WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ГАРАЕВ

Тимур Мансурович

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ  ПРОТИВОВИРУСНЫХ  СВОЙСТВ

СОЕДИНЕНИЙ  ПЕПТИДНОЙ  ПРИРОДЫ

03.01.03 молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012 

Работа выполнена в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и синтеза пептидов и в лаборатории онтогенеза вирусов Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский  институт  вирусологии

им. Д.И. Ивановского»  Минздравсоцразвития  Российской  Федерации

Научные руководители:  доктор химических наук, профессор

  Шибнев Владимир Александрович

  доктор медицинских наук

  Бурцева Елена Ивановна

Официальные оппоненты:  доктор биологических наук, профессор

Галегов Георгий Артемьевич: 

доктор химических наук, профессор

Каплун Александр Петрович

Ведущая организация:  Федеральное государственное бюджетное учреждение

  науки Институт биоорганической химии им. академиков

  М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

  Российской академии наук

Защита диссертации состоится «02» апреля 2012 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 00.020.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации

по адресу: 123098, г. Москва ул. Гамалеи,16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения  «Научно-исследовательский институт  вирусологии

им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации.

Автореферат разослан « 1 » марта 2012г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Важнейшей задачей современной науки является борьба с вирусными инфекциями, которая развивается в двух направлениях. Первое – поиск и создание химических препаратов, способных эффективно взаимодействовать непосредственно с вирусной частицей и тем самым ингибировать процесс ее репликации. Второе – поиск и создание нетоксичных веществ как природных, так и синтетических, способных активировать иммунную защиту организма, в частности за счет индукции интерферона.

Одной из актуальных проблем современной медицины является проблема гриппа. Ее сложность связана со способностью этих вирусов к легкой изменчивости структуры в результате мутаций, рекомбинаций и ассортации, приводящих к изменению биологических свойств.

Несмотря на всемирные усилия по созданию средств химиотерапии и вакцин пандемия 2009/2010 года, вызванная вирусом гриппа A(H1N1)pdm2009, показала как их крайнюю ограниченность, так и недостаточную эффективность. На сегодня имеется лишь два типа противогриппозных соединений - это производные сиаловой кислоты, являющиеся ингибиторами нейраминидазы (осельтамивир и занамивир), и производные адамантана (ремантадин и амантадин), которые ингибируют функцию протонпроводящего канала М2. У всех этих препаратов есть один существенный недостаток: в результате химического прессинга  вирусные частицы, легко мутируя, приобретают устойчивость по отношению к ним. Так, к ранее достаточно эффективным препаратам адамантанового ряда у вирусов гриппа А в настоящее время выработалась практически 100%-ная резистентность.

Поэтому очень важна не только разработка новых антигрипппозных препаратов, но и изучение путей «реанимации» активности соединений, утративших свои противовирусные свойства. Объектом такого исследования является синтез новых производных адамантанового карбоцикла на основе ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот.

Вещества, способные стимулировать иммунную защиту организма, в частности индуцировать выработку интерферона, принадлежат к разным классам органических соединений, начиная от полифенола из масла хлопчатника (госсипол) и кончая пептидами из иммуноглобулинов (тафцин). Этих соединений довольно много, но лишь единицы из них рассматриваются как медикаментозные средства, что связано с их токсичностью.

Источниками нетоксичных иммуностимуляторов могут являться пептиды, содержащие  аналоги природных аминокислот, такие как аминофосфиновые кислоты, а  также пептидные фрагменты «шарнирной» области иммуноглобулинов класса G, которые легко выщепляются сериновыми протеазами. Такие синтетические пептиды будут представлять собой новый класс нетоксичных противовирусных соединений, подконтрольных иммунной системе организма.

Цели работы.

Исследование посвящено двум направлениям. Первое – преодоление резистентность вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2) в отношении соединений ремантадина и амантадина модификацией их аминокислотными, пептидными и другими остатками. Второе – поиск и синтез соединений пептидной природы, способных индуцировать иммунный ответ в организме.

  Задачи исследования

  1. Синтезировать аминокислотные, пептидные и другие производные ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот и исследовать их противовирусные свойства в отношении вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2).
  2. Синтезировать новый тип потенциальных индукторов интерферона, включающих в свою структуру -аминофосфиновые кислоты, и исследовать их активность в отношении вируса энцефаломиокардита мышей.
  3. В качестве потенциального противовирусного соединения синтезировать гептапептидный фрагмент из «шарнирной» области IgG человека, включающий остатки пролина и дисульфидную связь, и исследовать его противовирусные свойства в отношении вируса гриппа А.

Научная новизна работы.

  1. Впервые осуществлен синтез производных адамантана (ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот) с аминокислотными, пептидными и некоторыми другими остатками. Показано, что среди них есть ряд нетоксичных соединений, обладающих высокой противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А(H1N1)pdm2009 и A(H3N2), резистентных к действию амантадина и ремантадина.
  2. Осуществлен синтез дипептидов, включающих нетоксичные -аминофосфиновые кислоты. Впервые показано, что дипептиды, содержащие фосфоаланин, обладают способностью индуцировать интерферон.
  3. По специально разработанной схеме синтеза был получен гептапептидный фрагмент из «шарнирной» области IgG человека, включающий дисульфидную связь, который обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm2009.
  4. На основе испытания синтезированных амидов трипептидов, включающих остатки иминокислот и глицина, показано, что противовирусный эффект амида H–Gly-Pro-Gly-OH в отношении ВИЧ-1 может реализоваться только в животной сыворотке, а не в сыворотке человека.

Практическая значимость работы.

