WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ВЯЛЫХ Екатерина Константиновна

Роль полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы в формировании предрасположенности к инсульту на фоне гипертонической болезни

03.02.07 – генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Белгород – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования ″Курский государственный медицинский университет″ Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:  Полоников Алексей Валерьевич  

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:  Петрин Александр Николаевич

  доктор медицинских наук, профессор, 

ГБОУ ВПО «Московский государственный

медико-стоматологический университет» 

Минздравсоцразвития России, заведующий 

  лабораторией медицинских генетических

технологий

 

Прощаев Кирилл Иванович

  доктор медицинских наук, профессор,

  ФГАОУ  ВПО «Белгородский  государс-

  твенный  национальный исследовательский

  университет»,  профессор  кафедры

  внутренних болезней №2

       

Ведущая организация:  Федеральное государственное бюджетное

  учреждение «Российский кардиологичес-

  кий научно-производственный комплекс»

  Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «___» _________ 2012 г. в _____ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

Автореферат разослан «_____»  _____________  2012 г.

Ученый секретарь совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций,

доктор биологических наук В.И. Кочкаров

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Цереброваскулярная патология занимает второе место среди главных причин смертности и инвалидизации населения экономически развитых странах, что определяет её как одну из важнейших медико-социальных проблем [Беленков, и др., 2003]. Хорошо известно, что гипертоническая болезнь  является ведущим фактором риска развития мозгового инсульта [Goldstein LB et al, 2011].

Гены, в отношении которых на сегодняшний день установлены ассоциации с развитием инсульта, относятся к разным генетическим системам: гены ренин-ангиотензиновой системы, системы гемостаза, местной регуляции сосудистого тонуса, гены, кодирующие метаболизм гомоцистеина и липидов, гены программированной клеточной гибели и многие другие [Скворцова и др., 2003]. К настоящему времени уже имеется достаточно большое число доказательств, что окислительный стресс, возникающий в результате генетически детерминированных нарушений баланса между накоплением высоко реактивных свободных радикалов и процессов их обезвреживания антиоксидантной системой, играет ключевую роль не только в развитии артериальной гипертензии [Ohta K. et al, 2003; Dolan C. et al, 2003; Moreno M.U. et al, 2003, 2006; Zhou X.F. et al, 2005; Yamada Y. et al, 2007; Rodrigo R. et al, 2007; Marinho C. et al, 2007; Naganuma T. et al, 2008], но и в развитии ишемического и геморрагического инсультов [Sugawara T, Chan PH., 2003; Zimmermann C. et al, 2004; Aygul R. et al, 2006; Amantea D. et al, 2009; Nanetti L. et al, 2011]. В частности, у больных, перенесших инсульт, обнаружены изменения параметров функционирования антиоксидантной системы: снижение активности ферментов АОС (каталазы, супероксиддисмутазы), снижение уровня окисленного и восстановленного глутатиона, а также повышение уровня продуктов перекисного окисления липидов [Zimmermann C. et al, 2004; Трофимова С.А. с соавт.,2010].

Антиоксидантная система включает в себя большое количество звеньев, но генетически детерминированными являются антиоксидантные ферменты, которые в популяции характеризуются выраженными межиндивидуальными различиями в ферментативной активности, благодаря наличию в структуре их генов функционально неравноценных полиморфных аллелей. В литературе имеется незначительная часть исследований в которых изучена роль отдельных полиморфных вариантов генов АОС в развитии мозгового инсульта. До настоящего времени комплексного изучения вклада полиморфных генов ферментов АОС в формирование предрасположенности к мозговому инсульту на фоне гипертонической болезни не проводилось, как в России, так и за рубежом. Выше изложенное послужило основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования. Провести комплексный анализ вовлеченности генов ферментов АОС в формирование предрасположенности к развитию мозгового инсульта, развивающегося на фоне гипертонической болезни.

Задачи исследования.

1. Исследовать ассоциации полиморфизмов генов ферментов АОС: GPX4 T718C, GSTP1 I105V, PON2 S311C, FMO3 E158K, CAT A20T, CYP1A1 I462V, +/del GSTT1 и +/del GSTM1 с риском развития мозгового инсульта у больных гипертонической болезнью с учетом полового диморфизма и возраста манифестации заболевания.

2. Изучить роль взаимодействия между генами ферментов АОС в формировании наследственной предрасположенности к мозговому инсульту на фоне гипертонической болезни.

3. Выявить особенности генно-средовых взаимодействий и их значение для развития мозгового инсульта у больных гипертонической болезнью посредством оценки совместного влияния полиморфизма изучаемых генов и средовых факторов риска заболевания.

4. Исследовать взаимосвязь полиморфизма генов АОС с клиническими проявлениями нарушения мозгового кровообращения и разработать критерии вероятностного прогнозирования риска развития инсультов у больных ГБ.

Научная новизна исследования. Впервые проведен комплексный анализ ассоциации 8 полиморфных вариантов генов ферментов АОС: GPX4 T718C,  GSTP1 I105V, PON2 S311C, FMO3 E158K, CAT A20T, CYP1A1 I462V, +/del GSTT1 и +/del GSTM1 с предрасположенностью к мозговому инсульту на фоне гипертонической болезни. Впервые изучен характер взаимодействия между полиморфными вариантами генов АОС и установлен их вклад в формировании генетической компоненты подверженности мозговому инсульту у русских жителей Центрального Черноземья. Охарактеризован половой диморфизм предрасположенности мозговому инсульту на фоне ГБ, детерминированный комплексом генов ферментов АОС. Впервые проведено моделирование межгенных взаимодействий в системе редокс-гомеостаза, связанных с развитием инсульта у больных ГБ, методом MDR. Впервые исследованы взаимодействия генотип-среда, формирующие предрасположенность к мозговому инсульту на фоне ГБ.

