WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

на правах рукописи

БОЛЬШАКОВ МАКСИМ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Роль каротиноидов в процессе фотоокисления бактериохлорофилла in vivo.

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Пущино – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Научные руководители:        доктор биологических наук

       Москаленко Андрей Анатольевич

Официальные оппоненты:        Проскуряков Иван Игоревич,

       доктор физико-математических наук,

       Институт фундаментальных проблем

       биологии РАН, ведущий научный сотрудник

       Стадничук Игорь Николаевич,

       доктор биологических наук,

      Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН,

      ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:        Институт микробиологии

       им. С.Н. Виноградского РАН

Защита состоится « 20 » декабря 2012 г. в  13-30  часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук по адресу: Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН.

Автореферат разослан « » ноября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.Н. Назарова

Общая характеристика работы



Актуальность темы.

Фототрофные бактерии широко используют для исследования различных аспектов фотосинтеза: выяснения организации и механизмов функционирования фотосинтетического аппарата, путей биосинтеза пигментов, принципов организации путей переноса энергии, метаболизма углерода, эволюции фотосинтеза. Хорошо изучен фотосинтетический аппарат пурпурных несерных бактерий. Выделены в чистом виде и охарактеризованы основные типы ПБК. Исследованы пространственные трехмерные структуры RC и комплексов LH2 и LH1, установлено расположение полипептидов, кофакторов фотосинтеза и простетических групп в этих комплексах. Основными пигментами бактерий являются Бхл и каротиноиды. Долгое время считалось, что функциями каротиноидов являются светособирающая и защитная (тушение возбужденных состояний Бхл). В последней четверти прошлого века усилился интерес к изучению каротиноидов и были выявлены новые функции (структурная, взаимодействие с активными формами кислорода, участие в сборке комплексов и т.д.).

В данной работе проведено изучение процесса фотоокисления Бхл в светособирающих комплексах LH2 серной фотосинтезирующей бактерии Alc minutissimum под действием сине-зеленого света, поглощаемого каротиноидами. Эта бактерия – одна из немногих, у которой возможно частично или полностью ингибировать биосинтез каротиноидов с сохранением в клетках полного состава нативных ПБК. Другими методами (классический мутагенез, введение транспозона) получить бескаротиноидные комплексы LH2 не удается. Получение подобных образцов необходимо для того, чтобы сравнить, как протекает процесс фотоокисления Бхл в ПБК с разным качественным и количественным составом каротиноидов или совсем без каротиноидов.

Цель и задачи исследования.

Целью исследования было изучение процесса фотоокисления Бхл850, инициированного каротиноидами при освещении ПСМ и ПБК Alc minutissimum сине-зеленым светом.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1.Получить клетки Alc minutissimum с разным содержанием и составом каротиноидов, используя ингибитор каротиноидгенеза – ДФА. Выделить из них ПСМ и ПБК LH2 с разным количественным и качественным составом каротиноидов.

2.Определить, действительно ли каротиноиды при возбуждении светом инициируют процесс фотоокисления Бхл в ПБК LH2.

3.Исследовать процесс фотоокисления Бхл в ПСМ и ПБК LH2 под действием сине-зеленого света в зависимости от количественного и качественного состава каротиноидов в образце.

4.Изучить распределение каротиноидов в комплексах LH2 с тем, чтобы оценить, как влияет содержание каротиноидов на процесс фотоокисления Бхл.

5.Идентифицировать продукт фотоокисления Бхл в ПБК. Выяснить, как влияет концентрация кислорода в среде на этот процесс.

6.Установить, какие факторы способны ингибировать процесс фотоокисления Бхл в ПБК.

7.Встроить каротиноиды из разных бактерий в ПБК LH2 из Alc minutissimum и выяснить, возможно ли восстановить процесс фотоокисления Бхл.

Научная новизна.

Исследованы ПСМ, светособирающий комплекс LH2 и ансамбль LH1-RC, выделенные из клеток Alc minutissimum с разным уровнем содержания каротиноидов, а также со встроенными каротиноидами из бактерий Alc minutissimum (основной каротиноид родопин) и Rs rubrum (основной каротиноид спириллоксантин). Изучен процесс фотоокисления Бхл850 в комплексе LH2 из Alc minutissimum под действием сине-зеленого света. Выявлена гетерогенность по каротиноидному составу комплексов LH2, выделенных из клеток Alc minutissimum с ингибированным синтезом каротиноидов. Установлено, что фотоокисление Бхл850 не приводит к разрушению структуры комплекса LH2.

Впервые показано, что каротиноиды при возбуждении сине-зеленым светом способны инициировать процессы образования активных форм кислорода, приводящие к окислению Бхл. Обнаружено ингибирующее влияние ловушек активных форм кислорода на изучаемый процесс. Некоторые из них, такие как тролокс, являются специфическими «тушителями» синглетного кислорода, что позволяет предположить участие последнего в процессе фотоокисления Бхл850 в комплексе LH2 из Alc minutissimum под действием сине-зеленого света. Продукт фотоокисления Бхл идентифицирован как 3-ацетил хлорофилл.

Практическая значимость работы.

Результаты работы имеют значение при рассмотрении механизмов взаимодействия каротиноидов и Бхл, а также расширяют наши представления о физико-химических свойствах каротиноидов.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на XII школе - конференции молодых ученых “Биология-наука XXI века” (Пущино, 2008), V и VI съезде Российского фотобиологического общества (Пущино 2008, Шепси, 2011), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов” (Москва, МГУ, 2008, 2009, 2010).

Публикации.

По теме диссертационной работы опубликовано 2 печатные работы, из них 2 статьи в реферируемых журналах, включая международные. Опубликовано 8 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Структура диссертации.

Диссертация содержит 7 глав и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 137 страницах, содержит 49 рисунков и 13 таблиц.

Обзор литературы

Обзор литературы включает изложение современных представлений о классификации и функционировании бактериального фотосинтетического аппарата; строении и биосинтезе бактериальных пигментов; структуре и функционировании бактериальных ПБК и RC; отдельное внимание уделено описанию функций каротиноидов и получению бескаротиноидных клеток бактерий.

