WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

ШЕМАРОВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ ИНФУЗОРИЙ TETRAHYMENA PYRIFORMIS В БИОТЕСТИРОВАНИИ ЭКОТОКСИКАНТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Научный консультант: Нестеров Владимир Петрович доктор биологических наук, заведующий лабораторией функциональной биохимии мышц Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Официальные оппоненты: Виноходов Дмитрий Олегович доктор биологических наук, профессор кафедры молекулярной биотехнологии ФГОУ ВПО «СанктПетербургский государственный технологический институт (технический университет)» Тихомирова Елена Ивановна доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой экологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.» Дыкман Лев Абрамович доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук

Ведущая организация: ФГОУ ВПО "Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (СПХФА)

Защита диссертации состоится « 5 » марта 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

Тел. / факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК.

Автореферат разослан « » ноября 2012 г.

И.о. Ученого секретаря диссертационного совета, доктор биологических наук Л.П. Антонюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. Контроль состояния природной среды и качества продукции – наиболее важные направления биотехнологии. В настоящее время в научной и производственной практике, наряду с аналитическими методами, широко применяются экспрессные методы биотестирования с использованием живых организмов для мониторинга состояния окружающей среды, определения токсичности пищевых продуктов, кормов и сырья животного происхождения, что, в конечном счете, способствует формированию экологически доброкачественной среды обитания человека и животных. Существуют различные методы определения качества окружающей среды с помощью биотестовых систем (Мелехова, 2007), однако их широкое применение в практике медикобиологических исследований сдерживается из-за отсутствия научнообоснованных критериев для использования тех или иных биологических объектов в реакциях биотестирования. В существующей практике использование микроорганизмов в качестве тест-объектов носит преимущественно рекомендательный характер, так как отсутствуют критерии комплексной оценки чувствительности микроорганизмов к определенным экотоксикантам (в частности, к солям тяжелых металлов и гербицидам), не определены точные механизмы их токсического действия на организмы на клеточном и молекулярном уровнях, не разработаны технологические режимы выращивания многих тестовых микроорганизмов, как объектов длительного культивирования, нет научной основы, доказывающей правомочность использования одноклеточных микроорганизмов в качестве тестовых объектов для предварительной оценки безопасности и эффективности лекарственных и биологически активных веществ (БАВ).

Разработке тестовых объектов уделяется огромное внимание во всем мире. Наибольшее распространение в качестве тест-объектов получили организмы, способные реагировать на загрязнение водной среды. К таким организмам относятся гидробионты различных таксономических групп, от позвоночных до прокариот, среди которых наиболее перспективными считаются одноклеточные микроорганизмы (Виноходов, 2007).

Значительно меньше внимания уделяется поиску новых тестовых объектов для нужд пищевой и медицинской биотехнологии (Шульгин, 2006).

Связано это с широким использованием в научно-исследовательской практике культур клеток позвоночных, которые, по сути, выполняют функции тест-объектов, позволяя исследователям значительно ускорить процедуру токсикологического исследования in vitro (Teeguarden et al., 2007). Анализ литературы свидетельствует, что техника культивирования клеток in vitro продолжает совершенствоваться, получение данных анализов автоматизируется, а сфера применения расширяется (Адамс, 1983; Никольский и др., 1984; Червонская и др., 1991, 1998; Visser, Zuschratter, 2011). Культуры клеток широко используются в биотехнологии и научных исследованиях для изучения закономерностей протекания внутриклеточных процессов, общих для всех типов клеток, механизмов регуляции ионного транспорта, метаболизма, клеточного цикла, внутриклеточной сигнализации (Епифанова и др., 1983, 1988; Никольский и др., 1984; Крутецкая и др., 2003), для исследования процессов внутриклеточного паразитизма (Бейер и др. 1978; Белостоцкая, Шемарова, 1991; Chini et al., 2005), а также для выявления токсического и мутагенного действия химических веществ на клетки (Еськов и др., 1987;

Альберт, 1989; Teeguarden et al., 2007). Сейчас культивируются практически все типы клеток человека, животных, рыб, насекомых, растений (Червонская и др., 1998). Считается, что использование клеточных культур является свидетельством высокого уровня эксперимента в любой сфере фундаментальных и прикладных народохозяйственных отраслях. Однако, отдавая должное культуральным тестам, не следует забывать и о дополнительных возможностях альтернативного моделирования с использованием одноклеточных свободноживущих микроорганизмов. Преимуществами методов биотестирования, основанных на применении одноклеточных организмов в качестве тест-объектов, является их простота, низкая себестоимость проведения анализов и большая экспрессность (Шемарова, 2007а). Однако внедрение свободноживущих микроорганизмов в качестве тест-объектов в практику токсикологических и медико-биологических исследований ограничено по двум основным причинам. Во-первых, из-за недостаточности экспериментальных данных, свидетельствующих о высокой чувствительности биотестов с использованием микроорганизмов.

Во-вторых, из-за отсутствия научно-теоретического обоснования возможности экстраполяции и частичного переноса экспериментальных данных, полученных в реакциях биотестирования с использованием одноклеточных микроорганизмов на позвоночных.

Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования является изучение сенсорных систем Tetrahymena pyriformis GL и научнометодологическое обоснование их использования в биотестировании экотоксикантов и биологически активных веществ.

Поставленная цель определила следующие задачи:

1. Изучить действие экотоксикантов (солей тяжелых металлов и комплексонов) на инфузорий Tetrahymena pyriformis GL на популяционном, организменном и молекулярном уровнях.

Определить острую и хроническую токсичность тяжелых металлов (Cd2+, Сu2+, Zn2+, Ni2+) и ряда комплексонов (пиколиновой кислоты и ее производных) методом биотестирования на Tetrahymena pyriformis GL. Изучить механизм их цитотоксического действия. Сравнить токсичность свободного и хелатированного кадмия и оценить возможность применения хелатирующих соединений для детоксикации промышленных загрязнений, содержащих тяжелые металлы.

2. Разработать систему биохимических и клеточных тестов для определения токсичности экотоксикантов. Изучить действие тяжелых металлов на фагоцитарную активность (ФА) инфузорий, их рост, активность глутатион-S-трансферазы (ГТ), дыхательные ферменты и процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ). Сравнить тест-реакции тетрахимен с реакциями кардиомиоцитов (КМ) лягушки Rana temporaria и митохондрий крысы.

3. Разработать экспериментальную тест-систему для изучения БАВ с использованием инфузорий Tetrahymena pyriformis GL.

Изучить митогенное действие на Tetrahymena pyriformis GL биологически активных веществ (EGF, инсулина, ацетилхолина и серотонина).

4. Оценить возможность использования клеточных и биохимических тестов (реакция пролиферативного роста, определение содержания ДНК, ИКД, спектра холинэстераз, субстратной специфичности аминооксидаз) для выявления митотической активности БАВ (EGF, инсулина, ацетилхолина и серотонина).

5. Изучить сенсорные системы тетрахимен, ответственные за передачу митогенных сигналов. Проанализировать и сравнить сигнальные системы одноклеточных микроорганизмов и высших эукариот.

6. Изучить механизм митогенного действия БАВ на T. pyriformis GL. Определить активность аденилатциклазы и динамику изменений синтеза ДНК в ядрах тетрахимен под действием активатора и блокаторов Са2+-каналов, ингибиторов МАРкиназ, РКС, PLC, ERK1 и ERK2-киназ. Оценить возможность применения блокаторов Са2+-каналов для снижения митотической активности клеток.

7. Испытать инфузорий T. pyriformis GL в качестве тест-объектов при биотестировании токсичности кормов и безопасности лекарственных препаратов.

8. Разработать систему мер для стандартизации параметров биотестирования с использованием в качестве тест-объектов инфузорий T. pyriformis GL.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Инфузории Tetrahymena pyriformis GL проявляют высокую чувствительность к действию тяжелых металлов (Cd2+, Сu2+, Zn2+, Ni2+), ряда комплексонов (ПК и ее производных), БАВ (EGF и инсулина), блокаторов и активаторов Са2+-каналов, ингибиторов ключевых ферментов МАР-киназного и PI-cигнальных путей. В присутствии этих веществ меняется поведение инфузорий, их метаболизм, скорость прохождения по клеточному циклу, в связи с чем, эти микроорганизмы и их реакции можно рассматривать в качестве диагностических тестовых систем для выявления токсичности тестируемых веществ (ТВ) и митотической активности БАВ.

2. Биологически активные вещества (инсулин и EGF) стимулируют синтез ДНК. Полученные данные позволяют считать функциональный тест по определению содержания ДНК в ядрах инфузорий основным цитохимическим критерием оценки митотического действия веществ на клетки.

3. Молекулярное сходство сигнальных систем одноклеточных микроорганизмов с сигнальными системами высших эукариот позволяет рассматривать одноклеточные микроорганизмы в качестве тест-объектов в медицинской биотехнологии и использовать их для предварительной оценки митогенного действия БАВ и веществ направленного синтеза.

4. Данные о биологическом действии веществ, полученные методом биотестирования с использованием Tetrahymena pyriformis GL, могут быть экстраполированы и частично перенесены на теплокровных животных, если сравнение полученных данных проводится на клеточном или молекулярных уровнях, но не на уровне целого организма.

Научная новизна. Впервые обобщены и систематизированы данные мировой литературы о сигнальных системах одноклеточных микроорганизмов. Получены новые экспериментальные данные о структурно-функциональной организации сенсорных систем микроорганизмов, которые включены в монографию «Внутриклеточная сигнализация у низших эукариот» (Шемарова, 2010).

Получены данные, свидетельствующие о высокой чувствительности микроорганизмов (инфузорий T. pyriformis GL, P. caudatum, жгутиконосцев A. longa) к действию тяжелых металлов (Cd2+, Сu2+, Zn2+ и Ni2+), хелатирующих соединений, обладающих гербицидной активностью, гормонов и факторов роста позвоночных. Изучены тест-реакции микроорганизмов на действие ксенобиотиков на популяционном, организменном и молекулярном уровнях.

Разработана тест-система для изучения действия БАВ на одноклеточных микроорганизмах. Показаны перспективы и ограничения метода биотестирования для выявления активности БАВ на инфузориях Tetrahymena pyriformis GL. Изучено действие инсулина, EGF, серотонина, ацетилхолина на пролиферацию Tetrahymena pyriformis GL и молекулярный механизм митогенного действия БАВ. Установлена роль ионов Са2+ и ряда сигнальных белков, во внутриклеточной передаче сигналов у одноклеточных эукариот. Показано, что первыми на действие БАВ реагируют сигнальные системы, включающие элементы АС- и тирозинкиназной систем, что приводит к стимуляции синтеза ДНК.

Полученные данные позволяют считать функциональный тест по определению содержания ДНК в ядрах инфузорий основным цитохимическим критерием оценки митогенного действия веществ на клетки.

Получены доказательства сходства сигнальных систем низших и высших эукариот, что позволяет рассматривать одноклеточные микроорганизмы в качестве тест-объектов в медицинской биотехнологии.