  1. Среди синтезированных производных адамантана обнаружены нетоксичные соединения с высоким уровнем противовирусной активности в отношении вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2), что указывает на практическую перспективность использования этих соединений для расширения ассортимента медикаментозных противогриппозных средств. Показано, что введение дополнительных функциональных групп в молекулу препарата, утратившего противовирусные свойства, является одним из путей преодоления резистентности вирусной инфекции к этому препарату.
  2. Синтезированные оригинальные пептиды, включающие остатки -аминофосфиновых кислот, обладают иммуностимулирующими свойствами.
  3. «Шарнирная» область иммуноглобулинов может быть источником иммуноактивных пептидов, которые представляют особую ценность в качестве нетоксичных противовирусных средств.
  4. На примере N-ацилтрипептидов, включающих -иминокислоты, исследованы и найдены оптимальные условия процесса амидирования пептидов при наличии в них лабильных пептидных связей.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Синтезированные новые производные адамантанового карбоцикла способны подавлять репликацию вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2), резистентных к действию ремантадина. Противовирусный эффект достигается введением в молекулы ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот новых функциональных групп за счет аминокислотных, пептидных и других остатков.
  2. Синтезированные фосфодипептиды, содержащие фосфиновый аналог аланина, способны индуцировать интерферон в высоком титре.
  3. Разработанная оптимальная стратегия синтеза позволила получить гептапептид «шарнирной» области IgG человека, с хорошим выходом конечного продукта. Показано, что этот пептид обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm2009.
  4. Найдено, что оптимальным способом амидирования эфиров трипептидов, содержащих лабильные пептидные связи между остатками глицина и иминокислот, является их взаимодействие с сухим аммиаком в условиях реакции смешанных ангидридов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и опубликованы в материалах V Российского Симпозиума «Белки и пептиды» (г. Петрозаводск, 2011) и на Международной научно-практической конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств новых биологически активных соединений» (г. Душанбе, Таджикский национальный университет, 2011). Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 28 сентября 2009 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 6 сообщений, из них в ведущих лицензированных научных журналах и изданиях, определенных Высшей аттестационной комиссией – 4. Опубликованы тезисы докладов на одной российской и одной международной конференциях. Зарегистрирована патентная заявка  в ФСИС № 2011115151 от 19.04.2011г.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения экспериментального материала, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 120 источников. Работа иллюстрирована 13 рисунками и содержит 29 схем и 40 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез соединений. Соединения были получены методами классического пептидного синтеза с использованием реакций смешанных ангидридов и активированных эфиров. При синтезе пептидов и пептидных производных использовались L-аминокислоты фирмы Nova Biochem (США). Для синтеза адамантановых производных использовался рацемический ремантадин гидрохлорид фирмы Zhejiang Kangyu Pharmaceutical Co (Китай). Все полученные соединения были идентифицированы с помощью ТСХ на пластинах Silufol (Чехия) и Dc-Kieselgel 60 (Merck, Германия), а также посредством масс-спектрометрии на MALDI-TOF-времяпролетном масс-спектрометре Bruker UltraFlex II с программным обеспечением для сбора  и обработки масс-спектров flexControl 1.1. и flexAnalys2.2. Удельное оптическое вращение полученных соединений определяли на автоматическом поляриметре А1-ЕПЛ (СССР) (1%-ный раствор в этиловом спирте, длина кюветы 0,5 дм). Температуру плавления полученных соединений измеряли на приборе «Boetius» VEB Analytik (ГДР). Данные ВЭЖХ для синтетических пептидных фрагментов IgG были получены на жидкостном хроматографе «Agilent1100»(США) с масс-спектрометрическим детектором «Agilent 1100VL».

Клетки. В работе были использованы клеточные культуры MDCK, VERO и суспензионная культура клеток MT-4.

Вирусы. Были использованы штаммы вируса гриппа А: пандемический A/IIV-Moscow/01/(H1N1)pdm2009, подобный эталонному варианту А/California/7/2009 (H1N1)swl,  и А/Москва/26/2009 (H3N2), резистентные к ремантадину; вирус простого герпеса (ВПГ) типа 1, штамм Л2;  вирус ВИЧ-1 BRU и вирус энцефаломиокардита мышей

(ЕМС), штамм Индиана.

Процент ингибирования вирусной репродукции синтезированными соединениями определяли in vitro методом ИФА по стандартной методике. Токсичность соединений определяли также  in vitro на клеточной культуре колориметрическим методом, сравнивая оптическую плотность контрольной и исследуемой лунки.

1. Аминокислотные производные адамантанового ряда и их противовирусная активность в отношении вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2).

1.1 Производные аминоадамантанов.

Изучение методом кристаллографии вирусного белка М2 гриппа А объяснило механизм противовирусного действия аминоадамантановых препаратов, которые за счет взаимодействия их аминогруппы с гидроксилом серина в положении 31 трансмембранной области белка М2 перекрывали канал, образованный этим белком,  и тем нарушали нормальный ток протонов, необходимый для репродукции вируса. В результате мутации вируса  остаток  серина в положении 31 был заменен остатком аспарагина, из-за чего стало невозможным образование связи аминоадамантанов с этим участком белка М2.

Для преодоления резистентности вирусов гриппа к препаратам адамантанового ряда следовало снабдить молекулу дополнительными функциональными группами, которые могли бы взаимодействовать с другими аминокислотными остатками белка М2 , нарушая работу канала. Одним из источников таких групп являются нетоксичные аминокислотные, пептидные и другие остатки. Они являются естественными элементами для организма и способны образовывать любые межмолекулярные связи за исключением ковалентных, а также влиять на гидрофильно-гидрофобные взаимодействия молекул.

Для присоединения таких остатков использовали метод смешанных ангидридов, в условиях которого свободная аминогруппа аминоадамантана и карбоксильная группа аминокислоты образовывали амидную связь.  Аминогруппу  аминокислоты или

пептида предварительно защищали трет-бутилоксикарбонильной (Boc-) или бензилоксикарбонильной (Z-) группами, которые впоследствии отщеплялись соответствующими методами (Схема 1).

Схема 1. Синтез аминоадамантановых производных Boc-аминокислот методом смешанных ангидридов. NMM – N-метилморфолин, ИБХФ – изобутилхлорформиат, R боковая группа аминокислоты

Испытание противовирусных свойств производных адамантана проводили совместно с Лабораторией эпидемиологии и этиологии гриппа.

По схеме 1 был получен ряд аминокислотных производных (Табл.1), которые позволили выяснить влияние на противовирусную активность удаленности аминогруппы аминокислотного остатка от адамантанового карбоцикла, основности и гидрофобности  вводимого аминокислотного остатка. Так, не проявили противовирусной активности  производные с остатками алифатических аминокислот, таких как глицин, β-аланин, γ-аминомасляная кислота (GABA) и  даже саркозин (Sar), основность которого за счет аминометильной группы довольно высока  (pKa 10,01). Однако в случае производных с -аминомасляной кислотой (табл.1, соед.14) и саркозином (табл.1, соед.16), у которых аминогруппа защищена Boc-группой, противовирусная активность в отношении вирусов гриппа  A(H1N1)pdm2009  и  A(H3N2)  составляла 50 и 70% соответственно, что может указывать на особую роль увеличения гидрофобности молекулы.

 

Таблица 1.  Ингибирование репродукции вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2) производными адамантана с остатками аминокислот и пептидов.

  №

соед.

Соединение

% ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток MDCK при

концентрации соединений 5 мкг/мл

A(H1N1)pdm2009

A(H3N2)

1

H-Gly-Rem

18

2

2

Boc-Gly-Rem

0

-

3

H-Ala-Rem

0

-

4

Boc-Ala-Rem

13

-

5

H-β-Ala-Rem

20

-

6

Boc-β-Ala-Rem

0

-

7

H-Val-Rem

28

-

8

Boc-Val-Rem

12

-

9

H-Leu-Rem

31

0

10

Boc-Leu-Rem

27

-

11

H-Ile-Rem

22

-

12

Boc-Ile-Rem

29

-

13

H-GABA-Rem

0

-

14

Boc-GABA-Rem

48

52

15

H-Sar-Rem

0

0

16

Boc-Sar-Rem

71

64

17

H-Gly2-Rem

0

-

18

Boc-Gly2-Rem

0

-

19

H-Gly3-Rem

0

-

20

H-Pro-Rem

11

13

21

Boc-Pro-Rem

7

-

22

H-Pro2-Rem

0

22

23

Boc-Pro2-Rem

9

-

24

H-Pro3-Rem

9

12

25

Boc-Pro3-Rem

0

-

26

H-Asn-Rem

25

-

27

Boc-Asn-Rem

18

-

28

H-Gln-Rem

0

-

29

H-Asp-Rem

4

-


30

Boc-Asp-Rem

37

-


31

H-Glu-Rem

0

-


32

Boc-Glu(ОBzl)-Rem

0

-

Дальнейшее отдаление аминогруппы от карбоцикла за счет пептидных остатков ди- и триглицина (табл.1, соед. 17-19) не привело к появлению противовирусной активности в отношении вирусов гриппа А. То же наблюдалось и в случае ди- и трипролиновых остатков, имеющих специфическую конформацию (табл.1, соед. 20-25)

Не обнаруживается активность и при использовании отдаленных амидных групп на примере аминокислотных остатков аспарагина и глютамина (табл.1, соед.26 и 27).

