белке YB-1 в растворе присутствуют три типа вторичной структуры:

клубкообразная, поли(L-пролиновая) спиральная второго типа и структурная (небольшое количество). Обнаружено, что домен холодового шока белка YB-1 обладает низкой стабильностью и претерпевает денатурационный переход как при нагревании, так и при охлаждении.

Определено, что олигомеры YB-1 могут достигать молекулярной массы 1010 кДа и иметь радиус инерции 106 . Показано, что в составе олигомеров белок YB-1 компактен, что указывает на наличие достаточно развитых внутримолекулярных взаимодействий, хотя и недостаточных для формирования жесткой третичной структуры. Установлена способность олигомеров YB-1 распадаться при понижении концентрации белка.

Обнаружено, что в условиях высокой ионной силы YB-1 способен образовывать протяженные фибриллы. За образование фибрилл отвечает CSD; A/P-домен стимулирует фибриллообразование; первая половина CTD блокирует образование фибрилл, а его вторая половина снимает блокирующее действие первой половины. Доказано, что фибриллы YB-являются амилоидоподобными. Показана способность фибрилл YB-распадаться при понижении ионной силы до физиологической, что отличает фибриллы YB-1 от большинства известных амилоидоподобных структур. Установлено, что фрагменты YB-1 без CTD обладают способностью образовывать фибриллы и при физиологической ионной силе. На основании опытов на фрагменте белка YB-11-129 предложена модель организации фибрилл.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: VIII European Symposium of the Protein Society (Zurich, Switzerland, 2009), International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov (Moscow-Pushchino, Russia, 2009), The 4th international IMBG conference for young scientists “Molecular biology: advances and perspectives” (Kiev, Ukraine, 2011); на ежегодных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2008, 2010, 2011), ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино 2010, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе четыре статьи в реферируемых журналах и одна статья в периодическом сборнике из списка ВАК.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа содержит рисунков и одну таблицу.

РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Исследование белка YB-1 в растворе 1.1. A/P-домен и CTD белка YB-1 предсказываются как неструктурированные Анализ гомологии белка YB-1 с известными белками показал наличие высоко консервативного домена CSD. Фланкирующие CSD последовательности были обозначены как A/P-домен и CTD (рис. 1, а).

(a) A/P CSD CTD CSD (б) PROF 1,альфа бета 0,клубок 0,50 100 150 200 250 3(в) PONDR 1,неупорядоченность 0,0,50 100 150 200 250 3номер аминокислотного остатка Рис. 1. Предсказание вторичной структуры в белке YB-1. (а) Доменная структура белка YB-1. (б) Предсказание распределения -, - и нерегулярной структуры в белке YB-1 по алгоритму PROF (Ouali & King, 2000. http://www.aber.ac.uk/~phiwww/prof/). (в) Предсказание неупорядоченности в белке YB-1 по алгоритму PONDR VL-XT (Li et al., 1999. http://www.pondr.com). Оценка 0,5 означает неупорядоченность.

Оценка Оценка Известно, что CSD белка YB-1 имеет структуру -бочонка. Для оценки возможной структуры остальных участков YB-1 мы провели компьютерный анализ аминокислотной последовательности с помощью алгоритма предсказания вторичной структуры PROF (Ouali & King, 2000) (рис. 1, б). Результат указывает на наличие -тяжей в CSD, что хорошо согласуется с экспериментальными данными. В то же время это предсказание указывает на отсутствие - или -структуры в доменах A/P и CTD, что может говорить о неструктурированности полипептидной цепи в этих доменах. Для подтверждения предсказания неструктурированности мы провели анализ аминокислотной последовательности YB-1 с использованием специализированного алгоритма предсказания природной неструктурированности белков PONDR (Li et al., 1999) (рис. 1, в).

Полученный результат также указывает на неструктурированность доменов A/P и CTD. Таким образом, большая часть белка YB-1 может быть неупорядочена.

1.2. Спектры кругового дихроизма указывают на большое содержание клубкообразной формы и структуры поли(L)-пролиновой спирали второго типа Для экспериментальной оценки содержания элементов регулярной вторичной структуры в белке YB-1 мы измерили спектр кругового дихроизма при 25 °C. Полученный спектр имеет минимум при 200 нм и слабо выраженный максимум при 220 нм (рис. 2, а). Такая форма спектра характерна для структуры поли(L)-пролиновой спирали второго типа (Sreerama & Woody, 1994). Известно, что при повышении температуры (а) 4 (б) ----------12 -300 320 340 3190 200 210 220 230 240 2, нм T, К Рис. 2. Исследование белка YB-1 методом спектроскопии кругового дихроизма.

Оптическое вращение 2,4 мг/мл YB-1 в 0,5 М фосфате калия, pH 7,4 измеряли на спектрополяриметре Jasco 815. (а) Спектр кругового дихроизма белка YB-1 при температуре 25 °C (сплошная линия) и 95 °C (точечная линия); (б) Зависимость оптического вращения белка YB-1 при 220 нм от температуры.

