WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

       

ГЫРЫЛОВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА

РОЛЬ Translocator protein (TSPO) В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ BRAF- ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ МЕЛАНОМЕ КОЖИ

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации  на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Новосибирск  – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский  государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук  Рукша Татьяна Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор кафедры физиологии,

факультета естественных наук,

ФГБОУ ВПО «Новосибирский

государственный университет»                Обухова Лидия Александровна

доктор медицинских наук, профессор

профессор кафедры патологической анатомии

ГБОУ ВПО «НГМУ» Минздрав России        Агеева Татьяна Августовна

Ведущая организация: ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения РАМН, Томск

Защита состоится «27» ноября 2012г. в «12-00» часов на заседании диссертационного совета Д.001.048.01 при ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2; г. Новосибирск, 630117;  тел/факс 8(383)333–64–56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН

Автореферат разослан «___»  октября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н.                 Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Злокачественные новообразования кожи, включая меланому кожи, в структуре всех злокачественных опухолей человека составляют более чем одну третью часть, что делает их одними из  наиболее часто встречающихся типов злокачественных новообразований (Pollock P.M. et al., 2003). Меланома кожи, являющаяся одной из наиболее  агрессивных опухолей, стремительный рост заболеваемости которым в последние десятилетия регистрируется во всем мире (Cormier J.N. et al., 2006), включая страны с исторически низким уровнем заболеваемости, в то время как заболеваемость другими видами рака, наоборот, снижается (Losina E, et al. 2007). Это позволяет расценивать меланому кожи как важную медико-социальную проблему, которая наносит невосполнимый экономический ущерб обществу.

По современным данным меланома характеризуется изначально молекулярным и генетическим разнообразием, определяющим клинический полиморфизм, а также особенности течения заболевания.

Пролиферация меланоцитов и меланобластов, выживание, дифференцировка и миграция являются важнейшими элементами нормальной физиологии кожи.  Как показывают последние исследования, одним из ключевых изменений, происходящих при развитии меланомы кожи, является мутагенная активация сигнального каскада митоген-активированных протеинкиназ (МАРК).

Хотя многочисленные исследования оценивали мутацию BRAF и сигнальный механизм МАРК как перспективную мишень для терапии меланомы кожи, начальные клинические исследования не показали эффективность лечения меланомы с использованием ингибиторов BRAF или МАРК–сигналрегулирующей киназы (МЕК). Это связано с тем, что высокая пластичность клеток меланомы кожи позволяет ей оставаться одной из наиболее резистентных опухолей к химиотерапии.

Для преодоления механизмов резистентности и повышения эффективности терапии меланомы кожи может являться потенциальной мишенью митохондриальный белок-переносчик Translocator Protein, TSPO. Показано, что TSPO, как один из компонентов митохондриальных пор,  может модулировать их функционирование путем увеличения  продолжительности открытия, что ведет к снижению мембранного потенциала (Decaudin D. et al., 2002). TSPO является внутриклеточным белком с преимущественной митохондриальной и ядерной локализацией. Показано участие  TSPO в регуляции пролиферации клеток, дифференцировки, апоптоза и ионного транспорта. Повышенные уровни TSPO обнаружены при различных типах злокачественных новообразований, в частности, при раке молочной железы, толстого кишечника, плоскоклеточном раке ротовой полости (Batarseh A. et al., 2010). Роль в канцерогенезе данного белка является изученной недостаточно, но предполагается, что он может потенцировать усиление клеточной пролиферации посредством участия в транспорте холестерина через биологические мембраны, что является необходимым для обеспечения пластических и энергетических затрат опухолевых клеток, характеризующихся высоким пролиферативным потенциалом. Помимо этого, выявлено, что лиганды TSPO при ряде злокачественных новообразований изменяют выраженность апоптоза, клеточной пролиферации.

Цель работы

Оценить возможность модуляции клеточной пролиферации и апоптоза лигандами белка-переносчика (Translocator protein, TSPO) в BRAF-позитивных меланомах кожи.

Задачи исследования

  1. Выявить особенности экспрессии TSPO в нейтрофилах периферической крови больных меланомой кожи;
  2. Определить уровень TSPO+ клеток и особенности экспрессии мРНК TSPO в клетках BRAF-позитивной меланомы кожи после инкубации с лигандом TSPO РК11195 в концентрациях 10 nmol/L, 100 nmol/L, 10µmol/L.
  3. Определить уровень TSPO+  клеток и особенности экспрессии мРНК TSPO в клетках BRAF-позитивной меланомы кожи после инкубации с МЕК-ингибитором UO126 в концентрациях 10 µmol/L, 50 µmol/L,  а также при сочетанной инкубации с UO126 и РК11195;
  4. Установить характер влияния лиганда TSPO, в том числе при сочетанном применении с МЕК-ингибитором UO126 на выраженность апоптоза и пролиферации опухолевых клеток BRAF-позитивной меланомы кожи;
  5. С помощью молекулярно-генетического анализа выявить частоту встречаемости BRAF-позитивных меланом кожи, а также клинико-гистологических вариантов меланомы кожи в Красноярском крае.

Научная новизна

В представленной работе впервые получены данные о характере экспрессии TSPO в клетках BRAF-позитивной меланомы кожи, в том числе после воздействия лигандом TSPO и МАРК-ингибитором UO126.

Впервые оценены изменения уровня пролиферации и апоптотической гибели в клетках BRAF-позитивной меланомы кожи при модуляции уровня TSPO; показано преимущество комбинированного применения модуляторов TSPO и МАРК-ингибиторов для индукции апоптоза в клетках меланомы. Впервые установлено регулирующее действие сигнального пути МАРК на уровень экспрессии TSPO в клетках меланомы кожи.

Впервые исследованы пациенты с меланомой кожи на предмет наличия мутации гена BRAF в Красноярском крае, а также выявлены клинико-гистологические особенности меланомы кожи в зависимости от  BRAF-статуса.

Научно-практическая значимость работы

Полученные экспериментальные данные указывают на возможность использования TSPO в качестве патогенетической мишени для модуляции уровня пролиферации и апоптоза клеток меланомы.

Показано, что BRAF-позитивные меланомы кожи в высокой степени присутствуют в популяции больных меланомой кожи, что также подчеркивает необходимость дальнейших разработок, поиска молекулярных мишеней для терапии данного молекулярного-генетического варианта опухоли.

Выполненная работа поддержана грантом Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности (2010 г.).