В случае присоединения к ремантадину остатков дикарбоновых кислот (аспарагиновой с pKa 3,86 и глютаминовой с pKa 4,25) восстановления противовирусной активности также не наблюдали ни при наличии свободных боковых карбоксильных групп (табл.1, соед. 29-31), ни в виде их бензиловых эфиров (соед.32). Лишь в случае соединения 30 активность составляла 37%.

Возможно, что отсутствие активности у производных ремантадина с алифатическими аминокислотными остатками могло быть следствием недостаточной основности молекулы. Поэтому были получены производные ремантадина с основными аминокислотами, содержащими дополнительную аминогруппу, такими как лизин, орнитин, цитруллин и аргинин. Но и соединения лизина  с ремантадином (табл. 2, соед.1 и 2) как с открытыми аминогруппами, так и с блокированными оказались малоактивными (15-20%). Однако когда лизиновый остаток удален от карбоцикла на длину глицинового остатка, противовирусная активность возрастает до 34% (табл.2,  соед.3).

Таблица 2. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А производными ремантадина с остатками лизина.

соед.

Соединение

% ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток MDCK при

концентрации соединений 5 мкг/мл

A(H1N1)pdm2009

A(H3N2)

1

H-Lys-Rem

15

11

2

Boc-Lys(Boc)-Rem

23

-

3

H-Lys-Gly-Rem

34

-

4

Boc-Lys(Boc)-Gly-Rem

0

-

5

H-Lys-Gly2-Rem

0

-

6

Boc-Lys(Boc)-Gly2-Rem

6

-

7

H-Lys-Gly3-Rem

0

-

8

Boc-Lys(Boc)-Gly3-Rem

0

-

9

Boc-Lys(Boc)-Lys(Z)-Rem

68

30

Дальнейшее отдаление аминогрупп лизина за счет аминокислотных остатков глицина (ди- и триглицина) не приводило к увеличению противовирусной активности соединений 5-8 (табл.2).

Синтезированное производное ремантадина, включающее дипептид лизил-лизин, в котором обе аминогруппы первого аминокислотного остатка закрыты Boc-группами, а ε-аминогруппа второго остатка Z-группой (соед.9, табл.1), проявляет ингибирующую активность в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm2009 (68%), а для штамма А(H3N2) активность лишь 30%. Размеры усредненного внутреннего диаметра поры канала М2 около 11 ангстрем, и объемное соединение 9, возможно, не способно проникнуть внутрь канала, но может взаимодействовать с его наружной частью.

Аналогом лизина может считаться аминокислота орнитин (Orn), в котором боковая группа короче на одно метиленовое звено. Этого оказалось достаточно, чтобы орнитин-адамантановое соединение с блокированными аминогруппами (табл.3, соед. 2) уже проявляло противовирусную активность на уровне 70%.

Можно полагать, что в процессе ингибирования вирусов гриппа А(H1N1)pdm2009 и A(H3N2) существенную роль играет увеличение гидрофобности за счет  Boc-группы.

Таблица 3. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А производными адамантана с основными аминокислотами

  №

соед.

Соединение

% ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток MDCK при

концентрации соединений 5 мкг/мл

A(H1N1)pdm2009

A(H3N2)

1

H-Orn-Rem

0

6

2

Boc-Orn(Boc)-Rem

71

66

3

H-Cit-Rem

36

0

4

Boc-Cit(Boc)-Rem

53

25

В этом ряду рассматривается влияние на противовирусную активность и такого аминокислотного остатка, как цитруллин (Cit). Активность соединения 4 (табл.3)  составляет 53%, что меньше активности Boc-Sar-Rem (71%) и Boc-Orn(Boc)-Rem (71%).

Следующие аминокислотные остатки, которые могли повлиять на появление противовирусных свойств, – это аргинин и креатин (Cre), содержащие гуанидиновую группу (табл.4). Гуанидиновая группа благодаря делокализации заряда при протонировании проявляет сильноосновные свойства (pKa 12,48) и способна к образованию устойчивых водородных связей. Были синтезированы производные ремантадина с остатками аргинина и нитро-аргинина (табл.4, соед. 1-4). Однако гуанидиновая группа в соединении с карбоциклом оказалась неспособной влиять на транспорт протонов в канале белка М2 ни в свободном, ни в блокированном виде.

Таблица 4. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А производными адамантана, содержащими гуанидиновую группу.

соед.

Соединение

% ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток MDCK при

концентрации соединений 5 мкг/мл

A(H1N1)pdm2009

A(H3N2)

1

H-Arg-Rem

25

-

2

Z-Arg(Z2)-Rem

0

-

3

Boc-Arg(NO2)-Rem

0

-

4

Boc-Arg-Rem

0

-

5

H-Cre-Rem

35

43

6

Boc- Cre -Rem

38

47

И только в случае производного с остатком креатина  противовирусная активность проявлялась в отношении обоих штаммов как для соединения со свободной аминогруппой (35 и  43%), так и с Boc- защищенной (38 и 47%) (табл. 2, соед.5-6).

 

Возможно, отсутствие активности в случае аргининового остатка и наличие ее у креатинового производного связано со структурной особенностью молекулы последнего. Она менее громоздка по сравнению с объемной молекулой производных аргинина, что позволяет ей взаимодействовать с белками канала М2 вируса гриппа А.

Особый интерес представляло присоединение к ремантадину остатка гистидина, имеющего имидазольную группу с подвижным атомом водорода (pKa  6). Она вносит в молекулу существенные изменения, в результате чего активность соединения H-His-Rem уже составила более 90% (табл.5, соед.1) в отношении обоих штаммов вируса гриппа А. В работе протонного насоса белка М2 вируса гриппа остатки гистидина в трансмембранной области белка М2 участвуют в регуляции потока протонов, поэтому присутствие дополнительного остатка гистидина в поре канала может нарушать нормальный ток протонов ввиду возникающей конкурентной реакции протонирования имидозольного кольца.

Таблица 5. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А производными адамантана с остатками гистидина и тирозина.

соед.

Соединение

% ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток MDCK при

концентрации соединений 5 мкг/мл

A(H1N1)pdm2009

A(H3N2)

1

H-His-Rem

91

94

2

Boc-His-Rem

33

37

3

H-His-AmAd*1

23

26

4

Boc-His-AmAd

29

31

5

H-Tyr(Bzl)-Rem

90

95

6

Boc-Tyr(Bzl)-Rem

5

-

Возможно, что имидазольная группа является той структурой,  которая позволяет соединению 1 (табл.5) осуществлять донорно-акцепторные взаимодействия с функциональными группами белка М2. Поэтому в случае блокировки -аминогруппы остатка гистидина обнаруживается снижение активности соединения  (менее  37%) в отношении обоих штаммов.

