WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


на правах рукописи Надеждин Кирилл Дмитриевич

Структура, динамика и механизм димеризации трансмембранного домена белка-предшественника бета-амилоида

03.01.02 – Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва – 2012 Диссертация выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Арсеньев Александр Сергеевич Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Бочарова Ольга Владимировна кандидат медицинских наук Кутышенко Виктор Павлович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор, Институт теоретической и экспериментальной биофизики (ИТЭБ РАН), заведующий лабораторией ЯМР-исследований биоструктур Польшаков Владимир Иванович доктор химических наук, профессор, Московский государственный университет им.

М.В.Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, руководитель лаборатории магнитной томографии и спектроскопии Федеральное государственное бюджетное

Ведущая организация: образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится 13 декабря 2012 г. в 14 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, стр. 12, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 12 ноября 2012 г.

Ученый секретарь Страховская Марина Глебовна диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Болезнь Альцгеймера – самый распространенный вид нейродегенеративного заболевания в мире. С физиологической точки зрения заболевание характеризуется накоплением внеклеточных амилоидных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков в нервных тканях мозга. Важнейшую роль в развитии болезни играет белок-предшественник бета-амилоида (ПБА). Протеолиз этого белка в организме человека различными ферментативными системами ведет к образованию бета-амилоида – главного на сегодняшний день маркера болезни Альцгеймера. ПБА является мембранным белком длиной 695-770 а.о., поэтому современные попытки его структурных исследований испытывают ряд объективных трудностей. ПБА и его производные димеризуются в мембране клеток и эндосом. Более половины мутаций, являющихся основным фактором риска раннего развития заболевания, приходится на трансмембранный (ТМ) домен белка. На данный момент нет четкого понимания механизма влияния патогенных мутаций на прогрессирование болезни. Однако существует мнение, что на протеолиз белка могут влиять как мутации, так и липидный состав мембраны.

Для адекватной терапии болезни Альцгеймера необходимо понимание молекулярных основ развития заболевания. Наличие одной лишь структуры целевого белка часто не достаточно для эффективного поиска новых лекарственных препаратов. Именно поэтому глубокое изучение динамики, условий и механизма ферментативного процессинга белкапредшественника бета-амилоида представляется перспективной задачей для современной фундаментальной науки и медицины.

Цели и задачи исследования Целью данной диссертационной работы являлось изучение структуры, динамических свойств и белок-белковых взаимодействий в составе димерных комплексов ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида в мембране и/или имитирующей мембранное окружение среде. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1) разработка системы эффективной экспрессии синтетического гена ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида в клетках E. coli, в том числе на средах, содержащих изотопы 15N и 13C;

2) разработка эффективного протокола очистки пептида;

3) изучение пространственной структуры и динамических характеристик пептида в мембранном окружении методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения;

4) определение мотивов димеризации, структуры димера и энергетических параметров процесса димеризации пептида.

Научная новизна и практическая значимость работы Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые:

1) разработана эффективная система экспрессии в клетках E. сoli ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида;

2) разработана система очистки рекомбинантного ТМ домена белкапредшественника бета-амилоида;

3) определена пространственная структура ТМ домена белка предшественника бета-амилоида методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, солюбилизированного в растворе мицелл из детергента додецилфосфохолина (ДФХ);

4) определена топология гомодимеризации пептида, а также описаны кинетические и энергетические параметры реакции димеризации.

Полученные данные о структуре и природе димеризации ТМ домена ПБА закладывают базис для адекватного описания молекулярных механизмов развития болезни Альцгеймера. Эти данные позволят не только расширить фундаментальные знания о влиянии старения или патогенных мутаций на процессы метаболизма в нейронах мозга, но и могут помочь выявить рациональный подход к эффективной терапии заболевания.

Апробация работы Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: EUROMAR-2009 (Гтеборг, Швеция, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009); 36th FEBS CONGRESS (Турин, Италия, 2011), EUROMAR 20Magnetic Resonance Conference (Франкфурт-на-Майне, Германия, 2011); Biophysical Society 56th Annual Meeting (Cан Диего, Калифорния, США, 2012); Российско-Германский симпозиум “Molecular Neurobiology Today and Tomorrow” (Москва, 2012).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 работы в реферируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение») и выводов.

Работа проиллюстрирована 40 рисунками, содержит 2 таблицы. Библиографический указатель содержит 110 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Рис. 1. Первичная структура APPjmtm. Участок Gln686-Lys726 является частью последовательности полноразмерного ПБА, а N-концевые Gly-Ser остаются после протеолиза гибридного белка тромбином.

Аминокислотная последовательность пептида (обозначен APPjmtm), исследованного в настоящей работе, приведена на рис. 1.

Для достижения высокого уровня экспрессии синтетических генов ТМ пептидов (таких, как APPjmtm) в бактериях прямая и секреторная экспрессия чаще всего оказываются неприменимыми. Это объясняется способностью рекомбинантных мембранных белков накапливаться в клеточной мембране бактерий. При суперэкспрессии это приводит к дестабилизации мембраны, нарушению е целостности и гибели клетки. Во избежание возможной токсичности ТМ пептидов для бактериальных клеток использован метод конструирования гибридных систем бактериальной экспрессии. В качестве белка-партнера выбран тиоредоксин E. coli (TRX) – небольшой белок, молекулярная масса которого составляет ~ 12 кДа. Этот белок участвует в различных восстановительных процессах и катализирует реакции тиол–дисульфидного обмена. Ряд свойств этого белка делают его эффективным партнером для систем гибридной экспрессии, в частности высокая растворимость (до 40 % от общего белка E. coli), а также доступность N- и C-концов для размещения белков-партнеров.

