WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

МАТЕНЬКОВА Елена Анатольевна

СОСТОЯНИЕ МИКРОБНЫХ ЦЕНОЗОВ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ НЕФТЬЮ

03.02.08 Экология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет»

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Наплекова Надежда Николаевна

Официальные оппоненты

Цильке Регинальд Александрович, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет», заведующий кафедрой селекции и генетики сельскохозяйственных растений

Пасько Ольга Анатольевна, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Национального исследовательского Томского политехнического универ-ситета, профессор кафедры общей геологии и землеустройства

Ведущая организация

ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный сельскохозяйственный институт»

Защита состоится «____»_________ в _______ часов на заседании диссертационного совета Д 220.048.03 созданном на базе ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» по адресу: 630039, г. Новосибирск, ул. Добролюбова, 160.

Тел/факс: 8(383)264-29-34, e-mail: norge@ngs.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» и на сайте www.nsau.edu.ru

Автореферат разослан «____» _______ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Маренков В.Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность работы. Нефть и нефтепродукты относятся к приоритетным загрязнителям биосферы. Аварийные разливы нефти превращают почвы в техногенные пустыни. Вследствие того, что масштабы нефтяных загрязнений огромны, а процесс самоочищения нефтезагрязненных почв затягивается на 10-25 лет (Оборин и др., 1988; Пиковский, 1993), исключительную важность приобретает проблема совершенствования биотехнологии рекультивации почв. При этом, несмотря на имеющиеся достижения в этом направлении (Мурзаков и др., 1992), проблема восстановления нефтезагрязненных почв по-прежнему далека от своего окончательного решения. Поэтому совершенствование способов очистки поврежденных почв остается важной биотехнологической задачей, решение которой невозможно без познания особенностей функционирования микробных ценозов в почвах нефтезагрязненных экосистем.

Биологическая деградация нефти в окружающей среде начинается микроорганизмами-деструкторами, поэтому важно, чтобы их численность была высокой (особенно на начальном этапе восстановления экосистемы). Это не всегда возможно, поскольку микробоценоз страдает от токсического шока, вызываемого поступлением больших количеств нефти в случае разлива, и численность микроорганизмов сокращается. Внесение дополнительных количеств эффективных микроорганизмов-деструкторов (биодеструкторов) позволяет усилить и ускорить разрушение нефти. Использование нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки почвы является не новой, но недостаточно изученной областью исследований. Вместе с тем, эта проблема представляется актуальной, особенно в связи с растущей потребностью в повышении интенсивности и эффективности процесса биологической очистки.

Цель исследований изучить биологическую активность дерново-подзолистой почвы, загрязненной нефтью, по микробным ценозам и ферментативной активности.

Задачи исследований:

  1. Определить численность основных эколого-трофических групп микроорганизмов в почве, загрязненной нефтью.
  2. Изучить метаболизм микроорганизмов в исследуемой почве.
  3. Выделить аборигенные бактерии-нефтедеструкторы из почвы и изучить степень деградации ими разных видов нефти.
  4. Определить влияние разной степени нефтяного загрязнения на растения.

Научная новизна. Выявлены особенности состава и функционирования микробных ассоциаций нефтезагрязненных дерново-подзолистых почв Ханты-Мансийского автономного округа. В работе впервые приводятся сведения о влиянии нефтяного загрязнения на состояние стабильности микрофлоры азота и углерода.

Показана большая устойчивость к загрязнению нефтью бацилл и микроскопических грибов. Высокой толерантностью характеризуется аэробный фиксатор азота Azotobacter. Выделены микроорганизмы, характеризующиеся высокой активностью деградации нефти.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования расширяют сведения об изменениях состава и функционирования микроорганизмов в почвах с нефтяным загрязнением. Выявлены микроорганизмы, устойчивые к загрязнению, их можно использовать для диагностики состояния экосистем и разработки стратегии биоремедиации нефтезагрязненных почв и рационального использования микробных ценозов в биотехнологии.

Материалы диссертации используются в учебном процессе при изучении дисциплин «Микробиология», «Экология», «Охрана окружающей среды», «Почвоведение» при подготовке специалистов – агрономов и агроэкологов в сельскохозяйственных вузах Сибирского региона.

Защищаемые положения:

  1. Загрязнение дерново-подзолистой почвы нефтью приводит к изменению структуры микробоценоза, снижению его биоразнообразия и физиологической активности.
  2. Суммарная биологическая активность почвы и степень загрязненности ее нефтью находятся в обратной корреляционной зависимости.
  3. Большую толерантность к нефтяному загрязнению проявляют сельскохозяйственные культуры по сравнению с дикорастущими.
  4. Применение микроорганизмов активных деструкторов нефти способствует рациональному использованию биологических ресурсов и самоочищению дерново-подзолистой почвы.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на I Региональной научно-практической конференции «Продовольственная безопасность Среднего Приобья» (Колпашево, 2008); XIV Международной студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий»  (Новосибирск, 2009); VII Межрегиональной конференции молодых ученых и специалистов аграрных вузов Сибирского федерального округа «Инновационный потенциал молодых ученых в развитии агропромышленного комплекса» (Новосибирск, 2009); VI Международной научно-практической конференции «Тяжелые металлы и радионуклиды в окружающей среде» (Семей, 2010); Региональной научно-практической конференции «Химия и жизнь» (Новосибирск, 2010).