----2[ ]*10, град * см * дмоль [ ] *10, град * см * дмоль спектры полипролиновой спирали приобретают форму, характерную для -структуры, то есть имеют минимум около 215-220 нм и максимум около 195 нм (Bochicchio & Tamburro, 2002). Действительно, при нагревании белка YB-1 до 95 °C происходит заметное уменьшение величины оптического вращения при 200 нм и увеличение при 220 нм (рис. 2, а). За изменением спектра удобно следить по изменению вращения при 220 нм (рис. 2, б). Выявленная зависимость оптического вращения от температуры подтверждает наличие структуры полипролиновой спирали в некоторой части белка. Поскольку CSD белка YB-1 является -структурным, повидимому, структура полипролиновой спирали содержится в доменах A/P и CTD. Структура полипролиновой спирали характерна для природно неструктурированных белков (Rath et al., 2005), поэтому можно предположить, что большая часть белка YB-1 действительно неупорядочена.

1.3. Домен холодового шока белка YB-1 обладает низкой стабильностью и претерпевает денатурационный переход как при нагревании, так и при охлаждении.

Известно, что изолированный CSD белка YB-1 обладает низкой стабильностью, поскольку этот домен в растворе при 25 °C (298 К) находится в равновесии между свернутой (70%) и несвернутой формами (30%) (Kloks et al., 2004). Для определения термодинамических параметров CSD в составе YB-1 мы провели микрокалориметрическое исследование белка YB-1, его фрагмента YB-11-129, содержащего домены A/P и CSD, и фрагмента YB-152-129, представляющего собой изолированный CSD (рис. 3, см. также рис. 8). Рассчитанные из эксперимента параметры приведены в таблице 1. Близость значений Cp при плавлении YB-1 и его фрагментов со значениями Cp бактериальных белков холодового шока говорит о том, что в белке YB-1 кооперативной единицей плавления является только CSD. При этом оказалось, что стабильность изолированного CSD белка YB-1 ниже (TM=312 К), чем стабильность бактериальных доменов холодового шока (TM,CspA=329 К) (Petrosian & Makhatadze, 2000).

Интересно, что добавление домена A/P к CSD понижает стабильность белка (TM=308 К), однако полноразмерный YB-1 плавится при более высокой температуре (318 К), что свидетельствует о стабилизирующем влиянии CTD на CSD.

(а) 2,5 (б) 2,2,86 2,2,2,2,2,1,2,1,280 300 320 340 3290 300 310 320 3T, К T, К Рис. 3. Микрокалориметрическое исследование белка YB-1 и его (в) 2,4 фрагментов. Кривые плавления (а) YB-1 в 20 мМ фосфате калия, pH 7,0, 0,2 М KCl, 2,(б) фрагмента YB-11-129 в 20 мМ фосфате 2,калия, pH 6,5, 0,2 М KCl, (в) фрагмента 1,YB-152-129 в 0,1 М фосфате калия, pH 6,были получены на микрокалориметре 1,СКАЛ-1. Точечная кривая – 1,экспериментальные данные, сплошная кривая – результат подгонки данных по 280 300 320 340 3модели двух состояний.

T, К Таблица 1. Термодинамические параметры плавления YB-1, YB-11-129, YB-152-129 и бактериальных гомологов CSD белка YB-1.

YB-1 YB-11-129 YB-152-129 CspA* CspB** TM, K 318 308 312 329 3Cp, kJ K-1 mol-1 3,2 5,4 5,2 3,2 3,H, kJ mol-1 118 85 99 181 1*Petrosian & Makhatadze, 2000; **Makhatatze & Marahiel, 1994.

Наличие небольшого минимума теплоемкости в левой части кривых плавления YB-152-129 и YB-11-129 позволяет предположить наличие холодовой денатурации CSD белка YB-1 (Privalov, 1990). Для проверки этого предположения мы использовали спектроскопию ЯМР. Метод H-ЯМР позволяет определить присутствие жесткой третичной структуры в исследуемом белке по наличию пиков в высокопольной части спектра.

Были получены спектры 1H-ЯМР белка YB-1 при различных температурах (рис. 4). При температуре 25 °C (298 К) действительно наблюдаются пики в высокопольной части спектра. Эти пики, по-видимому, соответствуют --------p p C, Дж * К * г C, Дж * К * г p p C, кДж * К * моль C, кДж * К * моль ----p C, Дж * К * г p C, кДж * К * моль жесткой третичной структуре CSD. При температуре 64 °C (334 К) пики в высокопольной части спектра не наблюдаются, что говорит об отсутствии в белке жесткой третичной структуры в этих условиях. Это согласуется с тем, что по данным микрокалориметрии CSD в составе белка YB-1 при этой температуре расплавлен. Однако высокопольные пики не наблюдаются и при температуре 2 °C (275 К), что подтверждает разрушение жесткой третичной структуры CSD вследствие холодовой денатурации. Таким образом, данные микрокалориметрии и ЯМР указывают на существование денатурационных переходов в CSD как при нагревании, так и при охлаждении.

Рис. 4. Спектры 334K xH-ЯМР белка YB-при различных температурах.

