WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

САРАНЦЕВА Светлана Владимировна

РОЛЬ ГЕНОВ ПРЕСЕНИЛИНА 1 И БЕЛКА ПРЕДШЕСТВЕННИКА АМИЛОИДА В ДИСФУНКЦИИ СИНАПСОВ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова»

Научный консультант: доктор биологических наук Шварцман Александр Львович, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова».

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук Владислав Сергеевич Баранов, заведующий лабораторией НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург, профессор, доктор биологических наук Михаил Борисович Евгеньев, заведующий лабораторией Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда, Москва, доктор биологических наук Николай Григорьевич Камышев, заведующий лабораторией Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург.

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится “ “ 2012 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан “ “ ___________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Л.А. Мамон Введение

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой наиболее распространенную форму первичных нейродегенеративных заболеваний пожилого возраста, которая характеризуется потерей памяти, расстройством речи и распадом психической деятельности [Davis, Samuels, 1998]. Несмотря на огромный объём накопленных за последнее время данных, этиология и патогенез заболевания остаются неясными. Лекарственные препараты, применяемые в настоящее время для лечения БА, имеют ограниченный эффект, временно улучшая симптоматику, и не задерживают процесс развития заболевания.

Нейроморфология БА хорошо известна и характеризуется накоплением в мозге больных амилоид-бета-пептида (А) в составе экстраклеточных амилоидных отложений, агрегированного белка тау в составе внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, дисфункцией и дегенерацией синапсов и гибелью нейронов. Однако первые проявления симптомов заболевания, связанные с потерей памяти и нарушением когнитивных функций, происходят в отсутствии каких-либо признаков амилоидоза или нейрофибриллярной патологии и сопровождаются лишь значительным уменьшением синаптической плотности [Terry, 1992, 2000].

Даже на более поздних стадиях БА потеря синапсов часто отмечается в отсутствии гибели нейронов, что указывает на первичное поражение синапсов при развитии заболевания [Masliah et al, 1994].

Доминирующей гипотезой развития БА является «гипотеза амилоидного каскада», в основе которой лежит положение о том, что повышенная секреция нейротоксичных форм А, являющегося главным компонентом амилоидных отложений в мозге больных, обусловливает всю цепочку патологических изменений, приводящих, в конечном счете, к амилоидозу, нейродегенерации, гибели нейронов и развитию деменции [Hardy, Higgins, 1992; Hardy, Selkoe, 2002]. Главными доказательствами этой гипотезы являются генетические данные о том, что семейные формы БА (СБА) обусловлены мутациями в генах белков, непосредственно участвующих в генерации А: в гене белка предшественника А, получившего название АРР (amyloid precursor protein) (APP); гене пресенилина-1 (PS1) и гене пресенилина-2 (PS2) [Hardy, Selkoe, 2002].

Несмотря на широкое признание гипотезы «амилоидного каскада» первые сомнения в ее универсальном характере вызвали сообщения о том, что у больных в ранней фазе СБА нарушения памяти и дисфункция синапсов происходят в отсутствии амилоидогенеза или нейрофибриллярной дегенерации и предшествуют гибели нейронов [Masliah etal., 1994]. Аналогичные результаты были получены и у трансгенных мышей, несущих СБА мутации в генах АPP и PS1 [Oddo et al., 2003.]. И, наконец, изучение больных с наследственными формами БА продемонстрировало, что мутации в PS1 и АРР не обязательно ведут к повышению тотального уровня А, а, напротив, могут приводить к его снижению [Stenh et al., 2002; Bentahir et al., 2006; Kumar-Singh et al., 2006]. При этом в ряде случаев отмечалось изменение отношения секретируемого А, содержащего 40 и 42 аминокислоты (соответственно А40 и А42) [Bentahir et al., 2006; Kumar-Singh et al., 2006]. Эти результаты однозначно показывают, что для ясного понимания патогенеза СБА необходимо учитывать не только изменение секреции А, но и возможные нарушения клеточных функций АРР и пресенилинов.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы – выяснение роли генов пресенилина 1 и АРР в развитии синаптической патологии при болезни Альцгеймера. В работе поставлены следующие задачи:

1. Определить клеточную локализацию PS1 в поляризованных клетках с высоким уровнем экспрессии эндогенного PS1 и исследовать его роль в установлении межклеточных контактов нейронов.