Объекты и методы исследования.

Объектом исследования являлись ПСМ и ПБК, выделенные из клеток пурпурной серной бактерии Alc minutissimum. Посевной материал выращивали во флаконах емкостью 100 мл и микробиологических матрацах емкостью 1,7 л в стерильных анаэробных условиях. Бактерии культивировали 4-6 суток на среде Ларсена анаэробно при освещении около 1000 люкс и температуре 25-27°С.

Для ингибирования биосинтеза каротиноидов в среду для выращивания клеток вносили водно-спиртовой (1:1) раствор ингибитора каротиноидгенеза – ДФА, в концентрации от 3 до 12 мг/л. Клетки выращивали в течение 4–6 суток и собирали в стационарной фазе роста. Образцы №1-4 получали, выращивая клетки Alc minutissimum при добавлении 3, 6, 9 и 12 мг ДФА на 1 литр питательной среды, соответственно. Полученную биомассу сразу использовали в экспериментах или хранили при температуре -18°С.

Для выделения ПСМ клетки ресуспендировали в 50мМ трис-HCl-буфере (рН 7.5). ПСМ выделяли после разрушения клеток на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1 (22 кГц; 0,4 А, дважды по 60 сек) методом дифференциального центрифугирования. Полученные ПСМ хранили при - 18°С.

ПБК выделяли с помощью метода препаративного ПАГЭ в 7% геле. Полученные зоны ПБК вырезали, гель размельчали и элюировали в течение 12 часов, затем концентрировали. Полученные образцы сразу использовали для анализа или хранили при - 18°С.

Спектры поглощения клеток пурпурных бактерий, а также выделенных из них ПСМ и ПБК регистрировали на спектрофотометре Cary 50 («Varian», Австралия), спектры флуоресценции (800-900 нм) и возбуждения флуоресценции (область возбуждения 300-650 нм) – на спектрофлуориметре Cary Eclips («Varian», Австралия), спектры кругового дихроизма – на спектрополяриметре JASCO – 600 (Япония).

Анализ пигментов проводили методом ВЭЖХ на колонке Spherisorb ODS2 5 мкм (Agilent technologies, США). Установка для ВЭЖХ состояла из насоса LC 10ADvp с модулем FCV10 Alvp и детектора с диодной матрицей SPD-M20A. Концентрацию каротиноидов рассчитывали, исходя из площадей полос поглощения в области 415-550 нм, с помощью программы LC-solution (“Shimadzu”, Япония) и соответствующих коэффициентов экстинкции.

Свободные каротиноидные карманы рассчитывали как отношение площадей полос поглощения каротиноидов (415-550 нм) в исследуемых ПСМ к площади полос поглощения каротиноидов в ПСМ дикого типа. Количество свободных каротиноидных карманов для LH2 комплексов определяли аналогично, делая перерасчет на 100 комплексов, учитывая, что в контрольном комплексе LH2 присутствует 8-9 мест связывания каротиноидов.

Встраивание каротиноидов в светособирающие комплексы LH2.

В качестве встраиваемых пигментов использовали общий экстракт каротиноидов из Alc minutissimum и Rs rubrum дикого типа.

Общий экстракт пигментов получали последовательной экстракцией ацетон/метанолом и петролейным эфиром из ПСМ Alc minutissimum и Rs rubrum. Бхл удаляли промывкой сухой пленки экстракта метанолом или на колонке с силикагелем «Silica Active 1» (фирма ICN, США).

Встраивание каротиноидов проводили по следующей методике. К 0,3 мл ДФА ПСМ из Alc minutissimum (плотность 35-40 опт. ед. при 850 нм) добавляли 0,15 мл Трис HCl (50 мМ) и 0,05 мл ДМ (20%). Далее последовательно вносили по 0,1 мл каротиноидов в ацетон-метаноле (7/2). После каждого добавления растворитель удаляли диализом. После окончания встраивания проводили ПАГЭ полученных образцов.

Особенность встраивания спириллоксантина заключалась в использовании ПСМ из Alc minutissimum, содержащих ~10% каротиноидов по сравнению с ПСМ дикого типа. К буферу для диализа добавляли аскорбат натрия с целью уменьшить процесс окисления Бхл850. После встраивания ПСМ освобождали от аскорбата натрия центрифугированием в пробирках Amicon Ultra 50k («Millipore», США).

Облучение сине-зеленым светом.

Мембраны (поглощение при 850 нм - 1 опт. ед.) в 0,5-см кювете помещали в термостатируемую ячейку и облучали светом, который выделяли с помощью светофильтров СЗС-22 и ЖС-12. Перед светофильтрами помещали 1-см тепловой фильтр (Н2О). Источником света служил диапроектор ЛЭТИ с галогеновой лампой 500 Вт. Интенсивность света, измеренная термостолбиком, составляла около 0,3 Ват/см2.

Результаты и их обсуждение

Фотоокисление Бхл850 светособирающего комплекса LH2.

Для того, чтобы исключить возможное влияние разных фоторецепторов на процесс фотоокисления Бхл850, был зарегистрирован спектр действия этого процесса (рис. 1). Как видно из Рис. 1, максимум спектра действия практически полностью совпадает со спектром поглощения каротиноидов (420-550 нм). Бхл фактически не дает вклада в спектр действия, так как в области с длиной волны >580 нм и <450 нм положительный сигнал не зарегистрирован.

Рис. 1. Спектр действия фотоокисления Бхл850 в содержащих пигменты мембранах из Alc minutissimum (черные треугольники). Для сравнения приведен спектр поглощения мембран из клеток Alc minutissimum дикого типа.

Полученные результаты позволяют предположить, что фотоокисление полосы Бхл при 850 нм связано в основном с действием света на каротиноиды и в нем не участвует ни Бхл (как активатор процесса), ни другие фоторецепторы.

На следующем этапе работы была проведена оценка влияния количества каротиноидов в ПСМ на фотовыцветание Бхл850. При изменении концентрации ингибитора ДФА в среде для культивирования были получены клетки и ПСМ Alc minutissimum с разным содержанием и составом каротиноидов, включая практически бескаротиноидные образцы (рис. 2). При ингибировании биосинтеза каротиноидов не происходило изменений в ближней ИК-области спектра поглощения. Это указывает на то, что в ПСМ сохранились комплексы LH1 (плечо при 890 нм) и LH2 (800, 850 нм) в нативном состоянии (рис. 2).