Рис. 2 Схема строения гибридного белка. Серые блоки – место вставки последовательности тиоредоксина и сайт узнавания тромбином. Стрелкой показано место протеолиза тромбином, подчеркнута ТМ часть ПБА.

Получение рекомбинантного трансмембранного домена ПБА686–7(APPjmtm) Между генами TRX и APPjmtm встраивалась последовательность из шести остатков гистидина (6His-таг) для очистки гибридного белка, а также сайт протеолиза тромбином (последовательность LVPRGS, рис.2). Тромбин сохраняет ферментативную активность и специфичность в присутствии детергентов, необходимых для солюбилизации и последующего протеолиза гибридного белка. После расщепления тромбином на N-конце APPjmtm остается дипептид Gly-Ser, что, по нашим данным, не должно влиять на структуру и специфическое взаимодействие ТМ доменов белков.

Ген APPjmtm был собран из семи синтетических олигонуклеотидов. Для последующей рекомбинации и клонирования последовательность прямого праймера включала участок, комплементарный 3'–концевой области гена TRX. В последовательности обратного праймера был предусмотрен сайт рестрикции BamHI. Полученный продукт, включающий в себя последовательности состыкованных генов Trx и APPjmtm, гидролизовался эндонуклеазами рестрикции CpoI и BamHI, а потом лигировался вектором pGEMEX-1, гидролизованного теми же рестриктазами.

Оптимизация условий экспрессии В качестве экспрессионного штамма E. coli был использован штамм BL21(DE3)pLysS, содержащий хромосомную копию гена РНК–полимеразы фага Т7, а также плазмиду pLysS с геном лизоцима фага Т7. Вследствие того, что лизоцим эффективно ингибирует Т7 РНК–полимеразу, фоновый уровень индукции в клетках данного штамма существенно снижен, что особенно важно при экспрессии генов токсичных белков, таких, как ТМ пептиды.

С целью получения максимального выхода гибридного белка был осуществлен подбор температуры выращивания бактерий и оптимальной концентрации химического индуктора изопропил––D–тиогалактозида (ИПТГ). Максимальному накоплению белка в клеточной биомассе способствует 0,05 мМ концентрация ИПТГ для «богатой» среды TB и 0,25 мМ для минимальной среды M9 при 18С.

На «богатой» среде ТВ гибридный белок накапливался в максимальных количествах в течение первых суток роста (выход 200 мг/л культуры), а на «бедной» среде М(включая рост на 15N- и 13C-содержащих средах с добавлением тотально меченых 15NH4Cl и 13C-глюкозы) – через 60–70 ч (выход 60 мг/л культуры).

Рис. 3. Металлохелатная аффинная хроматография TRX-APPjmtm до и после протеолиза тромбином. Слева: Электрофорез проб в 12% трис-глициновом ПААГ после МХАХ клеточного лизата. Справа: Электрофорез проб в 12% трис-трициновом ПААГ после протеолиза тромбином и последующей вычитающей МХАХ.

Очистка APPjmtm На всех этапах очистки ТМ фрагментов необходимо присутствие детергента. Это нужно для поддержания пептида APPjmtm и гибридного белка в растворимой форме вследствие их гидрофобности. По этой причине все буферные растворы, используемые в процессе очистки, содержали 1% мягкого неионного детергента Тритон Х–100. Такая концентрация детергента не препятствовала полному расщеплению гибридного белка тромбином и способствовала поддержанию ТМ пептида в растворимом виде после удаления белка-партнера.

Очистка пептида проходила в несколько этапов. После лизиса клеток проводилась металлохелатная аффинная хроматография (МХАХ) на колонке с Ni2+-хелатирующей сефарозой. На этой стадии гибридный белок TRX-APPjmtm очищался от большинства посторонних бактериальных белков. Так как гибридный белок TRX-APPjmtm содержал последовательность из шести гистидинов (6His-таг), он связывался с никелем, в то время как большинство белков E. coli не сорбировалось смолой (рис. 3: белок, не связавшийся с колонкой). Связанный с сорбентом гибридный белок элюировался 200 мМ имидазолом (рис.

3, фракции 1-6).

После этого гибридный белок подвергался протеолизу тромбином в течение 16-часов. Было установлено, что для протеолиза оптимальным является соотношение фер мент/субстрат равное 1 единице активности на 1 мг гибридного белка. Более того, эффективность гидролиза повышалась при снижении концентрации NaCl до 50 мМ и имидазола до 30 мМ.

Для разделения продуктов гидролиза гибридного белка проводилась повторная МХАХ на Ni2+-хелатирующей сефарозе. При этом продукты гидролиза, имеющие в своем составе последовательность из шести гистидинов (недорасщепленный гибридный белок и белок-партнер TRX), а также примесные белки, обладающие неспецифическим сродством к сефарозе, задерживались смолой, а целевой пептид оказывался в проскоке. Типичная картина состава проб после гидролиза и вычитающей МХАХ показана на рис. 3.

Окончательная очистка пептида проходила при помощи обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (оф-ВЭЖХ). Для нанесения пептида на колонку оф-ВЭЖХ было необходимо удалить детергент. С этой целью пептид APPjmtm, солюбилизированный в детергенте Тритоне X–100, осаждался трихлоруксусной кислотой. После этого осадок 3 раза промывался ацетоном от детергента. На этом этапе Тритон X–1переходил в растворимую фракцию, а чистый белок, свободный от детергента, оказывался в осадке.

После осаждения пептид растворялся в смеси трифторэтанол/вода в соотношении 1:1 с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) и наносился на колонку для очистки при помощи оф-ВЭЖХ. Сначала колонка уравновешивалась раствором А, содержаРис. 4. Очистка APPjmtm с помощью оф-ВЭЖХ (слева) и масс-спектр пептида (справа).