Научно-практическая значимость исследования. В результате исследования на основе тестирования полиморфных генов ферментов АОС в сочетании с другими факторами риска были разработаны статистические регрессионные модели вероятностного прогнозирования риска развития мозгового инсульта на фоне ГБ. Практическое использование моделей дает возможность врачам-генетикам, кардиологам, терапевтам и неврологам формировать среди пациентов с ГБ группу повышенного риска развития инсульта, оптимизировать и индивидуализировать мероприятия по превентивной коррекции нарушений регуляции АД, которые направлены на предупреждение развития сосудистых мозговых катастроф. Результаты исследования могут использоваться при чтении специальных курсов по медицинской и клинической генетике, биохимии, патофизиологии, неврологии, терапии, кардиологии в вузах медицинского профиля и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Личный вклад диссертанта в выполнение данной работы. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, проведено выделение ДНК у 667 больных. Диссертант принимал непосредственное участие в проведении медико-генетического тестирования, статистической обработке полученных данных и анализе результатов исследования.  Подготовлены основные публикации по теме выполненной работы.  Лично участвовала в апробации результатов исследования.

Апробация работы и публикации.  Материалы диссертационного исследования доложены на V-й международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2010), II-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии” (Курск 2011 г.), на конференции Европейского общества генетиков - ESHG (Амстердам, 2011) на итоговых научных сессиях ГБОУ ВПО ″Курский государственный медицинский университет″ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2009-2011),

По материалы диссертации опубликовано 13 печатных работ, в т. ч.  4 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.

Положения, выносимые на защиту

1. Полиморфизмы генов ферментов антиоксидантной системы являются важной генетической составляющей предрасположенности к мозговому инсульту, а также модификатором возраста его манифестации у больных, страдающих гипертонической болезнью.

2. Во взаимосвязях полиморфных вариантов генов ферментов антиоксидантной системы с риском возникновения мозгового инсульта при ГБ наблюдается отчетливый половой диморфизм, характеризующийся наибольшим вкладом исследованных генов в детерминацию риска развития мозгового у женщин, а также качественными различиями между мужчинами и женщинами в спектре ассоциированных ДНК-маркеров. 

3. Генетическую основу предрасположенности к мозговому инсульту при гипертонической болезни составляют сложные взаимодействия между генами ферментами АОС аддитивного и эпистатического характера, которые на фенотипическом уровне могут объяснять имеющийся дисбаланс в системе редокс-гомеостаза и усиление проявлений окислительного стресса – ключевых патогенетических механизмов развития мозгового инсульта.

4. Взаимосвязи полиморфных вариантов генов ферментов АОС с риском возникновения мозгового инсульта у больных ГБ модифицируются под влиянием разнообразных по природе средовых факторов, большая часть которых является известными факторами риска развития гипертонической болезни и мозгового инсульта.

5.Полиморфизмы генов ферментов АОС взаимосвязаны с клиническими проявлениями нарушений мозгового кровообращения и в сочетании с другими факторами риска являются значимыми предикторами в прогнозировании вероятности возникновения мозгового инсульта на фоне гипертонической болезни

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и метод, собственных результатов, общего обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 150 страницах  машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами и 4 рисунками.  Список литературы включает 220 источников: 60 отечественных и 160 зарубежных.

Материал и методы исследования

Материалом для исследования послужила выборка неродственных больных ГБ русской национальности, проживающих в Центральной России общей численностью 667 человек. Диагноз ГБ устанавливался после исключения всех вторичных артериальных гипертензий с помощью клинических, лабораторных и клинико-инструментальных методов. Диагноз инсульта подтверждался магнитно-резонансной томографией головного мозга. Больные находились на стационарном лечении в неврологических и кардиологических отделениях Курской областной клинической больницы и городской больницы скорой медицинской помощи г. Курска. Из 306 пациентов с диагнозом мозговой инсульт (группа ГБ-МИ) геморрагический инсульты перенесли 25 пациентов, с ишемический инсульт – 281 больной ГБ. Контрольную группу в количестве 361 человека составили больные ГБ, не имевшие в анамнезе острых нарушений мозгового кровообращения. Группы больных ГБ и больных, перенесших инсульт, на фоне ГБ  были сопоставимы, как по полу, так и по возрасту (р>0.05). Для проведения молекулярно-генетических исследований у всех обследуемых проводился забор венозной крови. Выделение геномной ДНК осуществляли из венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции. Пациентам проводилось генотипирование 8 полиморфизмов генов ферментов АОС GPX4 T718С, CAT-21A>T, FMO3 E158K, CYP1A1 I462V, PON2 C311S, GSTP1 I105V, GSTM1 del/+ и GSTT1 del/+ методами ПЦР и рестрикционного анализа по методикам, опубликованным в литературе.

Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных ГБ и контрольной группе использовали критерий χ2 и отношение шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI). Межгенные взаимодействия изучали двумя различными подходами. Первый подход был реализован посредством сравнительного анализа парных комбинаций генотипов между группами и расчета отношения шансов с целью оценки тенденций в накоплении функционально неполноценных сочетаний генотипов генов АОС среди больных ГБ, перенесших инсульт, в отличие от контроля. Второй подход - был реализован с помощью метода Multifactor Dimensionality Reduction (MDR), предложенного Ritchie M. D. et al [2003]. Анализ взаимодействий генотип-среда проводился путем сопоставления величин отношения шансов (OR), рассчитанных для индивидуальных генотипов в группах, сформированных по критерию наличия или отсутствия средового фактора риска [Pearce N., 1993].