Положения, выносимые на защиту

  1. У больных меланомой кожи по сравнению со здоровыми лицами, изменена функциональная активность нейтрофилов, о чем свидетельствует снижение экспрессии TSPO в нейтрофилах периферической крови
  2. Лиганд РК11195, специфически связываясь с TSPO, способен повышать его экспрессию  в клетках меланомы кожи в наномолярных концентрациях, изменение экспрессии данного митохондриального белка происходит однонаправлено с уровнем апоптоза; ингибитор МАРК UO126 повышает уровень экспрессии мРНК TSPO в клетках меланомы кожи SK MEL1, что доказывает его способность оказывать регулирующий эффект на TSPO;
  3. Лиганд TSPO РК11195 и ингибитор МАРК UO126 в эксперименте способен изменять выраженность апоптоза и уровень пролиферации в клетках меланомы кожи SK MEL1, характеризующихся положительным BRAF-статусом. При комбинированном использовании лиганда TSPO РК11195 и МАРК-ингибитора UO126 достигается более выраженный активирующий эффект в отношении уровня апоптоза клеток меланомы кожи.

Внедрение результатов исследования

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в практику лаборатории биохимии опухолей ФГБУ НИИ Онкологии СО РАМН с 11 января 2012г. Также результаты внедрены в учебный процесс кафедры нормальной анатомии и гистологии человека ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет Минздрава» со 10 сентября 2012 г., в календарно-тематический план практических занятий по теме: «Цитология. Жизненный цикл клетки». 

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на заседании кафедры патологической физиологии имени проф. В.В. Иванова Красноярского государственного медицинского университета имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, на IV и V региональной конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009, 2011 гг.), 18-ом и 20-ом Конгрессе Европейской Академии Дерматологии и Венерологии (Берлин, 2009г., Лиссабон, 2011 г.), 6-ом Весеннем Симпозиуме Европейской Академии Дерматологии и Венерологии (Верона, 2012г.), в рамках Летней школы для дерматовенерологов «Research and Imaging Techniques» (Вена, 2010 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе в 4 журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования статей, содержащих результаты диссертационных исследований. Получен  патент  Российской Федерации на изобретение №2455993 «Способ индукции апоптотической гибели клеток меланомы кожи», заявка № 2011127875, приоритет изобретения 6 июля 2011г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 107 страниц текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 14 рисунков, 6 таблиц. Библиографический список содержит 161 источник, из которых 8 отечественных и 157 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Гисто-морфологические особенности меланомы анализировались при проведении ретроспективного анализа 350 историй болезней пациентов находившихся на стационарном лечении в КГУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер» с 2003 по 2007 гг. с диагнозом злокачественная меланома кожи (рубрика С43) в соответствии с МКБ-10. Из которых 238 человек были женщины, 112 – мужчины. Средний возраст больных составил 56 лет [доверительный интервал 95% (ДИ 95%), 46,25-68]. Средний возраст мужчин составлял 55 [ДИ 95%, 44-65] лет, женщин 58 [ДИ 95%, 48-69] лет. Из 350 пациентов 255 человек были с впервые установленным диагнозом (72,5 %). Средний возраст первичных больных был 55 [ДИ 95%, 45-65]. Оценивались поло-возрастные показатели, клинико-морфологические данные пациентов.

При анализе стадирования меланомы по классификации Американского Объединенного Комитета по Раку (AJCC) выявлено, что из 255 пациентов с впервые установленным диагнозом у 54 (21%) меланома кожи определялась на III-IV стадиях, то есть у этой группы больных имелась метастазирующая опухоль.

Среди морфологических разновидностей наиболее часто встречалась поверхностно распространяющаяся меланома (57%), а также узловая форма пигментной меланомы (28%). Классификация меланомы кожи на различные субтипы основывается на анатомических и эпидемиологических особенностях, что в дальнейшем находит отражение в различиях в прогрессировании опухоли и, как следствие, в различном прогнозе заболевания. Молекулярно-генетические исследования выявили различия между меланомами разных субтипов, объясняющие разницу в эволюции данного новообразования (Curtin J.A. et al., 2005, Poetsch M. et al., 2003).

69% пациентов с поверхностно распространяющейся формой меланомы  составили женщины, и 31% мужчины. При узловой меланоме распределение по полу также было сходным: 63% женщин и 37% мужчин. Хотя считается, что подтип меланомы рассматривается как важный прогностический фактор, и узловая меланома признана более агрессивной формой опухоли, так как имеет более выраженную вертикальную фазу роста и соответственно более высокий уровень инвазии, достоверных различий между пациентами с определяемыми метастазами и без метастазов при распределении клинико-морфологических типов меланомы выявлено не было.

Толщина агрессивного компонента рассматривается как одна из наиболее важных переменных для определения прогноза. В проанализированных историях болезней верификация уровня инвазии при гистологическом исследовании проводилась по Кларку. Согласно этой классификации не первом уровне инвазии меланомные клетки заполняют весь верхний слой кожи, эпидермис, по-другому melanoma in situ. При втором уровне инвазии идет распространение клеток во второй слой кожи, дерму, на третьем-четвертом уровне происходит заполнение клеток меланомы на всю толщу дермы, при этом находятся в пределах этого слоя. При пятом уровне инвазии распространение опухоли происходит за пределы дермы, в подкожножировую клетчатку.

У большей части пациентов (119 человек, 46,9%) меланома определялась на III уровне инвазии, когда клетки меланомы заполняют весь сосочковый слой дермы, но не проникают в сетчатый слой. При этом у мужчин и женщин различий выявлено не было в распределении пациентов в зависимости от уровня инвазии, почти в половине случаев вне зависимости от пола доминировал III уровень: 43 и 48,5% соответственно. Кроме того, обращает на себя внимание достаточно высокий процент пациентов с неустановленным уровнем инвазии – 7,1%, при этом в группе мужчин и женщин доля таких пациентов равна.

Морфологические, молекулярно-генетические, культуральные исследования проводились на кафедре патологической физиологии им. проф. В.В. Иванова ГОУ ВПО «Красноярский государственные медицинский университет», в лаборатории фотобиологии Учреждения Российской академии наук «Институт биофизики СО РАН».

Человеческая культура клеток меланомы кожи SK-MEL-1 (American Type Cells Collection) была любезно предоставлена Московским НИИ Медицинской Экологии. Данная культура меланомы кожи имеет мутацию BRAF V600E, что было подтверждено результатами определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ анализ). Клетки выращивались в среде RPMI 1640 с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки с добавлением 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина при 37 °C в CO2 инкубаторе (5% CO2). Клетки рассеивались в чашки Петри с плотностью 2-4*106 кл/мл за 24 часа до начала эксперимента.