Публикации результатов исследований.  Материалы диссертации изложены в 12 публикациях, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК («Достижения науки и техники АПК»).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, библиографического списка, включающего 165 наименований, в том числе 19 иностранных авторов. Работа содержит 24 таблицы, 11 рисунков.

Автор выражает глубокую благодарность и признательность научному руководителю доктору биологических наук, профессору, заслуженному деятелю науки РФ Надежде Николаевне Наплековой.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальная часть работы выполнялась в 20072011 гг. Образцы исследуемой почвы были отобраны в Тюменской области с месторождения нефти «Восточная Правдина» в 2007 г. на разном расстоянии от разлива нефти на глубину 0-20 см. Схема последовательности научного поиска представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема исследований

Степень загрязнения каждого участка оценивалась по содержанию нефти в верхнем слое почвы в соответствии с принятой классификацией нефтезагрязненных земель (Гашев и др., 1992). Выделялись участки с сильным (более 40 %) и средним (от 10 до 40 %) загрязнением.

Микробиологические анализы проводили на кафедре агроэкологии и микробиологии Новосибирского государственного аграрного университета по методам, рекомендованным ВНИИСХМ (Ежов, 1974; Методы…, 1966). Общее количество бактерий, использующих органический азот, учитывали на МПА; бактерий, использующих минеральный азот, и актиномицетов – на КАА; аэробных азотфиксирующих микроорганизмов – на безазотистой среде Эшби; анаэробных азотфиксаторов – на среде Виноградского для клостридий; целлюлозолитических микроорганизмов – на среде Гетчинсона; микроскопических грибов – на подкисленной среде Чапека. Видовой состав доминирующих микроорганизмов определяли по руководствам Н.А. Красильникова (1949), Н.Н. Наплековой (1983), К.С. Bergey (1974), М.А. Литвинова (1967).

Ферментативную активность изучали следующими методами: уреазную активность экспресс-методом Т.Г. Аристовской (1989); каталазную активность по методу А.Ш. Галстяна (1956); для определения амилазы использовали методику Н.А. Красильникова, В.В. Котелева для фосфатазы (1959) в нашей модификации, с точной дозировкой крахмала. Активность разложения целлюлозы хлопчатобумажной ткани определяли по потере массы целлюлозы, заложенной на определенный срок в почву в лаборатории. Протеолитическую активность определяли по уменьшению массы азотосодержащих веществ желатины (Наплекова, 2001). Дыхание почвы определяли по методу С.М. Маштакова (1954), основанному на учете количественного изменения углекислого газа в окружающем воздухе почвы. Фитотоксичность почвы определяли методом почвенных пластинок (Берестецкий, 1971), используя в качестве критерия всхожесть семян, длину ростков и корней редиса сорта Жара.

Физиологическую активность микроорганизмов определяли по характеру сбраживания сахаров на среде Гисса, по отношению к различным источникам азота, по интенсивности разложения желатины и по сбраживанию молока.

Изучение биохимических свойств и идентификацию чистых культур бактерий-нефтедеструкторов проводили стандартными методами. При наработке биомассы штаммов в качестве источника углерода к среде 8Е добавляли глюкозу. Для определения их способности к деструкции использовали сырую нефть или нефтепродукты, добавленные по массе.

Для определения антибиотических свойств выделенных культур использовали метод агаровых блочков и метод диффузии в aгap (Егоров Н.С, 1957).

Состав и процентное соотношение углеводородов нефти в образцах определяли с использованием газового хроматографа HP 5890А с пламенно-ионизирующим детектором и системой обработки данных «ChemStation».

Полученные экспериментальные данные обработаны методом дисперсионного анализа с использованием пакетов прикладных программ SNEDECOR (Сорокин, 2004).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Численность и состав микрофлоры нефтезагрязненной почвы

Биологическое состояние почвы характеризуется численностью основных групп микроорганизмов, выполняющих определенные функции. Одним из важных факторов, влияющих на размножение микроорганизмов, является наличие минеральных и органических веществ (Асонов, 2001).

Действие нефтяного загрязнения на дерново-подзолистую почву оценивали по численности и составу микробоценоза (табл. 1).

Результаты исследования показали, что типы ответных реакций на нефтяное загрязнение для разных групп почвенных микроорганизмов сильно различаются.

Численность бактерий, усваивающих органические формы азота (МПА), в исследуемой контрольной почве составила 2,040 млн КОЕ/г почвы, что находится в пределах среднемноголетних значений, приведенных И.Л. Клевенской и др. (1974).

Установлено, что численность аммонификаторов в почве, загрязненной нефтью, варьирует от 0,200 до 0,660 млн КОЕ/г почвы, среди них отмечены микроорганизмы, толерантные к этому загрязнению, и при участии которых происходит окисление различных углеводородов нефти.

Наибольшую активность проявили специализированные аммонификаторы, способные окислять газообразные ароматические углеводороды. Так, при среднем и сильном загрязнении почвы численность бактерий рода Bacillus была выше, чем в контроле, на 76 и 70% соответственно (в контроле 238 тыс. КОЕ/г почвы).

Среди микроорганизмов, выделенных на МПА, преобладают спороносные формы рода Bacillus.