Метод логистической регрессии использовался для оценки влияния полиморфных генов АОС на риск развития МИ у больных ГБ, клинические симптомы и особенности течения болезни [Hosmer D. W., Lemeshow S., 2000]. При оценке уравнений регрессии использовался метод пошагового включения предикторов, который ранжировал признаки в соответствии с их вкладом в модель. В качестве критерия согласия реального распределения наблюдений использовались показатели чувствительности и специфичности. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов Statistica 8.0 (″StatSoft″) и MS Excel 2007.

Результаты собственных исследований

Распределение частот аллелей и генотипов ферментов антиоксидантной системы в исследуемых группах больных гипертонической болезнью

Для большинства полиморфизмов генов АОС частоты генотипов находились в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга. Отклонения частот генотипов от РХВ установлено для полиморфизма A20T гена CAT в группе больных ГБ, перенесших инсульт и для полиморфизма S311C гена PON2 в группе больных ГБ без ОНМК. Для двух полиморфизмов (GPX4 T718C и PON2 S311C) установлены статистически значимые различия в частотах аллельных вариантов между группами. Так, вариантные аллели 718C гена GPX4 (OR=1,53 95%CI 1,23-1,90) и 311C гена PON2 ассоциировались с повышенным риском развития МИ у больных ГБ.

Установлено, что дефицит генотипа 718TT гена GPX4 сопряжено с повышенным риском возникновения  МИ  у  больных  ГБ (OR=2,12 95%CI 1,42-3,16). Генотип 718CC GPX4 также ассоциировался с повышенным риском развития МИ (OR=1,51 95%CI 1,09-2,09). Генотип 20AA гена CAT был связан с пониженным риском развития МИ у больных ГБ (OR=0,69 95%CI 0,47-1,01). Генотип del/del гена GSTT1 также был ассоциирован с повышенным риском развития МИ. Дефицит гомозиготного генотипа дикого типа 311SS гена PON2  был сопряжен с повышенным риском развития инсульта (OR=1,95 95%CI 1,42-2,69). Генотип 311SС гена PON2  также увеличивал риск возникновения МИ у пациентов, страдающих ГБ (OR=1,77 95%CI 1,30-2,41). В отношении других локусов статистически значимых различий между группами не наблюдалось.

Половые различия в ассоциациях генов ферментов антиоксидантной системы с риском развития МИ и роль исследуемых генов в возрастной манифестации инсульта у больных гипертонической болезнью

Стратифицированный по полу анализ ассоциации генотипов АОС с риском развития МИ у больных ГБ позволил выявить различия в характере взаимосвязей изучаемых генов с формированием предрасположенности к поражению головного мозга при артериальной гипертензии. Так, дефицит генотипа дикого типа 718TT гена GPX4 ассоциировался с высоким риском возникновения инсульта, как у мужчин (OR=1,92 95%CI 1,12-3,30), так и у женщин (OR=2,46 95%CI 1,34-4,51), страдающих ГБ. Протективный эффект в отношении риска возникновения инсульта у мужчин установлен для носителей генотипа 20AA гена CAT (OR=0,57 95%CI 0,33-0,99), тогда как у женщин данной ассоциации не обнаружено. В отличие от мужчин, у женщин носительство гетерозиготного генотипа 462IV гена CYP1A1 увеличивало более чем в 2 раза риск развития МИ (OR=2,23 95%CI 1,18-4,21), Дефицит генотипа дикого типа 462II гена CYP1A1 также ассоциировался с повышенным риском инсульта только у женщин (OR=1,86 95%CI 1,02-3,40). У женщин, в отличие от мужчин, выявлена выраженная ассоциация генотипа 311SC PON2 с риском развития МИ (OR=2,63 95%CI 1,68-4,10). Кроме того, дефицит генотипа 311SS гена PON2  ассоциировался более чем с 3-кратным увеличением риска мозгового инсульта у женщин, страдающих ГБ OR=3,11 (95%CI 1,94-4,98).

Далее представлены результаты анализа ассоциации генотипов ферментов АОС с риском возникновения МИ в раннем (до 60 лет) возрасте. Установлено, что отсутствие генотипа 718TT гена GPX4 было сопряжено почти с 2-кратным увеличением риска раннего развития МИ у больных гипертонической болезнью (OR=1,92 95%CI 1,13-3,27). Носительство генотипа 718СС гена GPX4 также увеличивало риск развития раннего инсульта у больных ГБ (OR=1,52 95%CI 1,00-2,32). Также было установлено, что гипертоники-носители гомозиготного генотипа 158KK по вариантному аллелю гена FMO3 имели повышенный риск развития МИ (OR=1,56 95%CI 1,00-2,42). Отсутствие генотипа 311SS (OR=2,12 95%CI 1,36-3,26) и наличие генотипа 311SС (OR=1,75 95%CI 1,17-2,62) гена PON2 ассоциировались с ранним развитием мозгового инсульта у больных ГБ. Почти 2-кратное увеличение риска раннего развития МИ установлено для носителей генотипа del/del гена GSTT1 (OR=1,83 95%CI 1,22-2,74). Однако носительство генотипа del/del гена GSTT1 ассоциировалось с ранним развитием МИ только у мужчин-гипертоников (OR=1,86 95%CI 1,08-3,23). Дефицит генотипа 718TT гена GPX4  был  ассоциирован с повышенным риском развития раннего МИ у женщин (OR=2,63 95%CI 1,06-6,52). Гомозиготный генотип 158KK гена FMO3 почти в 2 раза увеличивал риск развития раннего инсульта у женщин (OR=1,87 95%CI 0,98-3,55). Отсутствие у женщин генотипа 311SS гена PON2 увеличивало риск развития раннего МИ в 4,5 раза (OR=4,51 95%CI 2,15-9,44). Носительство генотипа 311SС гена PON2 было также ассоциировано с повышенным риском МИ до 60 лет у женщин-гипертоников (OR=2,73 95%CI 1,48-5,02).