Далее клетки инкубировались с модуляторами МАРК и TSPO. Клетки рассеивались в чашки Петри с плотностью 2-4*106 кл/мл на следующий день к суспензии  клеток добавлялся TSPO лиганд РК11195 (Sigma) в концентрации 10 µmol/L, 100 nmol/L и 10 nmol/L. В другой группе к суспензии  клеток добавлялся блокатор МАРК - U0126 (Sigma) в концентрации 10 и 50 µmol/L. В третьей серии экспериментов проводилось инкубирование клеток меланомы одновременно блокатором МАРК U0126 и лигандом РК11195 в концентрациях 10 µmol/L и 100 nmol/L соответственно.

В контрольной группе клетки оставались без лечения. Через 72 часа осуществлялось центрифугирование клеток в течение 10 минут со скоростью 1,5 тыс./об., клеточный осадок промывался в холодном фосфатно-солевом буфере. Далее проводились морфологические исследования.

Иммуноцитохимическое исследование проводилось с культурой клеток SK-MEL1. Клетки рассеивались в чашки Петри с плотностью 2-4*106 кл/мл за 24 часа до экспериментов. После проведения экспериментального лечения  клетки промывались, переносились на стекла и высушивались в парах 10% формалина для фиксации в течение 30 минут. После этого проводилось окрашивание согласно стандартным методикам с моноклональными антителами к TSPO (Trevigen, разведение 1:400). Также проводилось окрашивание с моноклональными антителами к PCNA (Proliferating cell nucleus antigen, ядерный антиген клеточной пролиферации, Novocastra, разведение 1:200), маркером клеточной пролиферации. Для визуализации использовалась система иммунопероксидазной детекции Ready-to-Use (NovoLink Polymer Detection System, Leica Microsystems, Newcastle, United Kingdom) и диаминобензидин в качестве хромогена. Подсчет положительно окрашенных клеток производился при увеличении х400 с помощью микроскопа Olympus BX-41. Определялся процент положительно окрашенных клеток на 100 клеток.

Выраженность апоптоза оценивалась с помощью окраски акридиновым оранжевым/бромистым этидием  (AO/EB) (Gerbu Biothechnick GmbH, MP Biomedicals Inc.) согласно Ribble D., 2005 (Ribble D. et al., 2005). Определялся процент апоптотических клеток с ядром, окрашенным (полностью или фрагментарно) в оранжевый цвет. Ядра живых клеток окрашивались в зеленый цвет. Визуализация проводилась с помощью флюоресцентного микроскопа Primo Star (Carl Zeiss MicroImaging GmbH), подсчитывалось число апоптотических клеток на 100 визуализируемых клеток.

Для определения полиморфизма гена BRAF V600E в качестве материала использовались гистологические срезы меланомы кожи, которые были получены от 47 пациентов с меланомой кожи, после хирургического иссечения опухоли в Красноярском краевом онкологическом диспансере им. А.И. Крыжановского. После иссечения опухоль была подвергнута стандартной методике фиксации для получения гистологических срезов. Выделение ДНК проводилось из гистологических срезов согласно стандартной методике с использованием комплекта реагентов ДНК-сорб В (AmpliSens, ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора). Выделенные образцы ДНК хранились при -20°С.

Для выявления мутации использовался метод определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ анализ, RFLP-restriction fragment length polymorphism) описанный  Nagasaka T. et al. [Nagasaka T. et al., 2004]. Праймеры Mt-F, Wt-R и Mt-R (ООО «Сибэнзим», Новосибирск) были созданы для представления сайта рестрикции Btsl (BioLabs, New England) в диком аллеле для анализа 600 кодона гена BRAF. Амплификация проводилась на амплификаторе BIS Termocycler в объеме 25 мкл, содержащем ПЦР буфер, 1.5 ммоль/л MgCl2 (ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора), 0.2 мкмоль\л каждого праймера Mt-F и Wt-R, 0.1ммоль/л dNTPs (5х dNTPs mix, ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора), 0.625 единиц TaqF полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора) и 50 нг выделенной ДНК. Условия ПЦР были следующими: 95° С - 11 мин, и 30 циклов: 95° С - 30 сек., 58° С - 30сек., 72° С - 30 сек.; и 5 мин при 72° С.

Полученные ампликоны переосаждались по стандартной методике, и подвергались рестрикции с помощью рестриктазы Btsl при  температуре 55є С в течение 6 часов. Для определения массы полученных продуктов рестрикции осуществляли электрофоретическое разделение в 12%-ом полиакриламидном геле (камера для электрофореза Helicon) при следующих параметрах: сила тока - 50 мА, напряжение – 400 В, мощность – 15 Вт. После завершения электрофореза гель окрашивался бромистым этидием в течение 5 мин. Визуализация продуктов рестрикции осуществлялась с помощью прибора ChemiDoc (BioRad).

Далее проводился второй этап анализа со второй парой праймеров Mt-F и Mt-R, в тех же условиях. После амплификации продукты второго этапа ПЦР переосаждались и подвергались рестрикции в тех же условиях. В случае присутствия мутации гена  BRAF в 600 кодоне ПЦР продукты массой 130 нуклеотидных пар (base pair, bp) разрезались на фрагменты массой 112 и 18 нуклеотидных пар, в случае отсутствия данной мутации продукты рестрикции были следующие: 78, 34 и 18 нуклеотидных пар.

Для определения уровня мРНК TSPO использовался метод ПЦР в реальном времени. Для этой цели из клеток меланомы после инкубации с РК11195 и клеток контрольной группы производилось выделение РНК с помощью набора для выделения РНК «Рибо-золь-В» (AmpliSens) в соответствии с инструкцией производителя, после выделения РНК осуществлялась реакция обратной транскрипции с использованием комплекта реагентов «Реверта» (AmpliSens). Синтезированную в результате обратной транскрипции кДНК непосредственно использовали для постановки  ПЦР в реальном времени, применяя специфичные праймеры к TSPO и -актину в качестве эндогенного контроля (TaqMan, Applied Biosystems). Амлификацию и детекцию осуществляли методом ПЦР в реальном времени на приборе StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Качественные результаты РТ ПЦР были проанализированы по методу сравнения ДCt, который определяет амплификационный цикл, во время которого флюоресценция образца стала достоверно выше базального сигнала. Мы выполняли соответствующую оценку TSPO сигналов путем нормализации TSPO сигналов к сигналам от -актина (Applied Biosystems). Программа термоциклирования при следующих условиях: 50°C — 2 мин, 95°C — 10 мин, 45 циклов: 95°C — 15 сек, 60°C — 1 мин. 