Таблица 1. Микрофлора дерново-подзолистой почвы, загрязненной нефтью

Загрязнение

Аммони-фикаторы, млн КОЕ/г почвы

Микроорганизмы, использующие минеральный азот, млн КОЕ/г почвы

Грибы тыс./г почвы

Azotobacter,%

Контроль

2,040±0,030

7,248±0,790

1,30±0,89

100

Среднее

0,660±0,120

2,948±0,490

0,30±0,33

100

Сильное

0,200±0,230

2,248±0,210

51,00±13,90

98

НСР05

0,17

1,92

27,9

3,3





Для микрофлоры, усваивающей минеральные источники азота, в опыте установлено снижение общей численности микроорганизмов по сравнению с контрольным вариантом на 59,3 – 69,0 %.

В дерново-подзолистой почве преобладают микроорганизмы, предпочитающие минеральные формы азота по сравнению с органическими (аммонификаторами), это указывает на выраженное преобладание процесса минерализации. В контрольной почве коэффициент минерализации составляет 3,6, а при загрязнении он увеличивается в 1,23,1 раза. Причем увеличение процесса минерализации особенно велико при сильном загрязнении. Это подтверждает ту мысль, что в загрязненной почве активнее развиваются микроорганизмы, усваивающие минеральный азот, которые наиболее устойчивы к ряду углеводородов нефти, чем аммонификаторы.

Наряду с изменением численности микроорганизмов, изменилась и структура микробоценоза. Если в контроле и в варианте со средним загрязнением развивались все таксономические группы микроорганизмов – бактерии, грибы, актиномицеты, то при сильном загрязнении доминировали грибы, качественный состав которых многочисленный Cladosporium elegantulum Pidopliezko et Deniac, Penicillium funiculosum Zink ex Fries, Monotospora brevis Gilman et Abbott, Monilia brunnea Gilman et Abbott, Torula allii (Hanz) Saccardo, Dicoccum asperum (Corda) Sacardo, Humicola grisea Traaen, Cephalosporium oudemansis Corda, Zygosporium echinosporium Bunting et Moson, Mortierella Coemans. Установлено, что при сильном нефтяном загрязнении плотность токсичных грибов (Penicillium funiculosum Zink ex Fries, Monotospora brevis Gilman et Abbott, Cephalosporium oudemansis Corda, Zygosporium echinosporium Bunting et Moson) возрастала и составляла 2335% от общей численности микромицетов.

Cвоеобразно прореагировали на загрязнение аэробные азотфиксаторы. Под влиянием нефтяного загрязнения в небольших дозах азотфиксирующие микроорганизмы получают стимул к развитию вследствие внесения в почву свежего органического материала. Число почвенных комочков, обросших азотобактером на среде Эшби, составило 98-100% во всех вариантах (табл. 1), но в контроле он развивался у комочка почвы, цвет колоний был светло- коричневый. С усилением загрязнения усилилось образование меланиновых пигментов у Azotobacter chroococcum, колонии имели цвет от бурого до почти черного. Возможно, что они способны к использованию низкомолекулярных фракций нефти.

Наряду с азотобактером развивался другой активный анаэробный фиксатор атмосферного азота - Clostridium рasteurianum. Сильное загрязнение почвы нефтью способствовало развитию анаэробных процессов, и развитие этого азотфиксатора отмечено до разведения 10-7, а в контрольном варианте 10-4.

Таким образом, установлено, что к нефтяному загрязнению наиболее устойчивы спорообразующие бактерии, микромицеты и азотфиксаторы. Развитие этих микроорганизмов увеличилось в ряду: контроль< среднее загрязнение <сильное загрязнение.

3.2. Ферментативная активность почвы при нефтяном загрязнении

Каталазная активность в контрольной дерново-подзолистой почве бедная (1,48 см3 О2 за 1 мин в 1 г почвы) по шкале оценки степени обогащенности ферментами (Звягинцев, 1978).

При нефтяном загрязнении в связи с гидрофобной способностью нефти ухудшается кислородный режим, что приводит к снижению каталитической активности аэробных почвенных микроорганизмов, в частности аммонификаторов, на 2,0-8,1% (рис. 2).

Рис. 2. Каталазная активность дерново-подзолистой почвы при нефтяном загрязнении

Аммонифицирующие микроорганизмы являются продуцентами протеазы. При сильном нефтяном загрязнении отмечено снижение активности этого фермента в 11,8 раза по отношению к контрольной почве. Между контролем и вариантом со средним загрязнением отличия в протеолитической активности недостоверны, хотя тенденция к снижению проявляется достаточно четко.

При определении амилазной активности установлено, что нефтяное загрязнение способствует снижению массы разложившегося крахмала в 1,7-2,3 раза (рис. 3). Это связано с угнетением растений при нефтяном загрязнении, что сказывается на снижении содержания крахмала в почве и амилолитической активности.

Рис. 3. Амилазная активность дерново-подзолистой почвы, загрязненной нефтью

Наиболее чувствительными к загрязнению ароматическими углеводородами являются целлюлозоразрушающие бактерии, которые могут служить индикаторами загрязнения почв (Киреева, 1995). Установлено, что численность миксобактерий при сильном загрязнении нефтью снижается в 2,2 раза по сравнению с контролем (табл. 2). Толерантными к загрязнению оказались грибы рода Dematium. В лабораторных условиях на среде с целлюлозой при оптимальной температуре (24-26 0С) и влажности (60% от полной влагоемкости) обнаружено большое количество грибов (100%), но их развитие происходило у комочков почвы, и разрушение полотна, как правило, отсутствовало, что свидетельствует о их низкой целлюлозолитической активности.