Новые данные о сигнальных системах микроорганизмов дополняют концепцию биотестирования, расширяют представления о перспективах использования метода в биотехнологии, позволяют по-новому взглянуть на биотестирование как на инструментальный экспрессный метод для оценки безопасности и выявления биологической активности веществ направленного синтеза.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование относится к работам, вносящим вклад в теорию естествознания, расширяет современные представления о сигнальных системах эукариотических микроорганизмов как молекулярных сенсорах окружающей среды. В монографии «Внутриклеточная сигнализация у низших эукариот» (Шемарова, 2010) с грифом «Утверждено к печати Институтом эволюционной физиологии и биохимии РАН» впервые обобщены литературные и собственные экспериментальные данные о структурно-функциональной организации сигнальных систем эукариотических микроорганизмов, рассмотрены элементы биохимического и функционального сходства сигнальных систем, ответственных за передачу митогенных, апоптотических, стрессовых сигналов в клетках низших эукариот и позвоночных. В персональной главе “Calcium Signaling in Lower Eukaryotes” книги «Calcium Signaling» (New York, Nova Press, 2011) подробно анализируются механизмы формирования, распространения и тушения внутриклеточных Са2+сигналов у низших эукариот (Shemarova, 2011). Предложена концепция универсальности механизмов, лежащих в основе внутриклеточной сигнализации у высших и низших эукариот. Данная концепция позволяет систематизировать знания о внутриклеточных сигнальных системах эукариот с позиции их происхождения и эволюционного развития и объясняет причины сходных реакций клеток разного филогенетического уровня на один и тот же раздражитель.

Обобщены и систематизированы данные о действии химических веществ на одноклеточные микроорганизмы на популяционном, организменном и молекулярном уровнях. Определены молекулярные механизмы действия экотоксикантов (тяжелых металлов и комплексонов) на микроорганизмы. Систематизированы данные о выращивании инфузорий Tetrahymena pyriformis GL на искусственных питательных средах и изучены возможности метода спектрофотометрического определения содержания ДНК в ядрах инфузорий для выявления митотической активности БАВ и веществ направленного синтеза.

Исследования реакций инфузорий Tetrahymena pyriformis GL на антропогенные химические воздействия имеют важное практическое значение и включены в «Методические рекомендации по использованию инфузорий Tetrahymena pyriformis GL в качестве тест-объектов в токсикологических, фармакологических и экологических исследованиях» (Шемарова, 2007) с грифом «Утверждены Научным координационным советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научнометодического центра Россельхозакадемии».

Результаты работы, изложенные в «Методических рекомендациях» внедрены в практическую деятельность ГУ «Санкт-Петербургская городская ветеринарная лаборатория», а также лабораторий ветеринарносанитарной экспертизы на рынках Санкт-Петербурга.

«Методические рекомендации» используются в учебном процессе при проведении лабораторно-практических занятий по курсу «Токсикология» на ветеринарном факультете СПбГАВМ; их могут применять в своей работе ветеринарные врачи, экологи, специалисты производственных санитарно-гигиенических лабораторий, преподаватели биологических и сельскохозяйственных вузов.

Полученные в работе результаты и обобщения используются при чтении лекций по курсу «Протозоология» на ветеринарном факультете СПБГАВМ и могут применяться в лекционных курсах по биотехнологии, экологии, ветеринарной токсикологии, санитарной гигиене и некоторых специальных разделах зоологии, физиологии и клеточной биологии.

Апробация работы. Основные результаты исследования докладывались на заседаниях Лаборатории сравнительной функциональной биохимии беспозвоночных Института эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН (Санкт-Петербург, 1991 - 2001), на Всероссийской конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1991), на семинарах Института эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН (Санкт-Петербург, 2001-2011), III Всероссийском съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), IV Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005), VIII Международном совещании и VI школы по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), XX Всероссийском съезде физиологов (Москва, 2006), III Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), научной конференции «Фундаментальная наука – клинике», (Санкт-Петербург, 2007), I Международном конгрессе ветеринарных фармакологов (СанктПетербург, 2008), VII Международном Симпозиуме "Биологическая подвижность: достижения и перспективы" (Пущино, 2008), XIV Международном совещании и VII школы по эволюционной физиологии, посвященные памяти академика Л.А. Орбели (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. Результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 46 печатных работах, в том числе в двух монографиях, брошюре, 36 статьях в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях, 7 тезисах докладов на международных и всероссийских съездах, конференциях и школах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 2странице машинописного текста, включая 36 рисунков и 17 таблиц.

Состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, экспериментальных и 1 теоретической глав, обсуждения результатов исследования и выводов. Библиография включает 129 отечественных и 3зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили преимущественно свободноживущие инфузории Tetrahymena pyriformis GL. Опыты проводили на безмикронуклеусном штамме GL. Выбор объекта обусловлен его хорошей изученностью и возможностью культивирования в аксенических условиях (Elliott, 1973). В сравнительных экспериментах по оценке токсического действия солей тяжелых металлов использовали жгутиконосцев Astasia longa и инфузорий Paramecium caudatum; в экспериментах по анализу сигнальных систем - бактерий Methanosarcina barkeri. При сравнительном исследовании токсичности веществ на одноклеточных организмах и позвоночных животных использовали белых крыс линии Вистар и травяных лягушек Rana temporaria.

Всего в опытах было использовано более 550 стационарных и экспоненциально растущих культур T. pyriformis GL. Часть клеток из экспериментальных и контрольных культур подвергалась прижизненному, а затем посмертному анализу. Получено более 500 фиксированных на предметных стеклах препаратов, содержащих от 50 до 200 клеток тетрахимен. Препараты клеток, предназначенные для выявления содержания ДНК, фиксировались в жидкости Карнуа, после чего окрашивались по Фельгену для избирательного выявления ядерного аппарата. Основная часть фиксированных клеток подвергалась количественному подсчету. Цитофотометрический анализ содержания ДНК был проведен более чем в 3000 клетках.

В работе использован широкий спектр биохимических, физиологических, молекулярных методов, основные из которых:

цитофотометрическое определение внутриядерного содержания ДНК в ядрах инфузорий (Шемарова и др., 2007), определение активности глутатион-S-трансферазы (Habig et al., 1973), аминооксидазы и аденилатциклазы (Solomon et al., 1974), определение интенсивности дыхания клеток и активности ферментов окислительного фосфорилирования (Korotkov et al., 1999), определение продуктов перекисного окисления липидов ((Malshet et al., 1974), субстратноингибиторный анализ спектра холинэстераз в клеточных экстрактах (Бресткин и др., 1997), микровариант диск-электрофореза в ПААГ (Маурер, 1971), иммуноблоттинг и определение рецепторов к EGF (Кондратов, 2009), определение токсичности веществ in vitro и in situ на инфузориях и препаратах фрагментов изолированного сердца лягушки Rana temporaria с использованием компьютерной регистрации параметров мышечного сокращения (Кузнецов, Шемарова, 2007), подсчет клеток в культуре (Червонская и др., 1991); методы статистической обработки результатов (Лакин, 1980).





Для биотестирования использовали культуры Tetrahymena pyriformis GL с высокой плотностью популяции. Для получения таких культур в плоскодонные колбы Эрленмейера объемом на 1 л, содержавшие по 450,мл обогащенной углеводно-белковой среды, добавляли по 50,0 мл стационарной культуры тетрахимен с концентрацией клеток 1,5 – 2,0 х 1кл /мл и культивировали в условиях термостата при 28± 0,5 С, рН=7,4 – 7,6. При соблюдении данных параметров продуктивность культуры тетрахимен к 48 ч составляла 2,2 - 2,5 х 106 кл/мл. Затем массовые культуры объединяли и центрифугировали при 1000 об/мин в течение мин, надосадок удаляли, осевшие на дно клетки ресуспендировали в 20,мл той же питательной среды, из состава которой были удалены экстракты бычьей печени и дрожжей, (для исключения возможности неспецифической ростовой стимуляции клеток), повторно центрифугировали в вышеуказанном режиме, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в минеральной среде для получения клеточного инокулума.

Плотность клеточных популяций определяли в счетной камере Горяева путем подсчета общего количества клеток в 1 мл массовой культуры. Для этого клетки фиксировали 5 % раствором формалина и после тщательного перемешивания вносили в камеру, где подсчитывали количество тетрахимен на всей площади камеры. Отбор культуры из одной колбы или флакона и заполнение ею камеры Горяева проводили от 4-х до 6-ти раз.

За индекс клеточного деления (ИДК) принимали отношение числа делящихся клеток к общему числу клеток, выраженное в процентах (Murata-Hori, Fujishima, 1996).

Синхронизацию клеточных делений проводили путем переноса инокулума клеток из средней стационарной фазы роста культуры (48 ч культивирования), в свежую питательную среду.

При биотестировании экспериментальных растворов с использованием тетрахимен выполняли следующие процедуры. В три опытные пробирки вместимостью 10-15 мл наливали по 5 мл раствора тестируемых вещества, три контрольные пробирки наполняли таким же объемом минеральной среды. В каждую из опытных и контрольных пробирок добавляли 0,04 мл (2 капли) 48-часовой культуры тетрахимен и определяли исходное количество клеток в контроле и опыте. После чего пробирки помещали в термостат при температуре 28±0,5° С.

Культивирование опытных и контрольных проб продолжалось 24 или 96 ч (в зависимости от того, определяли острую или хроническую токсичность). В конце биотестирования подсчитывали количество инфузорий в контроле и опыте, из каждой пробы брали не менее 3-х капель. Обработку и оценку результатов производили в соответствии с рекомендациями, предложенными в «Руководстве по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов» (2001).

В основу проведения функционального биотеста положена модифицированная нами методика определения фагоцитарной активности у парамеций (Голубкова, 1988). Интенсивность фагоцитоза у T. pyriformis GL определяли путем подсчета поглощенных инфузориями клеток дрожжей, для чего 1 мл культуры клеток инкубировали в среде, содержащей убитые и окрашенные трипановым синим клетки Saccharomyces cerevisiae, в течение 10 мин. По истечении этого срока тетрахимен фиксировали 5 %-ным раствором формалина в фосфатном буфере, рН 7,3. В 10,0 мкл фиксированной клеточной культуры подсчитывали общее количество клеток и число фагоцитируюших клеток.

Фагоцитарную активность клеток оценивали по отношению числа фагоцитирующих клеток к общему числу подсчитанных в пробе клеток и выражали в процентах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе представлены экспериментальные доказательства высокой чувствительности эукариотических микроорганизмов (T. pyriformis GL, P.

caudatum, A. longa) к действию токсических агентов (тяжелых металлов, комплексонов, синтетических ингибиторов ионных каналов, ряда ферментов, сигнальных белков) и биологически активных веществ (эпидермального фактора роста и инсулина). Изучены механизмы внутриклеточной передачи сигналов у одноклеточных микроорганизмов.

Предложены методы биотестирования воды, кормов и новых лекарственных препаратов на общую токсичность с использованием T.

pyriformis GL.

ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Изучение общей токсичности Cd2+, Cu2+, Zn2+ и Ni2+ на популяции свободноживущих инфузорий и растительных жгутиконосцев.

Проведено исследование in vitro токсичности Cd2+, Cu2+, Zn2+ и Ni2+, как наиболее опасных и распространенных экотоксикантов. Установлено, что эти вещества вызывают дозозависимое снижение численности всех трех видов популяций микроорганизмов. При этом более токсичными для всех групп одноклеточных гидробионтов оказались ионы кадмия (табл. 1).

Таблица 1. Острая токсичность Cd2+, Cu2+, Zn2+ и Ni2+ для популяций T.

pyriformis, P. caudatum и A. longa Тестируемое LC50, мкМ/л (24 ч) вещество T. pyriformis GL P. caudatum A. longa (n = 12) (n = 8) (n = 8) CdCl2 5±0,8 5±0,65 4±0,NiCl2 40±1,2 45±1,1 49±0,CuSO4· 5H2O 280±2,1 290±2,15 285±2,ZnSO4 ·7H2O 850±4,1 875±5,3 885±4,Полученные данные могут говорить о высокой чувствительности одноклеточных микроорганизмов к действию тяжелых металлов, которые по степени токсичности можно расположить в следующем порядке: Cd2+ > Ni2+ > Cu2+ > Zn2+. Наиболее токсичным в этом ряду является Cd2+, наименее – Zn2+. Инфузории и жгутиконосцы проявляли примерно одинаковую чувствительность к тяжелым металлам, что позволяет использовать все три вида сравниваемых микроорганизмов в биотестовых реакциях для определения острой токсичности.

Результаты оценки хронической токсичности Cd2+, Cu2+, Zn2+ и Ni2+ для популяций T. pyriformis GL, P. caudatum и A. longa отражены в таблице 2.

Таблица 2. Хроническая токсичность Cd2+, Ni2+, Cu2+ и Zn2+ для популяций T. pyriformis GL, P. caudatum и A. longa Тестируемое LC50, мкМ/л (96 ч) вещество T. pyriformis GL P. caudatum A. longa (n = 12) (n = 8) (n = 8) CdCl2 2±0,15 2±0,1 3±0,NiCl2 19±1,1 20±1,3 15±1,CuSO4· 5H2O 29±1,35 29±1,5 26±1,ZnSO4 ·7H2O 170±2,6 179±1,7 182±1,Таким образом, Cd2+, Zn2+, Cu2+ и Ni2+ оказывали на исследованные популяции свободноживущих микроорганизмов сильное токсическое действие, которое проявлялось в дозо- и время зависимом снижении численности клеток в культуре. При исследовании хронической токсичности тяжелых металлов эффекты Cd2+ были более выраженными, эффекты Zn2+ - наименьшими. Как и в острых экспериментах, в хронических экспериментах токсичность Zn2+ и Cu2+ была значительно ниже, по сравнению с Cd2+ и Ni2+, что не только подтверждает их меньшую общую токсичность для клеток, но может говорить и о более низкой кумуляции этих микроэлементов по сравнению с Cd2+ и Ni2+.

В целом, результаты исследования острой и хронической токсичности тяжелых металлов в экспериментах на одноклеточных гидробионтах свидетельствуют о высокой чувствительности одноклеточных микроорганизмов к действию тяжелых металлов, что позволяет использовать их в биотестовых реакциях для оценки токсичности сред, содержащих тяжелые металлы. Однако более полную картину о действии металлов на клетки дают биотестовые исследования с использованием функциональных тестов (см. ниже).

Сравнительное исследование токсичности соединений Cd2+ в свободной и хелатированной формах для T. pyriformis GL. На рис.приведены экспериментальные данные, представляющие собой кривые роста культуры T. pyriformis GL в среде, содержащей катионы кадмия (10 и 50 мкМ) в свободной форме и в форме хелатного комплекса Сd2+ - ЭДТА.

Рис. 1. Влияние кадмия в свободной и хелатироваиной формах на динамику роста культуры T. pyriformis GL. По оси абсцисс - время инкубации (ч), по оси ординат -количество клеток (тыс. кл/мл) при инкубации в среде с добавлением следующих веществ (мкМ): 1 - 10 ЭДТА, 2 - 10 Сd2+ + 10 ЭДТА, 3 - контроль, 4 - 50 Сd2+, 5 - 10 Сd2+, 6 - 50 Сd2+ + ЭДТА. Каждая точка представляет собой среднее арифметическое значение 5 независимых экспериментов (n = 5). Различия достоверны (p<0,05).

Полученные в эксперименте данные указывают на большую токсичность для тетерахимен кадмия в свободной форме, чем в форме хелатного комплекса. В свободной форме при концентрациях 10 и 50 мкМ кадмий проявлял острую токсичность, начиная с первых часов инкубации (кривые 4 и 5), в то время как в форме хелатного комплекса с ЭДТА, начиная с более поздних сроков (кривые 2 и 6). При этом абсолютно смертельной для популяции тетрахимен была концентрация 10 мкМ Сd2+ в свободной форме и 50 мкМ в форме хелатного комплекса.

Действие соединений Cd2+ в свободной и хелатированной формах на фагоцитарную активность T. pyriformis GL. Различия в действии свободных и хелатированных катионов Сd2+ на фагоцитоз (способность образовывать пищеварительные вакуоли) тетрахимен проявились уже через 10 мин экспозиции с металлом. При этом отмечали дозозависимый характер ингибирования фагоцитоза, который проявлялся в уменьшении образования пищеварительных вакуолей, содержащих окрашенные клетки дрожжей S. cerevisiae. Наиболее выраженное торможение фагоцитоза отмечалось при использовании Сd2+ в свободной форме в концентрации мкМ (рис. 2). У тетрахимен, инкубированных в среде с Сd2+ + ЭДТА, фагоцитарная активность была значительно выше (рис. 2).

Рис. 2. Влияние кадмия в свободной и хелатироваиной формах на уровень фагоцитоза культуры Tetrahymena pyriformis GL в стационарной фазе роста. По оси абсцисс - время инкубации (ч), по оси ординат - скорость фагоцитоза (%) при инкубации в среде, содержащей испытуемые вещества в следующих концентрациях (мкМ): 1 - 10 ЭДТА, - 1 Сd2+ + 1 ЭДТА, 3 - 10 Сd2+ + 10 ЭДТА, 4 - 1 Сd2+, 5 - 10 Сd2+, 6 - 50 Сd2+ + 50 ЭДТА. Каждая точка представляет собой среднее арифметическое значение 5 независимых экспериментов (n = 5). Различия достоверны (p<0,05).

Понижение фагоцитарной активности (ФА) T. pyriformis GL в присутствии Cd2+ говорит о токсическом действии ионов кадмия на уровне клетки. Более выраженное угнетение фагоцитоза под действием Cd2+ в свободной форме свидетельствует о его высокой проникающей способности и негативном воздействии на процесс образования пищеварительных вакуолей. В хелатированной форме проникающая способность Cd2+ снижалась, что в некоторой степени уменьшало его токсичность для инфузорий и вызывало менее значительное снижение ФА по сравнению с действием Cd2+ в свободной форме (при всех сравниваемых концентрациях). Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности T. pyriformis GL к действию Cd2+ в свободной и хелатированной формах на уровне целого организма.

Действие соединений Cd2+ в свободной и хелатированной формах на активность глутатион-S-трансферазы T. pyriformis GL. Базальная активность глутатион-S-трансферазы (ГТ) – ключевого фермента детоксикации ксенобиотиков - в гомогенате клеток T. pyriformis GL была сравнительно высока и составляла 124 ± 20 нмоль/мин/мг белка.

Добавление в инкубационную среду 10 мкМ Сd2+ в свободной и связанной с ЭДТА формах уже через 30 мин приводило к снижению активности ГТ по сравнению с контролем на 39,3 и 5,0 %; 50 мкМ Сd2+ - на 61,2 и 55,0 % соответственно. Эти результаты показывают, что токсичность Сd2+ в свободной форме выше, чем в форме комплекса с ЭДТА, и согласуются с результатами, полученными в предыдущем эксперименте.

Сравнение результатов определения токсичности Сd2+ на тетрахименах методом биотестирования с результатами, полученными на миокардиальных препаратах лягушки Rana temporaria.

Установлено, что концентрация Сd2+, токсическая для тетрахимен, была токсичной и для сократительных миоцитов сердечной мышцы лягушки.

Минимальное изменение амплитуды сокращения (в среднем на 22 % по отношению к контролю) отмечалось при использовании 1 мкМ Cd2+.

Увеличение концентрации Cd2+ в пробе первоначально до 10 мкМ, а затем до 20 мкМ приводило к уменьшению силы cердечных сокращений в среднем на 50 % и 72 % соответственно (Шемарова и др., 2011).

Полученные в данном эксперименте результаты свидетельствуют о том, что в диапазоне исследуемых концентраций (1 – 20 мкМ) Cd2+ оказывает угнетающее действие на сокращения миокарда лягушки, что может говорить о высокой токсичности Cd2+ для кардиомиоцитов (КМ).

Сравнение результатов данного эксперимента с результатами, полученными нами при исследовании токсичности Cd2+ на тетрахименах, позволяют рассматривать оба теста эффективными и взаимодополняющими для выявления токсичности Cd2+ в опытах in vitro и in situ, а тетрахимен – тест-объектами, чувствительность которых сравнима с таковой клеток позвоночных животных.

Сравнение результатов определения токсичности Сd2+ на тетрахименах методом биотестирования с результатами, полученными на митохондриальных препаратах крысы. Установлено, что в присутствии Cd2+ набухание неэнергизованных митохондрий сердца крысы (МСК) в изотонических средах с KNO3 и NH4NO3 дозозависимо возрастает. При этом максимальное набухание митохондрий отмечается в препаратах, преинкубированных с 25 мкМ Cd2+. При изучении действия Cd2+ на энергезированные митохондрии было отмечено, что набухание митохондрий в гипоосмотической среде с ацетатом калия, cахарозой и Cd2+ происходит заметно быстрее, чем в контроле. Исследование окислительных процессов в митохондриях КМ показало, что Cd2+ нарушает работу дыхательной митохондриальной цепи. На это указывает более низкая по сравнению с контролем скорость эндогенного дыхания изолированных митохондрий в среде с Cd2+ в присутствии малата и сукцината и отсутствие ответа опытных клеток на 2,4-динитрофенол (ДНФ).

Таким образом, данное исследование, послужившее арбитражным методом для выявления токсичности Cd2+ in situ, не только подтвердило эффективность биотестирования токсичности Cd2+ на инфузориях, но и позволило расширить существующие представления о механизмах токсического действия на субклеточные элементы эукариотической клетки.

ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ГЕРБИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, НА T.