Гистидил-1-аминоадамантан (табл.5, соед.3 и 4), у которого в сравнении с гистидил-ремантадином отсутствует метиленовое звено при адамантановом карбоцикле, был не способен в достаточной мере ингибировать репродукцию вируса гриппа (29-31%). Возможно, что снижение активности связано с утратой молекулярной подвижности между аминокислотным остатком и адамантановым карбоциклом.

 

В ряду производных ремантадина с остатками фенилаланина и тирозина противовирусная активность не проявлялась. Однако была отмечена значительная роль тирозинового остатка, в котором гидроксил был защищен бензильной группой (соед.6, табл.3). Это соединение не проявляло активности в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm2009. Напротив, соединение 5 (табл.5) со свободной -аминогруппой было очень эффективным в отношении обоих штаммов (90-95% при 5 мкг/мл). Однако начиная уже с 20 мкг/мл, жизнеспособность клеток нарушалась.

В синтезе производных ремантадина также были использованы серосодержащие аминокислоты, такие как метионин, цистеин, таурин (Таu), а также липоевая кислота (тиоктовая, TOA) (табл.6). Соединения метионина с ремантадином (соед 1, 2, табл.6) не проявляли активности ни с открытой аминогруппой, ни с блокированной. То же самое наблюдается и для производного цистеина с открытой тиольной и -аминогруппой (соед. 4). Однако когда тиольная группа цистеина была блокирована ацетамидометильной (Аcm) группой, а -аминогруппа была свободной (соед. 3), то такое соединение уже проявляло противовирусную активность в отношении обоих штаммов порядка 50%.

Таблица 6. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А производными аминоадамантана с серосодержащими аминокислотами.

соед.

Соединение

% ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток MDCK

при концентрации соединений 5 мкг/мл

A(H1N1)pdm2009

A(H3N2)

1

H-Met-Rem

8

15

2

Boc-Met-Rem

10

-

3

H-Cys(Асm)-Rem

45

51

4

H-Cys-Rem

0

-

5

TOA-Rem

78

88

6

H-Tau- Rem

76

71

7

Boc-Tau- Rem

30

41

В случае производного ремантадина с остатком  липоевой кислоты (табл.6, соед.5),  в молекуле которой имеется длинная углеводородная цепочка с циклической дисульфидной группой, способной при определенных условиях размыкаться с образованием дисульфидной связи, возникает значительный противовирусный эффект (78 и 88%) в отношении обоих штаммов вируса гриппа А.

Интересно проявление противовирусных свойств у производного ремантадина с остатком таурина со свободной аминогруппой (табл.6, соед. 6), которое  подавляло развитие вирусов обоих штаммов более чем  на 70%, в то  время как  то же производное с N-защищенным таурином  (табл.6, соед.7) было менее активно (30-41%).

1.2 Производные адамантанкарбоновых кислот.

В качестве перспективных противовирусных соединений представляли интерес адамантанкарбоновые кислоты, которые тоже могли использоваться для получения аминокислотных производных.

При получении производных адамантанкарбоновых кислот амидная связь образовывалась уже за счет взаимодействия карбоксильной группы адамантанкарбоновых кислот и аминогруппы аминокислот или диаминов в условиях метода смешанных ангидридов аналогично схеме 1. При этом карбоксильная функция аминокислоты защищалась сложноэфирной группой. В синтезе использовали 1-адамантанкарбоновую и 1,3-адамантандикарбоновую кислоты.

Полученные производные адамантанкарбоновых кислот включали остатки глицина, серина,  лизина, пролина, глютаминовой кислоты, 1,2-диаминоэтана, 1,6-диаминогексана. 

При этом в случае производных с остатками  глицина, пролина и глютаминовой кислоты противовирусная активность не обнаруживалась.

Представляли интерес лизиновые производные 1-адамантанкарбоновой кислоты (Ad). При этом были получены производные как по -, так и по -аминогруппам лизина (схема 2).

Соединения, полученные по схеме 2, содержали адамантановый карбоцикл на  разном расстоянии от -карбоксильной группы лизина. Это свойство принципиально отличало две пары соединений, представленных в таблице 7.

Таблица 7. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А адамантил-лизиновых производных

  №

соед.

Соединение

% ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток MDCK при

концентрации соединений 5 мкг/мл

A(H1N1)pdm2009

A(H3N2)

1

Ad-Lys-OCH3

6

-

2

H-Lys(Ad)-OH

54

25

3

Ad-Lys-OH

14

-

4

H-Lys(Ad)-OCH3

47

25

Схема 2. Синтез адамантил-производных лизина методом смешанных ангидридов.

       

Из данных таблицы 7 следует, что соединения 1 и 3, в которых адамантанкарбоновая кислота связана с -аминогруппой лизина, практически неактивны. В то же время отдаление адамантанового остова от -карбоксильной группы лизина (табл.7, соед. 2 и 4) приводит к появлению активности порядка 50%. При этом активность в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm2009 заметно выше, чем в отношении A(H3N2).

Необычной модификацией функциональных групп производных адамантана была замена карбоксильной группы аминокислоты на фосфиновую группировку в составе аминокислоты. Методом  активированных  эфиров  было  получено соединение

1-адамантановой кислоты с фосфо-аланином (NH2-CH(CH3)-P(O)(OH)H). Однако противовирусная активность соединения Ad-AlaPH  была всего 27-39%.

Исходя из описанных выше результатов, можно предположить, что увеличение числа функциональных групп в адамантановой конструкции повышает возможности соединения для взаимодействия с белками вируса гриппа А. В таблице 8 представлены производные 1,3-адамантандикарбоновой кислоты (соед. 1 и 2)  и 1,3-адаманатандиуксусной кислоты (соед.3) с остатком серина и метиловым эфиром серина.

Таблица 8. Ингибирование репродукции вирусов гриппа А производными 1,3-адамантанкарбоновых кислот с остатком серина.

 

  №

соед.

Соединение

% ингибирования вирусной репродукции в культуре клеток MDCK при

концентрации соединений 5 мкг/мл

A(H1N1)pdm2009

A(H3N2)

1

Ad-(Ser-OMe)2

3

30

2

Ad-(Ser-OH)2

0

-

3

Ad-(CH2-Ser-OMe)2

90

98

Соединение 3 отличается от соединения 1 наличием метиленового звена при карбоцикле. Из данных таблицы 8 видно, что соединение 3 оказалось одним из наиболее активных (90-98%) среди аминокислотных производных адамантановых кислот. При этом оно абсолютно нетоксично для клеточной культуры MDCK, даже при достижении концентрации 80 мкг/мл клетки продолжали нормальное существование, а ингибирование успешно происходило уже при  концентрации 5мкг/мл. Напротив, соединение 1 не проявляло противовирусной активности в отношении вирусов гриппа А. Возможно, карбоксильные группы ввиду малой подвижности связи с карбоциклом в отсутствии метиленового звена не способны удерживать молекулярную конструкцию вблизи канала М2. С другой стороны, дополнительные CH2-группы в положении 1 и 3 адамантанового остова не только увеличивают подвижность остатков серина, но и геометрически удлиняют молекулу. Вероятно, это позволяет «перекрыть» канал белка М2.