При рассмотрении результатов стратифицированного анализа ассоциации генотипов ферментов АОС с риском возникновения инсульта после 60 лет, установлено, что дефицит генотипа 718TT гена GPX4 более чем в 2 раза увеличивал риск позднего развития мозгового инсульта у мужчин-гипертоников (OR=2,16 95%CI 1,07-4,35). В отношении других локусов генов ферментов АОС статистически значимых ассоциаций с поздней манифестацией МИ у мужчин с ГБ не выявлено. Протективный эффект генотипа 20AA гена CAT был установлен в отношении риска позднего развития инсульта у гипертоников (OR=0,64 95%CI 0,41-0,99).

У мужчин с ГБ установлено, что дефицит генотипа 718TT гена GPX4 более чем в 2 раза увеличивал у них риск позднего развития мозгового инсульта (OR=2,16 95%CI 1,07-4,35). В отношении других локусов генов ферментов АОС статистически значимых ассоциаций с поздней манифестацией МИ у мужчин с ГБ не выявлено. Недостаток генотипа 718TT гена GPX4 был ассоциирован с повышенным риском развития позднего МИ у женщин (OR=2,29 95%CI 1,12-4,67). Дефицит генотипа 462II гена CYP1A1 у женщин был связан почти с 2-кратным увеличением риска МИ позднего возраста начала (OR=1,94 95%CI 0,99-3,78). Кроме того у женщин носительство генотипа 462IV гена CYP1A1 было также сопряжено с повышенным риском возникновения позднего МИ (OR=2,25 95%CI 1,11-4,52). Генотип 311SS гена PON2 почти в 2 раза увеличивал у женщин риск развития МИ поздней манифестации (OR=2,45 95%CI 1,43-4,18). Кроме того, носительство гетерозиготного генотипа 311SС гена PON2 увеличивало риск возникновения мозгового инсульта у женщин, страдающих ГБ (OR=2,29 95%CI 1,37-3,81).

Анализ взаимодействия генов ферментов антиоксидантной системы у больных гипертонической болезнью и их значение для формирования предрасположенности к мозговому инсульту

Посредством анализа парных межгенных сочетаний генотипов были изучены взаимодействия между полиморфными вариантами генов ферментов АОС при ГБ, осложненной мозговым инсультом, с учетом выявленного полового диморфизма. Всего 16 парных сочетаний генотипов ферментов АОС были статистически значимо ассоциированы с предрасположенностью к мозговому инсульту у мужчин, страдающих ГБ. Наиболее патогенетически значимыми для развития инсульта у мужчин были взаимодействия следующих генов: GPX4 С718T, CAT -21A>T, CYP1A1 I462V, FMO3 158EK и GSTT1 +del. Наиболее мощные ассоциации (0,4<OR>2,0) мозгового инсульта у мужчин больных ГБ наблюдались с полиморфными вариантами генов АОС, такими как GPX4 С718T, CAT -21A>T, FMO3 158EK, PON2 311SC и GSTT1 +del, для которых нами были установлены ассоциации их аллелей и генотипов на предыдущих этапах работы. В отличие от мужчин, у женщин, страдающих ГБ, обнаружено 35 парных сочетаний генотипов ферментов АОС, статистически значимо ассоциированных с предрасположенностью к мозговому инсульту. Наиболее патогенетически значимыми для развития инсульта у женщин были взаимодействия следующих генов: GPX4 С718T, PON2 311SC, GSTP1 I105V, CYP1A1 I462V и FMO3 158EK. Наиболее мощные ассоциации (0,4<OR>2,0) мозгового инсульта у мужчин больных ГБ наблюдались с полиморфными вариантами генов АОС, такими как GPX4 С718T, CAT -21A>T, FMO3 158EK, PON2 311SC, GSTP1 I105V и GSTT1 +del. В целом, как у мужчин, так и у женщин, перенесших МИ, наблюдалась отчетливая тенденция в накоплении генотипов, функциональные варианты которых характеризуются избыточной активностью ферментов прооксидантного действия и/или пониженной активностью антиоксидантных ферментов.