Рис. 2. Спектры поглощения ПСМ из клеток Alc minutissimum с разным содержанием и составом каротиноидов:

1 – контрольные мембраны

2 – образец №1;

3 – образец №2;

4 – образец №3;

5 – образец №4.

Спектры нормированы по Qx полосе поглощения Бхл при 590 нм.

При увеличении концентрации ингибитора в среде выращивания уменьшалась интенсивность полос поглощения каротиноидов (420-550 нм) и они смещались в коротковолновую область (с 481 нм в контроле до 451 нм) (рис. 1Б). Это свидетельствует о количественных и качественных изменениях в составе каротиноидов, что подтверждается анализом каротиноидного состава данных образцов (Табл. 1).





В ПСМ из образцов №1-3 под действием сине-зеленого света отмечено быстрое фотоокисление полосы поглощения при 850 нм и ее коротковолновое смещение до 848-847 нм. Одновременно появлялась новая полоса поглощения при 698 нм, соответствующая продукту окисления Бхл. Интенсивность фотоокисления Бхл850 в образцах №1-3 практически не зависела от качественного и количественного состава каротиноидов. Только в образце №4, где каротиноиды практически отсутствуют, фотоокисление Бхл850 происходило очень медленно и продукт с полосой поглощения при 698 нм не образовывался. При дальнейшем освещении отмечено выцветание полосы Бхл890 (комплекс LH1), а затем - полосы Бхл800.

Таким образом, интенсивность процесса фотоокисления Бхл850 практически не зависела от качественного и количественного каротиноидного состава ПСМ. Эти результаты подтверждают предположение, что каротиноиды могут участвовать в процессе фотоокисления Бхл850 в комплексе LH2, поскольку этот процесс проявляется только в ПСМ, содержащих каротиноиды и отсутствует в бескаротиноидных ПСМ.

Таблица 1. Состав каротиноидов (%) в ПСМ из клеток Alcminutissimum, выращенных в присутствии разных концентраций ДФА.

Каротиноид

Образец

Контроль

№1

№2

№3

№4

Фитоин

-

-

7,6

11,9

4,3

Фитофлуин

-

0,9

2,2

2,7

0,2

-Каротин

-

6,8

11,5

3,3

0,4

Нейроспорин

-

31,0

22,8

1,4

0,1

Ликопин

1,9

1,9

0,8

-

-

Родопин

63,5

8,5

3,2

0,5

-

Дидегидрородопин

15,8

16,6

0,9

0,1

-

Ангидрородовибрин

4,5

0,2

-

-

-

Спириллоксантин

13,9

1,1

1,0

0,1

-

Свободные каротиноидные «карманы»

-

~33,0

~50,0

~80,0

~95,0

Гетерогенность каротиноидного состава в комплексах LH2 в клетках Alc minutissimum с ингибированным синтезом каротиноидов.

Чтобы ответить на вопрос - почему не связаны между собой количество каротиноидов в образце и величина наблюдаемого эффекта фотоокисления Бхл850, если последний напрямую связан с каротиноидами? - была проведена оценка гетерогенности каротиноидного состава ДФА-комплексов LH2 из Alc minutissimum.

ПСМ образцов №1-4 из Alc minutissimum выдерживали в водяной бане при температуре 80°С от 0,5 до 60 минут. Выжившие комплексы LH2 отделяли от разрушенных с помощью ПАГЭ. Спектры поглощения комплексов LH2, полученные в ходе этого эксперимента, представлены на рис. 3.

Из полученных данных следует, что в образцах с более высоким содержанием каротиноидов (№ 1-2) происходило более медленное разрушение комплексов LH2 (рис. 2А, Б) и поэтому требовалось более длительное время тепловой обработки. Для образца №3 отмечена меньшая термостабильность. Время, за которое происходило разрушение LH2 комплексов образца №3 было в 5 раз меньше, чем у образцов №1 и 2 (рис. 2В). Образец №4 (рис. 2Г), в котором каротиноиды практически отсутствовали, был наименее термостабильным и полностью разрушался при нагревании в течение 1 мин. Этот факт указывает на важную зависимость термостабильности структуры комплексов LH2 от количества молекул каротиноидов на один комплекс.

Рис. 3. Спектры поглощения комплексов LH2 (показана каротиноидная область), выделенных из ПСМ Alc minutissimum, выращенных при разной концентрации ДФА, до (1) и после (2-4) тепловой обработки при 80оС.

А - образец №1: 1 - контроль,

2 - 10 мин , 3 - 30 мин, 4 - 60 мин;

Б - образец №2: 1- контроль,

2 - 10 мин, 3 - 30 мин, 4 - 60 мин;

В - образец №3: 1 - контроль,

2 - 1 мин, 3 - 2 мин, 4 - 12 мин;

Г - образец №4: 1 - контроль,

2 - 0,5 мин и 3 - 1 мин.

Спектры нормированы по Qx полосе поглощения Бхл при 590 нм.

Из спектров поглощения (рис. 3) хорошо видно, что по мере увеличения времени термообработки в «выживших» комплексах LH2 увеличивается содержание каротиноидов (во всех исследованных образцах) и появляются более длинноволновые (>500 нм) полосы поглощения (образцы №1 и 2). Последний факт свидетельствует об обогащении «выжившей» популяции комплексов LH2 каротиноидами из более поздних стадий биосинтеза, что подтверждается также данными ВЭЖХ анализа каротиноидного состава.

При максимальном ингибировании биосинтеза каротиноидов (образец №4) во фракции свободных пигментов, полученной после 1 мин нагревания, полностью отсутствуют каротиноиды. Следовательно, та часть комплексов LH2, которая разрушилась при обработке, совсем не содержала каротиноидов. Этот вывод имеет прямое отношение к вопросу о возможности сборки комплексов LH2 без каротиноидов, который до сих пор является дискуссионным. Результаты данного эксперимента наглядно показывают, что подобная сборка возможна. Таким образом, можно утверждать, что каротиноиды не являются необходимым компонентом для формирования и функционирования по крайней мере некоторых светособирающих комплексов. Однако, отсутствие каротиноидов делает структуру комплексов более лабильной.