1 – область элюции 17–25 мин, содержащая примесные белки; 2 – пик, соответствующий элюции APPjmtm. Пунктиром показан градиент раствора Б (1% за 10 мин), правая шкала. Справа приведен масс-спектр смеси немеченого и 15N-меченного пептида (плюс ~50 Да к массе немеченого пептида) APPjmtm после стадии очистки на оф-ВЭЖХ. Измеренные массы пептидов 4445,1 и 4494,Да оказались в точном соответствии с теоретическими значениями (4445,6 Да для немеченого пептида).

щего 0,1 % ТФУ в воде. После нанесения на нее белка проводилась элюция градиентом раствора В, содержащего 0,1% ТФУ в ацетонитриле (рис. 4). Проверка на наличие примесей производилась посредством снятия гетероядерных двумерных H/15N-HSQC ЯМРспектров для меченых образцов в смеси трифторэтанол/вода в соотношении 1:1. По данным анализа спектров ЯМР, доля примесей в меченых и немеченых препаратах после заключительной стадии очистки составляла менее 1%. Окончательные выходы APPjmtm составили: 20 мг с литра богатой среды TB и 8 мг с литра минимальной среды M9.

Подбор условий для солюбилизации APPjmtm Ключевую роль в выборе имитирующей мембрану клетки среды для структурных исследований пептида играло время жизни образца, поэтому опытным путем был выбран детергент ДФХ. Солюбилизированный в мицеллах ДФХ пептид APPjmtm проявлял наибольшую стабильность среди всех тестируемых мембранных сред, пригодных для проведения экспериментов (тестировались мицеллы ДФХ, ЛМФХ, ЛМФГ, ГФХ, ДСН, смешанные мицеллы из ДФХ и ДСН, бицеллы из ДМФХ/ДГФХ). Характерная дисперсия химических сдвигов в спектрах 1H/15N-HSQC и разброс значений полуширин кросс-пиков по протонному направлению от 15 до 25 Гц указывают на то, что ТМ домен APPjmtm встроен в мицеллу и имеет -спиральную конформацию. При изменении молярного соотношения детергент/пептид в диапазоне от 80 до 30 (что соответствует от 1 до 2 молекул пептида на мицеллу) наблюдалось двоение сигналов в спектрах ЯМР из-за конформационных переходов мономер–димер.

Таким образом, предложенная стратегия экспрессии, очистки и солюбилизации позволяет получать ТМ домен ПБА в количестве, достаточном для структурно-динамических исследований спектроскопией ЯМР высокого разрешения.

Отнесение сигналов в спектрах ЯМР Отнесение сигналов мономерной формы пептида APPjmtm, солюбилизированного в 1 мицеллах ДФХ, было проведено при помощи двумерных спектров H/15N-HSQC, H/13C1 1 HSQC; а также трехмерных спектров H/13C/15N-HNCA, H/13C/15N-HN(CO)CA, H/15N13 NOESY-HSQC и С-HCCH-TOCSY. Отнесение сигналов в спектре H/15N-HSQC для APPjmtm при соотношении P/D 1:100 и pH 4,0 показано на рис. 5.

Рис. 5. Гетероядерный ЯМР-спектр H/15NHSQC рекомбинантного тотально C/15Nмеченного пептида APPjmtm. Пептид солюбилизирован в водной суспензии мицелл ДФХ с молярным отношением пептид/детергент 1:100; рН 4,0; 45°С.

Приведено отнесение сигналов для NH-групп APPjmtm.

Рис. 6. Наложение гетероядерных ЯМРспектров H/15N-HSQC при рН 6.2, 45°С для разных соотношений пептид/ детергент в образце. Пептид был солюбилизирован в водной суспензии мицелл ДФХ при соотношении пептид/детергент 1/120 (показан синим цветом), и при соотношении 1/50 (показан красным цветом). Отнесение сигналов показано для соотношения 1/120.

Отнесение сигналов в спектрах димера было проведено на основе имеющихся данных о химических сдвигах мономера APPjmtm. В спектре 1H/15N-HSQC солюбилизирован ного в мицеллах ДФХ (при соотношении пептид/детергент 1:50) пептида APPjmtm наблюдалось характерное двоение некоторых сигналов. Это прямо указывает на появление нескольких форм APPjmtm при насыщении мицелл молекулами пептида. При этом в спектре H/15N-HSQC, полученном при соотношении пептид/детергент 1:120, двоения не наблюдалось. На рис. 6 показано наложение спектров 1H/15N-HSQC, полученных при одинаковых условиях, с одной лишь разницей в соотношении пептид/детергент (1:50 и 1:120). После снятия и отнесения N,13C-F1-фильтрованного/F3-разделенного-NOESY спектра, было установлено, что наблюдаемое двоение сигналов было вызвано димеризацией пептида.

Следует отметить, что при дальнейшем насыщении мицелл происходило быстрое выпадение пептида в осадок (в течение 1 часа). Таким образом, стабилизация состояния образца происходила при соотношении пептид/детергент 1:50, а время его жизни составляло порядка 1-2 недель. Это позволило снять ЯМР спектры хорошего качества, которые оказались достаточными для отнесения сигналов и расчета структуры.

Спектры мономерной и димерной формы APPjmtm мало отличаются друг от друга.

На основании этого можно заключить, что структура пептида не претерпевает серьезных изменений при димеризации. Разница в значениях химических сдвигов амидных протонов основной цепи (до 0,07 м.д.) остатков Met706, Gly709, Val717 и др. можно объяснить удлинением/укорачиванием водородной связи, образованной соответствующим протоном (известно, что изменение длины водородной связи на 0,05 ведет к изменению соответствующего химического сдвига HN протона на 0,1 м. д.).