PYRIFORMIS GL И P. CAUDATUM Вещества, синтезированные на основе пиколиновой кислоты (ПК), являются эффективными гербицидными препаратами (Веселов, Морозов, 1971; Веселов, 1978; Березовский, Крумздоров, 1997). Имеющиеся данные литературы свидетельствуют о том, что эти препараты средне- или малотоксичны для теплокровных животных. LС50 для мышей находится на уровне 1265 - 2000 мг/кг, для крыс - 2308 - 6000 мг/кг (Шугаев, Бухаловский, 1972). Помимо этого, пиколиновая кислота является эндогенным ингибитором роста позвоночных животных, что открывает перспективу для изучения возможности синтеза на ее основе малотоксичных веществ, обладающих цитостатическими свойствами.

В этом разделе отражены результаты наших исследований по определению токсичности самой ПК, синтезированных в нашей лаборатории ее производных (хинальдиновой кислоты (ХК), 2,6пиридиндикарбоновой (2,6-ПДКК), 3,4-пиридиндикарбоновой (3,4-ПДКК), никотиновой (НК), и синтетических комплексонов моноэтаноламин-N,Nдиуксусной кислоты (МЭАДУК) и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для инфузорий двух видов T. pyriformis GL и P. caudatum. С помощью функциональных и биохимических биотестов подтверждены данные о токсичности ТВ, полученные по тест-реакциям гибели и снижения прироста численности инфузорий.

Изучение токсичности ПК, ее производных и синтетических комплексонов (ЭДТА и МЭАДУК). Установлено, что in vivo токсический эффект природного соединения ПК и ее комплексообразующих аналогов (ХК, 2,6-ПДКК) выше, чем у синтетических хелаторов (ЭДТА и МЭАДУК), обладающих значительно более высокой комплексообразующей активностью (Дятлова и др., 1970). Показано, что ПК и ее комплексообразующие аналоги (ХК и 2,6-ПДКК) в концентрациях 1 и 1, 5 мМ более чем на 50 % угнетают рост культур инфузорий (Шемарова и др., 2001). Обнаружено, что клетки из логарифмической фазы роста являются более чувствительными к цитотоксическому действию всех испытуемых веществ, чем клетки из стационарной фазы. Установлено, что цитотоксический эффект ПК связан не с нарушением репликации ДНК, а с нарушением процессов деления клетки в G2- и D- фаз клеточного цикла.

При сравнении действия исследуемых веществ на культуры инфузорий, находившиеся в логарифмической (рис. 3а) и стационарной (рис. 3б) фазах, оказалось, что экспоненциально растущие культуры в большей степени подвержены цитотоксическому действию комплексообразующих соединений, обозначенных на рис. I-IV, VI- VII, чем клетки в стационарной фазе роста. Обнаруженные факты согласуются с данными, полученными на клетках высших эукариот, о том, что покоящиеся клеткиболее устойчивы к повреждающему действию токсикантов, чем активно пролиферирующие (Епифанова и др., 1983).

Изучение действия ПК на активность глутатион-S-трансферазы.

Обнаружено, что к 24-му часу инкубации в присутствии 1 мМ ПК активность фермента понижалась и составляла у тетрахимен 25,5 %, у парамеций - 29,4 % относительно контроля (p < 0,05), что по времени совпадало с периодом задержки клеточного роста. По мере выхода инфузорий из блока пролиферации, активность ГТ вновь возрастала, но к 48 ч в опытных клетках все еще была ниже, чем в интактных клетках, что свидетельствовало о глубоком нарушении глутатион-зависимой защитной системы клеток под действием ПК.

Изучение действия ПК на процессы ПОЛ, клеточное дыхание и металлозависимые ферменты. Снижение численности опытных клеток может указывать на деструктивную мембранную патологию, в возникновении которой немаловажную роль играют процессы свободнорадикального окисления (Владимиров, Арчаков, 1977). Однако, как показали проведенные нами исследования, 1,5 мМ ПК в форме триспиколината не является индуктором процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в клетках экспоненциально растущих культур. Уровни диеновых конъюгатов (ДК) - первичных продуктов перекисного окисления липидов и Шиффовых оснований (ШО) - конечных продуктов ПОЛ, в клетках тетрахимен, культивируемых в течение 2 ч с ПК, были такими же, как и в контрольных клетках, и составили 2,2 ± 0,2 и 190 ± 18 (р < 0,01) соответственно.

Рис. 3. Цитотоксическое действие тестируемых веществ (ТВ) на инфузорий Tetrahymena pyriformis (1) и Paramecium caudatum (2) в логарифмической (а) и в стационарной (б) фазах роста. По горизонтали – ТВ: I – ПК, II - ХК, III - 2,6-ПДКК, IY – 3,4–ПДКК, Y – НК, YI – МЭАДУК, YII - ЭДТА. По вертикали – цитотоксичность ТВ (LC100), мМ.

Светлые столбики – (1), темные столбики – (2). Цитотоксичность оценивали через 24 ч инкубации инфузорий с ТВ ( n = 5, p < 0,05, относительная погрешность 9 %).

Для выявления действия ПК на клеточное дыхание и активность ферментов окислительного фосфорилирования был проведен эксперимент по оценке скорости поглощения кислорода изолированными МСК, инкубированными в присутствии 2 мМ ПК и энергетических субстратов фосфорилирования (рис. 4). Установлено, что внесение ПК в среду, содержащую энергетические субстраты, существенно не влияет на дыхание митохондрий, находящихся в состояниях 4 или 3 по Чансу, или разобщенных ДНФ. 2 мМ трис-пиколинат также не увеличивал светорассеивание суспензии митохондрий, помещенных в среду со 125 мМ NH4NO3. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что 2 мМ ПК не влияет на протонную проницаемость внутренней митохондриальной мембраны.

Таким образом, ПК не оказывает токсического действия ни на ферменты окислительного фосфорилирования, ни на ферменты дыхательной цепи митохондрий.

Рис. 4. Влияние 2 мМ трис-пиколината (ПК) на дыхание и набухание изолированных митохондрий крысы. Дыхание митохондрий (кривые 1 - 4). Субстраты: глутамат и малат (кривые 1 - 2) или сукцинат (кривые 3 - 4). Цифрами над кривыми обозначены скорости поглощения кислорода для различных метаболических состояний митохондрий (в нМ О2 в мин на мг белка). Набухание митохондрий (кривые 5 - 6). Стрелками показаны добавки в среду АДФ, ДНФ или ПК. Цифрами над кривыми показаны скорости поглощения кислорода. Представлены характерные кривые для трех независимых экспериментов.

Пиколиновая кислота – эндогенное комплексообразующее соединение, поэтому механизм цитостатического действия ПК может быть связан с хелатацией внутриклеточных переходных металлов и, в частности, железа. Чтобы проверить это предположение, мы оценивали выживаемость инфузорий T. pyriformis GL и P. caudatum, растущих в присутствии ПК, Fe2+, НАДФ·H и сочетаний этих веществ (Шемарова и др., 2003).

Сравнение динамики роста опытных культур, показало, что присутствие в среде НАДФ·H существенно снижает цитостатическое действие ПК. Более того, через 3 ч инкубированные в системе ПК - НАДФ·H клетки вступают в новый пролиферативный цикл и к 6 ч инкубации численность популяции тетрахимен увеличивается примерно в 1,8 раза, парамеций – в 1,2 раза (n=5, p<0,05). Причиной этого может быть нормализация клеточного дыхания, нарушенного в результате связывания митохондриальных ионов Fe2+ пиколиновой кислотой (Fortnagel, Freese, 1968).

Таким образом, наши данные показали, что ПК и ее структурные аналоги в концентрациях до 1 мМ, оказывают на клетки инфузорий цитостатическое действие, свыше 1 мМ - цитотоксическое действие.

Механизм цитотоксического действия ПК на микроорганизмы связан не с нарушением структурной организации клетки, а с нарушением ряда ее функций, и, в первую очередь, работы ГТ-зависимой защитной системы и с хелатацией железо-зависимых ферментов, участвующих в регуляции энергетического обмена (НАД+ и НАДФ+).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ T. PYRIFORMIS GL В данной главе представлены результаты экспериментов по изучению действия EGF, инсулина, серотонина и ацетилхолина на рост культуры T.

pyriformis GL и результаты опытов по исследованию активности ключевых ферментов, обеспечивающих функционирование гормон-стимулируемых сигнальных систем.

Изучение действия EGF на рост культуры. Установлено, что активированные к пролиферации клетки T. pyriformis GL раньше вступают в деление, чем интактные клетки, растущие в среде без EGF. Первые деления тетрахимен, подвергнутых действию EGF, после вступления в клеточный цикл мы отмечали на 30 мин раньше, чем деления клеток интактных культур. Пик клеточных делений в опытных культурах приходился на 2 ч 30 мин., в контрольных – на 3 ч от начала инкубации.

Следующий максимум клеточных делений в активированных к пролиферации опытных и интактных культурах T. pyriformis GL, был отмечен через 5 ч 30 мин. и 6 ч соответственно. При этом в процессе 2-ого клеточного цикла, отмечено и существенное уменьшение общей численности тетрахимен после деления. По-видимому, гибель части популяции связана с формированием нежизнеспособных клеток из-за их преждевременного вступления в S-период до завершения прохождения периода G2. Важно отметить, что культуры T. pyriformis GL в стационарной фазе роста не реагировали на присутствие EGF в среде культивирования.

Через 6 ч инкубации индекс клеточных делений (ИКД) в опытных культурах был таким же, как и в контрольных культурах, и составил менее 5 % (n=100, p<0,05).

Через 24 ч инкубации активированные к пролиферации культуры T.

pyriformis GL вступали в раннюю стационарную фазу. ИКД на этом сроке инкубации был примерно одинаковым и составил 9,7 % в опытных и 9,5 % (p<0,05) в контрольных культурах. Количество делящихся клеток в поздней стационарной фазе культуры (96 ч), инкубированных как в присутствии EGF, так и без него, было одинаковым и составило менее 1 % (p<0,05).

Изучение действия EGF на синтез ДНК. Для того чтобы детализировать и количественно описать процессы, которые лежат в основе стимулирующего действия EGF на рост культуры T. pyriformis GL, изучали динамику изменения внутриядерного содержания ДНК в клетках тетрахимен. Установлено, что клетки тетрахимен, находящиеся в логарифмической фазе роста и активированные EGF, раньше, чем интактные клетки, достигают максимального среднего содержания ДНК в расчете на 1 ядро. Пик этого показателя у интактной культуры приходится на 2 ч 30 мин, после чего к 3 ч происходит его снижение в результате массового деления клеток, приводящего к снижению доли особей, достигших стадии G2, и увеличению доли клеток, перешедших в стадию G– G1. При этом среднее содержание ДНК в ядрах клеток, стимулированных EGF, достигает максимума уже через 1 ч после начала опыта, однако этот максимум ниже, чем в интактной культуре через 2 ч мин вследствие того, что процесс деления клеток, стимулированных EGF, начинается значительно раньше. После завершения первого клеточного цикла в интактной культуре различия среднего содержания ДНК в контрольной и стимулированной EGF культурах нивелируются и становятся статистически недостоверными, а сами эти средние значения постепенно снижаются и достигают минимума через 24 ч.