Таблица 2. Целлюлозолитическая активность дерново-подзолистой почвы, загрязненной нефтью

Загрязнение

Общее разложение хлопчатобумажного полотна, %

Миксобактерии,%

Грибы,%

Контроль

95,00±5,00

63,30±3,30

75,00±14,40

Среднее

96,00±3,30

48,30±1,70

23,30±3,30

Сильное

15,00±5,00

28,30±4,40

100,00±0,33

НСР 05

15,6

11,5

29,6

Нефтяное загрязнение изменяет структуру микробных сообществ, что непосредственно отражается на общебиологическом показателе интенсивности дыхания почвы. По мере удаления от загрязнения интенсивность дыхания почвы увеличивается. Если при сильном и среднем загрязнении дыхание почвы составляло 0,0032 и 0,0027 г СО2 на 1 г почвы соответственно, то в слабозагрязненной почве оно было в 4 раза выше.

Установлено, что между степенью загрязненности и метаболизмом основных эколого-трофических групп микроорганизмов имеется тесная обратная корреляционная зависимость (с каталазой r=-0,68; амилазой r=-0,96; протеазой r=-0,88; целлюлазой r=-0,79; дыханием почвы r=-0,91).

3.3. Антагонизм бактерий, выделенных из нефтезагрязненных почв, к фито- и условно - фитопатогенным грибам

Из дерново-подзолистой почвы выделены 14 культур бактерийдеструкторов нефти общепринятыми методами. Каждому выделенному штамму присвоен свой порядковый номер.

Штаммы под номерами 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07 выделены из почвы с сильным загрязнением, 19, 110 из образца почвы среднего загрязнения, 2.13- из образца почвы слабого загрязнения, 315, 316, 317 из образца почвы контрольного варианта. Внешний вид клеток оказался однообразным. Бактерии грам положительные, в основном спорообразующие, с закругленными концами, расположенные поодиночке, парами или в виде короткой цепочки. Спора овальная, расположена термально, ближе к концу клетки. Большинство выделенных деструкторов нефти относятся к бациллам.

Ранее было изучено, что при нефтяном загрязнении лучше всего развивается грибная микрофлора.Поэтому особое значение приобретают работы по поиску микробов-антагонистов, подавляющих фитопатогенные грибы, что позволяет осуществить оздоровление почв.

У выделенных бактерий деструкторов нефти, выращенных на белковом азоте, изучали антагонизм к условно фитопатогенным грибам: Alternaria tenuis, Bipolaris sorokiniana, Aspergillus flavus, Stahybotrys alternans, Monotosporа brevis, Penicillium notatum.

Результаты исследований показали, что к грибу Alternaria tenuis виделена одна бактерия-антагонист, дающая зоны угнетения роста гриба от 12 до17 мм. Значительно больше бактерий-антагонистов обнаружено к грибу Bipolaris sorokiniana (3 вида). Наиболее активными были виды под № 04 и 07, выделенные из почвы с сильным нефтяным загрязнением, которые давали зоны угнетения от 12 до 20 мм, а также культура № 212, выделенная из почвы со слабым нефтяным загрязнением. Она давала зоны угнетения гриба от 20 до 26 мм. Гриб Monotosporа brevis подавляли два вида бактерийантагонистов № 04 и № 19, выделенная из почвы со средним нефтяным загрязнением. Они давали зоны угнетения от 14 до 19 мм (табл. 3).

Таблица 3. Антагонизм бактерий к фитопатогенным грибам на белковом азоте (зона угнетения, мм)

Номер культуры

Alternaria tenuis

Bipolaris sorokiniana

Monotosporа brevis

07

12-17

12-20

-

04

-

16-20

15-18

19

-

-

14-19

212

-

20-26

-

Таким образом бактерии антагонисты фитопатогенных грибов не выделены из контрольной дерново-подзолистой почвы. В почве со слабым, средним и сильным нефтяным загрязнением встречаются бактерии-антагонисты микромицетов. В сильно загрязненной почве число антагонистов бактерий к грибам увеличивается, и антагонистическое действие одного и того же вида бактерий проявляется к нескольким видам грибов. Судя по размеру зон угнетения, органический источник азота способствует проявлению активного антагонизма бактерий к фитопатогенным и условно фитопатогенным грибам в дерново-подзолистых почвах.

По результатам исследований установлено, что антагонизм бактерий нефтедеструкторов зависит от источника азота в среде (табл. 4).

Таблица 4. Антагонизм бактерий к грибам на разных источниках азота

Источник азота

Alternaria tenius

Bipolaris sorokiniana

Aspergillus flavus

Stahybotrys alternans

Monotosporа brevis

Penicillium notatum

Пептон

213/20

316/20

04/15

213/20

213/15

315/15

NaNO3

05/15

05/20

05/18

03/20

315/20

315/17

04/15

KNO2

19/15

03/15

04/15

06/12

110/15

(NH4)2SO4

07/1,5

06/1,5

19/20

317/15

19/2,0

213/1,5

Примечание. В числителе номер культуры, в знаменателе зона угнетения роста гриба, мм.