На основании полученных результатов можно говорить о гетерогенности каротиноидного состава в пределах одного пула комплексов LH2, если эти комплексы выделены из бактерий со сниженным, по сравнению с контролем, содержанием каротиноидов. Из этих данных также следует, что процесс фотоокисления Бхл850 не связан с прямым взаимодействием возбужденной молекулы каротиноида и Бхл. В ПСМ с низким содержанием каротиноидов должна существовать бескаротиноидная популяция комплексов, в которой указанное взаимодействие отсутствует. Поэтому, более вероятно, что под действием сине–зеленого света каротиноиды способны к образованию некоего продукта (возможно процесс протекает через несколько стадий), который обладает окислительной способностью. В комплексах LH2, которые не содержат каротиноидов, контакт данного продукта с БХл850, вызывающий окисление БХл, обеспечивается за счет диффузии.

Влияние фотоокисления Бхл850 на стабильность LH2 комплекса.

Для выяснения, связано ли фотоокисление Бхл850 с разрушением структуры комплекса LH2 был проведен следующий эксперимент. ПСМ, выделенные из клеток Alc minutissimum образцов №1-4, освещали сине-зеленым светом (рис. 4) и затем из них были выделены комплексы LH2 (рис. 5).

Рис. 4. Разностные спектры поглощения ПСМ Alc minutissimum

(30 мин облучения сине-зеленым светом - контроль).

А - контрольные ПСМ;

Б - образец №2;

В - образец №3;

Г - образец №4.

Стрелками указаны пики поглощения продукта фотоокисления Бхл850.

Разностные спектры поглощения всех исследованных образцов показывают, что, в принципе, независимо от содержания и состава каротиноидов, изменения в них достаточно похожи (рис. 4). Во всех образцах наблюдается фотоокисление длинноволновых полос поглощения Бхл. Однако, оно уменьшается при снижении содержания каротиноидов. В контрольных ПСМ (рис. 4А) и образцах №2-3 (рис. 4Б, В) этот процесс сопровождается появлением окисленного продукта, содержание которого резко снижено в образце №4 (рис. 4Г). Полученные данные свидетельствует о том, что каротиноиды принимают участие в процессе фотоокисления Бхл850, но сами при этом не окисляются (не разрушаются).

Разделение облученных ПСМ на комплексы показало, что независимо от содержания каротиноидов в образце, комплекс LH2 находится в конформации, у которой длинноволновая полоса поглощения смещена в коротковолновую сторону по сравнению с контрольным комплексом (рис. 5).

Рис. 5. Спектры поглощения комплексов LH2, выделенных из ПСМ, до (1) и после их освещения сине-зеленым светом в течение 30мин (2):

А - контроль,

Б - образец №2,

В - образец №3,

Г - образец №4.

В этом случае длинноволновая полоса поглощения комплекса LH2 локализована в области 829-837 нм. По мере снижения концентрации каротиноидов в комплексе LH2 уменьшается и наблюдаемое смещение (рис. 5). В облученных комплексах LH2 происходит фотоокисление Бхл850 и с этим процессом, по-видимому, связано коротковолновое смещение данной полосы. Отмечено, что продукт фотоокисления Бхл850, имеющий полосу поглощения при 698 нм, всегда сохранялся в структуре комплекса LH2 (рис. 5).

Окисление молекул Бхл850 не означает разрушения структуры комплекса LH2. Следовательно, окисление происходит в той части молекулы Бхл, которая существенна для его спектральных характеристик (изменяется система сопряженных двойных связей), но не влияет на стабильность структуры комплекса LH2.

Идентификация продукта окисления Бхл850.

Чтобы идентифицировать продукт окисления Бхл850, был проведен ВЭЖХ анализ пигментов, полученных после освещения сине-зеленым светом ПСМ из клеток Alc minutissimum (рис. 6Б). Для сравнения были проанализированы ПСМ из Alc minutissimum с Бхл850 химически окисленным с помощью феррицианида калия (рис. 6В). После облучения или химического окисления ПСМ на хроматограмме каждого образца появлялось по одному новому пятну (рис. 6Б и В, пятно №7). По своим спектральным характеристикам и времени удержания на колонке образовавшиеся продукты были идентичны. Поэтому можно говорить о том, что под действием света и при химическом окислении Бхл850 образуется одно и тоже соединение. По спектру поглощения и литературным данным обнаруженный продукт был идентифицирован как 3-ацетил хлорофилл.

Рис. 6. 2D хроматограмма пигментов из мембран Alc minutissimum до (A) и после (Б) их освещения сине-зеленым светом в течение 30 мин, (В) после химического окисления феррицианидом калия. Идентификация пятен:

1 – Бхл;

2 – дидегидролродопин;

3 – родопин;

4 – спириллоксантин;

5 – ангидрородовибрин;

6 – ликопин;

7 - 3-ацетил хлорофилл (продукт окисления Бхл).

При окислении Бхл в его 2-м пиррольном кольце происходит отрыв двух протонов и образование двойной связи. Ее образование кардинально изменяет систему двойных связей молекулы Бхл и вызывает смещение полосы поглощения с 770 нм (Бхл) до 678 нм (3-ацетил хлорофилл) (по данным ВЭЖХ анализа). Эти результаты хорошо согласуются с представленными выше результатами о стабильности структуры LH2 комплекса после окисления Бхл850.

Известно, что 3-ацетил хлорофилл легко образуется в модельных системах (Бхл в растворителе) при освещении светом. Это происходит благодаря взаимодействию возбужденных молекул Бхл с кислородом, при котором образуется синглетный кислород. Последний, взаимодействуя с Бхл, окисляет его до 3-ацетил хлорофилла. Поскольку при окислении молекул Бхл850 в комплексах LH2 Alc minutissimum был обнаружен этот же продукт, то логично предположить, что его образование также происходит через взаимодействие с активными формами кислорода (предположительно синглетным кислородом). Чтобы подтвердить это предположение из буфера, с растворенными в нем ПСМ Alc minutissimum дикого типа, удаляли кислород (продувка аргоном). Затем эти ПСМ освещали сине-зеленым светом, при этом в них не наблюдался процесс фотоокисления Бхл850. Полученные данные указывают на участие в изучаемом процессе кислорода.