Среднее содержание ДНК в ядрах клеток тетрахимен, находящихся в стационарной фазе роста, обнаруживало лишь незначительные колебания на протяжении 24 ч, причем наблюдавшиеся небольшие различия этого показателя между интактными клетками и клетками, растущими в присутствии EGF, во всех случаях были статистически недостоверными (p > 0,05).

Действие инсулина и инсулина в сочетании с EGF на рост культуры. Первые массовые клеточные деления в этих культурах отмечали уже через 30 мин после внесения ростовых факторов, в то время как в контрольной культуре выраженный пик клеточных делений наблюдался только к 2 ч (Шемарова и др., 2002). По-видимому, более раннее вступление инфузорий в фазу деления в опытных культурах объясняется тем, что факторы роста индуцируют деление субпопуляции клеток, вступивших в цикл в фазе G2, а отсутствие прироста популяций после первого деления на сроке 1 ч культивирования указывает либо на общую функциональную нежизнеспособность клеток, появившихся в результате экзогенной митогенной стимуляции, либо на отсутствие в них полноценного механизма внутриклеточной защиты от действия ксенобиотиков. Кроме того, во всех опытных культурах на сроках 30 мин и 1 ч, а в культурах, растущих в присутствии одновременно EGF и инсулина, и на сроке 4 ч, выявлялись очень мелкие клетки с высокой плотностью ядерного хроматина и низким содержанием ДНК, т.е. обладающие признаками стареющих клеток непролиферирующих культур (Епифанова и др., 1983).

Изучение действия инсулина и инсулина в сочетании с EGF на синтез ДНК. В данном разделе работы представлены результаты –исследования действия инсулина [10 М] и EGF [10 –8 М] в сочетании с –инсулином [10 М] на синтез ДНК активированных к пролиферации клеток T. pyriformis GL. Сравнительные данные по оценке действия на синтез ДНК инсулина и EGF при их раздельном и совместном использовании в пролиферирующих клетках тетрахимен представлены на гистограмме (рис. 5). Обнаружено, что интактные клетки, а также клетки, инкубированные с EGF в сочетании с инсулином, вступают в S-фазу позже, причем максимальное содержание ДНК в интактных клетках отмечалось на сроке 2,5 ч, а в клетках, инкубированных с EGF в сочетании с инсулином на сроке 4 ч. Второй максимум внутриядерного содержания ДНК в контрольных клетках и третий - в клетках, культивируемых с EGF и в присутствии EGF в сочетании с инсулином, наблюдался на сроке 4 ч, причем в клетках, инкубированных с EGF, содержание ДНК в ядрах было значительно выше, из чего можно заключить, что EGF стимулирует синтез Рис. 5. Влияние EGF и инсулина при их раздельном и совместном применении на среднее содержание ДНК в ядрах клеток Tetrahymena pyriformis GL, стимулированных к пролиферации. По горизонтали – время, ч; по вертикали – содержание ДНК, отн. ед. 1 – контроль; 2 – EGF; – инсулин; 4 EGF + инсулин. Вертикальные отрезки – среднеквадратичные отклонения.

ДНК и скорость прохождения клеток по клеточному циклу. В клетках, культивируемых в присутствии инсулина, максимальное содержание ДНК отмечалось на сроке 1,5 ч, но его значение лишь незначительно отличалось от значений на других определяемых сроках (рис. 5), из чего становится очевидным, что инсулин не препятствует вступлению клеток в фазу синтеза ДНК, но блокирует их дальнейшее прохождение по циклу.

Таким образом, проведенные исследования показали, что инсулин и EGF, являющиеся стимуляторами роста многих типов клеток млекопитающих, оказывают митогенный эффект и на клетки тетрахимен, который проявляется в их стимулирующем действии на скорость синтеза ДНК, усилении синхронизации клеточного деления (в случае применения EGF) и увеличении численности клеток в период экспоненциального роста культуры.

ЦИТОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ T. PYRIFORMIS GL В данном разделе обобщены результаты наших исследований, посвященных изучению механизмов передачи митогенных сигналов в клетках T. pyriformis GL. Рассмотрено действие EGF на синтез РНК, общего белка, активность аденилатциклазы, а также действие активатора и блокаторов кальциевых каналов и ключевых ферментов фосфоинозитидного и тирозинкиназного путей на синтез ДНК у T.

pyriformis GL.

Изучение влияния EGF на синтез РНК и общего белка.

Результаты измерения РНК и белка в цитоплазме клеток, помещенных в среду с EGF, показали, что их содержание по сравнению с контролем возрастает через 1 ч после начала опыта (табл. 3).

Таблица 3. Динамика синтеза РНК и белка в Tetrahymena pyriformis GL, стимулированнных EGF (n = 100) Количество РНК*, отн. ед. Количество белка*, отн. ед.

Время, ч Контроль EGF Контроль EGF 1 46,5 ± 0,1 53,5 ± 0,1 23,0 ± 0,1 25,1 ± 0,1,5 47,9 ± 0,1 57,0 ± 0,2 27,1 ± 0,1 39,6 ± 0,2 56,6 ± 0,2 48,4 ± 0,1 33,9 ± 0,1 24,3 ± 0,2,5 54,2 ± 0,2 53,6 ± 0,1 27,5 ± 0,2 47,5 ± 0,3 47,1 ± 0,1 61,9 ± 0,2 28,4 ± 0,1 46,10 ± 0,* Представлены средние значения и их 95 %-ные доверительные интервалы.

Как в опыте, так и в контроле наблюдалось двухступенчатое повышение содержания белка и РНК в расчете на одну клетку. Первый минорный пик макромолекулярных синтезов в опытных культурах приходился на срок 1, 5 ч, второй – на срок 2, 5 ч для белка и на 3 ч для РНК. В контрольных культурах скорость синтеза макромолекул была ниже, и подъемы внутриклеточных уровней белка и РНК наблюдались позднее (Шемарова и др., 2004). Сравнение результатов митогенного действия EGF на тетрахимен, находящихся в раннем пререпликативном периоде, с данными, полученными в сходных экспериментах на многоклеточных системах, свидетельствует о том, что события раннего пререпликативного периода клеточного цикла высших и низших эукариот носят универсальный характер и лишь отчасти зависят от природы применяемого митогена.

Изучение влияния блокаторов тирозинкиназ на синтез ДНК.

Установлено, что тетрахимены, растущие в свежей питательной среде, в среде с EGF, а также в среде с ингибитором RTK - соединением AG1478, содержали на 12 - 25 % больше ДНК по сравнению с нестимулированными к росту клетками и клетками, растущими в среде с ингибитором Srcтирозинкиназ - соединением CGP77675. По-видимому, некоторое подавление синтеза ДНК, вызванное CGP77675, в большей степени обусловлено его цитотоксическим действием и лишь незначительно связано со специфическим влиянием на сигнальную функцию. На это может указывать гибель части клеточной популяции сразу после воздействия ингибитора и отсутствие фосфорилирования по тирозину в клеточных лизатах при использовании PY20 - моноклональных антител к фосфорилированному тирозину.

Рис. 6. Влияние ингибиторов тирозинкиназ на синтез ДНК в T.

pyriformis GL, стимулированных EGF. По горизонтали: 1- покоящиеся клетки без EGF, 2 – клетки после переноса в свежую питательную среду без EGF, 3 – клетки после переноса в свежую питательную среду с EGF, – клетки, вступившие в цикл, с EGF и ингибитором рецепторной тирозинкиназы (5 мкМ AG1478), 5 - клетки, вступившие в цикл, с EGF и ингибитором цитоплазматической тирозинкиназы (1 мкМ CGP77675) через 1 ч (а) и через 4 ч (б) культивирования. По вертикали – содержание ДНК, отн. ед.

Изучение влияния блокаторов Са2+-каналов и МАР-киназ на синтез ДНК. В работе было использовано соединение PD98059, которое является ингибитором МАР ERK1,2-киназ. Установлено, что 1 ч преобработка тетрахимен 40 мкМ PD98059 в значительной степени замедляла скорость синтеза ДНК в клетках, стимулированных EGF. При этом максимальная задержка синтеза ДНК отмечена на сроке 3,5 ч, что может говорить об участии этих ферментов в передаче сигнала в S-фазу клеточного цикла (Шемарова и др., 2007). Очевидно, что, как и аналогичные МАР-киназы позвоночных животных, ERK1,2-подобные киназы тетрахимен, являются Са2+-зависимыми. На их кальций-зависимый характер указывала задержка синтеза ДНК в стимулированных EGF клетках под действием LaCl3 - блокатора неселективных Са2+-каналов.

Начальный ингибирующий эффект La3+ выявлен на сроке 1 ч.

Тенденция к задержке синтеза ДНК в клетках, преинкубированных с LaCl3, сохранялась на протяжении всего периода наблюдения (n =5, p<0,05). Эти результаты показывают, что ионы Са2+ необходимы для передачи митогенного сигнала в геном.

КОНЦЕПЦИЯ ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ЭВОЛЮЦИОННОГО РАЗВИТИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ Сигнальные системы одноклеточных микроорганизмов представляют собой сложноорганизованные сети сигнальных белков и молекул, образующих специализированные трансдукционные пути, которые берут начало от клеточной мембраны и заканчиваются в ядре. Сравнительный анализ внутриклеточной сигнализации у эукариотических микроорганизмов и Metazoa обнаружил множество элементов функционального и структурного сходства, которые позволяют рассматривать сигнальные системы одноклеточных эукариот в качестве эволюционных предшественников своих аналогов в клетках позвоночных (Шемарова, 2005, 2007; Shemarova, 2006).

Вопрос об эволюционном происхождении внутриклеточных сигнальных систем к настоящему времени остается еще открытым.

Отдельные элементы сигнальных систем, безусловно, имеющие древнейшее эволюционное происхождение, выявлены при изучении кальциевой сигнализации (Шемарова, Нестеров, 2005а,б, Shemarova, 2011) и сигнальной функции фосфорилирования белков по тирозину (Schemarova, 2006). Однако до сих пор нет концепции, которая объединила бы все общие закономерности функционирования внутриклеточных сигнальных систем у организмов разного филогенетического уровня. Мы полагаем, что такой интегрирующей концепцией может быть идея об едином происхождении внутриклеточных сигнальных систем высших и низших эукариот и об эволюционном развитии сигнальных систем высших эукариот из сигнальных систем одноклеточных организмов, отдельные компоненты которых обнаруживаются уже у прокариот (рис. 7).

Рис. 7. Гипотетическая схема эволюционного развития внутриклеточных сигнальных систем.

На схеме представлены основные этапы становления сигнальных систем, отражающие последовательность их развития в ходе прогрессивной эволюции.

Данная концепция не включает подробный анализ и сравнение «молекулярных инструментов», с помощью которых происходят эволюционные преобразования сигнальных систем при переходе одноклеточных организмов к многоклеточным, но позволяет получить более полную картину о путях эволюционного становления внутриклеточных сигнальных систем и отражает накопившиеся знания о механизмах сигнализации у низших эукариот.

Более подробно наши представления об эволюционном происхождении и развитии внутриклеточных сигнальных систем изложены в ряде работ (Шемарова, 2003, 2004; Шемарова, Нестеров, 2005а,б; Schemarova, 2006; Shemarova, 2007б, в; Шемарова, 2008, 2010, 2011, Shemarova, 2011).