Содержание в среде нитритного и аммонийного азота стимулирует продуцирование бактериями деструкторами нефти антибиотиков и ускоряет их развитие. Наиболее отзывчивы на внесение в среду нитритного азота культуры 03; 04;06 (выделенные из сильнозагрязненной почвы), 19, 110 (выделенные из почвы со средним загрязнением). При внесении аммонийного азота проявили антагонизм культуры 06, 07, 19, 213 (выделенная из почвы со слабым загрязнением), 317 (выделенная из контрольной почвы).

Из 11 изученных источников углерода по результатам метода диффузии в агар (табл. 5) наиболее сильно антагонизм бактерий проявляется при наличии мальтозы (10 культур), лактозы (8 культур), крахмала (7 культур). Так же сильно проявляется антагонизм при наличии в почвах рамнозы (6 культур).

Таблица 5.Антагонизм бактерий к грибам на средах с разными углеводами (зона угнетения, мм)

Углевод

Alternaria tenuis

Bipolaris sorokiniana

Aspergillus flavus

Stahybotrys alternans

Monotosporа brevis

Penicillium notatum

Маннит

19/17

Галактоза

110/13

06/18

19/15

213/17

213/16

110/16

316/14

Глюкоза

315/15

212/12

315/20

315/10

315/20

316/15

Крахмал

19/25

02/25

03/15

07/17

03/20

213/15

04/20

07/20

19/25

213/15

315/25

Мальтоза

07/15

03/12

110/20

04/15

07/19

19/15

05/15

316/17

19/25

317/20

315/13

07/12

317/13

212/20

110/10

316/12

Сахароза

06/15

04/15

05/15

212/15

07/12

Лактоза

213/10

03/19

01/15

317/20

19/15

212/15

213/15

317/15

Фруктоза

Ксилоза

07/10

03/17

317/15

03/12

04/15

07/15

Рамноза

213/20

02/20

07/12

05/15

07/15

315/20

317/20

Сорбит

06/15

01/10

06/15

06/10

213/18

315/15

Таким образом, антагонизм бактерий к условно фитопатогенным грибам зависит от источника азота и углерода в среде и проявляется активно при наличии нитритного и аммонийного азота, мальтозы, крахмала. Полученные данные необходимо учитывать при использовании этих деструкторов для биоремедиации.

3.4. Деструкция нефти микроорганизмами и возможности применения их для ремедиации почв

Проведена оценка степени утилизации нефти ассоциацией штаммов микроорганизмов, выделенных ранее из нефтезагрязненных почв и хранящихся в музее микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. В нее вошли неспорообразующие бактерии и дрожжи, которые оказались наиболее эффективными утилизаторами н-алканов. Степень деструкции ими н-алканов в титре 107 , взятых в соотношении 1:1, при рН 7,0 достигала 92% за 6 суток (рис.4).

Рис. 4 Газовая хроматограмма хлороформного экстракта васюганской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией штаммов микроорганизмов (Б) в течение 6 суток инкубирования при 23 0С и рН среды 7,0

При рН 5,0 утилизация н-алканов составляла 87%, а при рН 8,5 75% за 6 суток.

Загрязнение нефтью чаще всего бывает нефтесолевое. Известно, что в условиях высокого засоления среды сильнее ингибируется микробная деструкция ароматических и других гидрофобных соединений, чем растворимых субстратов (Oren, 1992).

Выяснено, что при повышенных концентрациях соли степень биодеструкции остается значительной: при 5% NaCl степень утилизации достигает 78%, а при 7% NaCl 73% за 6 суток.

Эта же ассоциация достаточно эффективно утилизировала образцы нефти, отличающиеся наличием большого количества тяжелых углеводородов (нефть Усинского месторождения). При температуре 2325 0С утилизация н-алканов усинской нефти составляла 92% за 6 суток, в то время как деструкция н-алканов более легкой васюганской нефти достигала 82% при температуре 46 0С.

В образцах нефти после взаимодействия с микроорганизмами - деструкторами обнаружены изменения, характерные для биологической деградации: на первых этапах мощная биоэмульгация, далее – полное исчезновение нефтяной пленки на поверхности среды. Газохроматографический анализ остаточной нефти показал изменение состава углеводородов по сравнению с контролем.

3.5. Использование сельскохозяйственных культур и дикорастущих растений для фиторемедиации нефтезагрязненных почв

Почва считается восстановленной от нефтяного стресса, если на ней могут произрастать травянистые растения, древесные или сельскохозяйственные культуры.

В почве при нефтяном загрязнении уменьшается доступность для растений и микроорганизмов воды и питательных минеральных веществ, уменьшается концентрация доступного растениям фосфора, нитратного азота, калия, резко увеличивается количество анаэробных микрозон. При таких условиях, а также действии остальных стрессовых факторов происходит увеличение количества корневых выделений растением.

При посеве культурных растений в нефтезагрязненные почвы всходы появились на 3-й день.

В ходе исследования было установлено, что нефтяное загрязнение в концентрации 5, 10, 15 % практически не влияет на всхожесть всех изучаемых культур (табл. 6). Размер ростков и корней в вариантах с загрязнением снижался в 2-4 раза. Особенно заметно проявление токсичности нефти на развитии корневой системы. В контрольном варианте корни овощных культур в среднем достигали 12-62 мм в длину. При загрязнении размер корней снижался в 3 раза, на корнях образовывался бурый слой и они утолщались, поднимались на поверхность почвы.

Снижение всхожести на уровне от 5 до 15 % наблюдалось по всем изученным овощным культурам.