В итоге отнесение сигналов мономерной формы APPjmtm проведено при соотношении пептид/детергент 1:100 и рН 4,0. Отнесение сигналов димера проведено при соотношении пептид/детергент 1:50 и рH 6,2.

Определение значения pK карбоксильных групп боковых цепей Glu693 и Asp6Так как протеолиз ПБА по амилоидогенному пути идет в кислой среде эндосом (pH~5), необходимо было проанализировать влияние рН раствора на состояние образца. В последовательности APPjmtm есть два аминокислотных остатка, pK карбоксильных групп боковых цепей которых могут лежать в районе pH 5 (Glu693 и Asp694). Для определения их pK был снят набор спектров, pH образца в которых варьировался от 2,9 до 7,2. В результате было определено, что рК титрующихся групп лежат диапазоне рН 4,3-4,9. Из получен ных данных был сделан вывод, что следует избегать структурных исследований в этом диапазоне рН, чтобы сузить количество неоднозначно интерпретируемых результатов.

Константа димеризации APPjmtm в мицеллах ДФХ С целью более точного описания комплекса пептид-мицелла и определения кинетических параметров перехода димер-мономер в мицеллярном окружении были измерены константы ассоциации APPjmtm при различных соотношениях пептид/детергент в образце.

Зависимость константы димеризации от концентрации детергента можно учесть при помощи модели комплекса пептид-мицелла (Fleming et al, 2003; Fisher et al, 2003), в которой свободная энергия ассоциации дается формулой:

Gapp G0 RT ln[Det]M, где G0 – стандартная энергия ассоциации; – коэффициент, характеризующий «идеальность» растворителя; [Det ]M - концентрация детергента, входящего в состав мицелл (равна общей концентрации детергента в растворе за вычетом концентрации свободно плавающих молекул детергента, не образующих мицеллы, оценочно равной критической константе мицеллообразования). Формально показывает порядок реакции по детергенту. Существует две интерпретации физического смысла этого коэффициента:

1) отображение изменения липидного состава мицеллы/бицеллы при димеризации;

2) описание зависимости энтальпии и энтропии системы от концентрации детергента.

Для определения константы димеризации/диссоциации был построен график зависимости видимой константы ассоциации Kaapp от соотношения пептид/детергент (P/D) в растворе (рис. 7). Проведенные эксперименты позволили определить значение параметра .

При D/P более 70, то есть когда на одну мицеллу приходится менее одной молекулы пептида, параметр равен 1,8. Значение свободной энергии димеризации Go при этом равно -1,4 ккал/моль, что является типичным значением для слабо взаимодействующих ТМ спиралей. Полученное значение для Go само по себе не описывает энергетику димеризации, но включает также в себя свободную энергию, необходимую для переноса нескольких молекул детергента из мицеллы в мицеллу при ассоциации. В насыщенных пептидом мицеллах при D/P <70 параметр 6, то есть при насыщении мицеллы молекулами пептида, то есть в случае, когда на одну мицеллу приходится в среднем более одной молекулы пептида, происходит резкое усиление димеризации и рост значения константы димеризации Kaapp.

Рис. 7. Кинетические параметры переходов мономер-димер.

А) Показана зависимость константы ассоциации (или димеризации) Kaapp от соотношения P/D указывает на усиление димеризации APPjmtm в случаях, когда на одну мицеллу приходится в среднем более одной молекулы пептида (при P/D порядка 1/70 на одну мицеллу приходится одна молекула пептида в образце).

В) Приведена зависимость свободной энергии ассоциации Gapp от натурального логарифма концентрации детергента ДФХ, находящегося в мицеллярной форме. Мицеллы, занимаемые в среднем менее одной молекулой пептида, являются «неидеальным растворителем» с параметром равным 1,8. При насыщении мицелл пептидом происходит усиление димеризации (6).

В разбавленном случае (D/P>70) свободная энергия ассоциации Go равна -1,ккал/моль, что является типичным значением для слабо взаимодействующих ТМ спиралей.

Элементы вторичной структуры Опираясь лишь на значение химических сдвигов ядер 1H, 13C и 15N, а также отнесение контактов ЯЭО в спектрах 1H/13C-NOESY-HSQC и 1H/15N-NOESY-HSQC, можно сделать предположения о вторичной структуре белка. Отличия 13С химических сдвигов ядра С от своего среднего значения в конформации «неупорядоченный клубок» указывают на тип вторичной структуры полипептидной цепи (так называемый вторичный химический сдвиг, C=C-белка-клубок). Он, как правило, имеет отрицательное значение для аминокислотного остатка в развернутом участке полипептидной цепи (-тяж) и положительное – в спиральной конформации.

Присутствие в спектре 1H/15N-NOESY-HSQC кросс-пиков контактов ЯЭО (HNi, Hi-3) и (HNi, Hi-4), а также кросс-пиков (Hi, Hi+3) в спектре H/13C-NOESY-HSQC говорит об участии этих остатков в формировании -спирали (рис. 8). Эти данные подкрепляются малыми значениями констант спин-спинового взаимодействия JHNH (<6 Гц), говорящих о значении двугранного угла основной цепи порядка 65°±15° (что также характерно для спирали).

Опираясь на полученные данные (рис. 8), можно предположить, что при рН 4,0 исследуемый пептид APPjmtm имеет два -спиральных участка Lys687-Asp694 и Gly700-Leu723.

В то же время при рН 6,2 спираль формируется только на участке Gly700-Leu723. Полученные результаты прямо указывают на влияние рН раствора на структуру исследуемых объектов и подчеркивают важность корректного выбора условий внешней среды при структурных исследованиях.