2. Определить эффект мутаций в гене PS1 на образование межклеточных контактов. Выявить возможные связи между нарушением нормальных функций PS1 (участие в клеточной адгезии) и дисфункцией синапсов.

3. Провести анализ структурных, морфологических и функциональных изменений в синапсах при гиперэкспрессии гена АРР человека в Drosophila melanogaster. Создать модель БА на Drosophila melanogaster, позволяющую разделить цитотоксические эффекты АРР и А.

4. Провести анализ нейропротекторных свойств пептидов-миметиков аполипопротеина Е на модели БА Drosophila melanogaster.

Научная новизна работы. Методом высокоразрешающей сканирующей иммуноэлектронной микроскопии и конфокальной микроскопии показано, что PS1 участвует в процессах клеточной адгезии. Впервые показано, что в линиях нейронов, полученных от мышей с нокаутом гена PS1, происходит дегенерация конусов роста и уменьшение числа синапсов.

Впервые показано, что мутации в гене PS1 снижают накопление PS1 в межклеточных контактах и ведут к нарушениям клеточной адгезии.

Впервые разработана модель БА на Drosophila melanogaster, позволяющая разделить цитотоксические эффекты АРР и А. Впервые показано, что экспрессия АРР может приводить к структурным и функциональным изменениям в синапсах, нейродегенерации, экспрессии синаптических белков и когнитивным нарушениям независимо от образования А.

Впервые показано, что пептиды-миметики аполипопротеина Е уменьшают нейродегенерацию и восстанавливают когнитивные функции животных на модели БА в Drosophila melanogaster.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в настоящей работе данные имеют фундаментальное значение для понимания патогенеза наследственных форм БА. Полученные результаты расширяют представления о роли генов АРР и PS1 в дисфункции синапсов при БА. Проведенные исследования представляют теоретическую базу и адекватную экспериментальную модель для исследования роли АРР и PS1 в проявлении и развитии синаптических нарушений при БА.

Итоги работы представляют несомненный интерес для практической медицины. Результаты проведенных исследований показывают, что миметики аполипопротеина Е являются перспективными агентами для разработки лекарственной терапии БА.

Полученные результаты могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Клеточные функции PS1 и природа дисфункций, вызываемых мутациями в этом гене при наследственных формах БА, не исчерпываются участием PS1 в гамма-секретазном комплексе. PSвовлечен в процессы клеточной адгезии, формирование и образование синаптических контактов.

• Нокаут гена PS1 может приводить к нарушениям в образовании синапсов.

• Экспрессия гена АРР человека и его мутантной формы АРР-Swedish в нервных клетках Drosophila вызывает изменение синаптогенеза, проявляющееся в уменьшении содержания синаптических белков в мозге. Этот эффект коррелирует с нарушением у животных способности к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов нейромышечных контактов личинок Drosophila. Наблюдаемые синаптические нарушения предшествуют нейродегенерации и обусловлены экспрессией гена АРР независимо от образования А.

• Пептиды-миметики аполипопротеина Е, созданные на основе его рецептор-связывающего домена, эффективно подавляют нейропатологические процессы, вызываемые экспрессией гена АРР человека на модели БА Drosophila melanogaster. Эти пептиды могут быть использованы для создания нейропротекторных лекарственных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях и симпозиумах: Второй международной конференции «Биотехнология – биомедицина – окружающая среда» (Пущино, 2005); Всероссийской конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2005);

Европейской конференции по нейропсихофармакологи (Амстердам, 2005); Третьей международной конференции «Наука и бизнес» (Пущино, 2006), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность:

фундаментальные исследования и практика» (Пущино, 2006); на Международном симпозиуме «Biological motility: basic research and practice» (Пущино, 2006); Второй научной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина»; Бреслеровские чтения – II (СанктПетербург, 2006); Первом международном симпозиуме «Combinatorial Sciences in Biology, Chemistry, Catalysts and Materials» (Флоренция, 2007);