Для подтверждения участия активных форм кислорода в фотоокислении Бхл850 был использован подход с использованием тушителей активных форм кислорода. Наиболее показательные результаты были получены с аскорбатом натрия и водорастворимым аналогом витамина Е – тролоксом (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксильная кислота). Последний достаточно часто используется как тушитель синглетного кислорода. Замедление процесса фотоокисления Бхл850 в два раза происходит при концентрации 10 мкМ Тролокса. При внесении в среду 200 мМ аскорбата натрия происходит практически полная остановка процесса окисления Бхл850, даже после освещения в течение 120 минут.

Встраивание каротиноидов как подход для изучения процесса фотоокисления Бхл850.

Как было показано выше, в бескаротиноидных ПСМ и комплексах, выделенных из клеток Alc minutissimum, не наблюдается процесс фотоокисления Бхл850. Поэтому представляло интерес встроить каротиноиды в бескаротиноидные ПБК и выяснить, восстановится ли в них способность к фотоокислению молекул Бхл850. Для решения этой задачи был использован экстракт каротиноидов из Alc minutissimum. Наибольшего встраивания удалось добиться после добавления десяти порций каротиноидов. При ПАГЭ ПСМ cо встроенными каротиноидами отмечена их частичная агрегация на вершине геля (рис. 7).

Рис. 7. ПАГЭ: ДФА - ДФА–ПСМ Alc minutissimum (используемые для встраивания); 2-10 – ДФА-ПСМ Alc minutissimum со встроенными каротиноидами (№ соответствует количеству порций добавленных каротиноидов), 7 – ПСМ Alc minutissimum дикого типа.

По сравнению с ПБК, выделенными из ПСМ образца №4, окраска зоны комплексов LH2 выделенных из ПСМ Alc minutissimum после добавления 2-10 порции каротиноидов, изменилась с сине-зеленой на оранжево-красную (рис. 7). Цвет зоны, соответствующей ансамблю LH1-RC – с бледно-желтой на оранжевую (рис. 7). Эти изменения окраски ПБК подтверждают, что каротиноиды встроились в оба комплекса.

Спектры поглощения комплексов LH2 и LH1–RC, выделенных из ПСМ с максимальным встраиванием каротиноидов, представлены на рис. 8. В области 420-550 нм наблюдается увеличение полос поглощения характерных для каротиноидов, как в комплексе LH2, так и в ансамбле LH1-RC, что свидетельствует об их успешном встраивании в оба комплекса.

Рис. 8. Спектры поглощения ПБК, выделенных из ДФА мембран Alc minutissimum до (1) и после (2) встраивания каротиноидов;

А – комплекс LH2.

Б – комплекс LH1-RC.

Спектры нормированы по Qx полосе поглощения Бхл при 590 нм.

Результаты ВЭЖХ анализа исследуемых образцов представлены в табл. 2. В комплексах LH2 из Alc minutissimum, используемых для встраивания, присутствовали в небольших количествах каротиноиды из ранних этапов биосинтеза: фитоин, фитофлуин (Табл. 2). В комплексах LH2 со встроенными каротиноидами (эффективность встраивания 50 и 90%) основным каротиноидом является родопин (Табл. 2). При увеличении эффективности встраивания в образце происходит увеличение концентрации дидегидрородопина и нейроспорина. Следует отметить, что количество спириллоксантина в обоих образцах со встроенными каротиноидами не превышало 3%. Это свидетельствует о возможной избирательности мест связывания каротиноидов в данном комплексе. Каротиноидный состав комплексов LH2 со встроенными каротиноидами был близок к контролю и значительно отличался от такового у комплексов, выделенных из ДФА ПСМ. Поэтому, можно утверждать, что каротиноиды из грубого экстракта Alc minutissimum встроились в комплексы, выделенные из ДФА ПСМ Alc minutissimum.

Важным критерием, подтверждающим правильность встраивания каротиноидов, являются спектры КД. Известно, что каротиноиды в растворе не имеют оптической активности. Поэтому доказательством встраивания является появление оптической активности в образцах со встроенными каротиноидами. На рис. 9 представлены спектры КД исследованных образцов.

Таблица 2. Состав каротиноидов (%) в комплексах LH2 со встроенными каротиноидами из Alc minutissimum.

Каротиноид

Образец

LH2 ДФА

LH2

50%*

LH2

90%*

LH2

Контроль

Кар**

Фитоин

3,0

6,5

-

-

-

Фитофлуин

5,5

-

-

-

-

-Каротин

0,3

10,3

4,7

-

-

Нейроспорин

0,1

5,0

6,1

0,4

-

Ликопин

-

-

1,3

2,2

4,2

Родопин

0,1

25,8

59,6

67,9

73,9

Дидегидрородопин

-

1,8

12,6

20,0

9,5

Ангидрородовибрин

-

-

2,6

5,0

2,6

Спириллоксантин

-

0,6

3,1

4,5

9,8

Свободные каротиноидные «карманы»

~91

~50

~10

~0

-

**Эффективность встраивания каротиноидов (%) в комплекс LH2.

**Состав каротиноидов, выделенных из ПСМ Alc minutissimum дикого типа, используемых для встраивания.

Спектры КД комплексов LH2, выделенных из ДФА ПСМ, существенно отличаются от спектра КД комплексов LH2 дикого типа, особенно в области 300-400 нм, где у них присутствует сигнал, похожий на консервативный (рис. 8А, Б). Он, по-видимому, связан с полосой Соре Бхл. Ранее этот сигнал никогда не регистрировался, потому, что не удавалось получить бескаротиноидный комплекс LH2 с сохранением нативных спектральных характеристик. Небольшие положительные сигналы в области 400-500 нм могут быть обусловлены наличием следов каротиноидов в этом комплексе (рис. 9А). После встраивания каротиноидов удается восстановить спектр КД до контрольного варианта (рис. 9Б).