Рис. 8. Определение элементов вто ричной структуры на основе ЯМРданных. (А) Аминокислотная последовательность APPjmtm. (Б) Межпротонные контакты ЯЭО при рН 4,0. (В) Вторичный химический сдвиг ядер C APPjmtm при рН 4,0 (Г) Межпротонные контакты ЯЭО при рН 6,2. (Д) Вторичный химический сдвиг ядер 13C APPjmtm при рН 6,2. (Е) Для мономера представлены данные о временах полуобмена, t1/2, амидных протонов APPjmtm на дейтерий растворителя. Заполненными кругами показаны остатки с t1/2>2 ч, пустыми – с 1 t1/22 ч; для остальных остатков t1/2<1 ч. Квадратами обозначены остатки APPjmtm, сигналы амидных протонов которых претерпевают изменения химического сдвига более 3х10-3 м. д.

при изменении температуры на 1°С. (Ж) Для димера при pH 6,2 заполненными кругами показаны амидные быстро обменивающиеся с водой амидные протоны. Пустыми кругами отмечены протоны со средней скоростью обмена. (З) Значения ОДК для всех отдельно стоящих кросс-пиков N-меченного образца APPjmtm при рН 4,0. (И) Схематичное представление вторичной структуры мономера APPjmtm при рН 4,0.

Химические сдвиги для атомов N, HC, C, CO и C являются чувствительными ко вторичной структуре белка, поэтому их значения были использованы для предсказаний значений торсионных углов основной цепи в программе TALOS+, точность которой в применении к -спиральным белкам составляет более 95%. Предсказанные значения торсионных углов позднее использовались при расчете пространственной структуры пептида.

Динамические характеристики APPjmtm Необходимым этапом исследования было измерение динамических характеристик отдельных участков полипептидной цепи APPjmtm. Для этого были определены времена продольной (T1) и поперечной (T2) релаксации, а также величина ЯЭО для ядер N всех остатков, высоту кросс-пиков от N/H-групп которых можно измерить в спектрах H/15NHSQC. Исходя из полученных параметров T1 и Т2, были рассчитаны эффективные времена корреляции броуновского вращения R для большинства NH-векторов ТМ доменов по 1 Tформуле 6 7 (где N - несущая частота спектрометра по ядру 15N в Герцах).

R 4N TДанные N релаксации позволяют сделать предположения о локальной подвижности и о вторичной структуре. Значения 15N{1H} ЯЭО, T1, Т2 и R зависят от расположения остатка в аминокислотной последовательности (рис. 9). Участки с низкой подвижностью (с высоким значением R) будут соответствовать встроенным в мицеллу ТМ спиралям, в то время как подвижные остатки (с низким значением R) соответствуют более подвижным или неструктурированным участкам. Согласно динамическим характеристикам, спиралям соответствуют участки Gly700-Leu723 при значениях рН 4,0 и 6,2. Причем для некоторых остатков удалось определить значение R как в мономерном, так и в димерном состоянии (рис. 9). Как и следовало ожидать, размер комплекса димер-мицелла несколько больше размера комплекса мономер-мицелла (разница значений времен вращательной корреляции R в среднем 2-4 нс).

Исходя из данных по R можно отметить, что при рН 4,0 подвижность примембранного (ПМ) участка Lys687-Asn698 для мономера ниже, чем при рН 6,2. Это хорошо прослеживается по разнице в R на 2 нс, что можно объяснить формированием вторичной структуры - короткой ПМ -спирали Lys687-Asp694. Также при рН 4,0 (это ниже рК титруемых боковых цепей Glu693 и Asp694) боковые цепи Glu693 и Asp694 протонируются и теряют отрицательный заряд. Это позволяет всей ПМ спирали плотнее контактировать с мицеллой за счет наличия гидрофобных взаимодействий с ацильными цепями детергента ДФХ и отсутствия кулоновских сил отталкивания заряженных боковых групп Glu693/Asp694 от отрицательно заряженных фосфатов липидных головок.

Рис. 9. Данные N релаксации. Приведены 15N-релаксационные параметры для амидных групп APPjmtm. (А) Значения гетероядерного N{1H} ЯЭО для мономерного состояния при рН 4,0. (Б) значения эффективного времени корреляции броуновского вращения R, рассчитанного из отношения 15N Т1/Т2 при рН 4,0. (В) Значения R при рН 6,2 для образца с динамическим равновесием димер-мономер.

Темно-серым цветом показано значение R для димерного состояния. Светлосерым показано значение R для мономера (если в спектре был отдельный пик) или равновесия димер-мономер (если пи ки в спектре были неразличимы).

Оценка массы супрамолекулярных комплексов мономер-мицелла и димер-мицелла, 9.18103 240.согласно эмпирической зависимости R exp N (где Т - температура в TT Кельвинах, N – число аминокислотных остатков в белке) из усредненного значения R по спиральным участкам, дает величину около 25-30 кДа. Это соответствует мономеру/димеру APPjmtm, окруженному 60-70 молекулами детергента (что является типичным значением для мицеллы ДФХ).

Измерение остаточных дипольных констант По значениям измеренных остаточных дипольных констант (ОДК) можно судить о взаимной ориентации различных доменов в белках и пептидах. Данный метод особенно актуален при изучении структуры пептида APPjmtm. При анализе предварительных данных (химических сдвигов, релаксации, обмена с водой) было выявлено, что пептид при рН 4,0 состоит из двух структурированных участков – ПМ и ТМ -спиралей. Однако имеется недостаток экспериментальных данных о петле, соединяющей эти два участка. В результате он приводит к неоднозначности взаимной ориентации ПМ и ТМ спиралей в пространстве относительно друг друга при расчете структуры. Измерение констант ОДК для амидных протонов позволяет снять данную неопределенность.