Дизайн эксперимента представлен на рис. 1.

Для статистической обработки результатов исследования использовали пакет программ Statistica 6.0. Применяли методы описательной статистики, результаты исследования проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса. В случае нормального распределения был использован t-критерий Стьюдента для независимых групп, в случаях, где распределение полученных статистических показателей отличалось от нормального, сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи U-критерии Манна-Уитни. Для количественных признаков общее межгрупповое различие оценивали при помощи критерия Крускала – Уоллиса. Для оценки качественных признаков применяли точный односторонний критерий Фишера. Статистическую обработку динамических рядов производили с помощью полинома второй степени.

Выборочные параметры, приводимые в таблицах имеют следующие обозначения: Me -медиана, p- достигнутый уровень значимости, n- объем анализируемой подгруппы. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

А.

Больные с меланомой кожи

Биоптаты кожи

ПДРФ анализ, определение мутации BRAF V600E

В.

Рис. 1. Дизайн экспериментальной работы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первоначально была исследована экспрессия TSPO в клетках меланомы кожи клеточной линии SK-MEL1 и в нейтрофилах пациентов с меланомой кожи, а также проведен анализ изменения экспрессии TSPO в клетках меланомы после инкубации клеток меланомы с его лигандом РК11195.

В клетках млекопитающих TSPO преимущественно локализуется в митохондриях, и соответственно, участвует в регуляции фундаментальных процессов клетки. Однако, также было продемонстрировано, что TSPO экспрессируется и в плазматической мембране эритроцитов, клеток, не имеющих ни ядра, ни митохондрий (Olson J.M. et al., 1988). Кроме того, регистрируется экспрессия  TSPO в плазматической мембране  и цитоплазме нейтрофилов, определяющаяся по результатам иммуноцитохимического исследования, что приводит к стимуляции НАДФН-оксидазной активации этих клеток (Zavala F. et al., 1991).

Определяли количество TSPO+ полиморфноядерных нейтрофилов в периферической крови у пациентов с меланомой кожи. Для этого проводилось иммуноцитохимическое окрашивание полиморфноядерных нейтрофилов (ПЯН), выделенных из  периферической крови здоровых лиц и больных меланомой кожи,  моноклональными антителами к TSPO. Оценивалось число положительно окрашенных клеток. Локализация TSPO в ПЯН преимущественно была ядерной и цитоплазматической. В нейтрофилах периферической крови здоровых лиц количество TSPO+  окрашенных клеток составляло 98,25%. Определено достоверное снижение количества TSPO+ ПЯН у больных меланомой кожи, по сравнению с показателями у здоровых лиц: 88% и 98,25% соответственно (р=0,016) (Рис. 2). Снижение количества TSPO+  ПЯН у больных меланомой по сравнению с показателями здоровых лиц указывает на изменение функциональной активности нейтрофилов при меланоме кожи, а также дисрегуляцию экспрессии TSPO при развитии меланомы кожи.

При иммуноцитохимическом исследовании клеток меланомы SK-MEL1 с моноклональными антителами к TSPO определялась преимущественно цитоплазматическая локализация белка. В клетках меланомы кожи контрольной группы количество TSPO+  клеток составляло 8 положительно окрашенных клеток на 100 клеток меланомы (Рис. 3).

   

Рис. 2.                                                         Рис. 3.

Рис. 2. TSPO+  полиморфноядерные нейтрофилы в периферической крови пациента с меланомой кожи: TSPO+ клетки окрашены иммунопероксидазным методом. Ув. x400.

Рис. 3. TSPO+ клетки меланомы кожи SK-MEL1:TSPO+ клетки окрашены иммунопероксидазным методом. Ув. x400.

Как известно, TSPO локализуется на наружной митохондриальной мембране, однако, также была отмечена и перинуклеарная экспрессия в клетках рака молочной железы [Pretner E. et al., 2006].  По результатам иммуноцитохимического исследования в культуре клеток меланомы кожи TSPO определялся преимущественно в цитоплазме (Рис. 3). В клетках меланомы кожи SK-MEL1 уровень TSPO составлял 8 положительно окрашенных клеток на 100 клеток меланомы.

В дальнейшем после инкубации клеток меланомы с лигандом TSPO РК11195 происходило достоверное увеличение количества TSPO+  клеток с 8% уровня до 70-85% в зависимости от выбранной концентрации лиганда: максимальный уровень иммунопозитивных к TSPO клеток определялся при инкубации с РК11195 в концентрации 10 µmol/L. По результатам ПЦР в реальном времени уровень экспрессии мРНК TSPO изменялся только после инкубации с РК11195 в концентрации 100 nmol/L (р<0,05) (Рис. 4). Таким образом, специфический лиганд TSPO РК11195 связывается со своим белком  и резко увеличивает количество TSPO+ клеток меланомы кожи. Известно, что изменение экспрессии данного митохондриального белка влияет на особенности его функционирования (Veenman L. et al., 2007). Согласно литературным данным более 20 типов клеток различных тканей  и органов, в том числе клетки злокачественных опухолей проявляют чувствительность к проапоптотическому действию РК11195, наиболее эффективной концентрацией, в большинстве случаев достоверно увеличивающей уровень апоптотической гибели клеток была концентрация 100 nmol/L.

Рис.4. Уровень экcпрессии мРНК TSPO в клетках меланомы после инкубации с лигандом TSPO РК11195 по результатам ПЦР в реальном времени. Оценка сигналов проводилась путем определения Ct, который определялся при нормализации TSPO сигналов к сигналам от -актина. Для достоверного сравнения уровня экспрессии  мРНК TSPO в контроле и после инкубации с РК11195 использовали критерий Манна-Уитни. Me [25%;75%].

*- отличия от значения показателя контрольной группы достоверны p < 0.05.