       Если соединение 1 (табл. 8) в виде диметилового эфира проявляло противовирусную активность  в отношении вируса гриппа A(H3N2) порядка 30%, то полученное после омыления сложноэфирных групп соединение 2 (табл.8) полностью ее утратило.

Исследования противовирусной активности синтезированных аминокислотных и пептидных производных адамантанового ряда подтвердили, что в ряде полученных соединений введение функциональных групп приводит к значительному подавлению репликации вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2), резистентных к действию ремантадина.

В таблице 9 представлены соединения, способные с разной степенью эффективности ингибировать вирусы A(H1N1)pdm2009 и А(H2N3), и результаты цитопатического действия этих соединений на культуру клеток MDCK. Изучение противовирусной активности проводили при нагрузке препарата 5 мкг/мл. Представленный в таблице процент ингибирования соединений является средним арифметическим из  опытов в аналогичных условиях. 

Проведенные исследования зависимости противовирусной активности от структуры синтезированных соединений позволяют лишь в общих чертах дать этому оценку. Создается впечатление, что уровень противовирусной активности во многом зависит от гидрофобности молекулы (табл.9). С другой стороны, наличие имидазольной группы увеличивает противовирусную активность почти до 100% (соед. XI, табл.9), но стоит заблокировать аминогруппу этого же соединения Вос-группой (соед.2, табл.5), как его противовирусная активность снижается до 33-37%. Подобное наблюдается в случае очень гидрофобного адамантантирозинового соединения со свободной аминогруппой (соед.XV, табл.9), когда противовирусная активность достигает 90-95%, а при закрытой аминогруппе (соед.6, табл.5) полностью исчезает. Такое поведение может указывать на разный механизм взаимодействия этих соединений с аминокислотными остатками белка М2 протонпроводящего канала.

Полученные результаты позволяют считать, что адамантановый цикл в качестве мембранотропного носителя способен транспортировать  функционально активные группы  к белку М2 вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2). А такие соединения как (Boc)2-Orn-Rem (I), Boc-Sar-Rem (II), TOA-Rem (VII), H-His-Rem (XI), Ad-(CH2-Ser-OMe)2 (XIII), H-Tau-Rem (XIV) могут представлять практический интерес в качестве перспективных противовирусных средств.

Таблица 9. Ингибирование вирусной репродукции производными адамантана (5 мкг/мл) и их токсическое действие на монослой клеток MDCK

  №

соед.

Соединение

Активность, %

МПК (мкг/мл)

ХТИ

A(H1N1)pdm2009

A(H3N2)

I

Boc-Orn(Boc)-Rem

71,06

66

40

8

II

Boc-Sar-Rem

70,8

64

40

8

III

H-Cit-Rem

36

н/э

40

8

IV

Boc-Cit(Boc)-Rem

53

25

>80

>16

V

Boc-Lys(Boc) - Lys(Z)- Rem

69

30

>80

>16

VI

Boc-GABA-Rem

48

52

40

8

VII

TOA-Rem

78

89

80

16

VIII

H-Lys(Ad)-OH

54

25

>80

>16

IX

H-Lys(Ad)-OMe

47

25

>80

>16

X

Ad -HDA

74

63

>80

>16

XI

H-His-Rem

91

94

40

8

XII

H-Cys(Асm)-Rem

45

51

60

12

XIII

Ad-(CH2-Ser-OMe)2

98

90

>80

>16

XIV

H-Tau- Rem

76

72

>80

>16

XV

H-Tyr(Bzl)-Rem

90

95

20

4

Remantadine

н/э

н/э

40

8

HDA- остаток 1,6-гександиамина,  МПК – максимальная переносимая концентрация, ХТИ – химико-терапевтический индекс

2. Синтез и исследование противовирусных и иммуностимулирующих свойств дипептидов, включающих -аминофосфиновые кислоты.

       

В настоящее время известно большое количество природных и неприродных  соединений, способных активировать иммунную систему. Среди них наибольший интерес представляют пептиды, способные индуцировать интерферон. Это особенно присуще тем пептидам, в структуре которых присутствуют остатки неприродных аминокислот, к числу которых относятся α-аминофосфиновые кислоты. Особенность этих кислот состоит в том, что фосфиновая группа при определенных условиях способна превращаться в  фосфоновую, которая отличается как геометрией молекулы, так и кислотностью. Однако до настоящего времени не было исследования их свойств в качестве элементов воздействия на иммунную систему ни в роли противовирусных средств, ни в качестве индукторов интерферона. Попадая в систему сложных биохимических процессов, пептиды, включающие эти фосфоаминокислоты, должны оказывать влияние на функционирование иммунной системы.

Синтез пептидов, включающих остаток фосфоаланина, осуществлялся методом активированных эфиров, исходя из Boc-аминокислот и фосфоаланина в водно-диоксановой среде с последующим отщеплением защитной Boc-группы HCl в этилацетате по схеме 3.

Схема 3.  Синтез дипептидов, включающих остаток AlaPH фосфинового аналога аланина на примере получения H-Lys-AlaPH.

По этой схеме были синтезированы фосфо-дипептиды H-Lys-AlaPH и H-Pro-AlaPH. Реакция образования пептида проходила с выходом около 70-75%. Очистку проводили хроматографией на силикагеле в системе метанол-хлороформ(13:60).

2.1 Интерферониндуцирующая активность фосфопептидов.

Полученные фосфодипептиды исследовались на способность индуцировать интерферон в милимолярных концентрациях. Изучение иммуномодулирующих свойств проводили совместно с Лабораторией онтогенеза вирусов. Исследование проводили in vitro через 5, 24 и 48 часов после индукции лимфоцитов периферической крови. Оба дипептида (H-Lys-AlaPH и H-Pro-AlaPH) обладали способностью индуцировать интерферон.

Исследование индукции интерферона in vivo проводили на белых лабораторных мышах. Для этой цели мышам внутрибрюшинно вводили дипептид H-Pro-AlaPН однократно в дозах 0,5; 1,0 мг/кг массы. Титр интерферона определяли в сыворотке крови через 5, 24 и 48 часов после введения дипептида. В качестве референс-индуктора применяли ридостин.  Дипептид H-Pro-AlaPH индуцировал синтез позднего интерферона при обеих примененных дозах  (320 и 160 ед/мл) (табл. 10).

Таблица 10. Индукция интерферона у мышей дипептидом H-Pro-AlaPН

Концентрация дипептида, мг/кг

Титр интерферона, ед/мл

5 ч.

24 ч.

48 ч.

0,5

< 10

< 10

320

1,0

< 10

< 10

160

Ридостин, 5,0

320

640

320

Из  таблицы 10 видно, что пептиды, включающие -аминофосфиновые кислоты, были способны к индукции позднего интерферона на уровне референс-индуктора ридостина.