Европейской конференции по генетике человека (Париж, 2007; Гетеборг, 2010, Амстердам, 2011); Международной конференции «Нейронауки для медицины и физиологии» (Судак, 2007; 2008; 2011); Третьей международной конференции "Фундаментальные науки – медицине" (Новосибирск, 2007); Международном симпозиуме «Biological motility:

achievements and perspectives» (Пущино, 2008), на Российском конгрессе с международным участием "Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное" (Санкт-Петербург, 2010); на Международном симпозиуме «Biological Мotility. From fundamental achievements to nanotechnologies» (Пущино, 2010); на Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008; Одесса, 2010; Киев, 2012); ХХI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ, в том числе 14 оригинальных работ, опубликованных в журналах, включенных в список ВАК, две главы в коллективной монографии и статей в сборниках и материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 234 страницы включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, 55 рисунков, 10 таблиц, заключение, выводы и список литературы, включающий 496 источников.

Содержание работы Материалы и методы исследования В работе использованы следующие клеточные культуры: Tлимфоциты человека (Jurkat клетки) и клон FH-CRC E6-1 были получены в компании ATCC (American Type Culture Collection). Культуры нейронов, полученные от мышей с нокаутом гена PS1, были любезно предоставлены доктором Де Струпером и доктором Сафтигом (Dr. B. De Strooper and Dr. P. Saftig, Experimental Genetics Group, Center for Human Genetics, Campus Gasthuisberg, Belgium). L-фибробласты мыши и эпителиальные клетки человека HEp 2 были получены в компании ATCC (American Type Culture Collection).

В работе использованы следующие линии Drosophila melanogaster:

UAS-APP, содержит ген АРР человека (далее в тексте АРР); UAS-АРРSwedish, содержит ген APP с мутацией Swedish (670K3N, 671M3L), приводящей к наследственной форме БА (далее в тексте АРР-Sw); UASAPPCT (укороченная форма АРР, кодирует белок без внутриклеточного фрагмента), UAS-APPNT (укороченная форма АРР, кодирует белок без экстраклеточного фрагмента), UAS-BACE, содержит BACE человека (далее в тексте ВАСЕ).

Экспрессия трансгенов была проведена в системе UAS- GAL4 [Brand and Perrimon, 1993]. Были использованы следующие активаторы транскрипции: GAL4- elav c155 – экспрессия в нервных клетках Drosophila (далее в тексте elav); GAL4-D42 (далее в тексте D42) – экспрессия в моторных нейронах личинок третьего возраста Drosophila melanogaster.

Для анализа распределения синаптических белков в мозге мух были использованы линии: GAL4-elavc155,UAS-syt-eGFP (далее в тексте syt1), содержащая последовательность elav, последовательность гена синаптотагмина 1 (synaptotagmin 1) и последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP) [Zhang et al., 2002];

GAL4-elavc155,UAS-n-syb-GFP (далее в тексте syb), несущая последовательность elav, вставку гена нейронального синаптобревина (nsynaptobrevin) и последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP) [Zhang et al., 2002].

Для изучения морфологии нейромышечных соединений Drosophila melanogaster использовали линию UAS-CD8-GFP (далее в тексте CD8), мембраны нервных клеток мух в которой, мечены GFP.

Для визуализации и количественного анализа митохондрий в нейромышечных соединениях была использована линия UAS-mito-GFP, мембраны митохондрий мух в которой, мечены GFP.

Линии получены из коллекции Drosophila Bloomington Stock Center. Во время проведения экспериментов мух содержали на стандартной дрожжевой среде при температуре 25оС или 29оС и 12-часовом световом дне.