Рис. 9. Спектры КД комплексов LH2, выделенных из ДФА ПСМ Alc minutissimum (А). Спектры КД комплексов LH2 (Б) дикого типа (1) и комплексов LH2 с максимальным встраиванием каротиноидов (2).

Для оценки правильности встраивания каротиноидов в комплексы LH2 были измерены спектры испускания и возбуждения флуоресценции у трех типов образцов: контрольных ПБК, ДФА-ПБК и ПБК со встроенными каротиноидами. Комплекс LH2 со встроенными каротиноидами и контроль (комплекс LH2 из Alc minutissimum дикого типа) имеют сходные характеристики по возбуждению и эффективности передачи энергии от каротиноидов на Бхл. Это доказывает, что каротиноиды корректно встроились в комплекс LH2 и восстановили способность к переносу энергии возбуждения к Бхл (на том же уровне, что и в ПБК дикого типа).

При облучении сине-зеленым светом комплексов LH2, выделенных из ПСМ Alcminutissimum с максимальным (95%) встраиванием каротиноидов, отмечено фотоокисление Бхл850 и образование окисленного продукта (рис. 10). Данный процесс практически идентичен фотоокислению Бхл850 комплексов LH2 дикого типа. Продукт фотоокисления, также как и в описанном выше эксперименте, сохраняется в структуре комплекса LH2 и не приводит к его разрушению.

На основании полученных данных можно утверждать, что каротиноиды корректно встраиваются в светособирающие комплексы LH2 пурпурной серной бактерии Alc minutissimum. При этом восстанавливаются все основные функции (структурная, перенос энергии возбуждения), в том числе и способность к фотоокислению Бхл850 при облучении сине-зеленым светом.

Рис. 10. Спектры комплексов LH2 со встроенными каротиноидами из Alc minutissimum до (1) и после освещения сине-зеленым светом в течение: 2 – 10 мин; 3 – 20 мин;

4 – 30 мин.

Стрелкой отмечен продукт окисления Бхл850 (3-ацетил хлорофилл). Спектры нормированы по Qx полосе поглощения Бхл при 590 нм.

Встраивание каротиноидов из Rs rubrum в ДФА ПБК Alc minutissimum.

Для выполнения поставленной в этой работе цели необходимо было установить, могут ли другие каротиноиды, отличные от родопина (основной каротиноид у Alcminutissimum), участвовать в процессе фотоокисления Бхл850 и можно ли их встроить в комплекс LH2. Был использован экстракт каротиноидов из Rs rubrum. Основным каротиноидом в нем является спириллоксантин (Табл. 3), конечный продукт данного пути биосинтеза.

Таблица 3. Состав каротиноидов (%) в экстрактах из Rs rubrum и Alc minutissimum, используемых для встраивания.

Каротиноид

Экстракт каротиноидов из:

Смесь экстрактов

Rs rubrum

Alc minutissimum

1/2*

1/1*

2/1*

Ликопин

3,7

2,5

1,9

1,2

Родопин

13,9

70,9

51,9

42,4

32,9

Дидегидрородопин

22,1

11,7

15,2

16,9

18,6

Ангидрородовибрин

4,5

2,6

3,2

3,6

3,9

Спириллоксантин

59,5

11,1

27,2

35,3

43,4

*Цифрами указано отношение каротиноидных экстрактов из Rs rubrum и Alc minutissimum в смеси каротиноидов, используемой для встраивания.

Нам не удалось встроить чистый экстракт каротиноидов из Rs rubrum, так как происходило окисление и разрушение комплекса LH2. Поэтому были использованы смеси экстрактов Rs rubrum и Alc minutissimum в соотношении 1/2, 1/1 и 2/1, (концентрация спириллоксантина около 25, 35 и 45%). Каротиноидный состав экстрактов и готовых смесей указан в табл. 3.

Для встраивания указанных смесей каротиноидных экстрактов были использованы ПСМ Alc minutissimum с ~10% содержанием каротиноидов по сравнению с ПСМ дикого типа. Предполагалось, что такие ПСМ будут более устойчивы в процессе встраивания. Основными каротиноидами в этих ПСМ были -каротин (6,1%), нейроспорин (1,3%) и родопин (1,4%). В незначительных количествах ( 0,5%) присутствовали фитоин, футофлуин и дидегидрородопин.

Эксперименты показали, что примененный нами подход позволяет встроить каротиноиды в ПБК Alc minutissimum и сохранить нативную структуру комплексов. Небольшое разрушение ансамбля LH1-RC отмечено только при встраивании смеси 2/1. ПАГЭ ПСМ Alc minutissimum после встраивания смесей экстрактов из Rs rubrum и Alc minutissimum в соотношениях 1/2, 1/1 и 2/1 показан на рис. 11. Спектры ПБК, выделенных из соответствующих зон после электрофореза показаны на рис. 12.

Рис. 11. Электрофорез ПСМ Alc minutissimum после встраивания смесей экстрактов из Rs rubrum и Alc minutissimum в соотношениях 1/2 (1), 1/1 (2) и 2/1 (3).

Рис. 12. Спектры поглощения: комплексов LH2 (А) и ансамблей LH1-RC (Б), до (1) и после встраивания экстрактов каротиноидов из Rsrubrum и Alc minutissimum в соотношениях 1/1 (2), 2/1 (3) и 1/2 (4) в ДФА-ПСМ Alcminutissimum; спектр поглощения комплекса LH2 (5А) и ансамбля LH1-RC (5Б) из клеток дикого типа, соответственно.

Даны спектры поглощения только каротиноидной области.

Спектры нормированы по Qx полосе поглощения Бхл при 590 нм.

В каротиноидной области спектры поглощения ансамблей LH1-RC со встроенными каротиноидами похожи и отличаются только по интенсивности. Максимальное встраивание (~98%) наблюдается при самом высоком содержании родопина во встраиваемой смеси каротиноидов (рис 12Б, спектр 4). Основной максимум в них локализован при 486 нм, что характерно для родопина. На встраивание спириллоксантина в ансамбль LH1-RC указывает повышение поглощения в области 500-575 нм (рис 12Б). Однако, в ансамбле из LH1-RC дикого типа с высоким содержанием спириллоксантина присутствуют максимумы при 514 и 549 нм.