2.2 Противовирусная активность фосфодипептидов

Изучение противовирусных свойств  проводили in vivo при смертельной экспериментальной инфекции мышей, вызванной вирусом энцефаломиокардита мышей (ЕМС), а также in vitro на штамме ВИЧ-1 BRU, предоставленном профессором Л.Монтанье (Ин-т Пастера, Франция) на культуре клеток MT4.

Для  исследования in vivo были использованы пептиды, способные индуцировать выработку интерферона: H-Lys-AlaPH и H-Pro-AlaPH.

Исследуемые соединения вводили мышам внутрибрюшинно однократно в дозах 0,5; 1 и 10 мкг/кг за 24 часа до заражения. Полученные данные представлены в таблице 11.

Таблица 11. Защитный эффект фосфопептидов при инфекции мышей, вызванной вирусом энцефаломиокардита мышей

Концентрация, мкг/кг

H-Pro-AlaPH

H-Lys-AlaPH

Выжившие, %

Защита, %

р

Выжившие, %

Защита, %

р

0,5

19,1

18,1

<0,5

10,0

5,0

>0,5

1,0

37,5

27,1

<0,05

40,0

35,0

<0,05

10,0

25,0

15,0

<0,05

20,0

15,0

<0,5

Ридостин, 5,0

54,1

44,1

<0,05

37,2

32,2

<0,05

Примечание: Вирус ЕМС вводили интеркраниально через 24 часа после введения дипептидов, p – погрешность измерений.

H-Pro-AlaPH, введенный в дозах 0,5; 1 и 10 мг/кг, достоверно защищает мышей от экспериментального вирусного энцефалита (18,1%, 27,1% и 15,0 % соответственно).  Защитный эффект H-Lys-AlaPH  наблюдали при дозах от 1 мг/кг и выше ( 35% и 15%).

Совместно с Лабораторией вирусов иммунодефицита человека проводили испытания in vitro на модели экспериментальной инфекции на перевиваемой лимфобластоидной линии клеток  человека МТ4 вирусом иммунодефицита (штамм ВИЧ-1 BRU). В качестве препарата сравнения использовали азидотимидин (AZT).

Соединения не проявляли токсического эффекта до 750 гамм, при концентрации 1000-1500 гамм клетки испытывали цитотоксический эффект. Наиболее остро токсический эффект проявился для фосфодипептида H-Lys-AlaPH. Ингибирования вируса ВИЧ-1 в данном случае достичь не удалось. По прошествии 48 часов клетки погибли. Наблюдалось слияние клеточных мембран - синцитиев.

3. «Шарнирная» область иммуноглобулинов как потенциальный источник противовирусных пептидов.

В процессе иммунного ответа иммуноглобулины под воздействием сериновых протеиназ  способны продуцировать пептиды, активирующие иммунный ответ организма. Их источником могут являться как Fab-, так и Fc – фрагменты антитела. В этом отношении мало изучена так называемая «шарнирная» область антитела, представляющая собою  последовательность, включающую в зависимости от типа антитела от 15 до 64 аминокислотных остатков. Структурная особенность «шарнирной» области характеризуется как высоким содержанием остатков пролина, так и наличием остатков цистеина, которые образуют S–S связи, выполняющие задачу стяжки между двумя параллельными полипептидными цепями этого фрагмента антитела.

Ранее было показано, что гексапептидный фрагмент «шарнирной» области IgG кролика H-Cys-Pro-Pro-Pro-Glu-Leu-OH способен индуцировать в высоком титре лейкоцитарный интерферон на уровне токсина золотистого стафилококка. В связи с этим было важно выяснить, способны ли подобные пептидные фрагменты, также содержащие в своей структуре -S-S- фрагмент, проявлять противовирусные свойства в культурах клеток на примере ингибирования вирусов гриппа А, а также определить уровень токсичности подобных веществ в отношении ряда клеток.  С этой целью была разработана оптимальная схема синтеза  подобного соединения H-Cys(StBu)-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu- Phe-OH (схема 5). Как следует из схемы, синтез осуществляется конденсацией отдельных фрагментов ди- и трипептидов.

Схема 5. Cхема синтеза гептапептида HClH-Cys(StBu)-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Phe-OEt.

С.А. - метод смешанных ангидридов

При синтезе пептидов классическим методом необходимо защищать карбоксильную группу образованием сложного эфира или амида. Однако в финальной стадии синтеза, когда приходится с пептида удалять защитные группы, возникает определенная сложность. Сложноэфирная группа либо отщепляется щелочным гидролизом, либо превращается в амидную группу. Оба эти процесса в зависимости от длины пептида в разной степени сопровождаются протеканием побочных реакций. Вариант синтеза пептида, исходя из амида С-концевой аминокислоты во многом определяется свойствами этой аминокислоты, поскольку лимитирующим моментом становится растворимость соединения.

Первоначально рассматривался «амидный» вариант синтеза этого гептапептида, однако уже дипептид H-Leu-Phe-NH2 был нерастворим в условиях реакции смешанных ангидридов.

Для исследования процесса амидирования эфиров более длинных N-ацилпептидов, включающих остатки иминокислот, которые образуют наиболее чувствительные к гидролизу и аммонолизу пептидные связи, были выбраны трипептиды, содержащие иминокислоты (пролин и оксипролин). Наличие иминокислот позволило с помощью ТСХ и изатинового реагента идентифицировать возможную деградацию пептидных связей.

Было исследовано три способа амидирования N-ацилпептидов и их эфиров.

  1. Аммонолиз эфиров N-ацилтрипептидов в абсолютном спирте, насыщенном сухим аммиаком, в ампуле. Выход амида составлял около 50%.
  2. Амидирование полученных каталитическим гидрированием эфиров трипептидов в ампуле в растворе хлороформа, насыщенного сухим аммиаком, при 20С в течение двух суток. Процесс не доходил до конца и выход не превышал 35%.
  3. Использование метода смешанных ангидридов в случае ацилтрипептидов со свободной карбоксильной группой. Активированная карбоксильная группа трипептида при температуре -25С взаимодействовала с сухим аммиаком (двукратный избыток) в хлороформе. Выход амида ацилтрипептида достигал 60-70%.

Последний способ амидирования был успешно использован для получения серии амидов аминокислот и пептидов (табл.12):

Таблица 12. Синтезированные амиды пептидов и аминокислот

соед.

Соединение

соед.

Соединение

1

H – Gly – Pro – Gly – NH2

7

H – Hyp – Pro – Gly – NH2

2

H – Gly – Hyp – Gly – NH2

8

H – Gly – Pro – -Ala – NH2

3

H – Pro Pro – Gly – NH2

9

H – Pro – Gly – NH2

4

H – Pro Hyp – Gly – NH2

10

H – Hyp – Gly – NH2

5

H – Lys – Pro – Gly – NH2

11

H – Gly – NH2

6

H – Lys Hyp – Gly – NH2

12

H - β-Ala-NH2

Этот же метод амидирования использовали для получения Z-Glu(OtBu)-Leu-Phe-NH2. Однако после снятия N-защитной группы растворимость H-Glu(OtBu)-Leu-Phe-NH2 была недостаточна для обеспечения необходимого выход пентапептида  Z-Ala-Pro-Glu(OtBu)-Leu-Phe-NH2. Поэтому синтез проводили, исходя из эфира фенилаланина Н-Phe-OEt. В качестве N-защитных групп использовали Z- или Boc-группу, которые отщеплялись каталитическим гидрированием над палладием и 4н HCl в этилацетате соответственно. Эфиры N-ацилди-  и трипептиов в процессе синтеза омыляли 0,05н NaOH (ацетон-вода, 1:1).