В этой связи в представленном исследовании были оценены изменения пролиферации клеток и уровня апоптоза в клетках меланомы кожи SK-MEL1 после воздействия лигандом РК11195. После инкубации с РК11195 регистрировалось снижение уровня PCNA+ клеток  с 80% в группе контроля до 62% после инкубации с РК11196 в концентрации 10 nmol/L (р<0,05), до 28% в концентрации 100 nmol/L, и до 22% в концентрации 10 µmol/L (различия достоверны, р<0,001) (Рис. 7, 8). Данный факт  является свидетельством снижения пролиферативной активности клеток меланомы и говорит об успешности лечения. Уровень апоптоза увеличился в 5 раз от 5% до 24% в концентрации 10 nmol/L, до 26% в концентрации 100 nmol/L, и до 26,6 % в концентрации 10 µmol/L (различия достоверны, р<0,05) (Рис.5, 6). Таким образом, лиганд TSPO РК11195 в эксперименте демонстрирует способность индуцировать апоптоз также и в клетках меланомы, что не было показано ранее.

Рис. 5.                                                 Рис.6.

Рис. 5. Клетки меланомы кожи SK-MEL1 после окрашивания акридиновым оранжевым/бромистым этидием.  Живые клетки визуализируется с равномерно зеленым окрашиванием ядра и цитоплазмы. Ув. x400.

Рис. 6. Клетки меланомы кожи SK-MEL1 после инкубации с РК11195 +UO126 в концентрации 100 nmol/L и 10 mol/L. Апоптотические клетки имеют фрагментированный и конденсированный хроматин оранжевого или зеленого цвета.

Рис. 7.                                                        Рис. 8.

Рис. 7. PCNA+ клетки меланомы кожи SK-MEL1, клетки окрашены иммунопероксидазным методом. Ув. x400.

Рис. 8. PCNA- клетки меланомы кожи SK-MEL1 после инкубации с PК11195 в концентрациях 100 nmol/L и с UO126 10 µmol/L по результатам иммуноцитохимического исследования. Ув. x400.

Говоря о регуляции экспрессии и функциональной активности TSPO, известно, что протеинкиназа С также регулирует экспрессию данного белка (da Rocha A.B. et al., 2002). Протеинкиназа С вовлечена в многие сигнальные клеточные процессы, и в том числе, в сигнальный механизм МАРК, регулирующий фундаментальные аспекты жизнедеятельности клеток, в том числе, было установлено, что протеинкиназа С регулирует экспрессию гена TSРО через МАРК сигнальный каскад, в свою очередь, приводит к активации транскрипционных факторов с-Jun  и STAT3 (Batarseh A. et al., 2010). 

В этой связи на следующем этапе исследований использовался ингибитор МАРК UO126 для оценки влияния на уровень экспрессии TSPO. UO126 является ингибитором фосфорилирования протеинкиназы МЕК, эффекторной протеинкиназы МАРК сигнального каскада. UO126 ингибирует способность МЕК к фосфорилированию протеинкиназы ERK, и, в конечном итоге, изменяет промоторную активность гена TSРО (Batarseh A. et al., 2010). В клетках меланомы кожи SK MEL1 после инкубации с ингибитором МАРК UO126 в концентрации 10 и 50 mol/L происходило достоверное увеличение уровня TSPO+ клеток по сравнению с контрольной группой в 10-11 раз с 8% до 83-92% (р<0,001). Результаты иммуноцитохимического исследования подтверждались результатами ПЦР в реальном времени: достоверно увеличилась экспрессия мРНК TSPO после использования UO126 в концентрации 10 mol/L (р<0,05) (Рис. 9). Как уже указывалось выше, известно, что блокаторы МАРК эффективны в отношении индукции апоптоза клеток меланомы, с другой стороны, в дальнейшем клетках меланомы вырабатывается резистентность к данным агентам.

Поэтому мы оценивали сочетанные эффекты лиганда TSPO и блокатора МАРК для определения их апоптоз-стимулирующего действия, эффекта на пролиферацию клеток меланомы. В нашем исследовании при сочетанном использовании лиганда TSPO РК11195 и блокатора МАРК UO126 в концентрациях 100 nmol/L и 10 mol/L соответственно, в культуре клеток меланомы SK-MEL1  также происходило увеличение количества TSPO+ клеток меланомы кожи с 8% до 75% (р<0,001), подтвержденное повышением экспрессии мРНК TSPO по результатам ПЦР в реальном времени (р<0,05) (Рис. 9).

Рис. 9. Уровень экспрессии мРНК TSPO в клетках меланомы после инкубации c ингибитором МАРК UO126, результаты ПЦР в реальном времени. Оценка TSPO сигналов проводилась путем определения Ct, который определялся при нормализации сигналов TSPO к сигналам от -актина. Для достоверного сравнения уровня экспрессии  мРНК TSPO в контроле и после лечения использовали критерий Манна-Уитни. Ме [25%-75%].

*- отличия от значения показателя контрольной группы достоверны p < 0.05.

Таким образом, изменение экспрессии TSPO ассоциировано с различными физиологическими эффектами, такими как процессы клеточной гибели и пролиферации. Понимание механизмов экспрессии гена TSРО необходимо для разработки диагностических, терапевтических и прогностических мероприятий, в частности при злокачественных заболеваниях, и при меланоме кожи. Можно резюмировать, что меланома кожи характеризуется определенным профилем экспрессии данного белка. Использование лиганда TSPO, а также блокаторов МАРК сигнального каскада оказывает регулирующее влияние на его экспрессию.

Стоит предположить, что в клетках меланомы SK-MEL 1 с низким профилем экспрессии TSPO происходит изменение активности митохондриальной поры, и, как следствие, снижение выраженности апоптотической гибели клеток меланомы на фоне неограниченной пролиферации, что является ключевым событием начальных изменений при опухолевой трансформации клеток, ведущих к формированию опухолевого фенотипа.

Как известно, МАРК сигнальный каскад активируется протеинкиназой С, в свою очередь, регулирующей промоторную активность и экспрессию TSPO. Данный сигнальный каскад, как уже упоминалось, является одним из наиболее патогенетически важных сигнальных механизмов в развитии меланомы кожи, активация МАРК каскада отмечается в высоком проценте случаев меланомы кожи (Izumi Y. et al., 2005). В результате происходит активация сигнального каскада МАРК через онкогенную активацию BRAF или RAS, что вызывается активирующей мутацией BRAF V600E.