Таким образом нефтяное загрязнение дерново-подзолистой почвы в пределах от 5 до 15% к массе почвы показывает тенденцию к снижению всхожести семян и достоверному угнетению размера ростков и корней всех изученных овощных культур (редиса сорта Жара, капусты белокочанной Номер первый Грибовский 147, свеклы столовой).

Степень угнетения их усиливается по мере увеличения степени негативного загрязнения от 5 к 10 и 15% к весу почвы.

Особенно чувствительной культурой к сильному нефтяному загрязнению оказался редис сорта Жара, который при сильном загрязнении имел размер корней в 4 раза меньше, чем в контроле, а размер ростков в 3,8 раза.

Лабораторные опыты показали, что фитотоксичность почвы находится в прямой зависимости от загрязнения. Выявлено, что степень ингибирования роста и развития растений пропорциональна дозе нефти.

Нефтяное загрязнение оказало отрицательное влияние на прорастание куриного проса сразу после высева семян в грунт. Это объясняется как токсичностью самой нефти, так и приобретением почвой гидрофобных свойств.

Таблица 6. Всхожесть, размер ростков и корней овощных и злаковых культур на образцах почвы с разным нефтяным загрязнением

Вариант

Всхожесть,%

Размер ростков, мм

Размер корней, мм

Редис сорта Жара

Контроль

90,00±4,04

53,00±7,50

62,00±1,55

5%

85,00±8,66

18,00±1,15

21,00±0,57

10%

75,00±0,00

17,00±2,88

20,00±1,73

15%

75,00±2,88

14,00±2,30

16,00±2,30

НСР05

16,27

13,77

5,15

Капуста белокочанная Номер первый Грибовский 147

Контроль

95,00±2,88

42,00±4,61

30,00±4,04

5%

90,00±4,04

14,00±2,30

11,00±0,57

10%

85,00±5,77

13,00±1,73

10,00±1,73

15%

90,00±1,15

12,00±2,30

11,00±3,28

НСР05

12,56

9,64

8,99

Свекла столовая

Контроль

60,00±8,66

29,00±0,57

12,00±1,15

5%

60,00±7,26

15,00±1,73

7,00±1,15

10%

50,00±4,41

15,00±2,88

4,00±1,15

15%

45,00±2,88

15,00±0,57

4,00±0,57

НСР05

19,02

5,64

3,39

Пшеница Новосибирская 29

Контроль

100,00±0,00

89,00±0,58

86,00±3,46

5%

95,00±2,89

61,00±0,57

59,00±5,77

10%

95,00±2,88

57,00±0,04

49,00±6,00

15%

95,00±2,89

39,00±5,19

41,00±0,57

НСР05

8,15

10,86

14,49

Подобная картина наблюдалась и у семян звездчатки. Через 4 дня всходы звездчатки появились недружно, причем, чем выше концентрация нефти, тем меньше число проростков. Уже при 5%-м нефтяном загрязнении всхожесть снизилась на 12% по сравнению с контрольным вариантом. По мере прорастания семян с увеличением дозы загрязнителя эта величина снижалась.

При всех концентрациях нефти размер ростков звездчатки отставал от контроля, при различных дозах высота была в 4 и более раз ниже, чем в контроле.

Интерес представляет изучение влияния нефтяного загрязнения на развитие корневой системы. Длина корней растений звездчатки даже при 5%-м загрязнении составляла только 1/5 от длины корней в контрольном варианте. При 10 и 15%-м уровне загрязнения длина корней растений звездчатки была в 9 раз меньше длины корней растений, выросших на незагрязненной почве (табл. 7).

Таблица 7. Всхожесть, размер ростков и корней звездчатки на образцах почвы с разным нефтяным загрязнением

Вариант

Всхожесть,%

Размер ростков, мм

Размер корней, мм

Звездчатка

Контроль

44,00±2,30

92,00±1,15

47,00±4,04

5%

32,00±2,30

22,00±2,30

9,00±0,58

10%

19,00±2,40

16,00±1,16

5,00±1,73

15%

10,00±1,15

15,00±2,89

5,00±0,57

НСР05

6,79

7,89

7,29

Интересно проследить реакцию культурных растений на постепенное загрязнение почвы. Повышение силы влияния фактора в градации 5, 10, 15% не вызывает достоверно различающегося снижения размера ростков растений по сравнению с предыдущим уровнем загрязнения нефтью.

Что касается реакции звездчатки на постепенное загрязнение почвы, то наблюдалось незначительное снижение размера ростков по сравнению с предыдущими дозами. Это явление наблюдалось и по отношению к отдельным морфологическим признакам, а именно длине корней (см. табл. 7).

Таким образом, для фиторемедиации почв из изученных сельскохозяйственных культур возможно использовать зерновые культуры, из дикорастущих растений наиболее устойчивой оказалась звездчатка.

3.6. Прогноз самоочищающей способности нефтезагрязненных почв

Учитывая то обстоятельство, что в наших исследованиях состав и структура микробных сообществ изучались после аварийной ситуации, то по процессу ее изменения можно считать, что самое раннее самоочищение можно ожидать через 7-11 лет по четырем показателям (аэробным азотфиксаторам, целлюлозоразрушающим микроорганизмам, каталазе и уреазе), если принять средний показатель самоочищения 10% в год. Остальные показатели могут прийти к стабильному состоянию через 30110 лет. Особенно медленно будет восстанавливаться численность аммонификаторов.