Таким образом, независимо от количества спириллоксантина во встраиваемом экстракте, не отмечено его избирательного встраивания в ансамбль LH1-RC. Это означает, что изменение концентрации спириллоксантина в полтора раза (смеси 1/2 и 2/1) не повлияло на его встраивание в данный ансамбль. По нашим оценкам его содержание в образцах не превышало 50% (Табл. 4).

Таблица 4. Каротиноидный состав комплексов LH1-RC (%), выделенных из ПСМ Alc minutissimum со встроенными каротиноидами из Rs rubrum и Alc minutissimum в соотношении 1/2 и 1/1.

Каротиноид

Образец

LH1-RC

ДФА*

LH1-RC

1/2**

LH1-RC

1/1**

LH1-RC***

-Каротин

3,3

следы

следы

-

Нейроспорин

0,9

следы

следы

-

Ликопин

2,6

-

1,1

Родопин

0,4

29,7

26,6

25,7

Дидегидрородопин

0,2

5,2

1,1

3,7

Ангидрородовибрин

12,8

-

3,0

Спириллоксантин

1,2

47,7

37,3

66,5

Свободные каротиноидные «карманы»

~94,0

~2,0

~35,0

0

*Комплекс LH1-RC, выделенный из ДФА ПСМ Alc minutissimum, используемый для встраивания.

**Цифрами указано отношение каротиноидных экстрактов из Rs rubrum и Alc minutissimum в смеси каротиноидов, используемой для встраивания.

***Комплекс LH1-RC, выделенный из ПСМ Alc minutissimum дикого типа.

Полученные данные подтверждают предположение о различии процессов встраивания каротиноидов in vivo и in vitro.

В спектре поглощения комплекса LH2 из ПСМ, используемых для встраивания, присутствуют небольшие полосы поглощения при 428, 447 и 480 нм (рис. 12А, спектр 1) в каротиноидной области. После встраивания происходит увеличение полос поглощения в этой области. По спектру поглощения комплексы LH2 со встроенными каротиноидами были похожи на аналогичные комплексы из дикого типа.

Следует отметить два существенных момента. Во-первых, как и в случае со встраиванием экстракта из Alc minutissimum, нам не удалось добиться 100% встраивания. В этих условиях было достигнуто встраивание на уровне ~85; ~65 и ~70 %, для смесей 1/2, 1/1 и 2/1, соответственно. Таким образом, эффективность встраивания коррелирует с количеством родопина в каротиноидном экстракте, используемом для встраивания. Во-вторых, концентрация спириллоксантина во встроенных образцах LH2 варьировала в пределах 9-13% (Табл.5) и не зависела от его концентрации в смеси, используемой для встраивания (Табл. 3).

Таблица 5. Каротиноидный состав комплексов LH2 (%), выделенных из ПСМ Alc minutissimum со встроенными каротиноидами из Rs rubrum и Alc minutissimum в соотношениях 1/2, 1/1 и 2/1.

Каротиноид

Образец

LH2 ДФА*

LH2 1/2**

LH2 1/1**

LH2 2/1**

LH2***

-Каротин

4,7

8,4

8,9

8,7

-

Нейроспорин

1,6

22,3

19,0

24,2

-

Ликопин

-

следы

следы

следы

2,3

Родопин

1,8

39,9

25,1

17,9

68,1

Дидегидрородопин

0,6

7,6

следы

2,5

20,0

Ангидрородовибрин

-

2,5

1,8

3,5

5,0

Спириллоксантин

0,3

9,3

10,2

13,2

4,6

Свободные каротиноидные «карманы»

~91,0

~10,0

~35,0

~30,0

0

*Комплекс LH2, выделенный из ПСМ Alc minutissimum используемых для встраивания.

**Цифрами указано отношение каротиноидных экстрактов из Rs rubrum и Alc minutissimum в смеси каротиноидов, используемой для встраивания.

***Комплекс LH2, выделенный из ПСМ Alc minutissimum дикого типа.

Измерение cпектров КД, испускания флуоресценции, а также возбуждения флуоресценции комплексов LH2 показало корректность встраивания каротиноидов в ПБК из Alc minutissimum. В этих образцах наблюдалось фотоокисление Бхл850 комплекса LH2 и образование окисленного продукта под действием сине-зеленого света. Последний процесс, по-видимому, связан с присутствием в этих комплексах существенных количеств родопина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

В настоящее время изучению каротиноидов уделяется достаточно много внимания. Однако основные работы в этой области посвящены таким функциям каротиноидов, как антиоксидантная, защитная, тушение синглетного кислорода и т.д. Вопрос о том, что некоторые каротиноиды могут взаимодействовать с кислородом с образованием активных форм кислорода, никогда в литературе не рассматривался.

Показано, что фотоокисление Бхл850 в ПСМ или ПБК LH2 Alc minutissimum при освещении сине–зеленым светом происходит благодаря присутствию каротиноидов (очевидно, родопина). Установлено, что, несмотря на различия в качественном и количественном составе каротиноидов фотоокисление Бхл850 наблюдается во всех образцах. Исключение составляют только бескаротиноидные ПСМ и LH2 Alc minutissimum. Получены результаты по гетерогенности каротиноидного состава в пределах одного пула LH2 комплексов, если эти комплексы выделены из бактерий со сниженным, по сравнению с контролем, содержанием каротиноидов.

Продукт фотоокисления Бхл850 был идентифицирован как 3-ацетил хлорофилл. Известно, что он образуется в результате химического окисления Бхл в модельных системах синглетным кислородом. Предположено, что окисление Бхл850 в ПБК LH2 также происходит при участии активных форм кислорода. После удаления из среды кислорода процесс фотоокисления Бхл850 не наблюдался. В присутствии ловушек синглетного кислорода (аскорбат и тролокс) отмечено замедление или полная остановка этого процесса.