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ НА T. PYRIFORMIS GL Проведенные нами исследования по биотестированию с использованием инфузорий T. pyriformis GL позволили оптимизировать методы культивирования инфузорий, условия экспериментов, отработать методы визуального и количественного контроля качества культуры, отработать режимы выращивания культуры на разных питательных средах в зависимости от назначения и др. Результаты экспериментов нашли отражение в «Методических рекомендациях» (Шемарова, 2007а). С помощью методов биотестирования на тетрахименах мы определяли качество корма на токсичность (в период за 2007-2010 гг. на базе ГУ «Санкт-Петербургская Городская ветеринарная лаборатория» было проведено более 100 исследований), изучали токсичность экспериментальных водных растворов, содержащих соли тяжелых металлов и гербициды (производные пиколиновой кислоты), безопасность лекарственных веществ (на примере верапамила), а также производили оценку митогенного действия ряда биологически активных веществ (EGF, инсулина, ацетилхолина и серотонина).

Оптимизация условий культивирования культур инфузорий T.

pyriformis GL. Преимуществом аксенических культур T. pyriformis GL по сравнению с моно- или поликсеническими культурами является их способность использовать в качестве пищевого субстрата органические компоненты питательной среды, а не кормовые микроорганизмы. Для того, чтобы оптимизировать процесс культивирования тетрахимен и увеличить продуктивность культуры мы изучали закономерности процесса роста культуры T. pyriformis GL на различных питательных средах и определяли рациональные условия культивирования тетрахимен.

В качестве белковых компонентов среды для тетрахимен применяли говяжью печень, пептон с добавлением дрожжевого экстракта или гидролизата лактальбумина (табл. 4).

Таблица 4. Влияние состава питательной среды на продуктивность культуры T. pyriformis GL Название Состав среды (из Вносимый Средний прирост среды расчета на 1 л белковый биомассы дистиллирован- компонент тетрахимен через ной воды) 48 ч культивирования, % (M ± ) 1 2 3 Минераль- NaCl - 0,1 г; КСl - - n = ная среда 0,01 г; СаСl2 - 0,01 Лозина- г; MgCl2-0,01 г;

Лозинского NaHCO2 - 0,02 г Поддержи- NaCl - 0,01 г; Говяжья n = вающая CaCl2 – 0,01 г; печень 5,0 ± 0,белковая KCl 0,06 г;

среда СaHРO4 – 0,04 г;

MgSO4 – 0,02 г;

печень гов. – 10 г Поддержи- NaCl - 0,01 г; Дрожжевой n = вающая CaCl2 – 0,01 г; экстракт 7,2 ± 0,углеводно- KCl 0,05 г;

белковая СaHРO4 – 0,04 г;

среда MgSO4 – 0,02 г;

дрожжевой экстракт – 1 г, глюкоза – 2 г Поддержи- NaCl - 0,01 г; Гидролизат n = вающая CaCl2 – 0,01 г; лактальбуми- 10,3 ± 1,углеводно- KCl 0,05 г; на белковая СaHРO4 – 0,04 г;

среда MgSO4 – 0,02 г;

лактальбумина гидролизат – 1 г;

глюкоза – 2 г 1 2 3 Стандарт- NaCl - 0,01 г; Пептон n = ная CaCl2 – 0,01 г; 120,2 ±6,ростовая KCl 0,06 г;

среда СaHРO4 – 0,04 г;

MgSO4 – 0,02 г;

пептон – 20 г Обогащен- NaCl – 0,01 г; Пептон n = ная CaCl2 – 0,01 г; Дрожжевой 150,3 ±5,углеводно- KCl 0,06 г; экстракт белковая СaHРO4 – 0,04 г;

среда MgSO4 – 0,02 г;

пептон – 20 г;

дрожжевой экстракт – 1 г;

глюкоза – 5 г; рН 7,4– 7,Обогащен- NaCl – 0,01 г; Пептон n = ная CaCl2 – 0,01 г; Гидролизат 170,1 ± 8,углеводно- KCl – 0,06 г; лактальбумибелковая СaHРO4 – 0,04 г; на среда MgSO4 – 0,02 г;

пептон – 20 г;

лакт. гидролизат – 5 г; глюкоза – 5 г; рН 7,4– 7,Из данных таблицы видно, что наиболее оптимальными для роста тетрахимен оказались обогащенные углеводно-белковые питательные среды, содержащие пептон в сочетании с дрожжевым экстрактом или гидролизатом лактальбумина (150,3% и 170,1 % прироста биомассы соответственно).

В процессе оптимизации состава питательной среды были определены рациональные физико-химические условия культивирования T. pyriformis GL. Установлено, что оптимальной для роста производственных культур тетрахимен является температура 28 ± 0,5 С, рН=7,4 – 7,6. При соблюдении данных параметров продуктивность культуры тетрахимен к 48 ч составила 2,2 - 2,5 х 106 кл/мл, что в среднем на 15% выше аналогичного показателя при использовании не стандартизированной по данным показателям технологии культивирования инфузорий (использование культур, растущих при комнатной температуре и в средах, приготовленных на растворах низкой буферной емкости).

Определение общей токсичности корма. Исследование токсичности корма экспресс-методом биотестирования проводили следующим образом.

Отобранные для анализа пробы комбикорма тщательно перемешивали и растирали в ступке. Из каждой пробы отбирали навеску по 300 мг. Навески вносили в пробирки, в каждую из которых заливали по 2 мл кипяченой воды, неплотно закрывали резиновыми пробками и прогревали в водяной бане 20 мин при температуре 90 С. После охлаждения до комнатной температуры в пробирки добавляли по 0,5 мл культуры Tetrahymena pyriformis GL и ставили в термостат при температуре 28 С на 24 ч. Через сутки оценивали токсичность корма по характеру роста и реакции гибели инфузорий. Токсичным считался корм, если в пробирках, содержавших экстракт навески такого корма, наблюдалось угнетение роста инфузорий. В пробирках, содержащих нетоксичный корм, отмечали густой рост инфузорий. При микроскопической оценке в пробирках, содержавших экстракты токсичного корма, выявляли малочисленные клетки типичной грушевидной формы и отдельные шаровидные клетки инфузорий. В пробирках, содержавших пробы нетоксичного корма и контрольных, не содержавших корм, наблюдали большое количество подвижных инфузорий типичной грушевидной формы и отдельные делящиеся клетки в виде гантелей.

Таблица 5. Качественная оценка токсичности корма методом биотестирования с использованием инфузорий T. pyriformis GL (n = 116) К-во проб Характер Гибель клеток,(% ) Степень роста через: токсичности корма (0 – IV) культуры 1 ч 24 ч 82 Густой 0 0 12 Средний 1-2 4-5 I 8 Ниже 4-5 15-20 II среднего 7 Очень сильно 35-40 65-70 Ш угнетен 7 Рост подавлен 50-75 95-100 IV При выявлении токсичности корма (II - IV степени) проводили дополнительное исследование его общей токсичности на кроликах путем постановки кожной пробы (ГОСТ Р52337-2005).

В результате сравнительных испытаний экспресс-метода биотестирования токсичности корма с использованием инфузорий Tetrahymena pyriformis GL и метода постановки кожной пробы на кроликах были выявлены следующие преимущества метода биотестирования с использованием инфузорий Tetrahymena pyriformis GL:

1. Большая оперативность экспресс-метода - получение результата через 24 ч после начала тестирования; в случае использования кожной пробы – через 120 ч.

2. Большая экономичность – уменьшение затрат на содержание кроликов, реактивы (ацетон) и специальное оборудование (вытяжной шкаф, вытяжка, клетки для кроликов и т.д.).

На основании всего вышесказанного был сделан вывод о том, что экспресс-метод биотестирования с использованием инфузорий Tetrahymena pyriformis GL целесообразно использовать в животноводческих хозяйствах для получения оперативной информации о качестве корма.

Определение безопасности лекарственных веществ. Для тестирования был выбран растворимый препарат верапамил - (RS)-5[(3,4-диметоксифенэтил)-метиламино]-2-(3,4-диметоксифенил)2изопропилвалеронитрила гидрохлорид - кардиологический препарат, антагонист кальция (Машковский, 2005).

Биотестирование безопасности верапамила. На основе углеводнобелковой питательной среды готовили растворы верапамила с содержанием вещества от 0,5 до 10 мг/л. Объем каждой пробы составлял 5 мл. В каждую пробу (3 повторности) вносили по 0,1 мл посевной культуры T. pyriformis GL в концентрации 2,5 х 106 кл/мл.

Таблица 6. Выживаемость инфузорий T. pyriformis GL в среде, содержащей верапамил (n = 5) Сод-е верапамила в Концентрация клеток % к контролю пробе, мг/л через 24 ч, тыс. кл/мл (Р < 0,05) (M ± ) 1 24,8 ± 3,3 95,3 25,5 ± 4,4 98,5 23,5 ± 2,3 90,7 25,8 ± 3,4 99,9 21,5 ± 2,9 82,10 21,0 ± 2,6 81,Параллельно готовили 3 контрольных пробы с ростовой средой, в которые также вносили по 0,1 мл культуры тетрахимен в той же концентрации.

Пробы помещали в термостат при температуре 28 С. Через 24 ч культивирования тетрахимен подсчитывали в камере Горяева.

Полученные результаты по выживаемости T. pyriformis GL в среде, содержащей верапамил, приведены в табл. 6. Видно, что при увеличении содержания препарата в пробе до 10 мг (1,5 терапевтические дозы) выживаемость T. pyriformis GL, растущих в его присутствии в течение ч, остается в пределах 81 %, что свидетельствует о низкой токсичности верапамила в данных концентрациях.

Для того чтобы определить возможность экстраполяции данных, полученных на инфузориях, на позвоночных животных мы продолжили испытания верапамила на травяных лягушках Rana temporaria с использованием метода компьютерной регистрации ЭКГ (Кузнецов, Шемарова, 2007).

Использование результатов биотестирования безопасности верапамила на тетрахименах в эксперименте по определению его действующей концентрации на сердце лягушки. В наших исследованиях опыты с верапамилом были проведены на механически фиксированных и обездвиженных лягушках в условиях in vivo и in situ (Шемарова и др., 2008). Регистрация ЭКГ, проведенная у животных до фармакологического введения верапамила, выявила правильный синусовый ритм (рис. 8, А) с частотой сердечных сокращений (ЧСС) 63,8 ± Рис. 8. ЭКГ лягушки в норме (А), через 10 (Б), 15(В), 50 (Г) мин после внутрисердечного введения верапамила в дозе 6 мг/кг. По оси абсцисс – время (с), по оси ординат – амплитуда (мВ).

6,5 уд/мин. После инъекции верапамила в дозе 6 мг/кг происходило развитие выраженной брадикардии, ЧСС снижалась на 50 – 70 %. У части животных развивалась бигеминия. Замедление ритма СС отмечалось на протяжении всего срока наблюдения (рис. 8, Б, В).