В работе использованы следующие методы:

• высокоразрешающей сканирующей иммуноэлектронной микроскопии, конфокальной микроскопии, световой микроскопии;

• иммуногистохимии и иммунофлуоресценции;

• цитологические при приготовлении парафиновых срезов головного мозга и нейромышечных соединений личинок Drosophila;

• физиологические при анализе экзо- и эндоцитоза в нейромышечных контактах личинок;

• ПЦР в режиме реального времени, иммунопреципитации, Вестернблот гибриизации, клонирования фрагментов ДНК, трансфекции клеток, экдизон-индуцибельная экспрессионная система (Invitrogen) для регулируемой экспрессии GFP-PS1 кДНК;

• синтеза пептидов и разработанный нами метод инъекций меченых пептидов в абдомен мух с последующим их выявлением в мозге.

Результаты и обсуждение Локализация АРР и PS1 в культуре эмбриональных нейронов В настоящее время показано, что появление ранних клинических симптомов БА происходит при отсутствии каких-либо признаков амилоидоза или нейрофибриллярной дегенерации и коррелирует лишь с потерей или дисфункцией синапсов [Walsh, Selkoe, 2004]. Для понимания этого феномена необходимо ясно представлять, по крайней мере, функции двух белков APP и PS1, мутации, в генах которых приводят к подавляющему большинству семейных форм БА. Как правило, функции белков отражены в особенностях их клеточной локализации, и поэтому в наших экспериментах мы, в первую очередь, исследовали особенности клеточного распределения APP и PS1 в нейронах. Локализацию АРР и PSв культурах эмбриональных нейронов на покрытых L-полилизином стеклах проводили в присутствии 10% сыворотки крови теленка. Среда не изменялась в течение всего периода культивирования вплоть до фиксации и окраски. Антитела к АРР или PS1 выявляли более 90% клеток, демонстрируя интенсивное флуоресцентное окрашивание сомы, коротких и длинных нейритов и конусов роста (рис.1А и 1Б).

Эти результаты согласуются с представленными ранее результатами для АРР и PS1 [Sabo et al., 2003; Uemura et al., 2007; Parent and Thinakaran, 2010]. Однако в нашей работе значительные различия наблюдались в локализации этих белков на поверхности клеток (рис. 1В и 1Г). Если PSконцентрировался лишь на поверхности конусов роста (КР), то АPP не был обнаружен на поверхности КР, а был равномерно распределен на поверхности сомы и нейритов. Эти особенности в распределении двух белков указывают на принципиальное различие в их клеточных функциях.

Мы проверили, не является ли поверхностная локализация APP и PSотражением их внутриклеточного распределения. Конфокальная микроскопия демонстрировала стандартное специфическое сегментальное флуоресцентное окрашивание как АРР в нейритах, так и PS1 в КР в пермеабилизированных клетках (рис. 2).

Рис. 1. Иммунолокализация АРР и PS1 в культуре 15-дневных кортикальных нейронов мыши.

А, Б – Иммунофлуоресцентная микроско- пия, масштаб – 20 мкм.

В, Г – Сканирующая электронная микро- скопия, масштаб – 13,9 мкм, стрелками указаны конусы роста.

В – в левом верхнем углу выделено изображение конуса роста Г – в правом верхнем углу выделено изображение части нейрита Подобное распределение указывает на образование микрокластеров этих белков в структурных компартментах клеток и их связь с цитоскелетом [Ferreira et al., 1993; Sabo et al., 2003].

Рис. 2. Иммунолокализация PS1 в КР и АРР в нейритах в культивируемых кортикальных нейронах мыши.

А – сканирующая микроскопия масштаб – 30,4 мкм; большой стрелкой указан исследуемый конус роста, малой стрелкой указан исследуемый нейрит;

Б, Г – выделенные изображения: Б – конуса роста, Г- нейрита. В, Д – конфокальная иммуномикроскопия:

В – конус роста, PS1; Д – нейрит, АРР Спустя 3,4 дня после начала культивирования в эмбриональных культурах нейронов происходило образование межнейронных синапсов, плотность которых возрастала в течение 14 дней культивирования. Для оценки синаптической плотности в качестве маркера в наших экспериментах мы избрали белок синаптических везикул синаптофизин, который идентифицирует пресинаптический терминал и, по сути, определяет плотность морфологических синапсов в культуре. В культуре нейронов синаптофизин концентрируется в специальных кластерах, которые определяют положение синаптического контакта [Sabo et al., 20Masliah et al., 2001, 2006]. Аналогичное окрашивание было показано ранее для многих белков пресинаптического терминала [Masliah et al., 2001]. На рис. 3 показано совместное окрашивание АРР, PS1 и синаптофизина, доказывающее участие АРР и PS1 в синаптических контактах.