На последней стадии N-концевую Boc-группу и трет-бутильную группу с -COOH функции глютаминовой кислоты отщепляли 4н HCl в этилацетате, при этом сульфгидрильную группу цистеина оставляли защищенной, чтобы сохранить S-S связь, которая могла влиять на биологическую активность пептида.

На рисунке 1 показана структурная модель синтетического гептапептидного фрагмента «шарнирной» области IgG человека. Модель была обсчитана с помощью программного обеспечения HyperChem 8.0 Professional Edition. Структура, представленная на рисунке 1, была получена с применением полуэмпирического метода MNDO, который позволяет проводить качественные расчеты электронной и атомной структур органических молекул. Этот метод позволяет получать хорошие результаты для больших органических молекул при расчетах электронных характеристик системы и теплот образования.

4.2. Биологические свойства синтетического гептапептида.

Испытание токсичности проводили в условиях in vitro на трех клеточных культурах: VERO, MDCK и суспензионной культуре клеток MT-4 (табл. 13).

Рис.1 Структурная модель синтетического гептапептида HClН-Cys(StBu)-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Phe-OEt

Таблица 13. Исследование цитотоксического воздействия гептапептида на клетки.

Клеточная культура

Гибель клеток, %

10 мкг/мл

50

мкг/мл

100

мкг/мл

250

мкг/мл

500

мкг/мл

1000

мкг/мл

VERO

0,0

0,0

0,0

0,0

100,0

100,0

MDCK

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

MT-4

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

75%

Из таблицы 13 легко видеть,  что пептид проявляет токсическое действие на  клетки VERO при постоянном его присутствии в течение всего срока культивирования клеток (5 суток) в концентрациях 500 мкг/мл и выше. Клеточная линия MDCK оказалась устойчивой к присутствию пептида в течение всего срока культивирования клеток  (3 суток). При всех концентрациях пептида монослой клеток оставался целым и соответствовал клеточному контролю без препарата вплоть до 1000 мкг/мл.

Суспензионная культура МТ-4 не разрушалась вплоть до концентрации 500 мкг/мл, однако при 1000 мкг/мл наблюдалась гибель клеток.

Была исследована способность полученного гептапептида защищать клетки от вирусов гриппа А и простого герпеса (ВПГ). 

Противовирусную активность пептида в отношении эпидемического человеческого штамма гриппа А/Москва/(H1N1)pdm2009, резистентного к действию ремантадина и амантадина, определяли на монослое клеток MDCK методом ИФА по методике, описанной ранее.  Полученные данные представлены в таблице 14.

Таблица 14. Процент ингибирования репродукции вируса гриппа А/Москва/A(H1N1)pdm2009 в клетках культуры MDCK синтетическим гептапептидом.

Разведение

вируса

Защита клеток, %

0

мкг/мл

25

мкг/мл

50

мкг/мл

100

мкг/мл

250

мкг/мл

500

мкг/мл

10-2

0

25,2

39,4

42

44

---

10-3

0

12,5

44

46

41

41

При анализе данных оказалось, что эфир гептапептида с S-трет-бутильной группой защищает клетки MDCK от воздействия вируса гриппа А на 40%. Причем из таблицы 14 видно, что увеличение концентрации от 50 до 500 мкг/мл не влияет на противовирусную активность, из чего можно сделать вывод, что пептид скорее взаимодействует с клетками и защищает их, чем вмешивается в жизненный цикл вируса.

Исследования противовирусной активности пептида против ВПГ проводили совместно с лабораторией Онтогенеза вирусов. В эксперименте использовался ВПГ типа 1, штамм Л2 в титре 4,5 lgТЦИД50. Пептид вводили по двум схемам: одновременно с заражением и за 2 часа до заражения клеточной культуры VERO вирусом герпеса в дозе 100 ТЦИД50. Полученные результаты представлены в таблице 15.

Таблица 15. Влияние исследуемого гептапептида на развитие цитопатического эффекта в клетках, инфицированных вирусом простого герпеса

Схема

применения

Вирусиндуцированный цитодеструктивный эффект, %

0

мкг/мл

10

мкг/мл

25

мкг/мл

50

мкг/мл

100

мкг/мл

200

мкг/мл

Введение пептида одновременно с заражением

100,0

100,0

100,0

100,0

100,0

100,0

Введение пептида за 2 часа до заражения.

---

---

---

---

100,0

100,0

Как видно из данных таблицы 15, пептид в концентрации до 200 мкг/мл не защищает клетки VERO от цитодеструктивного действия вируса простого герпеса. Дальнейшее увеличение концентрации (более 500 мкг/мл) вызывает цитотоксический эффект.

4. Исследование цитотоксического действия амидов пептидов и их испытание на анти-ВИЧ активность.

Синтезированные амиды трипептидов неожиданно оказались интересными, когда было опубликовано сообщение E.Андерссона и соавт. (Su J., Andersson E., Horal P. J. Human Virology, vol 4, № 1, (2001)) о том, что амид трипептида H–Gly–Pro–Gly–OH (табл.9, соед.1) способен в культуре клеток ингибировать репликацию ВИЧ-1. Создавалось впечатление, что этот трипептид, представляющий собой фрагмент петли V3 гликопротеина gp120 этого вируса, на который направлены типоспецифические нейтрализующие антитела, отчасти способен выполнять ее функции.

       Удивительная простота амида трипептида со свойствами противовирусной активности побудила исследовать зависимость этого феномена от аминокислотного состава трипептида, включающего остаток амида глицина.

Было исследовано токсическое действие синтезированных амидов пептидов на  клетки линии МТ-4. Пептиды добавляли в регулярных концентрациях (100-1500 мкг/мл). Клетки инкубировали при 37С в атмосфере CO2 и 98% влажности в течение 3-5 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя (метод МТТ) и световой микроскопии. Результаты представлены в таблице 16.

Таблица 16. Процент выживших клеток МТ-4 при различных концентрациях соединений в мкг/мл.

Концент-рация мкг/мл

H-Gly-NH2

H-Gly-Pro

-Gly- NH2

H-Gly-Pro

--Аla-NH2

H-Pro-Pro

-Gly-NH2

H-Hyp-Pro

-Gly-NH2

H-Pro-Hyр

-Gly-NH2

100

88,7

78,8

87,8

85,1

97,1

84,3

250

90,2

79,9

83,4

89,3

94,2

96,4

500

86,8

84,7

86,7

77,2

86,3

73,1

750

82,2

90,1

89,3

74,0

72,3

89,3

1000

77,9

74,8

93,5

66,5

72,9

70,0

1500

75,3

84,1

83,2

43,2

46,2

51,1

Для сравнения: AZT 77,49% (1мкг/мл)

Как следует из приведенных данных, этими соединениями не удалось достигнуть значимого подавления роста клеток при концентрациях пептидов до 1000мкг/мл, что свидетельствует о крайне низкой токсичности синтезированных веществ.