Для оценки межгенных взаимодействий методом MDR использовался алгоритм всестороннего поиска (Exhaustive), который оценивал все возможные комбинации ДНК-маркеров в отношении риска развития МИ. В случаях, когда данный алгоритм не позволял выявить статистически значимую модель, мы использовали алгоритм Forced (Forced search algorithm), на основании которого для создания n-локусных комбинаций маркеров вручную выбирались генные локусы, которые на предыдущих этапах анализа показали ассоциации с риском развития инсульта. На рисунке 1 представлены взаимодействия между данными генами в пределах полученной модели  взаимодействующих генов. Выраженный синергизм наблюдался между полиморфизмами генов FMO3 E158K и GSTP1 I105V, а также между CAT -21A>T и PON2 S311C (последний SNP не был представлен в наилучшей четырехлокусной модели). Умеренной силы антагонизм в отношении влияния на риск развития МИ у мужчин выявлен для вариантов С718T гена GPX4, CAT -21A>T и PON2 S311C. Как видно из рисунка 1 (нижняя часть рисунка), именно для локуса GPX4 С718T наблюдался наиболее выраженный фенотипический эффект в отношении риска  развития мозгового инсульта у мужчин. Применение алгоритма всестороннего поиска у женщин была выявлена трехлокусная модель взаимодействия генов FMO3 E158K × PON2 S311C × GSTP1 I105V, показавшая наилучшую воспроизводимость (100%) и точность предсказания (64%). После 1000 симуляций был установлен минимальный эмпирический уровень значимости взаимодействия между данными генами p=0,001.

Рисунок 1

Структура межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов антиоксидантной системы при мозговом инсульте у мужчин (вверху - кластерный анализ, снизу – граф, отражающий силу взаимодействий между локусами)

  Примечание.

Цвет линий отражает характер взаимодействия между генами: красный – выраженный синергизм в отношении влияния на фенотип, оранжевый – умеренный синергизм, синий – выраженный антагонизм в отношении влияния на фенотип, зеленый – умеренный антагонизм, коричневый – аддитивное взаимодействие генов. % отражает силу и направленность фенотипического эффекта взаимодействия генов (% энтропии).

На рисунке 2 представлены графические отображения взаимодействий между данными генами в пределах  полученной модели взаимодействующих генов. Выраженная степень синергизма наблюдалась между полиморфными вариантами генов FMO3 E158K и CAT -21A>T (последний SNP не был представлен в наилучшей модели), а также между PON2 S311C и GSTP1 I105V. Как видно из рисунка 2, для локусов PON2 S311C (5,5%) GPX4 С718T (2,1%) наблюдался наиболее выраженный фенотипические эффект в отношении риска развития мозгового инсульта у женщин, как было оценено на основе величин положительной энтропии во взаимодействии между данными полиморфными генами АОС. Таким образом, взаимодействия между генами АОС, отличающиеся у мужчин и женщин, по всей видимости играют важную роль в детерминации предрасположенности больных гипертонической болезни к развитию мозгового инсульта.

Исследование роли генно-средовых взаимодействий в развитии мозгового инсульта у больных гипертонической болезнью

Нами был проведен стратифицированный анализ влияния генотипов АОС на риск развития МИ у больных ГБ в зависимости от наличия тех или иных средовых факторов риска болезни. Данный анализ проводился в объединенных выборках пациентов, а случае обнаружения ассоциаций с каким-либо маркером - раздельно у мужчин и женщин. Изучалась взаимосвязь полиморфизмов генов АОС с риском развития МИ у больных ГБ в зависимости от влияния 6 средовых факторов, таких как курение, употребление алкоголя, уровня физической активности, наличия хронических стрессов, солевого аппетита и уровня употребления свежих овощей и фруктов. Нами было установлено большое число статистически значимых взаимодействий генотип-среда, связанных с риском развития МИ у больных ГБ, у мужчин и женщин. Причем многие генотипы АОС оказывали влияние на риск развития МИ при участии средовых факторов различной природы. В  качестве примера можно привести несколько генно-средовых взаимодействий. Так, носительство вариантных генотипов (718TC+718СC) GPX4 ассоциировалось с повышенным риском развития инсульта у больных ГБ независимо от пола и статуса курения, но для курильщиков обладателей указанных генотипов риск возникновения инсульта был значительно выше, чем для некурящих пациентов (p=0,03). Носительство указанных генотипов GPX4 у больных ГБ с умеренным или низким употреблением алкоголя увеличивало риск развития МИ более чем в 2,5 раза (p<0,0001).

Рисунок 2

Структура межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов антиоксидантной системы при мозговом инсульте у женщин-гипертоников (вверху - кластерный анализ, снизу – граф, отражающий силу взаимодействий между_локусами) Примечание.

Цвет линий отражает характер взаимодействия между генами: красный – выраженный синергизм в отношении влияния на фенотип, оранжевый – умеренный синергизм, синий – выраженный антагонизм в отношении влияния на фенотип, зеленый – умеренный антагонизм, коричневый – аддитивное взаимодействие генов. % отражает силу и направленность фенотипического эффекта взаимодействия генов (% энтропии).

  Курильщики, носители генотипа 20AA CAT, имели повышенный риск развития инсульта, тогда как некурящие пациенты не имели риска развития данного осложнения. Кроме того, мужчины с генотипом 20AA CAT, злоупотребляющие алкоголем, имели 5-кратное увеличение риска развития МИ (p=0,04). При высокой или умеренной физической активности мужчины с генотипом 20AA CAT имели, наоборот, пониженный риск развития МИ (p=0,02). При низкой физической активности протективный эффект данного генотипа в отношении риска развития МИ не выявлялся. Протективный эффект генотипа 20AA CAT также установлен у мужчин, которые не отмечали хронических стрессов в жизни (p=0,02). У носителей генотипа 20AA CAT выявлен повышенный риск возникновения МИ при умеренном или низком солевом аппетите (p=0,05). В то же время у мужчин носителей генотипа 20AA CAT при повышенном употреблении свежих овощей и фруктов выявлен пониженный риск развития МИ (p=0,04). В целом, говоря о природе установленных нами генно-средовых взаимодействий, следует отметить, что данные взаимодействия, по-видимому, представляют собой проявление неспецифического адаптивного механизма у индивидов с различными генотипами к разнообразным и сопряженным в своих действиях на организм средовым влияниям, являющихся неотъемлемыми элементами современной цивилизации.