При интродукции в почву микроорганизмов-деструкторов процесс самоочищения можно значительно ускорить. Но активное действие микроорганизмов ограниченно весеннее – летнее осенним периодом. Для данной технологии сложными являются случаи толстой (свыше 3 мм) нефтяной пленки. Доступ воздуха в почву при этом прекращается, и растительность погибает быстрее, чем микроорганизмы успевают разрушить нефтепродукты – ведь этот процесс требует от двух недель до трех месяцев, что зависит от состава нефти и наличия в ней тех или иных углеводородов.

В климатических условиях Сибири самоочищение с помощью эндогенных углеводородразрушающих микроорганизмов происходит с низкой скоростью. В связи с этим интродукция микроорганизмов в почву для ремедиации представляется более эффективным приемом. Но для этого целесообразно применять штаммы представителей местной углеводородредуцирующей микрофлоры. Необходимо также создавать более благоприятные условия для реализации их способности к разложению нефти в природной обстановке. Считается, что этого достичь можно внесением в почву, загрязненную нефтью, минеральных удобрений.

Внесение (NPK)90 и посев огурца и гороха в почву с нефтяным загрязнением и аборигенными микроорганизмами с дополнительной интродукцией нефтедеструкторов показало, что в контроле всходы огурца появились уже на 3-и, а гороха на 9-е сутки. На фоне загрязнения нефтью они всходов не дали даже в течение 21 суток. Внесение одних минеральных удобрений слабо сказалось на всхожести семян. И только совместное внесение микроорганизмов деструкторов нефти и минеральных удобрений повысило деградацию нефти, чем снизило ее токсичность и повысило всхожесть семян. Всходы огурца появились на 3-и сутки (20%) и к 13-му дню составили 60%, а гороха появились на 10-е сутки (30%) и к 21-му дню составили 40%. Развитие растений на незагрязненной дерново-подзолистой почве шло нормально. На 3-и сутки появились всходы, а на 7-е сутки всходы составили 70% и у растений появился 3-й лист. Они достигли размера 1012 см. На 9-е сутки сформировался 4-й лист.

Что касается гороха, то на незагрязненной почве его всходы появились на 9-й день (40%) и к 21-му дню его всходы достигли 60% и нормально развивались.

На почве, загрязненной нефтью, с внесением минеральных удобрений только 10% семян гороха взошли и дали очень мелкие растения, которые после 13 дней роста погибли. Без внесения минеральных удобрений на нефтезагрязненной почве горох всходов не дал.

Интродукция микроорганизмов в почву привела к частичному разрушению нефти, что привело к снижению ее токсичности по отношению к гороху. Всходы его составили на 10-е сутки 30%, и растения практически нормально развивались в течение всего опыта (21 сутки), хотя по размерам заметно отличались от контроля.

Приведенные данные показывают, что рекультивация нефтяных территорий одним внесением минеральных удобрений процесс крайне медленный. Дополнительное внесение микроорганизмов ускоряет процесс, но состояние исходной почвы за период опыта не достигается.

Следует сказать, что в нашем модельном опыте вносили 2 г нефти на 100 г почвы, что составляло 2%. Это загрязнение было более высоким, чем в опыте Е.В. Донца (2008), изучавшего влияние нефтяного загрязнения на всхожесть семян и рост проростков березы повислой. В этой работе установлено, что предельно допустимая концентрация нефти для данного вида – 1 мг/л, а концентрации с 10 мг/л и более 50 мг/л резко, до 50%, снижают всхожесть семян и сокращают среднюю продолжительность прорастания.

Прогнозы о скорости деградации нефти на нефтезагрязненных территориях весьма проблематичны, так как сильно зависят от качества нефти, фитоценоза, экологических условий расположения микроорганизмов и состава самих микробных ассоциаций.

ВЫВОДЫ

  1. Нефтяное загрязнение негативно влияет на деструкционный блок микроорганизмов дерново-подзолистой почвы, приводя к заметному снижению численности микроорганизмов и перегруппировке их таксономического состава. Заметно увеличивается численность микроскопических грибов (в 39 раз), и повышается коэффициент минерализации (в 3 раза).
  2. Загрязнение нарушает деятельность микробных ценозов, что приводит к снижению интенсивности дыхания в сильно загрязненной почве в 4 раза.
  3. Метаболическая активность биоты снижается в почве с нефтяным загрязнением. В сильно загрязненной почве численность антагонистов бактерий к фитопатогенным и условно фитопатогенным грибам увеличивается, и антагонистическое действие одного и того же вида бактерий проявляется к нескольким видам грибов.
  4. Выявлено, что ингибирование роста и развития растений пропорционально степени загрязнения нефтью. Нефтяное загрязнение в концентрации 5, 10, 15 % практически не влияет на всхожесть семян сельскохозяйственных растений: редиса, капусты, свеклы, пшеницы, но угнетает развитие их ростков и корней. В контрольном варианте корни овощных культур в среднем достигали 12-62 мм в длину. При загрязнении размер корней снижался в 3 раза. Дикорастущие растения (звездчатка и куриное просо) угнетаются сильнее, чем культурные. Внесение минеральных удобрений и интродукция микробного сообщества снижают токсическое действие нефти и всхожесть семян растений (огурца, гороха) к контролю, но стабильного состояния не достигается.
  5. Скорость деструкции нефти зависит от экологических условий. Более интенсивно протекает процесс при температуре 23-25 0С и нейтральной реакции среды. Снижение температуры до 4-6 0С и рН среды до 5,0 замедляют деградацию нефти вследствие создания неблагоприятных условий для развития микроорганизмов.
  6. Изменения состояния показателей микробного ценоза дерново-подзолистой почвы позволяют сделать прогноз биоремедиации сильно нефтезагрязненной территории Ханты Мансийского автономного округа Тюменской области по одним показателям (аэробным азотфиксаторам, целлюлозоразрушающим микроорганизмам, каталазе и уреазе) за 7-11 лет, по другим (дыхание, анаэробные азотфиксаторы, аммонификаторы, коэффициент минерализации) за 30-110 лет.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