Спектры 2,4 мг/мл YB-xв 0,5 М фосфате калия, 298K pH 7,4 получены на спектрометре AVANCE III 600. Справа на вставках показаны высокопольные части 275K xспектра.

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 1.4. YB-1 в растворе обладает высокой степенью компактности Мы решили исследовать, каким образом организована неструктурированная часть белка YB-1. Для этого мы оценивали компактность белка методом малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS). Анализ кривой рассеяния в координатах Гинье (Feigin & Svergun, 1987; Glatter & Kratky, 1982) указывает на существование небольших олигомеров YB-1 со средней массой 85 кДа в 0,5 М фосфата калия при pH 7,4 (рис. 5, а). При этом наличие выраженного максимума на графике в координатах Кратки (Semisotnov et al., 1996) (рис. 5, б) говорит о том, что белок компактен. При понижении pH до 4,0 ассоциаты диссоциируют до мономеров с молекулярной массой 36 кДа, однако белок теряет компактность, о чем свидетельствует менее выраженный максимум на графике Кратки (рис. 5, а, б). Распад олигомеров и нарушение компактности белковой молекулы при pH 4,0 может быть связано с увеличением положительного заряда полипептидной цепи белка и, следовательно, как внутримолекулярного, так и межмолекулярного электростатического отталкивания. Мы также оценили компактность YB-методом скоростной седиментации (рис. 5, в). Полученное значение коэффициента седиментации S20,w=2,65 S подтверждает, что белок YB-обладает компактностью, сравнимой с компактностью глобулярных белков такой же молекулярной массы (рис. 5, г), несмотря на неструктурированность значительной части белковой цепи. Это может объясняться тем, что в доменах A/P и CTD существуют определенные взаимодействия внутри доменов и/или с CSD. Для C-концевого домена можно предложить модель компактной укладки за счет взаимодействия противоположно заряженных кластеров аминокислот.

2,(а) (б) 0,5 М K-PO4, pH 7,0,5 М K-PO4, pH 7,2,0,Rg=83 , Mw=85 кДа Rg=83 , Mw=85 кДа 0,15 М KCl, pH 4,0,15 М KCl, pH 4,2,Rg=63 , Mw=36кДа 2,0,2,1,0,1,1,0,0,0000 0,0004 0,0008 0,0012 0,0016 0,00 0,04 0,08 0,12 0,Q2, -Q, -(в) (г) 102,65 s 0,10,0,0,0,0 0,1 2 3 4 5 6 7 103 104 105 106 107 1S, сведберг молекулярная масса, Да Рис. 5. Исследование компактности белка YB-1. (а), (б) Исследование YB-1 методом SAXS в 0,5 М фосфате калия, pH 7,4 и 20 мМ глицин-HCl, pH 4,0, 0,15 М KCl. Данные представлены в координатах (а) Гинье и (б) Кратки. (в) Определение коэффициента седиментации белка YB-1 методом аналитического ультрацентрифугирования в 20 мМ Hepes-KOH, pH 7,4, 0,2 М KCl. (г) Сравнение компактности YB-1 с компактностью глобулярных белков. – глобулярные белки, – YB-1.

IQ Log I S C 20,w 1/S *v /(1-v* ) 1.5. Олигомеризация YB-Способность YB-1 к олигомеризации отмечалась ранее. Мы исследовали YB-1 методом SAXS и определили, что YB-1 в условиях повышенной ионной силы (1 М KCl при нейтральном pH) образует олигомеры с молекулярной массой 1010 кДа и радиусом инерции 106 (рис. 6, а). При этом в составе больших олигомеров YB-1 остается довольно компактным, на что указывает наличие выраженного максимума на графике Кратки (рис. 6, б). Степень ассоциации уменьшается с уменьшением концентрации белка. Так, в присутствии 1 М NaCl при сравнительно высокой концентрации белка (около 2,7 мг/мл или 75 мкМ) методом гель-фильтрации выявляются комплексы массой свыше 440 кДа.

При уменьшении концентрации белка эти комплексы распадаются вплоть до мономеров (при концентрации белка 10 мкг/мл или 0,3 мкМ эффективная молекулярная масса не превышает 45 кДа) (рис. 6, в).

0,(б) (а) 3,Rg=106 , Mw=1010кДа 0,3,0,2,0,2,0,2,0,0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,0,0000 0,0004 0,0008 0,0012 0,00Q2, -Q, -(в) 800 440 66 45 кДа 2,7 мг/мл 343 мкг/мл 60 мкг/мл 10 мкг/мл 0 5 10 15 20 Объем элюции, мл Рис. 6. Исследование олигомеризации белка YB-1. (а), (б) YB-1 исследовали методом SAXS в 20 мМ фосфате калия, pH 7,4, 1 М KCl. Данные представлены в координатах (а) Кратки и (б) Гинье. (в) Хроматограммы гель-фильтрации белка YB-1 в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,6, 2 М KCl на колонке Superose 12 при различных концентрациях белка. Значения максимальной оптической плотности в каждой хроматограмме взяты за единицу. Отмечены объемы элюции глобулярных белков-маркеров. На вставке указаны концентрации белка в пиках.