Последние исследования продемонстрировали, что        именно BRAF статус ассоциируется с селективностью лечения ингибиторами МЕК при меланоме кожи, ингибирование протеинкиназы МЕК определяет рациональный терапевтический подход к лечению меланомы с положительным BRAF статусом (Solit D.B. et al., 2006, Martindale J.L. et al., 2002). Было отмечено, что в высоких концентрациях ингибиторы МЕК,  к которым относится и UO126, достоверно снижают пролиферацию клеток различных линий меланомы кожи и в режиме монотерапии, а также достоверно снижают уровень метастатических поражений в легких (Sharma A. et al., 2005, Sharma A. et al., 2006, Adnane L.  et al., 2005, Grabe C., 2002).

В нашем исследовании было также продемонстрировано наличие эффекта ингибитора МАРК UO126 на пролиферацию клеток меланомы кожи SK MEL1, характеризующихся положительным BRAF статусом. При использовании UO126 в концентрациях 10 и 50 µmol/L происходило снижение уровня PCNA+ клеток до 24 и 59% соответственно (р<0,001). Параллельно со снижением пролиферативного уровня происходило и увеличение уровня апоптотической гибели с 5% в контрольной группе до 14,7- 33% (р<0,001).

Из литературных данных известно, что лиганд TSPO РК11195 обладает выраженным синергетическим эффектом в комбинации с проапоптотическими агентами. РК11195 показывал проапоптотический эффект в сочетании с разнообразными противоопухолевыми препаратами. Потенциальным преимуществом сочетанного действия РК11195 с другими противоопухолевыми и цитотоксическими веществами является возможность снижения дозы вышеуказанных средств, повышая при этом их эффективность. В случае меланомы кожи сочетанное применение антагониста TSPО РК11195 с МАРК-ингибиторами должно быть исследовано далее для оценки возможного снижения вероятности развития химиорезистентности, столь характерной для клеток меланомы кожи.

К механизмам, посредством которых может развиваться проапоптотическое действие в таком случае, относят активацию каспаз и дисфункцию митохондрий (Chauhan D. et al., 2004).

Таким образом, на следующем этапе исследований были проанализированы эффекты комбинированного воздействия блокатора МАРК UO126 в сочетании с лигандом TSPO РК 11195 и проведен сравнительный анализ этих эффектов в отношении отдельного действия этих агентов. Для определения эффективности определяли изменение уровня пролиферации и апоптотической гибели в культуре клеток меланомы кожи SK MEL1.

В качестве рабочих концентраций были использованы наименее низкие концентрации препаратов, которые по данным литературы обладают положительным эффектом на уровень пролиферации и апоптоза: 10 nmol/L лиганда РК11195 и  10µmol/L блокатора МАРК UO126. А также использовали концентрацию РК11195 100 nmol/L, как достоверно изменяющую экспрессию белка TSPO, исходя из результатов, полученных ранее в нашем исследовании (достоверное изменение уровня мРНК TSPO по результатам ПЦР в реальном времени),  в комбинации с UO126 в концентрации 10µmol/L, также достоверно приводящей к изменению уровня экспрессии мРНК TSPO.

В результате, при анализе изменений пролиферативной активности клеток меланомы отмечается снижение количества PCNA+ клеток до 45%, при этом эти результаты были сопоставимы с режимом монотерапии РК11195 и UO126 (62 и 59% соответственно). Преимуществ в комбинации данных агентов в отношении изменения тестируемых параметров выявлено не было.

Однако при анализе изменения уровня апоптотической гибели клеток меланомы кожи SK MEL1 было отмечено резкое увеличение данного показателя в 8 раз в сравнении с группой контроля (с 5% уровня в группе контроля до 42% в группе исследования). В режиме монотерапии  РК11195 и UO126 показатели апоптотической гибели увеличивались лишь в 5 и 6 раз. 

Таким образом, были выявлены достоверно значимые различия эффективности терапии в режиме монотерапии в сравнение с комбинированным лечением. Так, уровень апоптотической гибели после лечения РК11195 100 nmol/L составил 26%, а после лечения в комбинации с UO126 10 mol/L уровень апоптозположительных клеток достоверно увеличился до 42% (р=0,049, при р<0,05 различия достоверны). Уровень апоптотической гибели после лечения UO126 10 mol/L составил 33%, а после лечения в комбинации с PK11195 100 nmol/L процент апоптозположительных клеток достоверно увеличился до 42% (р=0,049, при р<0,05 различия достоверны).

Таким образом, стоит резюмировать, что в клетках меланомы РК11195 также потенцировал проапоптотические эффекты, в данном случае – МАРК-ингибитора UO126. Следовательно, РК11195, специфический лиганд-антагонист TSPO, может использоваться в качестве проапоптотического агента при меланоме кожи.

Выполненное исследование также служит доказательством возможности использования TSPO в качестве молекулярной мишени при меланоме кожи, в том числе, для достижения более выраженного эффекта в отношении регуляции  пролиферации и апоптоза клеток меланомы кожи.

Современные представления о патогенезе меланомы кожи позволили предположить, что данная опухоль характеризуется не только клиническим и патоморфологическим разнообразием, но также и различными молекулярными механизмами развития. В частности, считается, что мутации гена BRAF играют ключевую роль в формировании меланомы кожи в участках, подверженных воздействию ультрафиолетового излучения (Cohen Y. et al., 2004).

В этой связи в дальнейшем было проведено молекулярно-генетическое исследование с целью определения распространенности BRAF-позитивных меланом в Красноярском крае.

Согласно современным генетическим исследованиям наиболее часто при меланоме кожи встречается  мутация BRAF  V600E, по результатам различных групп исследователей в различных популяциях частота варьирует от 60 до 70% среди пациентов с меланомой кожи (Davies H. et al., 2002, Shinozaki M. et al., 2004, Mercer K.E. et al., 2003). В Красноярском крае распространенность случаев меланомы кожи, имеющих данную соматическую мутацию ранее не исследовалась. Анализ BRAF-статуса больных меланомой кожи производился с помощью ПДРФ-анализа на основе ПЦР гистологических срезов больных меланомой кожи с различным уровнем инвазии опухоли, находящихся на стационарном лечении после хирургического иссечения опухоли в КГУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского» с диагнозом злокачественная меланома кожи (рубрика С43) в соответствии с МКБ-10. 

Цитологическая картина при меланоме кожи характеризовалась  следующими признаками опухолевого фенотипа: меланомные клетки отличались  обильной цитоплазмой и наличием  гранул пигмента, измененным ядерно-цитоплазматическим отношением, ядерной атипией от средней до тяжелой степени, гиперхромией ядер, неровной ядерной мембрана, наличием высокого количества митозов, в том числе патологических (Рис. 10, 11).