Связь полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы с клиническими проявлениями мозгового инсульта. Прогнозирование риска возникновения инсульта у больных гипертонической болезнью с использованием комплекса ДНК-маркеров и средовых факторов риска

Для мужчин, перенесших МИ установлено, что полиморфизм A20T гена CAT ассоциировался с такими клиническими проявлениями как головокружение (p=0,02), тошнота (p=0,01) и нарушение температурной чувствительности (p=0,01). Полиморфизм E158K гена FMO3 был связан с поражением мягкого нёба (p=0,05), наличием асимметрии сосудов мозга (p=0,05) и тошнотой (p=0,04) у мужчин, перенесших инсульт. У мужчин, перенесших инсульт, также было выявлено, что полиморфизм S311C гена PON2 связан с нарушением зрения (p=0,03), а полиморфизм I105V ген GSTP1 - с нарушением слуха (p=0,03). Для женщин, перенесших мозговой инсульт установлено, что полиморфизм A20T гена CAT оказывает влияние на такие клинические проявления как нарушение речи (p=0,04), тремор конечностей (p=0,001) и опущение углов рта (p=0,02). Кроме того, у женщин обнаружены ассоциации полиморфизма E158K гена FMO3 с развитием нистагма (p=0,03), изменением голоса(p=0,02), фонацией мягкого неба (p=0,004), а также нарушением функций тазовых органов (p=0,05). Полиморфизм C718T гена GPX4 ассоциировался с тошнотой у пациенток, перенесших МИ (p=0,05). Полиморфизм S311C гена PON2 был связан с нарушением ориентации у женщин(p=0,01). Делеционный полиморфизм гена GSTT1 ассоциировался с нарушением двигательной функции(p=0,003), онемением конечностей  (p=0,05) и рвотой (p=0,02). Таким образом, для отдельных полиморфных вариантов генов АОС нами были установлены взаимосвязи с клиническими характеристиками у пациентов-гипертоников, перенесших мозговой инсульт.

Нами была осуществлена оценка влияния полиморфных вариантов генов ферментов АОС в сочетании с другими факторами риска на вероятность развития инсульта у больных ГБ. Использовался метод бинарной логистической регрессии, который позволял построить статистическую модель для прогнозирования вероятности инсульта [Hosmer D.W., Lemeshow S., 2000]. Учитывая половой диморфизм выявленных ассоциаций исследуемых кандидатных генов, моделирование проводилось раздельно у мужчин и у женщин. У мужчин (таблица 1) была установлена логистическая регрессионная модель прогнозирования риска развития МИ наибольшей прогностической значимости на основе следующих предикторов:  SNPs GPX4 T718C и PON2 S311C, а также курения, наличия у больного ИБС, наличия у больного сахарного диабета и стадии ГБ. Среди всех оцененных статистических моделей наиболее прогностически ценной в отношении риска развития инсульта у женщин, страдающих ГБ (таблица 2), была модель, включающая следующие предикторы: GPX4 T718C, PON2 S311C, наличие у больной ИБС, стадия гипертонической болезни и степень АГ.

Таблица 1

Логистическая регрессионная модель прогнозирования риска возникновения мозгового инсульта у мужчин с гипертонической болезнью, разработанная на основе данных генотипирования полиморфизмов генов антиоксидантной системы и других факторов риска

Независимые (объясняемые) признаки (Xi) и их градации

Регрессионные коэффициенты, bi

Уровень значи-мости (p) для bi

0. Интерцепт (константа)

-2,874

0,02

1. GPX4 T718C (1, 2, 3)

0,630

0,003

2. PON2 S311C (1, 2, 3)

-0,383

0,05

3. Курение (0,1)

-1,781

0,0000001

4. Наличие у больного ИБС (0,1)

-2,120

0,000002

5. Наличие у больного сахарного диабета (0,1)

-1,179

0,03

6. Стадия гипертонической болезни (1, 2, 3)

1,261

0,002

Параметры лог-регрессионной модели:

Уровень значимости модели в целом p=0,000001 (χ2=92,42; df=6, OR=13,03);

Чувствительность – 88%, специфичность – 64%.

Таблица 2

Логистическая регрессионная модель прогнозирования риска возникновения мозгового инсульта у женщин с гипертонической болезнью, разработанная на основе данных генотипирования полиморфизмов генов антиоксидантной системы и других факторов риска

Независимые (объясняемые) признаки (Xi) и их градации

Регрессионные коэффициенты, bi

Уровень значи-мости (p) для bi

0. Интерцепт (константа)

-4,753

0,0003

1. GPX4 T718C (1, 2, 3)

0,809

0,0001

2. PON2 S311C (1, 2, 3)

0,621

0,001

3. Наличие у больного ИБС (0,1)

-2,689

0,000001

4. Стадия гипертонической болезни (1, 2, 3)

1,739

0,000003

Параметры лог-регрессионной модели:

Уровень значимости модели в целом p=0,000001 (χ2=74,03; df=5, OR=6,92);

Чувствительность – 75%, специфичность – 70%.

С целью проверки работоспособности модели нами были обследованы двое пациентов Курской областной клинической больницы в отношении указанных факторов риска развития инсульта.