IQ Log I Поскольку молекулярная масса YB-1 равна 36 кДа, можно сделать вывод о высокой степени компактности белка в мономерной форме. Кроме того, эти данные свидетельствуют о высокой лабильности ассоциатов YB-1 в растворе.

2. Формирование фибрилл белком YB-2.1. Белок YB-1 способен образовывать протяженные фибриллы с участием домена холодового шока При исследовании процесса олигомеризации YB-1 мы обнаружили, что при длительной инкубации в условиях высокой ионной силы белок формирует протяженные фибриллы. Белок YB-1 инкубировали в присутствии 2 М LiCl, затем препарат адсорбировали на подложку и получали изображения белка с помощью электронной или атомно-силовой микроскопии (рис. 7, а-в). Формирование фибрилл наблюдалось уже через 1 час инкубации (рис. 7, а). С увеличением времени инкубации длина фибрилл увеличивалась и могла превышать 10 мкм, при этом длинные фибриллы имели тенденцию к упорядочению в пучки или ленты (рис. 7, б, в). Более тщательный анализ изображений фибрилл показал, что они обладают спиральной организацией с периодом 50-52 нм и имеют толщину 15-20 нм.

(а) (б) (в) 1 мкм 0,4 мкм 0,4 мкм Рис. 7. Образование фибрилл белком YB-1. Белок YB-1 инкубировали в присутствии 2 М LiCl в течение (а) 1 часа, (б) 24 часов или (в) 30 дней и анализировали с помощью (а, б) электронной или (в) атомно-силовой микроскопии.

Для того чтобы определить, какая часть YB-1 отвечает за образование фибрилл, мы использовали ряд фрагментов белка (рис. 8). Самый крупный фрагмент YB-11-219, у которого отсутствовала примерно половина C-концевого домена, был ранее обнаружен нами как продукт процессинга YB-1 20S-протеасомой. Также мы использовали описанные выше фрагменты YB-11-129 и YB-152-129.

3CSD A/P CSD CTD YB-1 2YB-11-21 1YB-11-152 1YB-152-1Рис. 8. Доменная структура белка YB-1 и его фрагментов, использованных в работе.

YB-1 и его фрагменты инкубировали в присутствии 2 М LiCl, затем препараты анализировали с помощью электронной микроскопии (рис. 9).

Оказалось, что в этих условиях фрагмент YB-11-219 не образовывал фибриллы (рис. 9, б), в отличие от полноразмерного белка YB-1 (рис. 9, а).

Однако, фрагмент YB-11-129, у которого CTD полностью отсутствовал, был способен эффективно образовывать фибриллы (рис. 9, в). При дальнейшем удалении A/P-домена с образованием фрагмента YB-152-129 способность белка к фибриллоообразованию сохранялась (рис. 9, г). Таким образом, для образования фибрилл достаточно CSD. Можно отметить, что добавление к CSD домена A/P стимулировало образование фибрилл, что может быть обусловлено дестабилизацией CSD A/P-доменом (см. табл. 1). Различные участки CTD по-разному влияли на фибриллоообразование: первая половина CTD блокирует способность к образованию фибрилл, в то время как вторая половина CTD снимает блокирующее действие первой половины этого домена (рис. 9).

Рис. 9. Образование (а) (б) фибрилл белком YB-1 и его фрагментами при высокой ионной силе. (а) YB-1, (б) фрагмент YB-11, (в) фрагмент YB-11-129, 2(г) фрагмент YB-152-1инкубировали при концентрации 10 мкМ в (в) (г) присутствии 2 М LiCl при 20 °C в течение 24 часов, затем анализировали с помощью электронной микроскопии. Масштабная метка 0,4 мкм.

Способность белка YB-1 образовывать фибриллярные структуры ранее не отмечалась. Это могло быть связано с тем, что большинство экспериментов с белком проводилось в условиях физиологической ионной силы. Мы решили проверить, могут ли белок YB-1 и его фрагменты образовывать фибриллы при физиологической ионной силе. Для этого препараты инкубировали в присутствии 0,15 М KCl, затем образцы анализировали с помощью электронной микроскопии. Оказалось, что в этих условиях в препаратах полноразмерного YB-1 и фрагмента без второй половины CTD YB-11-219 наблюдались только глобулярные ассоциаты, но не фибриллы (рис. 10, а, б). По-видимому, как полноразмерный, так и укороченный CTD при физиологической ионной силе подавляют фибриллообразование. При этом фрагменты YB-1 без CTD: YB-152-129 и YB-11-129 – в этих условиях способны образовывать фибриллы практически так же, как и при высокой ионной силе (рис. 10, в, г).

Рис. 10. Образование (а) (б) фибрилл белком YB-1 и его фрагментами при физиологической ионной силе. (а) YB-1, (б) фрагмент YB-11-219, (в) фрагмент YB-11-129, (г) фрагмент YB-152-129 инкубировали при концентрации 10 мкМ в присутствии 0,15 М KCl при (в) (г) 20 °C в течение 95 часов, затем анализировали с помощью электронной микроскопии. Масштабная метка 0,4 мкм.