 

Рис. 10                                                Рис.11

Рис. 10. Поверхностно-распространяющаяся меланома. Цитологическая характеристика: клеточная атипия, множественные митозы в меланомных клетках. Ув. х400.

Рис. 11. Поверхностно-распространяющаяся меланома. Цитологическая характеристика: клеточная атипия, ядерная атипия, гиперхромия ядер. Ув. х400.

Рис. 12. Поверхностно-распространяющаяся меланома: формирующийся узел опухоли, который приподнимает эпидермис и сжимает сосочковый слой дермы. Ув. Х100.

Гистологическая картина различалась в зависимости от типа опухоли и фазы роста (уровня инвазии). Так, при наиболее часто встречающемся  поверхностно-распространяющемся типе меланомы  наблюдался педжетоидный тип распространения клеток (опухолевые клетки распространяются на все слои эпидермиса) в эпидермисе, клетки инфильтрируют эпидермис, также комплексы атипичных меланоцитов распространяются до сосочкового слоя дермы, возможно формирование гнезд опухолевых клеток. В подлежащей дерме выражена лимфоцитарная инфильтрация. При инвазии меланомных клеток в более глубокие слои дермы и глубже опухолевые клетки становятся менее пигментированными, воспалительный инфильтрат не так выражен (Рис. 12).

Используя данный метод определения BRAF статуса, ПДРФ анализ, мы выявили мутацию в 43 (85,1%) из 47 протестированных  меланом. Мутация отсутствовала лишь в 4 случаях (14,9%). Кроме того, меланомы были гетерозиготными, т.е. продукты амплификации разрезались на фрагменты 112 и 18 bp, что говорит о присутствии мутации, и в то же время после амплификации со второй парой праймеров продукты ПЦР рестрицировались на фрагменты 78, 34 и 18 bp, что говорит о ее отсутствии. Либо были гомозиготные образцы, и в результате рестрикции получались фрагменты лишь 112 и 18 bp (Рис. 13).

Рис. 13. ПДРФ анализ BRAF мутации  V600E.

М-маркер молекулярного веса, 1, 2- фрагменты ДНК до рестрикции. 3,4 -фрагменты ДНК после рестрикции, 3- фрагмент ДНК 112 bp,  4 -фрагмент ДНК 78 bp.

Учитывая то, что данная мутация является активирующей, даже в случае гетерозиготного генотипа происходит активация сигнального каскада МАРК, что приводит к неограниченной пролиферации меланоцитов.

При анализе клинических данных у большинства пациентов, имеющих мутацию BRAF  V600E, меланома кожи локализовалась в области лица и шеи (44,2%), а также в области конечностей (41,8%). Для сравнения по данным  Ellerhorst J.A. пациенты с меланомой кожи, имеющей мутацию BRAF, преимущественно имели первичную локализацию меланомы в области конечностей (41%) и туловища (46%) (Ellerhorst J.A. et al., 2011).

При анализе гистологических вариантов опухоли преобладал поверхностно-распространяющийся тип  меланомы кожи (82,9%), и лишь три случая узловой меланомы (6, 8 %) и 4 случая  (9 %) лентиго – меланомы. В виду того, что большинство проанализированных меланом  на предмет наличия мутации относились к поверхностно распространяющейся форме, то и среди меланом, имеющих мутацию BRAF в нашем исследовании к этому клиническому варианту относилось большинство - 76,6% меланом.

Генетический профиль опухоли влияет на агрессивность клинического поведения. Одним из важнейших прогностических факторов при меланоме является уровень инвазии опухоли по Кларку. При анализе уровня инвазии опухоли среди меланом, протестированных нами на предмет наличия мутации BRAF выявили, что  среди меланом с положительным BRAF статусом в 39,5 % определялся I-II уровень инвазии, в 41,8%  III уровень, и в 18,6%  IV-V уровень. При сравнении с данными литературы проведенный анализ 109 случаев меланом, с положительным BRAF статусом, определялся I-II уровень в 11% случаев, III уровень в 38,5% и IV-V в 50,5% случаев (Ellerhorst J.A. et al., 2011).

Полученные данные говорят о высокой частоте данной мутации среди пациентов с меланомой кожи в  Красноярском крае. Кроме того, отсутствие значимых различий между группами сравнения говорит об универсальности мутации BRAF V600E, то есть активация МАРК каскадного пути происходит вне зависимости от пола, и в любом возрасте.

Известно, что одним из важных факторов риска развития меланомы кожи является ультрафиолетовое облучение (УФО) (Cummins D.L. et al., 2006, Cockburn M. et al., 2001). Как уже указывалось выше, Красноярский край не относится к регионам с высоким уровнем инсоляции, однако, повсеместное использование искусственных источников УФО является фактором риска развития меланомы кожи и в данной территории. Учитывая высокий уровень выявленной мутации BRAF среди проанализированных пациентов с меланомой кожи и преимущественную локализацию первичного очага на открытых участках тела (лицо, конечности), можно предположить, что действительно изменение уровня инсоляции пациентов Красноярского края может влиять на появление мутации BRAF и дальнейшее развитие меланомы.

Сложившаяся неблагоприятная ситуация по заболеваемости и смертности меланомой кожи в Красноярском крае и в Российской Федерации в целом требует немедленных мероприятий по профилактике и изменений подходов к терапии меланомы кожи. Основные стратегии по первичной профилактике меланомы кожи должны быть направлены на ограничение воздействия основных этиологических факторов, в первую очередь, ультрафиолетового облучения. Завершить созданием основ персонифицированной терапии, полногеномным скринингом отдельно взятого пациента и подбора препаратов в зависимости от биологии клеток опухоли.