Исходя из предварительного анализа значений ОДК, можно утверждать, что ПМ (положительные значения ОДК) и ТМ (отрицательные значения ОДК) спирали по-разному ориентированы относительно общего тензора ориентации (рис. 8з). Точный ответ на вопрос о расположении ПМ и ТМ спиралей относительно друг друга был дан при расчете структуры с использованием значений ОДК в списке ограничений.

Рис. 10. Пространственная структура мономера APPjmtm при рН 4,0. (А) Набор из 20 ЯМР-структур APPjmtm, совмещенных по атомам основной цепи -спирали Gly700-Leu723. Показана основная цепь пептида. (Б) Набор из 20 ЯМР-структур, совмещенных по атомам основных цепей спиралей Lys687–Asp694 (ПМ спираль) и Gly700–Leu723 (TM спираль) по отдельности.

Структуры приведены с разрывом в петлевом участке между остатками Gly696– Ser697. Показаны только тяжелые атомы.

(В) Пространственная структура APPjmtm. Показаны ковалентные связи с участием тяжелых атомов (для спиралей зеленым цветом), а также амидных протонов (желтым). Красным выделены амидные группы остатков TM спирали с минимальными значениями вторичного химического сдвига. (Г) Представлено схематичное изображение мицеллы ДФХ со встроенным мономером APPjmtm. ПМ и TM спирали выделены синим и красным соответственно. Под ПМ спиралью показаны места встраивания парамагнитных меток: 5- и 16-доксилстеариновой кислоты. Парамагнитные центры меток схематично показаны в виде звездочек. Под петлей между спиралями рядом с N-концом TM спирали схематично указан связывающий холестерин центр ТМ домена ПБА.

Расчет пространственной структуры пептида Пространственная структура пептида была рассчитана методом симулированного отжига в пространстве торсионных углов в программе CYANA 3.0. Статистика расчета структуры приведена в таблице.

Качество расчета и структурная статистика 20 структур при 12 структур при рН рН 4,0 (мономер) 6,2 (димер) Штрафная функция программы CYANA (2) 0,38 0,03 0,26 0,Попарное среднеквадратическое отклонение между структурами по атомам основной цепи () регион 686-60,23 0,09 0,52 0,-спиральный регион 699-70,14 0,05 0,45 0,Димерный -спиральный регион 699-724 - 0,80 0,В результате расчета пространственной структуры установлено, что при рН 4,APPjmtm в мицеллах ДФХ состоит из двух -спиралей – Lys687–Asp694 и Gly700–Leu723 (рис.

10, код PDB: 2LLM), соединенных неструктурированным петлевым участком Val695-Lys699.

Рис. 11. Вторичный химический сдвиг сигналов протонов HN для мономерной конформации APPjmtm при рН 4,0 (А) и димерной конформации при рН 6,2 (Б). На гистограмме указаны значения HN,, зависящие помимо прочего от длины водородной связи, в которой участвует амидный протон.

Оси ПМ и ТМ спиралей перпендикулярны друг другу (рис 10). Структура каждой спирали рассчитана с высокой точностью (таблица, рис. 10а, 10б). Конформация основной цепи и боковых цепей точнее установлена для -спирали Gly700-Leu723. Периодичность (i,i+4) вторичного химического сдвига сигналов протонов HN (рис. 11) указывает на периодичное изменение длин водородных связей HNOC вдоль ТМ спирали. Амидные группы остатков Leu705, Gly709, Ala713 и Val715, расположенные на одной стороне ТМ спирали (рис. 10в), образуют более короткие водородные связи HNOC, чем остатки с противоположной стороны спирали. Таким образом, у ТМ спирали в районе спаренных остатков Gly708–Gly709 имеется небольшая вогнутость со слабополярной поверхностью.

Значительная разница (~4 нс) в значениях R у остатков ПМ и TM спиралей частично объясняется топологией APPjmtm с перпендикулярным расположением -спиралей в мицелле друг относительно друга. Помимо этого возможно вращение APPjmtm внутри мицеллы, а также повышенная латеральная подвижность ПМ спирали (по сравнению с ТМ сегментом) за счет неструктурированной соединительной петли Val695–Lys699.

Структура каждой субъединицы в составе димера очень похожа на структуру отдельного мономера. При рН 6,2 пептид содержит лишь один участок с ярко выраженной вторичной структурой – ТМ -спираль Gly700–Leu723 длиной ~38 , обрамленную по концам положительно заряженными остатками Lys699 и Lys724. Также как и для мономера при рН 4,0 в районе остатков Gly708-Gly709 находится изгиб, который разделяет ТМ спираль на два региона, находящихся под углом 17 7° друг относительно друга. Вогнутость на N конце ТМ спирали сформирована слабополярными остатками Gly700, Gly704, Gly708 и Gly709.

Это хорошо видно по периодичности значений вторичного химического сдвига HN остатков Ile702, Met706, Val710, Thr714 (рис. 11б). Места изгиба ТМ спирали в мономере и димере отличаются друг от друга сдвигом на один аминокислотный остаток спирали или поворотом на ~90°.

Примембранный участок при рН 6,2 не формирует жесткую вторичную структуру.

При анализе всех ЯМР данных в совокупности (контакты ЯЭО, вторичный химический сдвиг, R, КССВ 3JHNH, ограничения на углы и , скорость обмена амидных протонов с водой) можно предположить, что участок Lys687–Asp694 находится в динамическом равновесии между спиральной формой и конформацией «неупорядоченного клубка».