2.2. Фибриллы YB-1 являются амилоидоподобными Мы предположили, что фибриллы белка YB-1 являются амилоидоподобными. Амилоидные и амилоидоподобные структуры образуются за счет формирования межмолекулярной кросс--структуры.

Основными признаками образования амилоидных и амилоидоподобных белковых структур являются (Nelson & Eisenberg, 2006):

а) формирование фибриллярных структур;

б) появления способности окрашиваться специфичными красителями тиофлавином Т (ThT) и конго красным;

в) увеличение доли -структуры;

г) характерное рассеяние рентгеновских лучей ориентированными препаратами.

Мы исследовали, способны ли фибриллы YB-1 связывать специфичный к амилоидам флуоресцентный краситель ThТ. Белок YB-инкубировали при высокой ионной силе, затем анализировали с помощью атомно-силовой микроскопии или флуоресцентной микроскопии после окраски ThТ. На рисунке 11, а видно, что после инкубации в препарате YB-1 появились фибриллы. На изображении, полученном с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 11, б), видно, что эти фибриллы окрашиваются красителем.

(а) (в) 5 мкм (б) (г) 5 мкм Рис. 11. Фибриллы YB-1 связывают специфичные к амилоидам красители. (а), (б) Окраска фибрилл YB-1 тиофлавином Т. YB-1 (3 мкМ) инкубировали в присутствии 2 М LiCl, затем исследовали с помощью (а) атомно-силовой микроскопии или (б) конфокальной микроскопии после окраски тиофлавином Т. (в) Окраска фибрилл YB-конго красным. YB-1 (~1,4 мМ) инкубировали в присутствии 2 М LiCl, образовавшийся гель отмывали от соли в деионизированной воде, затем высушивали на стекле и окрашивали 0,1% водным раствором конго красного. Препарат фотографировали в режиме светлого поля (слева) или в поляризованном свете (справа). (г) Окраска фибрилл YB-11-129 конго красным. YB-11-129 (1,4 мМ) инкубировали в 0,2 М KCl, образовавшийся гель высушивали на стекле, затем окрашивали и анализировали как описано для полноразмерного YB-1.

Мы также проверили, способны ли фибриллы YB-1 связывать другой специфичный к амилоидам краситель – конго красный. Белок YB-инкубировали при концентрации 1,4 мМ в присутствии 2 М LiCl. В процессе инкубации происходило формирование геля, которое указывало на фибриллообразование. Гель высушили на стекле, окрасили конго красным, полученный препарат анализировали с помощью поляризационного микроскопа. На рисунке 11, в видно, что препарат белка после окраски конго красным (слева) проявлял характерное зеленое окрашивание в поляризованном свете (справа). Мы также проверили способность фибрилл фрагмента YB-11-129, полученных инкубацией в условиях, близких к физиологическим (0,2 М KCl), связывать конго красный. При инкубации препарата также происходило формирование геля, указывающее на образование фибрилл, а исследование окрашенного препарата с помощью поляризационного микроскопа выявило специфичное для амилоидов связывание красителя (рис. 11, г).

Поскольку при формировании амилоидной кросс--структуры часто наблюдается увеличение общего содержания -структуры в белке, мы исследовали изменение вторичной структуры YB-1 и фрагмента YB-11-1при формировании фибрилл. Были сняты спектры кругового дихроизма белков при физиологической ионной силе или после инкубации при высокой ионной силе. На полученных спектрах (рис. 12, а, б) видно, что при физиологической ионной силе в обоих белках наблюдается малое содержание регулярной вторичной структуры. После инкубации белков при высокой ионной силе их спектры приобретают форму, характерную для -структурных белков.

Для того, чтобы подтвердить формирование кросс--структуры при образовании фибрилл YB-1, мы исследовали ориентированные препараты фибрилл YB-1 и его фрагмента YB-11-129 с помощью дифракции рентгеновских лучей. Для получения ориентированных препаратов использовали те же образцы белков, что и для окраски конго красным.

Небольшое количество белкового геля отмывали от солей в деионизированной воде и готовили препарат методом растягивания капли.

На полученных дифракционных картинах видны рефлексы, соответствующие периодам 4,7 и 10-11 , характерные для амилоидной кросс--структуры (рис.12, в, г).

Таким образом, фибриллы белка YB-1, а также его фрагмента YB-11-129 обладают набором свойств, характерных для амилоидных структур.

(б) (а) 0 -----15 -190 200 210 220 230 240 250 190 200 210 220 230 240 2, нм , нм (в) (г) 4,7 4,7 10-11 10-11 Рис. 12. Формирование кросс--структуры при образовании фибрилл белка YB-1 и его фрагмента YB-11-129. Спектры кругового дихроизма (а) YB-1 и (б) фрагмента YB-11-129. Спектры были получены в условиях физиологической ионной силы (0,15 М KCl, сплошная линия) и после инкубации в условиях высокой ионной силы (1 М MgSO4, точечная линия) на спектрополяриметре Jasco J-815. Картины рентгеновской дифракции (в) YB-1 и (г) фрагмента YB-11-129. Белки с концентрацией 1,4 мМ были инкубированы в присутствии 2 М LiCl (YB-1) или 0,2 М KCl (YB-11-129), образовавшийся гель отмывали от солей в деионизированной воде, затем готовили ориентированный препарат методом растяжения и высушивания капли. Картины дифракции получали с помощью генератора Microstar X-ray с оптикой HELIOX, оборудованного детектором Platinum135 CCD detector (X8 Proteum system, Bruker AXS).