1. Пациент с ГБ мужчина А: генотип 718TT GPX4 (значение X1=1), генотип 311СC PON2 (значение X2=3), пациент курит (значение X3=1), пациент также страдает ИБС (значение X4=1), пациент не страдает сахарным диабетом (значение X5=0), больной имеет 2 стадию ГБ (значение X6=2). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим: Y = -2,874 + (0,630 × 1) + (-0,383 × 3) + (-1,781× 1) + (-2,120 × 1) + (-1,179 × 0) + (1,261 × 2) = -4,772, соответственно P = 2,72-4,772/ (1+2,72-4,772) или (1/2,724,772) / 1+ (1/2,724,772) = 0,01, т.е. вероятность риска возникновения МИ у мужчины А., страдающего ГБ, чрезвычайно мала и составляет всего 1%.

2. Пациентка с ГБ женщина Б: генотип 718CC GPX4 (значение X1=3), генотип 311SC PON2 (значение X2=2), пациентка не страдает ИБС (значение X3=0), больная имеет 2 стадию ГБ (значение X4=2) и 2 степень АГ (значение X5=2). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим: Y = -4,753 + (0,809 × 3) + (0,621 × 2) + (-2,689 × 0) + (1,739 × 2) + (-0,955 × 2) = 0,482, соответственно P = 2,720,482/ (1+2,720,482) = 0,62, т.е. вероятность риска возникновения мозгового инсульта у женщины Б., страдающей ГБ, крайне высока и составляет 62%.

Таким образом, учитывая достаточно высокую прогностическую ценность моделей в отношении риска развития мозгового инсульта при ГБ, как у мужчин, так и у женщин, разработанные статистические модели могут использоваться для формирования среди гипертоников группы риска развития инсульта и проводить лечебно-профилактические среди них мероприятия по предупреждению развития цереброваскулярных катастроф.

Выводы

1. Аллели и генотипы полиморфных вариантов генов ферментов антиоксидантной системы ассоциированы с предрасположенностью к мозговому инсульту у больных гипертонической болезнью. В наибольший степени на риск возникновения мозгового инсульта оказывали  влияние полиморфизмы T718C гена GPX4 и S311C гена PON2.

2. Установлен половой диморфизм в ассоциациях генов ферментов антиоксидантной системы с риском развития мозгового инсульта при гипертонической болезни: у мужчин в детерминации предрасположенности к инсульту важную роль играли полиморфизмы генов T718C GPX4 и A20T CAT, у женщин - T718C GPX4, I462V CYP1A1 и T718C PON2.

3. Возрастная манифестация мозгового инсульта при гипертонической болезни определяется влияниями полиморфизмов различных генов ферментов АОС и характеризуется отличиями у мужчин и женщин. Ранняя манифестация мозгового инсульта ассоциируется с полиморфизмами +/del гена GSTT1 у мужчин и T718C гена PON2 и E158K гена FMO3 у женщин, тогда как поздняя манифестация инсульта связана с влиянием полиморфизма T718C гена GPX4 у мужчин и генов T718C гена GPX4, I462V CYP1A1 и T718C PON2 у женщин.

4. В формировании предрасположенности к мозговому инсульту на фоне гипертонической болезни значительная роль принадлежит взаимодействию между генами ферментов АОС. У мужчин наиболее патогенетически значимыми в развитии мозгового инсульта являются полиморфные варианты GPX4 С718T, CAT -21A>T, CYP1A1 I462V, FMO3 158EK и GSTT1 +/del, у женщин - GPX4 С718T, PON2 311SC, GSTP1 I105V, CYP1A1 I462V и FMO3 E158K.

5. Выявлены генно-средовые взаимодействия, которые играют важную роль в возникновении мозгового инсульта на фоне гипертонической болезни. Такие средовые факторы как курение, злоупотребление алкоголем, хронические стрессы, гиподинамия и недостаточное употребление свежих овощей и фруктов в сочетании генотипами полиморфных вариантов генов GPX4 С718T,  CAT -21A>T, PON2 311SC, GSTT1 +/del и GSTM1 +/del вносят наиболее ощутимый вклад в предрасположенность больных ГБ к развитию мозгового инсульта.

6. Логистический регрессионный анализ позволил установить, что полиморфные варианты генов ферментов АОС являются прогностически ценными предикторами при расчете вероятности возникновения мозгового инсульта при ГБ. У мужчин наибольшее значение имеет влияние сочетания таких предикторов как  полиморфизмы GPX4 T718C и PON2 S311C, курение, наличие у пациента ИБС и сахарного диабета, а также стадия ГБ, у женщин наиболее ценными предикторами, увеличивающими риск мозгового инсульта являются GPX4 T718C и PON2 S311C, наличие у пациенток ИБС, стадия ГБ и степень артериальной гипертензии.

Практические рекомендации

1. Рекомендовать для внедрения в практику медико-генетических консультаций в семьях больных гипертонической болезнью генетическое тестирование полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы с целью вероятностного прогнозирования возникновения мозгового инсульта и разработки лечебно-профилактических мероприятий по предупреждению его развития.

2. При медико-генетическом консультировании пациентов, страдающих гипертонической болезнью, с целью оценки вероятности развития мозгового инсульта рекомендуется использовать разработанные уравнения логистической регрессии с учетом пола и прогнозировать риск развития МИ на основе комплекса диагностически ценных признаков: у мужчин - полиморфизмы GPX4 T718C и PON2 S311C, курение, наличие у пациента ИБС и сахарного диабета, а также стадии. ГБ, у женщин - полиморфизмы GPX4 T718C и PON2 S311C, наличие у пациенток ИБС, стадию ГБ и степень артериальной гипертензии.