Контакты между мономерами и структура димера Рис. 12. Контакты между двумя субъединицами APPjmtm в составе димера. Слева: пример двумерных срезов С-фильтрованных/13С-разделенных спектров ЯЭО APPjmtm с сигналами между спиралями, которые использовались при расчете структуры димера. Справа: представление всех однозначно идентифицированных контактов ЯЭО между мономерами. На рисунке показан только ТМ регион пептида, черным цветом указана основная цепь, зеленым/фиолетовым – тяжелые атомы боковых цепей. Красными пунктирными линиями показаны обнаруженные контакты между спиралями.

Структура димера APPjmtm была рассчитана на основании контактов между спиралями, обнаруженных в фильтрованных по ядру 13С спектрах ЯЭО (рис. 12). В мицеллярном окружении ТМ спирали APPjmtm (Gly700-Leu723) ассоциируют с образованием левозакрученного параллельного димера по длинному гептадному мотиву I702X3M706X2G709X3A713X2I716X3I720X2I723. Расстояние между осями спиралей равно 8,30,. Площадь контактирующих поверхностей составляет 63060 2. Угол между Сконцевыми участками димера (Gly709-Lys724), где структура определена точнее, оказался равным 264°, в то время как для N-концевого региона (Lys699-Gly708) равен 6011°. По всей длине стабилизация структуры левозакрученного димера происходит между длинными боковыми цепями лейцинов, изолейцинов, метионинов и валинов. Минимальное рас7стояние между спиралями наблюдается в районе остатков GхххA713 (так называемый GG4 мотив) за счет малых боковых цепей и, следовательно, отсутствия затрудняющих сближению пространственных факторов.

В Рис. 13. Пространственная структура димера APPjmtm и свойства поверхности интерфейса димеризации. (A) 12 структур пептида совмещены по атомам основной цепи ТМ доменов (Gly700-Leu723). Также показано альтернативное совмещение для ПМ спирали Gln686-Val695. Приведены только тяжелые атомы. Основные цепи показаны черным цветом, а боковые – голубым и фиолетовым для каждой субъединицы димера. (Б) Схематическое представление структуры димера с поворотом на 90°. Желтым и зеленым цилиндрами иллюстрирована ТМ спираль с изломом в районе остатков Gly708-Gly709. Голубыми цилиндрами показана ПМ область, находящаяся в переходном состоянии между спиралью и неупорядоченным клубком. (В) Показана карта гидрофобности. Возвышенности, которые соответствуют большим значениям молекулярного гидрофобного потенциала, показаны контурами. Участок взаимодействия спиралей при димеризации показан фиолетовыми точками. Остатки, образующие классический GG4 мотив димеризации G700X3G704GX3G708 (не используется), показаны зеленым цветом, а G709X3A713 мотив (определен в работе) показан красным цветом. Остатки, мутации которых ведут к наследственным формам болезни Альцгеймера, обведены желтым цветом. Справа желтым и зеленым цветом показаны гидрофобные и гидрофильные области на поверхности ТМ спирали, соответственно.

Свойства поверхности димера и интерфейсы димеризации Для структуры димера APPjmtm был проведен анализ гидрофобных свойств поверхности ТМ спирали с использованием теории молекулярного гидрофобного потенциала (Efremov et al, 1995). Этот эмпирический потенциал описывает свободную энергию переноса участка поверхности боковой цепи аминокислоты в составе -спирали из гидрофобной среды в гидрофильную.

Интерфейс димера изображен на карте гидрофобности поверхности ТМ спирали на рис. 13. В стабилизации димера участвуют гидрофобные области ТМ сегментов. Это согласуется с рядом гипотез о принципах упаковки ТМ спиралей, описанных в литературе (Gurezka et al, 1999). Альтернативный сайт димеризации (G700хххG704GхххG708 мотив), который был предложен другими исследовательскими группами (Mnter et al, 2007), формируется наиболее гидрофильной областью ТМ сегментов (рис. 13, код PDB: 2LOH).

Анализ карты гидрофобности показывает, что на поверхности ТМ спиралей есть несколько областей, по которым может происходить взаимодействие. Это дает возможность переключения с одного мотива димеризации на другой в результате, например, изменения условий окружающей среды белка (липидного состава мембраны, рН и других факторов).

Положение пептида в мицелле и взаимодействие с аналогом холестерина Для определения топологии -спиралей APPjmtm в мицелле ДФХ при рН 4,0 было проанализировано уширение сигналов протонов амидных групп пептида, вызванное их пространственной близостью к парамагнитным спиновым меткам 5- и 16-ДСК (5- и 16доксилстеариновые кислоты), преимущественно распределяющихся вблизи поверхности и центра мицеллы, соответственно. На основании картины изменения интенсивности кросспиков в спектре 1H/15N-HSQC при добавлении спиновых меток (рис. 14), а также данных о замедленном обмене протонов амидных групп на дейтерий растворителя (рис. 8е) сделан вывод о том, что ПМ -спираль Lys687–Asp694 находится на поверхности мицеллы в области гидратированных полярных групп ДФХ, а ТМ -спираль Gly700–Leu723 пронизывает гидрофобную часть мицеллы.

Рис. 14. Добавление к образцу спиновых меток и холестерилсукцината. (А) Эффект от добавления к образцу спиновых меток 5- и 16-ДСК. Показано падение интенсивности относительно контрольного спектра сигналов амидных групп APPjmtm в спектрах H/15N-HSQC после добавления 5- и 16-ДСК (в соотношении одна спиновая метка на мицеллу). (Б) Изменение обобщенных химических сдвигов амидных протонов при рН 4,0 после добавления холестерилсукцината.