2.3. Исследование процесса образования фибрилл YB-Исследование процесса образования амилоидоподобных структур представляет большой интерес для поиска путей предотвращения накопления амилоидных отложений. Известно, что промежуточной стадией амилоидообразования является формирование олигомеров, однако процесс перехода от олигомеров к фибриллам остается малоизученным (Uversky, 2010). Мы проанализировали электронно-микроскопические изображения препаратов фибрилл YB-1 и его фрагментов и обнаружили кольцевые олигомерные структуры (рис. 13, верхний ряд). Эти кольцевые ----[ ]*10, град * см * дмоль [ ]*10, град * см * дмоль олигомеры имеют диаметр около 13 нм и состоят из 5-6 более мелких частиц, точное число частиц определить затруднительно. Подобные кольцевые структуры часто обнаруживаются в препаратах амилоидоподобных фибрилл и считаются интермедиатом их образования.

На изображениях препаратов фибрилл YB-11-129 были также замечены структуры, которые могут представлять собой промежуточные стадии роста фибрилл из кольцевых олигомеров. На рисунке 13 эти структуры расположены в порядке увеличения их размера, предложена модель их организации.

Рис. 13. Олигомерные структуры в препаратах фибрилл фрагмента YB-11-129. Предполагаемые интермедиаты образования фибрилл YB-11-129 в присутствии 2 М LiCl.

Изображения получены методом электронной микроскопии и расположены сверху вниз в порядке увеличения размера структур.

Справа представлена модель их организации. Масштабная метка 50 нм 50 нм.

Анализ данных электронной микроскопии также выявил, что фибриллы YB-1 имеют выраженную полярность, поскольку заметна разница в изображениях концов частиц. Один конец («закрытый») хорошо контрастируется уранилацетатом (рис. 14, а), в то время как другой конец («открытый») контрастируется значительно хуже (рис. 14, б). Можно предположить, что полярность фибриллы отражает направленность ее роста, при этом «закрытый» конец является началом роста фибриллы, а «открытый» – местом присоединения белка, приводящего к увеличению длины фибриллы. Действительно, исследования роста амилоидных фибрилл различных белков показали его направленность (Ban et al., 2003;

Inoue et al., 2001).

(а) (б) 100 нм Рис. 14. Электронно-микроскопические изображения концевых фрагментов фибрилл белка YB-1. (а), (б) – «Закрытые» и «открытые» концы фибрилл, соответственно. Фибриллы получены инкубацией YB-1 в присутствии 2 М LiCl.

2.4. Влияние различных катионов на рост амилоидоподобных фибрилл YB-Чтобы исследовать влияние различных катионов, мы сравнили действие различных солей, таких как KCl, LiCl, MgCl2 и NaCl (содержащих различные катионы и один и тот же анион, Cl-), на образование амилоидной структуры полноразмерного YB-1. Образцы YB-инкубировали в присутствии высокой концентрации различных хлоридов металлов, амилоидообразование анализировали по связыванию специфичного флуоресцентного красителя ThT (рис. 15). По способности вызывать образование амилоидной структуры, определенной этим методом, катионы расположились в следующем порядке:

Mg2+>Li+>Na+K+.

Рис. 15. Эффект различных солей на 6образование амилоидоподобных * 500 *** фибрилл YB-1. YB-1 (10 мкМ) *** инкубировали в буфере 20 мМ Hepes-KOH, 400 *** pH 7,4, содержащем различные соли, 3указанные на графике, в течение 24 часов при 20 °C. Амилоидообразование 2отслеживали по флуоресценции 1тиофлавина Т. Указаны средние значения и стандартное отклонение (n=3); *, *** 0,15 M KCl 2 M KCl 2 M NaCl 2 M LiCl 1 M MgCl обозначают t-test p<0.05, p <0.001, соответственно.

Флуоресценция ThT, усл.

ед.

2.5. При понижении ионной силы фибриллы YB-1 распадаются Одним из общих свойств амилоидных и амилоидоподобных структур является их нерастворимость в физиологических условиях. Следствием такой нерастворимости является накопление белковых отложений при амилоидогенных патологиях. Мы решили проверить, устойчивы ли фибриллы YB-1 в условиях физиологической ионной силы. Фибриллы получали инкубацией белка в условиях высокой ионной силы, а затем переводили в физиологические условия. Наличие амилоидной агрегации отслеживали по флуоресценции тиофлавина и электронной микроскопией (рис. 16).