Полученные соединения тестировались против ВИЧ-1 типа В на модели экспериментальной инфекции перевиваемой линии лимфобластоидных клеток человека МТ-4 штамма ВИЧ -1 BRU (субтип В). Использовался активный вирус ВИЧ-1 BRU.

Данные биологических испытаний трипептидов приведены в таблице 17.

Таблица 17. Подавление ВИЧ-1 BRU синтезированными амидами трипептидов в процентах (метод МТТ).

Соедин.

мкг/мл

H-Gly-NH2

H-Gly-Pro-Gly-NH2

H-Gly-Pro- -Аla-NH2

H-Pro-Pro-Gly-NH2

H-Hyр-Pro-Gly-NH2

H-Pro-Hyр-Gly-NH2

100

0

0

0

0

0

0

250

14,9

0

0

0

0

0

500

10

0

0

0

0

0

750

13,3

3,5

0

0

0

0

1000

5,3

0

0

0

0

0

1500

11,4

0

0

0

0

0

Для сравнения: активность AZT составляла 58,77% (1 мкг/мл)

Из данных таблицы 17 следует, что эти соединения не подавляли репликацию вируса ВИЧ-1 BRU.

В дальнейшем стало понятно, почему в данном случае не наблюдалось противовирусного действия H–Gly–Pro–Gly–NH2. Позднее в работах E.Андерссона и соавт. было показано, что амид трипептида Gly–Pro–Gly подвергался ферментативному гидролизу до образования амида глицина, затем специфической гидролазой, находящейся в животной сыворотке, он трансформировался в активное начало – амид -гидроксиглицина, который и оказывал ингибирующее действие на ВИЧ-1.

Отсутствие анти-ВИЧ-активности у вышеописанного амида (табл.12, соед.1) и родственных ему соединений  (табл.12, соед.2-12) связано с тем, что использованная тест-система содержала человеческую сыворотку, в то время как фермент гидроксилирующий соединение 11 (табл.12) по данным Е.Андерссона и соавт. содержится лишь в животной сыворотке. Кроме того применяемый в опытах вирус ВИЧ-1 BRU принадлежит субтипу В, а в экспериментах E.Андерссона и соавт. был использован субтип А.

ВЫВОДЫ:

  1. Синтезированные новые производные адамантанового карбоцикла способны подавлять репликацию вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2), резистентных к действию ремантадина. Противовирусный эффект достигается введением в молекулы ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот новых функциональных групп за счет аминокислотных, пептидных и других остатков. Среди исследованных аминокислотных производных адамантанового карбоцикла соединения  Boc-Orn(Вос)-Rem, Boc-Sar-Rem, H-His-Rem, TOA-Rem, H-Tau-Rem и Ad-(CH2-SerOMe)2, не проявляя токсичности,  обладали высоким уровнем противовирусной активности, и могут рассматриваться в качестве потенциальных медикаментозных средств против вируса гриппа А.
  2. Синтезированные фосфодипептиды, содержащие -аминофосфиновые кислоты (фосфоаланин и фосфолейцин) обладают противовирусной активностью в отношении вируса энцефаломиокардита мышей, а также способны индуцировать интерферон в достаточно высоком титре (160-320 ед.).
  3. Разработанная оптимальная стратегия синтеза позволила получить этиловый эфир гептапептидного фрагмента «шарнирной» области иммуноглобулина человека HClH-Cys(StBu)–Pro–Ala–Pro-Glu–Leu–Phe–OH. Показано, что этот пептид обладает противовирусными свойствами in vitro в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm2009. Исследование цитотоксического действия этого пептида на культурах VERO, MDCK и МТ4 показало, что эфир гептапептида обладает крайне низкой токсичностью.
  4. На примере трипептидов, включающих остатки иминокислот (пролина и оксипролина), был исследован процесс амидирования их карбоксильной группы в присутствии лабильных пептидных связей, чувствительных к аммонолизу. Установлено, что амид трипептида H-Gly-Pro-Gly-OH и родственные ему соединения, содержащие остатки глицина, пролина и оксипролина, не способны ингибировать репликацию вируса иммунодефицита человека в человеческой сыворотке по причине отсутствия в ней гидролазы, способной переводить амид глицина в амид -гидроксиглицина, которая содержится лишь в животной сыворотке.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Носик Н.Н., Лаврухина Л.А., Кондрашина Н.Г., Гараев Т.М., Шибнев В.А. Интерферониндуцирующая и противовирусная активность дипептидов.// Вопр.вирусол. 2009.- т.55 - №3. - с. 41-43.
  2. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко Е.С., Бурцева Е.И. Новые производные адамантана и пути  преодоления резистентности вирусов гриппа А.// Вопр.вирусол 2011. - т.56. -  №2. - с. 36-39.
  3. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко Е.С.,  Бурцева Е.И. Некоторые пути  преодоления резистентности вирусов гриппа А к препаратам адамантанового ряда.// Хим.Фарм.Журн. 2012. - т.46 - №1. - с. 36-40
  4. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко Е.С., Бурцева Е.И. Новые производные адамантана, способные преодолеть резистентность вирусов гриппа А(H1N1)pdm2009 и А(H3N2) к ремантадину.// Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2012. - т.153. - №2. - с. 200-203.
  5. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко Е.С.,  Бурцева Е.И. Исследование путей восстановления противовирусных свойств производных адамантанового ряда в отношении вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 и A(H3N2) с помощью аминокислотных и пептидных остатков.// V Российский Симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск), Сборник докладов – 8-12 августа 2011. - с. 425.
  6. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Шевченко Е.С., Бурцева Е.И. Адамантан-аминокислотные производные как потенциальные источники противовирусных свойств в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm09 и A(H3N2).// Материалы международной конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств новых биологически активных соединений» (Таджикский Национальный Университет, г.Душанбе), Сборник докладов – 3-4 октября 2011. – с.53-54.

Благодарности

       Автор выражает глубокую благодарность и признательность своим научным руководителям доктору химических наук, профессору Шибневу Владимиру Александровичу и доктору медицинских наук Бурцевой Елене Ивановне за помощь и внимательное отношение на всех этапах подготовки работы. Автор также благодарит заведующего лабораторией онтогенеза вирусов д.м.н., проф. Носика Николая Николаевича и его сотрудников за помощь в проведении биологических испытаний синтезированных соединений. Автор благодарен коллегам химикам: к.х.н. М.П.Финогеновой за помощь в подготовке,  интерпретации и оформлении результатов диссертации, а также К.В.Зайцевой за помощь в идентификации полученных соединений физико-химическими методами. Автор признателен заведующему Лабораторией иммунодефицитов человека д.м.н., проф. Д.Н.Носику и сотрудникам его лаборатории к.м.н. Л.Б.Калниной и к.б.н. И.А.Киселевой за помощь в проведении биологических исследований. Автор благодарит сотрудников Лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа к.м.н. Е.С.Шевченко и к.б.н. Н.В.Белякову за помощь в работе с высокопатогенными вирусами гриппа.  Автор также благодарит коллег и соавторов публикаций, принимавших участие в получении результатов.


* AmAd - остаток 1-аминоадамантана




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.