Для мономерной конформации при pH 4,0 было изучено связывание APPjmtm с аналогом холестерина – холестерилсукцинатом. Из картины изменения химических сдвигов можно предположить, что после встраивания аналога холестерина в мицеллу ДФХ проис ходит его специфическое взаимодействие с исследуемым пептидом. Наиболее значимые изменения обобщенного химического сдвига HN (вычисляемого по формуле 15N 2 HN 1H , где 1Н и 15N – изменения протонного и азотного химиче ского сдвига, соответственно), при добавлении вещества к образцу наблюдалось для остатков Gly695, Ser696, Gly700, Ile701, Ile703 и Thr713 (рис. 14б). Это указывает, что место встраивания холестерилсукцината находится в области подвижной петли Val695-Lys699 между спиралями и N-концевой части ТМ региона (рис. 10г).

Стоит отметить, что существует и альтернативное объяснение изменения химических сдвигов амидных протонов с добавлением холестерина к образцу: вариация размера или других физических свойств мицеллы. Это может приводить к локальным изменением структуры APPjmtm (например, изгиба -спирали).

Изменение внешних условий и окружения ПБА в клеточной мембране может влиять на конформацию петлевого участка между спиралями. Это должно привести к вариации взаимной ориентации ПМ и ТМ спиралей с возможным влиянием на связывание холестерина. Поэтому установление пространственной структуры ТМ домена ПБА со связывающим холестерин ПМ участком в мембраноподобной среде методом гетероядерной ЯМРспектроскопии стало весомым шагом в раскрытии молекулярного механизма альтернативного расщепления ПБА, ассоциированного с патогенезом болезни Альцгеймера.

Выводы 1) Разработана система эффективной экспрессии синтетического гена ТМ домена ПБА 686-726 в клетках E. coli на богатой среде и минимальной среде, содержащей изотопы 15N и 13C.

2) Разработан протокол очистки рекомбинантного ТМ домена ПБА 686-726.

3) Методом гетероядерной спектроскопии ЯМР определена пространственная структура трансмембранного домена ПБА 686-726 с его примембранным участком в имитирующей мембрану среде – мицеллах ДФХ. Структура получена для мономерной и димерной формы пептида. Для димерной формы определен мотив димеризации - гептадный мотив I702X3M706X2G709X3A713X2I716X3I720X2I723.

4) Определены энергетические параметры перехода мономер-димер в мицеллах ДФХ.

5) Полученная структура позволяет анализировать влияние патогенных наследственных мутаций на развитие заболевания.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТИЦИИ Статьи 1. Bocharova O.V., Nadezhdin K.D., Bocharov E.V., Arseniev A.S. Expression and purification of a recombinant transmembrane domain amyloid precursor protein associated with Alzheimer's disease Bioorg.

Khim. 2010 Jan-Feb; 36(1):105-11.

2. К.Д. Надеждин, О.В. Бочарова, Э.В. Бочаров, А.С. Арсеньев. Пространственная структура и динамика трансмембранного домена белка-предшественника -амилоида. Acta Naturae, 2011, Том 3 № 1 (8): 74-3. Nadezhdin KD, Bocharova OV, Bocharov EV, Arseniev AS. Dimeric structure of transmembrane domain of amyloid precursor protein in micellar environment. FEBS Lett. 2012 Jun 12;586(12):1687-92.

Тезисы докладов 1. Nadezhdin Kirill, Bocharova Olga, Bocharov Eduard, Arseniev Alexanger “Structural investigations of dimeric transmembrane domain of amyloid precursor protein”EUROMAR 2009, Gottenburg, Sweden, 2009, Сборник докладов, стр.2. Надеждин К.Д., Бочарова О.В., Бочаров Э.В., Арсеньев А.С. «Структурные исследования димера трансмембранного домена белка-предшественника амилоида», Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75летию со дня рождения Ю.А. Овчинникова, Москва-Пушино, 2009, Сборник тезисов, стр. 23. K.D. Nadezhdin, O.V. Bocharova, E.V. Bocharov and A.S. Arseniev “Structural and dynamic studies of transmembrane domain of amyloid precursor protein” 36th FEBS CONGRESS, Torino, Italy, 2011, Сборник докладов, стр. 14. Kirill D. Nadezhdin, Olga V. Bocharova, Eduard V. Bocharov, Alexander A. Arseniev “Structural and Dynamics Studies of Amyloid Precursor Protein’s Transmembrane Domain” EUROMAR 20Magnetic Resonance Conference, Frankfurt am Main, Germany, 2011, Сборник докладов, стр. 15. Kirill Nadezhdin, Eduard Bocharov, Olga Bocharova, Alexander Arseniev “Structure of transmembrane domain and dimerization mechanism of amyloid precursor protein”, Biophysical Society 56th Annual Meeting, Cан Диего, Калифорния, США, 25-29 февраля, 2012, Сборник докладов, стр. 6. O. Bocharova, K. Nadezhdin, E. Bocharov, A. Arseniev “Molecular Neurobiology Today and Tomorrow” Российско-Германский симпозиум, Москва, 25-29 апреля, 20Список сокращений ПБА – предшественник бета-амилоида P/D – молярное соотношения пепТМ – трансмембранный (регион) тид/детергент ПМ – примембранный (регион) кДа – килодальтон ЯМР – ядерный магнитный резонанс ДФХ – додецилфосфатидилхолин TRX – тиоредоксин ЛМФХ – лизомиристоилфосфатидилхолин ЯЭО – ядерный эффект Оверхаузера (NOE ЛМФГ -лизомиристоилфосфатидилглицерин эффект) ГФХ - гексаноилфосфатидилхолин ПААГ – полиакриламидный гель ДСН – додецилсульфат натрия, МХАХ - металлохелатная аффинная хрома- ДМФХ – димиристоилфосфатидилхолин тография ДГФХ – дигексаноилфосфатидилхолин ОДК – остаточная дипольная константа PDB – protein data bank оф-ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.