1(а) 2 М KCl 2 М KCl0,15 M KCl *** *** (б) 0,15 M KCl 110,15 М KCl 2 М LiCl 2 М LiCl0,15 M KCl (в) Рис. 16. Распад амилоидоподобных фибрилл YB-1 при физиологической ионной силе. (а), (б) YB-1 (56,8 мкМ) инкубировали в 0,15 М или 2 М KCl в течение 24 часов.

После инкубации часть образца YB-1 в 2 М KCl разбавляли до концентрации соли 0,М KCl. Концентрация белка составила 4,26 мкМ. Остальные образцы разбавляли до той же конечной концентрации белка растворами 0,15 М или 2 М KCl так, чтобы концентрация соли не изменялась. Полученные образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и анализировали (а) по флуоресценции тиофлавина (показаны средние значения и стандартное отклонение (n=3); *** обозначает t-test p<0,001) или (б) электронной микроскопией. (в) YB-1 (30 мкМ) инкубировали в 0,15 М или 2 М LiCl в течение 24 часов. После инкубации часть образца YB-1 в 2 M LiCl диализовали против 0,15 М KCl. Наличие фибрилл отслеживали атомно-силовой микроскопией. Масштабная метка 0,4 мкм. Указаны условия инкубации.

Было замечено, что при замене 2 M LiCl на 2 M KCl белок YB-1 образует сходные фибриллы (рис. 16, б), поэтому простым разбавлением соли можно достичь ионных условий, близких к физиологическим (0,15 M KCl).

Мы инкубировали образец YB-1 в 2 M KCl, а затем разбавляли водой до 0,15 M KCl для понижения ионной силы до физиологической. В Флуоресценция ThT, усл.

ед.

отрицательном контроле образец YB-1 инкубировали в 0,15 M KCl, а в положительном – в 2 M KCl, затем разбавляли растворами 0,15 M или 2 M KCl, соответственно, чтобы концентрация соли оставалась неизменной.

Таким образом, конечная концентрация YB-1 во всех образцах при измерении флуоресценции ThT была одинаковой. Как и ожидалось, флуоресценция ThT в образце YB-1 после инкубации в 0,15 M KCl практически не отличалась от флуоресценции самого ThT. После инкубации YB-1 в 2 M KCl флуоресценция ThT значительно повышалась, что говорит о появлении амилоидной структуры. Если же в таком образце YB-1 после инкубации в 2 M KCl концентрацию соли понижали до 0,15 M KCl, то флуоресценция ThT понижалась до значения, близкого к значению для образца, инкубированного только в 0,15 M KCl (рис. 16, а). Это понижение флуоресценции ThT указывает на распад амилоидной структуры. Эти же образцы анализировали с помощью электронной микроскопии (рис. 16, б). Как и ожидалось, в отрицательном контроле после инкубации YB-1 в 0,15 M KCl не наблюдалось каких-либо фибрилл (рис. 16, б, слева), а в положительном контроле после инкубации YB-1 в M KCl наблюдались протяженные фибриллы (рис. 16, б, в центре). Если в образце после инкубации YB-1 в 2 M KCl концентрация соли была понижена разбавлением до физиологической, то количество и длина фибрилл существенно уменьшались (рис. 16, б, справа).

Аналогичные результаты были получены для фибрилл, образованных в 2 M LiCl, при понижении концентрации соли диализом (рис. 16, в). YB-инкубировали в присутствии 0,15 M KCl или 2 M LiCl. Визуализация образцов YB-1 с помощью атомно-силовой микроскопии показала, что после инкубации в 0,15 M KCl также не наблюдается фибриллярных структур (рис 16, в, слева). В присутствии 2 M LiCl появляются протяженные фибриллы (рис. 16, в, в центре), которые исчезают после диализа образца против 0,15 M KCl (рис. 16, в, справа). Таким образом, амилоидоподобные фибриллы полноразмерного YB-1, образованные при повышенной ионной силе, способны распадаться при физиологической ионной силе.

ВЫВОДЫ 1. На основании компьютерного анализа и исследования вторичной структуры белка YB-1 методом кругового дихроизма показано, что значительная часть белка YB-1 не имеет регулярной вторичной структуры, стабилизированной водородными связями, и может быть неупорядоченной.

2. Исследование YB-1 методами дифференциальной микрокалориметрии и H-ЯМР выявило, что в белке YB-кооперативной единицей плавления, обладающей жесткой третичной структурой, является только домен холодового шока, который претерпевает денатурационный переход как при нагревании, так и при охлаждении.

3. Гидродинамическими методами и методом малоуглового рентгеновского рассеяния показана высокая компактность белка YB-1 в растворе как в мономерной форме, так и в составе олигомеров. Показана непрочность ассоциатов YB-1 в растворе.

4. Методами атомно-силовой и электронной микроскопии обнаружено, что в условиях высокой ионной силы белок YB-1 образует фибриллы. С использованием различных фрагментов белка YB-было установлено, что за образование фибрилл отвечает CSD. При этом A/P-домен стимулирует образование фибрилл, первая половина CTD подавляет фибриллообразование, а вторая половина CTD снимает блокирующее действие первой половины.