Получены ПБК (LH2 и LH1-RC) со встроенными каротиноидами. Корректность встраивания была доказана с помощью сравнения спектров КД, испускания и возбуждения флуоресценции комплексов LH2 со встроенными каротиноидами с контрольными. В комплексах LH2 со встроенными каротиноидами процесс фотоокисления Бхл850 при освещении сине-зеленым светом восстанавливался полностью.

ВЫВОДЫ:

1. Подобраны условия роста клеток Alc minutissimum в присутствии ингибитора – дифениламина. Из них выделены мембраны и пигмент-белковые комплексы с разным содержанием и составом каротиноидов.

2. Установлено, что каротиноиды выполняют основную роль в процессе фотоокисления Бхл850 при облучении мембран Alc minutissimum, на основании совпадения спектра действия этого процесса с полосой поглощения каротиноидов.

3. Показано, что процесс фотоокисления Бхл850 под действием сине-зеленого света в ПСМ из клеток Alc minutissimum с ингибированным биосинтезом каротиноидов не зависит от содержания и состава каротиноидов в образце. В полностью бескаротиноидных ПСМ этот процесс не зафиксирован.

4. Установлена гетерогенность по каротиноидному составу LH2 комплексов из клеток Alc minutissimum с частично ингибированным биосинтезом каротиноидов. Показано, что в клетках с низким содержанием каротиноидов всегда присутствует некоторое количество бескаротиноидных комплексов LH2. Предполагается, что при возбуждении каротиноидов светом происходит образование продукта (окислителя), который легко диффундирует в среде и способен окислять Бхл850 в комплексах LH2, в которых нет каротиноидов.

5. Фотоокисление молекул Бхл850, образующих в комплексе LH2 кольцевую структуру с поглощением при 850 нм, не означает разрушение структуры самого комплекса. Методом ПАГЭ установлено, что весь окисленный Бхл сохраняется в комплексе LH2.

6. Продукт фотоокисления Бхл850 идентифицирован методом ВЭЖХ как 3-ацетил хлорофилл, который отличается от Бхл наличием двойной связи во втором пиррольном кольце в положении 7-8. Предположено, что образование 3-ацетил хлорофилла происходит через взаимодействие Бхл850 с синглетным кислородом.

7. Установлено, что ловушки синглетного кислорода (аскорбат натрия и тролокс) ингибируют процесс фотоокисления Бхл850 под действием света, поглощаемого каротиноидами.

8. С целью выяснения возможности восстановления процесса фотоокисления Бхл850 в бескаротиноидных комплексах LH2 проведено встраивание в них экстрактов каротиноидов из Rs rubrum и Alc minutissimum. Показано, что процесс фотоокисления Бхл850 полностью восстанавливался после встраивания каротиноидов.

Публикации по теме диссертации:

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК:

1. Makhneva Z., Bolshakov M., Moskalenko A. (2008) “Heterogeneity of carotenoid content and composition in LH2 of the purple sulphur bacterium Allochromatium minutissimum grown under carotenoid-biosynthesis inhibition“. Photosynth Res. V. 98 (1-3), pp. 633-41.

2. Махнева З.К., Большаков М.А., Ашихмин А.А., Ерохин Ю.Е., Москаленко А.А. (2009) “Влияние синего света на стабильность структуры антенных комплексов из Allochromatium minutissimum с разным содержанием каротиноидов”. Биологические мембраны, V. 26 (3), pp. 25-30.

Прочие публикации:

1. Bolshakov M.A., Makhneva Z.K., Moskalenko A.A. (2008) “The photooxidation of bacteriochlorophill dimers of LH2 complexes in the membranes of Alc minutissimum depending on content and composition of carotenoids”. Международная конференция “Преобразование энергии света при фотосинтезе”, стр. 84, г. Пущино.

2. Большаков М.А., Махнева З.К., Москаленко А.А. (2009) “Встраивание каротиноидов в светособирающие комплексы В800-850 из Alc minutissimum и изучение их свойств”. XIX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция “Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах”, стр. 16, г. Пущино.

3. Махнева З.К., Большаков М.А., Ашихмин А.А., Москаленко А.А. (2009) “Почему фотоокисление Бхл850 не вызывает разрушения структуры комплексов LH2 из Alc minutissimum”. XIX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция “Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах”, стр. 42, г. Пущино.

4. Большаков М.А. (2010) “Роль каротиноидов в процессе фотоокисления бактериохлорофилла in vivo”. XIV Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века», Т. 2, стр. 311, г. Пущино.

5. Большаков М.А. (2010) “Специфичность мест встраивания каротиноидов в светособирающий комплекс В800-850 из Alc minutissimum”. XVII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2010», стр. 46, г. Москва.

6. Москаленко А.А., Махнева З.К., Большаков М.А., Ашихмин А.А., Ерохин Ю.Е. (2010) “Каротиноиды в бактериальном фотосинтезе”. Всероссийский симпозиум с международным участием «Автотрофные микроорганизмы», стр. 73, г. Москва.

7. Большаков М.А., Махнева З.К., Москаленко А.А. (2011) “Роль каротиноидов в процессе фотоокисления бактериохлорофилла in vivo”. Материалы съезда VI съезда Российского общества фотобиологов, стр. 10, г. Москва.

8. Ашихмин А.А., Большаков М.А., Махнева З.К., Москаленко А.А (2011) “Встраивание каротиноидов в пигмент-белковые комплексы серных фотосинтезирующих бактерий”. Материалы VI съезда Российского общества фотобиологов, стр. 9. г. Москва.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

LH2                        Периферийный светособирающий комплекс

RC                        Реакционный центр

LH1-RC        Ансамбль, состоящий из комплекса LH1 и RC («core» комплекс)

Бхл                        Бактериохлорофилл

ВЭЖХ                Высокоэффективная жидкостная хроматография

ДФА                        Дифениламин

КД                        Круговой дихроизм

ПАГЭ                Электрофорез в полиакриламидном геле

ПБК                        Пигмент–белковыq комплекс

ПСМ                        Пигментсодержащая мембрана

СДС                        Сопряженная двойная связь

Alc minutissimum - Allochromatium minutissimum

Rs rubrum - Rhodospirillum rubrum






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.