Сравнение результатов действия верапамила на ритм СС у лягушки с результатами, полученными на теплокровных животных, наряду с общими признаками (развитие брадикардии в результате понижения внутриклеточной концентрации Са2+ в предсердных миоцитах) (Lupi et al., 1979), выявило и ряд существенных различий. Так, у теплокровных животных брадикардия, индуцированная верапамилом, развивается значительно медленнее, чем у лягушки и, как правило, не сопровождается падением амплитуды потенциалов и появлением зон дополнительной эктопической активности (Gilmour, Zipes, 1983).

В целом, полученные данные открывают перспективу для использования двух разработанных нами методов для биотестирования новых кардиологических антиаритмических лекарственных препаратов на безопасность и эффективность на доклиническом этапе их испытаний.

Использование инфузорий T. pyriformis GL в биотестировании экотоксикантов и биологически активных веществ (БАВ). Было проведено более 550 исследований проб экспериментальных водных растворов, содержащих экотоксиканты (соли тяжелых металлов и гербициды), а также БАВ (гормоны и факторы роста) для выявления их биологического действия на тетрахимен на популяционном, клеточном и молекулярном уровнях.

В результате проведенных исследований установлено, что совокупность используемых методов биотестирования на популяционном, клеточном и молекулярном уровнях дает наиболее полную картину о биологическом действии веществ на тетрахимен. Наши исследования показали, что тест-реакции на уровне популяции являются эффективными для получения первичной информации об общей цитотоксичности веществ (солей тяжелых металлов, гербицидных препаратов) и о митогенном действии ряда БАВ (инсулина и EGF) на клетки. Тест-реакции (ФА, ИКД), выявляющие функциональные изменения на уровне клетки и молекулярном уровнях (активность ферментов, содержание ДНК), служат в качестве вспомогательных для подтверждения обнаруженной токсичности или биологической активности исследуемых веществ.

Сравнение результатов биотестирования с использованием инфузорий с результатами, полученными на крысах и кроликах, позволили разработать схему проведения исследований для выявления биологического действия испытуемых веществ на доклиническом этапе испытаний (рис. 9).

Таким образом, используя в работе различные методы воздействия на функциональные системы тетрахимен, мы получили положительный ответ на вопрос о возможности использования одноклеточных организмов в качестве альтернативы соматическим клеткам позвоночных животных и экстраполяции данных, полученных с использованием модельных одноклеточных организмов, на клетки позвоночных.

Инфузории T.

pyriformis GL Реакция Реакция Реакция гибели задержки роста увеличения роста ФА ИКД Кролики (выявление острой Содержание токсичности) Активность ГТ ДНК Перевиваемые клетки Лягушки (выявление позвоночных (выявление хронической митогенной активности) токсичности и безопасности ЛВ) Измерение амплитуды СС Измерение ритма СС Рис. 9. Схема биотестирования для выявления биологического действия испытуемых веществ на доклиническом этапе испытаний с использованием инфузорий T. pyriformis GL. Серым цветом показаны тесты, проводимые на тетрахименах.

ВЫВОДЫ 1. Тетрахимены - эффективные сенсоры изменений окружающей среды.

Реакция гибели клеток, изменение показателя прироста популяции, снижение уровня фагоцитоза, активности ГТ, угнетение синтеза ДНК в ядрах тетрахимен могут служить важными тест-реакциями для оценки токсичности объектов окружающей среды и изучаемых веществ.

2. На основании изучения действия экотоксикантов (солей тяжелых металлов, таких как Cd2+, Сu2+, Zn2+, Ni2+и комплексонов – производных пикалиновой кислоты и ЭДТА) на инфузорий Tetrahymena pyriformis GL на популяционном, организменном и молекулярном уровнях и проведенного сравнения тест-реакций тетрахимен с реакциями кардиомиоцитов (КМ) лягушки Rana temporaria и митохондрий крысы сделано заключение о возможности экстраполяции и частичного переноса данных, полученных с использованием тетрахимен, на позвоночных животных.

3. Тетрахимены являются клетками с индуцированным синтезом ДНК, что позволяет рассматривать их не только в качестве тест-объектов в экобиотехнологических исследованиях, но и в качестве возможных биологических моделей для изучения митогенных и цитостатических свойств лекарственных веществ, а также для предварительной оценки их безопасности.

4. Доказана возможность использования в биотестировании цитофотометрического метода для определения митогенного действия БАВ на одноклеточные микроорганизмы.

5. Показана принципиальная возможность использования T. pyriformis GL для биотестирования безопасности ЛВ. Гибель менее 20 % популяции тетрахимен в опытных пробах при испытании эффективных концентраций лекарственных веществ может свидетельствовать об их низкой токсичности и о пригодности данных ЛВ для дальнейших клинических испытаний на позвоночных животных.

6. Разработана система мер для стандартизации параметров биотестирования с использованием в качестве тест-объектов инфузорий T. pyriformis. Она включает применение лабораторного амикронуклеусного штамма T. pyriformis GL, обладающего генетической стабильностью, синхронизацию культуры перед использованием, применение оптимизированных по составу питательных сред и рациональных физико-химических условий культивирования тетрахимен. Преимуществом использования данного тест-объекта по сравнению с другими видами и штаммами инфузорий является их хорошая изученность, возможность культивирования в аксенических условиях и высокая сходимость результатов биотестирования.

7. Проведены производственные испытания экспрессного метода биотестирования токсичности корма на тетрахименах. Сделано заключение о целесообразности использования метода биотестирования на тетрахименах в животноводческих хозяйствах для получения оперативной информации о качестве корма.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Научные результаты работы внедрены в практическую деятельность ГУ «Санкт-Петербургская городская ветеринарная лаборатория» (Утв.

07.04.2011 № 99/01-11), а также лабораторий ветеринарно-санитарной экспертизы на рынках Санкт-Петербурга (Утв. 16.05.2011 № 01-18-372/110-0).

Научные результаты работы, включенные в «Методические рекомендации по использованию инфузорий Tetrahymena pyriformis GL в качестве тест-объектов в токсикологических, фармакологических и экологических исследованиях» (Шемарова, 2007) используются в учебном процессе при проведении лабораторно-практических занятий по курсу «Токсикология» на ветеринарном факультете Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (СПбГАВМ) (Утв.

10.02.2011).

Полученные в работе результаты и обобщения используются при чтении лекций по курсу «Протозоология» на ветеринарном факультете СПбГАВМ (Утв. 10.02.2011).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ Полученные результаты работы и выводы могут найти свое практическое применение в экобиотехнологии, ветеринарной медицине, фармацевтике, здравоохранении, в частности в животноводческих хозяйствах для получения оперативной информации о качестве корма, а также при разработке новых лекарственных препаратов для предварительной оценки их безопасности.

Выводы и результаты работы, изложенные в «Методических рекомендациях» могут использоваться в учебном процессе при проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии и фармакологии; их могут применять в своей работе специалисты производственных санитарно-гигиенических лабораторий, преподаватели биологических и сельскохозяйственных вузов, ветеринарные врачи и экологи.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Шемарова И.В. Внутриклеточная сигнализация у низших эукариот / И.В.

Шемарова. СПб. : Комильфо, 2010. - 345 с.

2. Shemarova I.V. Ca2+ Signaling in Lower Eukaryotes / I.V. Shemarova. In.: Calcium Signaling (Ed.: Masayoshi Yamaguchi). - New-York. Nova Science Publishers Inc., 2011. - P. 1 - 36.

3. Шемарова И.В. Методические рекомендации по использованию инфузорий Tetrahymena pyriformis GL в качестве тест-объектов в токсикологических, фармакологических и экологических исследованиях / И.В. Шемарова. СПб.:

СПбГАВМ, 2007. - 26 с.

4. Шемарова И.В. Сравнительное исследование влияния катионов кадмия в свободной и хелатированной формах на активность глутатион-S-трансферазы, рост и эндоцитоз культуры инфузорий Tetrahymena pyriformis / И.В.

Шемарова, А.Е. Хованских, Е.Б. Майзель // Журн. эвол. биохим. и физиол.

2000. - Т. 36. - № 2. - С.83-87.

5. Шемарова И.В. Аминооксидаза одноклеточных микроорганизмов Methanosarcina barkeri и Tetrahymena pyriformis / О.В. Ягодина, Е.Б.

Никольская, И.В. Шемарова, А.Е. Хованских // Журн. эвол. биохим. и физиол.

2000. - Т. 36. - № 3. -С. 184-187.

6. Шемарова И.В. Антипротозойное действие пиколиновой кислоты и некоторых ее структурных аналогов / И.В. Шемарова, Н.П. Степанова, И.В.

Возный, А.Е. Хованских // Хим.-фарм. журн. 2000. - Т. 34. - № 7. - С.13-15.

7. Шемарова И.В. Синтез и влияние на активность ЦТ Р-450 некоторых производных пиразолона и гидразидов никотиновой кислоты / И.В.

Шемарова, Н.П. Степанова, И.В. Возный, А.Е. Хованских // Хим.-фарм. журн.

2000. - Т. 34. - № 10. - C. 17-18.

8. Шемарова И.В. Участие пиридинкарбоновых кислот во внутриклеточной регуляции размножения у цилиат / И.В. Шемарова, А.Е. Хованских, Е.Б.

Майзель // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2001. - Т. 37. - № 1. - С.10-15.

9. Шемарова И.В. Стимуляция эпидермальным фактором роста пролиферации и синтеза ДНК в клетках Tetrahymena pyriformis / Г.В. Селиванова, И.В.

Шемарова, Т.Д. Власова // Онтогенез. 2002. - Т 33. - № 6. - С. 457-460.

10. Шемарова И.В. Влияние эпидермального фактора роста и инсулина на пролиферацию и синтез ДНК в клетках цилиат Tetrahymena pyriformis / И.В.

Шемарова, Т.Д. Власова Г.В. Селиванова // Цитология. 2002. - Т. 44. - № 11. - С. 1097-1103.

11. Шемарова И.В. Роль фосфорилирования по тирозину в регуляции пролиферации и клеточной дифференцировки у низших эукариот / И.В.

Шемарова // Цитология. 2003. - Т. 45. - № 2. - С. 196-215.

12. Шемарова И.В. Исследование механизма цитостатического действия пиколиновой кислоты на пролиферирующие клетки Tetrahymena pyriformis / И.В. Шемарова, С.М. Коротков, И.Ю. Носова // Докл. Академии Наук. 2003. - Т. 391. - № 2. - С. 276-280.

13. Шемарова И.В. Роль фосфоинозитидного пути передачи сигнала в клетках низших эукариот / И.В. Шемарова // Цитология. 2004. - Т. 46. - № 2. - С. 136150.

14. Шемарова И.В. Цитофотометрическое исследование влияния эпидермального фактора роста на синтез РНК и белка в инфузориях Tetrahymena pyriformis / И.В. Шемарова, Т.Д. Власова, Г.В. Селиванова // Цитология. 2004. - Т. 46. - № 11. - С. 993-995.