ВЫВОДЫ

  1. У больных меланомой нарушена функциональная активность нейтрофилов, на что указывает снижение уровня TSPO+  клеток в нейтрофилах периферической крови по сравнению с показателем здоровых лиц.
  2. Экспрессия TSPO в клетках меланомы кожи индуцируется лигандом данного рецептора РК11195, при этом повышение уровня мРНК TSPO происходит только при инкубации с РК11195 в концентрации 100 nmol/L;
  3. Экспрессия TSPO в клетках меланомы кожи повышается при действии ингибитора сигнального пути МАРК UO126 при концентрациях последнего 10 µmol/L, что доказывает регуляторный эффект данного механизма передачи сигнала в отношении TSPO.
  4. Лиганд TSPO РК11195 обладает способностью вызывать изменение уровня апоптоза и пролиферации клеток меланомы; при этом РК11195 потенцирует проапоптотический и антипролиферативный эффекты МAPК-ингибитора UO126, что показывает возможность использования TSPO в качестве молекулярной мишени для оптимизации способов противоопухолевой терапии в отношении BRAF-положительной меланомы кожи.
  5. BRAF-позитивные меланомы доминируют в популяции вне зависимости от пола, возраста, локализации и гистотипа опухоли.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. Распространенность BRAF-позитивных меланом в Красноярском крае определяет и необходимость поиска новых регуляторов пролиферации и апоптоза клеток меланомы у таких пациентов.
  2. Необходимо учитывать BRAF статус пациентов с меланомой кожи, и в дальнейшем использовать комбинированную терапию, включающей применение BRAF ингибиторов в сочетании с препаратами, воздействующими на процессы пролиферации или апоптотической гибели клеток, например в качестве мишени может выступать TSPO.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Рукша Т.Г. Канцерогенез и старение кожи / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова, А.В. Зубова // Актуальные вопросы долголетия - Красноярск, 2008.- С.162-172.
  2. Федоша А.В. Изменение экспрессии белков, ассоциированных со стероидогенезом, у пациентов с меланомой кожи / А.В. Федоша, С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша // Молекулярная медицина и биобезопасность: Тезисы международной конференции – 2008, Новосибирск - С.103-104.
  3. Гырылова С.Н. Эпидемиология и клинико-морфологическая характеристика меланомы кожи в Красноярском крае за 2003-2007 гг. / С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша // Сибирский онкологический журнал – 2009, - Прил. №1.- С.56-57. (Тезисы к региональной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии»).
  4. Гырылова С.Н. Изменение экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в полиморфноядерных нейтрофилах периферической крови у пациентов с меланомой кожи / С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша // Молекулярная медицина и биобезопасность: Тезисы международной конференции – 2009, Москва - С.73-75.
  5. Рукша Т.Г. Нарушения механизмов передачи сигнала при меланоме кожи / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова // Сибирский журнал дерматологии и венерологии. – 2009.-№3.- С.46-47.
  6. Гырылова С.Н. Особенности эпидемиологии и клинических проявлений меланомы кожи в Красноярском крае / С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша, Г.А Арутюнян // Вестник дерматологии и венерологии.- 2009. - №6.-С.21-27. (из списка ВАК)
  7. Gyrylova S.N. The clinical epidemiology of cutaneous melanoma / S.N. Gyrylova, T.G. Ruksha // Abstracts of 18-th Congress of the European Academy of Dermatology and Venereology - 2009, Berlin.
  8. Рукша Т.Г. Актуальные проблемы ранней диагностики меланомы кожи / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова // Человек и лекарство: Тезисы XVII Российского Национального конгресса - 2010, Москва - С.237.
  9. Рукша Т.Г. Применение TSPO в качестве патогенетической мишени для воздействия на пролиферацию клеток меланомы / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова // Достижения современной онкологии: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Барнаул, 2010, - С.263-265.
  10. Рукша Т.Г. Злокачественные новообразования кожи: анализ заболеваемости в  Красноярском крае, проблемы профилактики и совершенствования ранней диагностики / Т.Г. Рукша, М.Б. Аксененко, С.Н.  Гырылова // Вестник дерматологии и венерологии – 2010.-№4.- С.4-9. (из списка ВАК).
  11. Комина А.В. Применение метода ПЦР в реальном времени для оценки экспрессии апоптоз-ассоциированного белка / А.В. Комина, С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша // Молекулярная диагностика: Сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием – Москва, 2010 - С.86-87.
  12. Гырылова С.Н. Ингибирование МАРК-сигнального механизма как способ патогенетической коррекции пролиферации клеток меланомы кожи / С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша // Сибирский журнал дерматологии и венерологии – 2011. - №12.- С.77-78.
  13. Гырылова С.Н. Индукция апоптоза клеток меланомы лигандом TSPO PK11195 / С.Н. Гырылова, А.В. Комина, Рукша Т.Г. // Сибирский онкологический журнал –2011. - №1.- С.40-43. (из списка ВАК)
  14. Анализ BRAF-статуса у больных меланомой кожи / С.Н. Гырылова, Т.Г. Рукша, Зобова С.Н., Комина А.В., Аксененко М.Б. // Вестник дерматологии и венерологии. – 2011. - №6.- С.27-30. (из списка ВАК)
  15. Рукша Т.Г. Молекулярная генетика меланомы кожи: современные подходы к диагностике и персонификации терапии / Т.Г. Рукша, С.Н. Гырылова // Abstract on the 2-nd Continental Congress of Dermatology of the International Society of Dermatology – St. Petersburg, 2011 - С.327.
  16. Гырылова С.Н. Способ модуляции апоптоза и клеточной пролиферации клеток меланомы кожи / С.Н. Гырылова // Сибирский онкологический журнал – Томск, 2011.- Прил. №1.- С.38-39. (Тезисы к VI региональной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии»)
  17. Gyrylova S.N. Translocator Protein (TSPO) ligand PK11195 induces apoptosis in melanoma cells / S.N. Gyrylova, T.G. Ruksha, A.V.  Komina // Abstracts of 20-th Congress of the European Academy of Dermatology and Venereology – Lisbon, 2011.
  18. Gyrylova S.N. Translocator Protein (TSPO) ligand PK11195 induces apoptosis in melanoma cells / S.N. Gyrylova, T.G. Ruksha, A.V.  Komina // Abstracts of 6-th Spring Symposium of the European Academy of Dermatology and Venereology – Verona, 2012.

Патенты

  1. Способ индукции апоптотической гибели клеток меланомы кожи / С.Н. Гырылова,  Т.Г. Рукша, А.В. Комина // Патент Российской Федерации №2455993 (№2011127875), 6.07.2011.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

PCNA (proliferating cell nuclear antigen)-ядерный антиген пролиферирующих клеток

TSPO - Translocator protein

МАРК (Mitogen activating protein kinase signaling pathway) - сигнальный каскад митоген-активированных протеинкиназ

МЕК (MAP kinase kinase) - МАРК–сигналрегулирующая киназа

мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота

РК11195 - 1-(2-хлорофенил)-N-метил-N-(1-метил-пропил)- изохинолинкарбоксамид

ПДРФ анализ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

УФО – ультрафиолетовое облучение

Соискатель Гырылова С.Н.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.