При определении действия нефтяного загрязнения целесообразно проводить комплексную оценку его влияния на состояние отдельных звеньев микробоценозов. В качестве критериев могут быть использованы изменения структуры микробных сообществ и их ферментативная активность.

Публикации по материалам диссертации

  1. Матенькова Е.А. Целлюлозолитическая активность почв, загрязненных нефтью/Е.А. Матенькова, Н.Н. Наплекова// Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития: сб. материалов Всерос. науч.- практ. конф. с междунар. участием (25-27 нояб. 2008 г.). – Киров, 2008. – С. 188189.
  2. Матенькова Е.А. Влияние нефтяного загрязнения на микробный ценоз дерново-подзолистой почвы Тюменской области /Е.А. Матенькова//Сб. тр. 1-й Регион. науч.-практ. конф. «Продовольственная безопасность Среднего Приобья». Колпашево: Сев. фил. НГАУ, 2008.С.81-82.
  3. Матенькова Е.А. Состав микробных ассоциаций дерново-подзолистых почв с нефтяным загрязнением /Е.А Матенькова, Н.Н. Наплекова// Достижения науки и техники АПК.М.. 2009.-№4.- С.20-22.
  4. Шипилин Н.Н. Биотестирование токсичности почвы в радиусе действия нефтезагрязнения Ханты-Мансийского автономного округа /Н.Н. Шипилин, Н.Н.Наплекова, Д.С.Жаннин, Е.А. Матенькова// Системно-экологическая оптимизация фитосанитарных технологий: сб. науч. тр., посвящ. 25 летию науч. шк. по защите растений.Новосибирск, 2009. С.5261. 
  5. Сапронов С.Ю. Действие бактерий-антагонистов из почвы разного нефтяного загрязнения на фитопатогенные грибы /С.Ю. Сапронов, Е.А. Матенькова // Материалы  XIV Междунар. студ. конф. «Экология России и сопредельных территорий» / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2009. С.187.
  6. Матенькова Е.А. Влияние нефтяного загрязнения на биологическую активность почвы /Е.А. Матенькова// Тр. Всерос. совета молодых ученых и специалистов аграр. образоват. и науч. учр./ Рос. акад. наук. М., 2009. Том 2. С.6770.
  7. Матенькова Е.А. Изменение аммонифицирующей и азотфиксирующей способности и фитотоксичности почвы при нефтяном загрязнении/Е.А.  Матенькова // Инновационный потенциал молодых ученых в развитии агропромышленного комплекса Сибири: материалы VII Межрегион. конф. молодых ученых и специалистов аграр. вузов Сиб. федерал. округа (3-5 июня 2009). – Новосибирск, 2009. С.6567.
  8. Матенькова Е.А. Изменение биологической активности почвы при нефтяном загрязнении /Е.А.Матенькова// Тяжелые металлы и радионуклиды в окружающей среде. Материалы VI Междунар. науч.-практ. конф. (4-7 февр. 2010).–Семей, 2010. Т.2 С.399-401.
  9. Матенькова Е.А. Адаптация микроорганизмов к нефтяному загрязнению/Е.А. Матенькова, Н.Н. Наплекова// Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: материалы V Межрегион. конф. молодых ученых (28 сент. - 1 окт.). Саратов, 2010. С.63.
  10. Югрина К.А. Влияние нефтяного загрязнения на всхожесть и размер проростков овощных культур /К.А. Югрина, Н.С.Белоусов, Е.А. Матенькова// Химия и жизнь: сб. тез. и докл. регион. науч.-практ. конф. / Новосиб. гос. аграр. ун-т. – Новосибирск, 2010. С.211-213.
  11. Драчева Ю.Ю. Физиологическая активность микроорганизмов, выделенных из дерновоподзолистой почвы с нефтяным загрязнением, в разных экологических условиях /Ю.Ю. Драчева, Е.А. Матенькова// Химия и жизнь: сб. тез. и докл. регион. науч.-практ. конф. / Новосиб. гос. аграр. ун-т. – Новосибирск, 2011. С.193-195.
  12. Сапронов С.Ю. Влияние нефтяного загрязнения на биологическую активность почвы и урожайность шестирядного ячменя «Робус» /С.Ю.Сапронов, Е.А. Матенькова// Химия и жизнь: сб. тез. и докл. регион. науч.-практ. конф. / Новосиб. гос. аграр. ун-т. – Новосибирск, 2012. С.236-239.

Подписано в печать

Тираж 100 экз. печ. л. 1,0. Заказ №

Отпечатано в ООО «Копи-Трейд»

г. Новосибирск, ул. Кошурникова 53/1

тел.: (383) 267-97-97, 256-13-43






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.