3. При проведении генетико-эпидемиологических исследований, направленных на поиск генов-кандидатов предрасположенности к мозговому инсульту на фоне гипертонической болезни, и в частности при тестировании ассоциаций генов с риском развития данной патологии необходимо учитывать возможные средовые факторы риска болезни с целью установления патогенетически значимых для развития инсульта генно-средовых взаимодействий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Комплексная оценка влияния генов регуляторов водно-солевого обмена, сосудистого гомеостаза и сигнальной трансдукции на развитие мозгового инсульта на фоне гипертонической болезни / А.В. Полоников, А.М. Шестаков, Е. К. Вялых и др. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008; Т.7 № 22. Приложение 1: С. 296а-297.

2. Связь полиморфизма 1166А>C гена рецептора 1 типа ангиотензина-11 с предрасположенностью к гипертонической болезни у русских жителей Центрального Черноземья . / Е. К. Вялых, Д.В. Ушачев, А.М. Шестаков и др. // Материалы конференции «Молодежная наука и современность». Курск, 2009 - С. 64.

3. Анализ ассоциации полиморфизма -463 G>A гена  миелопероксидазы с предрасположенностью к эссенциальной гипертензии в Центральном Черноземье / Е. К. Вялых,  Д.В. Ушачев, А. М. Шестаков и др. // Вестник  РГМУ.- 2010; специальный выпуск №2,- С. 465.

4. Промоторный полиморфизм -262C>T гена каталазы и риск возникновения гипертонической болезни у русских жителей курской области / Е. К. Вялых,  В. А. Кабанина, И.В. Булгакова, О. А. Петрова и др. // Вестник  РГМУ.- 2010; специальный выпуск №2,- С. 495.

5. Защитный эффект полиморфизма GLY272SER гена GNB3 в развитии гипертонической болезни и его взаимосвязь со средовыми факторами риска развития заболевания / В.П. Иванов,  А.В. Полоников,  Е. К. Вялых и др. // Тер. архив. -2011; № 4. С. 55-60.

6. Полиморфизм Gly460Trp гена альфа- аддуцина и предрасположенность к гипертонической болезни. Значение генно-средовых взаимодействий для возникновения заболевания в русской популяции.  / А.В. Полоников, В.П. Иванов, Е. К. Вялых и др. // Кардиология . - 2011; № 10. С. 33-38.

7.  Анализ ассоциации полиморфизма A21T гена CAT с риском возникновения ишемического инсульта у больных гипертонической болезнью / Полоников А.В., Карасева Е. И., Е. К. Вялых и др. // Материалы конференции «Молодежная наука и современность» – Курск, 2011 – С. 61-62

8. Влияние полиморфизма C311S гена PON2 на риск развития ишемического инсульта  на фоне гипертонической болезни.  / А.В. Полоников,  Е. К. Вялых, Тевс Д.В. и др. //  Материалы  научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, 2011 г. том 1, С. 229.

9. Исследование взаимосвязи полиморфизма E158K гена FMO3 с риском развития ишемического  инсульта на фоне гипертонической болезни. / В.П. Иванов, А.В. Полоников, Е. К. Вялых и др. // Материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием ″Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии″. Курск, 2011., С.43.

10. Тестирование ассоциаций комплекса генетических маркеров с риском развития ишемического инсульта у больных гипертонической болезнью./ А.В. Полоников,  Е. К. Вялых, А.М. Шестаков и др.// Материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием ″Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии″. Курск, 2011., С.88.

11. Протективный эффект полиморфизмов гена gp22phox Субъединицы НАДФ-оксидазы в отношении риска развития гипертонической болезни. / А.В. Полоников, Е. К. Вялых,  Д.В. Ушачев, А.М. Шестаков, Бушуева О. Ю., Кабанина В. А., Булгакова И. В. и др. // Материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием ″Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии″. Курск, 2011., С.101.

12. Анализ ассоциации  полиморфизма A4582C гена минералкортикоидного  рецептора (MLR) с предрасположенностью к гипертонической болезни у русских жителей Курской области.  /А.В. Полоников,  Е. К. Вялых, В.П. Иванов, Бушуева О. Ю., Кабанина В. А., Булгакова И. В.  и др.// Материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием ″Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии″. Курск, 2011., С.118.

13. Polymorphism IIe105Val of the GSTP1 gene is a predictor for ischemic stroke in patients with essential hypertension in Russian population / I. Bulgakova, A. Polonikov, E. Vyalykh, et al. // European Journal of Human Genetics -2011/ Vol.19, Suppl 2, p.296.

Список используемых сокращений

CAT – каталаза

CYP1A1 – цитохром P-450 1A1

FMO3 – флавин-содержащая монооксигеназа

GPX4 – глутатионпероксидаза 4 типа

GSTM1– глутатион S-трансфераза Ml

GSTT1 – глутатион S-трансфераза Tl

GSTP1 – глутатион-S-трансферазы P1

PON2 – параоксоназа 2 типа

АГ – артериальная гипертензия

АД – артериальное давление

АОС – антиоксидантная система

ГБ – гипертоническая болезнь

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБС – ишемическая болезнь сердца

ПЦР – полимеразная цепная реакция

рхв – равновесие Харди-Вайнберга

MDR – Multifactor Dimensionality Reduction

OR – odds ratio, отношение шансов

SNP – single nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм)

CI – доверительный интервал




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.