15. Шемарова И.В. Путь передачи сигнала через cAMPPKA в клетках низших эукариот / И.В. Шемарова // Цитология. 2005. - Т. 47. - № 4. - С. 296-309.

16. Шемарова И.В. Эволюция механизмов Са2+ сигнализации. Роль ионов Са2+ в сигнальной трансдукции у прокариот / И.В. Шемарова, В.П. Нестеров // Журн.

эвол. биохим. и физиол. 2005а. - Т. 41. - № 1. - С. 12-17.

17. Шемарова И.В. Эволюция механизмов Са2+ сигнализации. Роль ионов Са2+ в передаче сигнала у низших эукариот / И.В. Шемарова, В.П. Нестеров // Журн.

эвол. биохим. и физиол. 2005б. - Т. 41. - № 4. - С. 303-313.

18. Шемарова И.В. Роль протеинкиназных каскадов в передаче стрессовых сигналов в клетках низших эукариот / И.В. Шемарова // Цитология. 2006. - Т.

48. - № 2. - С. 993-995.

19. Шемарова И.В. Роль Са2+ и медиаторов симпатической нервной системы в передаче стрессового сигнала в кардиомиоцитах / И.В. Шемарова, В.П.

Нестеров // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2006. - Т. 42. - № 2. - С. 97-104.

20. Sсhemarova I.V. The Role of Tyrosine Phosphorylation in Regulation of Signal Transduction Pathways in Unicellular Eukaryotes / I.V. Sсhemarova // Curr. Issues Mol. Biol. 2006. - V. 8. - P. 27-50.

21. Шемарова И.В. Исследование механизма передачи пролиферативного сигнала, индуцированного EGF, у инфузорий Tetrahymena pyriformis / И.В.

Шемарова, Т.Д. Власова, Г.В. Селиванова // Цитология. 2007. - Т. 49. - № 2. - С. 156-160.

22. Шемарова И.В. Эволюция механизмов Са2+ сигнализации. Значение Са2+мессенджерных систем при переходе организмов к многоклеточности / И.В.

Шемарова, В.П. Нестеров // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2007. -Т.43. - № 2.

С. 117-124.

23. Шемарова И.В. Пути передачи апоптотических сигналов в клетках низших эукариот / И.В. Шемарова // Цитология. 2007б. - Т.49. - № 3. - С. 229-242.

24. Шемарова И.В. Роль сдвигов мембранного потенциала на начальных стадиях проведения сигнала в клетках низших эукариот / И.В. Шемарова // Цитология.

2007в. - Т.49. - № 11. - С. 952-265.

25. Shemarova I.V. Phosphoinositide signaling in unicellular eukaryotes // I.V.

Shemarova // Crit. Rev. Microbiol. 2007. - V. 33. - P.141-156.

26. Шемарова И.В. Преобразование механизмов внутриклеточной Са2+ сигнализации при переходе от прокариот к протистам и Metazoa / В.П.

Нестеров, И.В. Шемарова // Тез. VIII Междунар. совещ. и VI школы по эвол.

физиологии. 2007. С.-Петербург. - С. 153-154.

27. Шемарова И.В. Использование инфузорий Tetrahymena pyriformis GL в качестве тест-объектов для скрининговой оценки цитостатического действия потенциальных лекарственных препаратов / И.В. Шемарова, Г.В. Селиванова, Т.Д. Власова // Тез. докл. III Съезда фармакологов России. Санкт-Петербург.

2007. - Т. 2. - С. 2016.

28. Шемарова И.В. Метод компьютерной регистрации электрограмм сердца для выявления различий в действии лекарственных препаратов / С.В. Кузнецов, И.В. Шемарова // Тез. докл. научной конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина». Санкт-Петербург. - 2007. - C. 60-61.

29. Шемарова И.В. Особенности Са2+-регуляции функциональной активности миокарда лягушки Rana temporaria» / И.В. Шемарова, С.В. Кузнецов, И.Н.

Демина, В.П. Нестеров // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2008. - Т. 44. - № 1. - С. 117-124.

30. Шемарова И.В. Эволюция механизмов Са2+ сигнализации. Роль Са2+ в регуляции фундаментальных клеточных функций / И.В. Шемарова, В.П.

Нестеров // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2008. - Т.44. - № 4. - С. 341-351.

31. Шемарова И.В. Посттрансляционная регуляция программируемых клеточных процессов у низших эукариот // Цитология. 2008. Т. 50. № 8. С. 663 – 670.

32. Шемарова И.В. Регуляция продолжительности жизни у низших эукариот / И.В. Шемарова // Цитология. 2008. - Т. 50. - № 8. - С. 647-670.

33. Шемарова И.В., Селиванова Г.В., Власова Т.Д. Изменение содержания ДНК у стимулированных EGF инфузорий Tetrahymena pyriformis под действием кофеина, KCl и ингибиторов PLC и PKC / И.В. Шемарова, Г.В. Селиванова, Т.Д. Власова // Цитология. 2008. - Т. 50. - № 11. - С. 999-2004.

34. Шемарова И.В. Роль ацетилхолина в Са2+-зависимой регуляции функциональной активности миокарда лягушки Rana temporaria / И.В.

Шемарова, С.В. Кузнецов, И.Н. Демина, В.П. Нестеров // Журн. эвол. биохим.

и физиол. 2008. - Т. 44. - № 6. - С. 591-602.

35. Шемарова И.В. Инфузории Tetrahymena pyriformis GL – как альтернативные биологические модели в медико-биологических исследованиях /И.В.

Шемарова //Тез. докл. I Международн. конгресса ветеринарных фармакологов «Эффективные и безопасные средства». С.-Петербург. 2008. - С. 59.

36. Shemarova I.V. сAMP-dependent signal pathways in unicellular eukaryotes / I.V.

Shemarova // Crit. Rev. Microbiol. 2009. - V. 35. - P.23-42.

37. Shemarova I.V. Role of T-channels and Na+-Ca2+-exchanger in regulation of functional activity of frog myocardium / I.V. Shemarova, S.V. Kuznechov, I.N.

Demina // Abstr. of the report of conf. “Biological Motility: Achievements and Perspectives” Pushchino, Moscow region, Russia. 2008. - С. 156.

38. Шемарова И.В. Особенности передачи сигналов у паразитических низших эукариот / И.В. Шемарова // Цитология. 2009. - Т. 51. - № 11. – С. 880-895.

39. Шемарова И.В. Т-каналы и Na+,Ca2+-обменники как компоненты Са2+-системы регуляции активности миокарда сердца лягушки Rana temporaria / И.В.

Шемарова, С.В. Кузнецов, И.Н. Демина, В.П. Нестеров // Журн. эвол. биохим.

и физиол. 2009. - Т. 45. - № 3.- С. 319-328.

40. Шемарова И.В. Влияние окислительных процессов в митохондриях на сократимость сердечной мышцы. Эффекты Ni2+ / И.В. Шемарова, С.М.

Коротков, И.Н. Демина, В.П. Нестеров // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2010.

- Т. 46. - № 2. - C. 138-142.

41. Shemarova I.V. Signaling mechanisms of apoptosis-like PCD in unicellular eukaryotes // Comp. Biochem. Physiol. B. 2010. V. 155. P. 341 - 353.

42. Шемарова И.В. Влияние окислительных процессов в митохондриях на сократимость сердечной мышцы лягушки Rana temporaria. Эффекты кадмия / И.В. Шемарова, С.М. Коротков, В.П. Нестеров // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2011. - Т. 47. - № 4. - С. 306-310.

43. Шемарова И.В. Сигнальная функция кальций-связывающих белков у низших эукариот / И.В. Шемарова // Цитология. 2011. - Т. 53. - № 7. - С. 600 – 615.

44. Шемарова И.В. Концепция происхождения и эволюционного развития внутриклеточных сигнальных систем / И.В. Шемарова // Тез. XIV международного совещания и VII школы по эволюционной физиологии, посвященные памяти академика Л.А. Орбели, 24-26 октября 2011 г. –С. 207.

45. Шемарова И.В. Инотропное действие Сd2+ на сердечную мышцу лягушки Rana temporaria / И.В. Шемарова, В.П. Нестеров // Тез. XIV международного совещания и VII школы по эволюционной физиологии, посвященные памяти академика Л.А. Орбели, 24-26 октября 2011 г. - С. 207-208.

46. Шемарова И.В., Селиванова Г.В., Власова Т.Д. Влияние активатора и ингибиторов Са2+-каналов на пролиферативную активность инфузорий Tetrahymena pyriformis // Онтогенез. 2012. - Т. 43. - № 4. - С. 1-9.

БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю искреннюю благодарность своему научному консультанту доктору биологических наук Владимиру Петровичу Нестерову за ценные советы, постоянную поддержку и помощь при выполнении работы. Я глубоко признательна академику РАН, профессору, доктору биологических наук Н.Н. Никольскому (Институт цитологии РАН) за моральную поддержку, благожелательные советы и предоставление экспериментальной базы для проведения исследований по выявлению у тетрахимен рецепторов к EGF, кандидату биологических наук Е.Б.

Буровой за неоценимую помощь в освоении методов молекулярной биологии, а также своим постоянным соавторам и единомышленникам сотрудникам Лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН - кандидату биологических наук Г.В. Селивановой и Т.Д. Власовой за сотрудничество и помощь в проведении гистохимических исследований. Я очень благодарна сотрудникам Лаборатории функциональной биохимии беспозвоночных ИЭФБ РАН старшему лаборанту Т.Н. Ножко, кандидату биологических наук О.В. Ягодиной, кандидатам химических наук Е.М.Майзелю, Н.П. Степановой и И.В. Возному за синтез органических веществ, необходимых для выполнения моей работы, партнерство и сотрудничество в проведении исследований по выявлению действия продуктов органического синтеза и тяжелых металлов на активность ряда ферментов. Я искренне благодарна заведующему Лабораторией развития нервной деятельности животных в онтогенезе ИЭФБ РАН доктору биологических наук С.В. Кузнецову за понимание, поддержку и всестороннюю помощь в проведении физиологических экспериментов на позвоночных животных. Я глубоко признательна младшему научному сотруднику Лаборатории нейрофизиологии ИЭФБ РАН И.Ю. Носовой - за интерес, проявленный к моей работе, и методическую помощь, оказанную в проведении экспериментов по определению продуктов перекисного окисления липидов. Я благодарна сотрудникам Лаборатории молекулярной эндокринологии ИЭФБ РАН за бескорыстную помощь в экспериментах с использованием радиактивных изотопов, предоставленные печатные материалы и всестороннее обсуждение моей работы. Особую благодарность приношу своим друзьям и коллегам – сотрудникам Лаборатории функциональной биохимии мышц ИЭФБ РАН за доброе отношение, искреннюю поддержку и практическую помощь в проведении исследовательских работ на базе нашей лаборатории. Я благодарна руководителям ветеринарной службы Санкт-Петербурга, ветврачам, коллегам из Академии Ветеринарной Медицины (СПбГАВМ), помогавшим в организации производственных экспериментов и внедрении результатов моей практической работы в производство и учебный процесс.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.