5. Обнаружено, что в условиях физиологической ионной силы фрагменты YB-1 без домена CTD способны образовывать амилоидоподобные фибриллы, а добавление полноразмерного CTD или только его первой половины блокирует фибриллообразование.

6. Исследование свойств фибрилл белка YB-1 и его фрагментов с помощью специфичных красителей, спектроскопии кругового дихроизма и рентгеновской дифракции показало, что фибриллы YB-1 являются амилоидоподобными.

7. Исследовано влияние катионов на фибриллообразование, предложена модель организации фибрилл. Установлено, что амилоидоподобные фибриллы YB-1 обладают низкой стабильностью и распадаются при понижении ионной силы раствора до физиологической.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Guryanov S.G., Selivanova O.M., Nikulin A.D., Enin G.A., Melnik B.S., Kretov D.A., Serdyuk I.N., Ovchinnikov L.P. (2012) Formation of amyloid-like fibrils by Y-box binding protein 1 (YB-1) is mediated by its cold shock domain and modulated by disordered terminal domains.

PLoS One, 7, 5:e36969.

2. Eliseeva, I.A., Kim, E.R., Guryanov, S.G., Ovchinnikov, L.P., and Lyabin, D.N. (2011). Y-box-binding protein 1 (YB-1) and its functions.

Biochemistry (Moscow) 76, 13:1402-1433.

3. Елисеева И.А., Ким Е.Р., Гурьянов С.Г., Овчинников Л.П., Лябин Д.Н. (2011) Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) и его функции. Успехи биол. химии, 51:65-132.

4. Селиванова O.M., Гурьянов С.Г., Енин Г.А., Скабкин М.А., Овчинников Л.П., Сердюк И.Н. (2010) Белок YB-1 обладает способностью образовывать протяженные нанофибриллы.

Биохимия, 75, 5:629-636.

5. Sorokin A.V., Selyutina A.A., Skabkin M.A., Guryanov S.G., Nazimov I.V., Richard C., Th'ng J., Yau J., Sorensen P.H., Ovchinnikov L.P., Evdokimova V. (2005) Proteasome-mediated cleavage of the Y-box-binding protein 1 is linked to DNA-damage stress response.

EMBO J. 24, 20:3602-3612.

6. Гурьянов С.Г., Селиванова О.М., Никулин А.Д., Енин Г.А., Мельник Б.С., Кретов Д.А., Сердюк И.Н., Овчинников Л.П. (2012) Белок YB-образует амилоидоподобные фибриллы. Ежегодная научная конференция Института белка РАН (Пущино, 8-9 июня 2012 г.).

Сборник тезисов. с. 12. Пущино.

7. Guryanov S.G., Selivanova O.M., Nikulin A.D., Kretov D.A., Enin G.A., Serdyuk I.N., Ovchinnikov L.P. (2011) Amyloid-like structure of Y-box binding protein 1 (YB-1) dissociates in native conditions. The 4th international IMBG conference for young scientists “Molecular biology: advances and perspectives” abstract book. p. 51. Kiev.

8. Гурьянов С.Г., Кретов Д.А., Никулин А.Д., Селиванова О.М., Овчинников Л.П. (2011) Мультифункциональный белок YB-способен образовывать амилоидоподобные фибриллы. Биология – наука ХХI века: 15-я Международная Пущинская школаконференция молодых ученых (Пущино, 18-22 апреля 2011 года).

Сборник тезисов. с. 58. Пущино.

9. Сердюк И.Н., Гурьянов С.Г., Селиванова О.М., Енин Г.А., Овчинников Л.П. (2010) Белок YB-1 и его фрагмент AP-CSD обладают способностью к молекулярной самосборке в протяженные тяжи длиной несколько микрометров. Ежегодная научная конференция Института белка РАН (Пущино, 8-9 июня 2010 г.).

Сборник тезисов. с. 11. Пущино.

10. Гурьянов С.Г., Селиванова О.М., Енин Г.А., Сердюк И.Н., Овчинников Л.П. (2010) Мультифункциональный белок YB-способен образовывать протяженные фибриллы. Биология – наука ХХI века: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 19-23 апреля 2010 года). Сборник тезисов. с. 128. Пущино.

11. Guryanov S.G., Melnik B.S., Filimonov V.V., Timchenko A.A., Kutyshenko V.P., Ovchinnikov L.P., Semisotnov G.V. (2009) The major mRNP protein YB-1: structural and association properties. International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov September 28 – October 2, 2009.

Abstracts. p. 60. Moscow – Pushchino.

12. Guryanov S.G., Melnik B.S., Filimonov V.V., Timchenko A.A., Kutyshenko V.P., Ovchinnikov L.P., Semisotnov G.V. (2009) The major mRNP protein YB-1: structural and association properties. VIII European Symposium of The Protein Society June 14-18, 2009. Book of Abstracts.

p. 172. Zurich.

13. Гурьянов С.Г., Мельник Б.С., Семисотнов Г.В., Овчинников Л.П.

(2008) Исследование структуры белка YB-1 методом кругового дихроизма. Биология – наука ХХI века: 12-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 1014 ноября 2008 года). Сборник тезисов. с. 17. Пущино.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.