Рис. 3. Конфокальная микроскопия: АРР и PS1 в синапсах в культивируемых кортикальных нейронах мыши.

АРР – иммунофлуоресцентная окраска АРР, SYN – иммунофлуоресцентная окраска синаптофизина, PS1– иммунофлуоресцентная окраска PS1, АРР+SYN – колокализация АРР и SYN, PS1+ SYN – колокализа- ция PS1 и SYN. Стрелками показаны сайты колокализации Обсуждая возможные функции АРР и PS1, мы обращаем внимание на принципиальное различие в локализации этих белков на поверхности нейронов. Действительно, характер распределения АРР на нейронах (рис.1 и рис. 2) и описанное в литературе взаимодействие с интегринами на поверхности аксонов и дендритов [Yamazaki et al., 1997] дает основание предполагать, что АРР в фокальных участках адгезии участвует во взаимодействии нейронов с клеточным матриксом. Напротив, концентрация PS1 на поверхности мотильных элементов (рис. 1) предполагает непосредственное участие этого белка в межклеточных взаимодействиях.

Анализ конусов роста и структуры их цитоскелета в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина Предполагая, что анализ морфологии КР представляет значительный интерес в понимании роли PS1 в межнейронных контактах, мы провели сравнительное исследование морфологии конусов роста в нейронных культурах мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена PS1.

У мышей с нокаутом гена PS1 в эмбриогенезе наблюдаются выраженные скелетные аномалии, кортикальная дисплазия, нарушение миграции нейронов и гибель клеток Кахаля-Ретциуса в маргинальной зоне коры мозга. Хотя эти нарушения летальны, тем не менее, эмбриональные PS1(–/–) нейроны могут быть культивированы и использованы для исследования [De Strooper et al., 1998].

При анализе PS1(+/+) и PS1(–/–) нейронов методом сканирующей электронной микроскопии мы не отмечали каких-либо выраженных различий в форме клеток или длине нейритов. Лишь для некоторых PS1(–/–) нейронов было замечено незначительное увеличение числа ответвлений коротких нейритов. Наибольшие различия для исследуемых культур были отмечены для КР (Таблица 1).

Таблица Характеристика конусов роста PS1(+/+) и PS1(-/-) нейронов Нейроны Конусы роста Конусы роста Конусы роста Конусы роста (x > 100 мкм2) Дегенерация (x < 10 мкм2) (10 < x <1 Коллапс мкм2) PS1(+/+) 8 (9,7 %) 31 (37,8 %) 37 (45,1 %) 6 (7,3 %) PS1(–/–) 20 (22,7 %) 17 (19,3 %) 20 (22,7 %) 31 (35,2 %) Для сравнения параметров КР исследовали по 60 нейронов, полученных из PS1(+/+) и PS1 (–/–) культур. Х – площадь КР (расстояние от «шейки КР до границы филоподий).

PS1(+/+) нейроны характеризовались значительно более высокой долей КР с размерами 10 < x <100 мкм2 и x >100 мкм2. Для PS(–/–) нейронов, напротив, часто встречались КР с размерами x < 10 мкм2.

Морфология КР варьировала в зависимости от их размера. Как правило, КР с площадью x > 100 мкм2 характеризовались выраженной адгезией на поверхности матрикса и присутствием значительных по размеру ламеллярных радиальных структур с множеством длинных филоподий. КР с площадью x < 10 мкм2 часто не имели какой-либо выраженной формы и представляли собой небольшие утолщения, не имеющие четких филоподий. В то же время на разветвленных нейритах обнаруживались сравнительно небольшие КР, однако, имеющие значительное число филоподий.

Через 3,4 дня роста нейронов значительная часть КР в PS1(–/–) культурах подвергалась спонтанной дегенерации, включающей как центральную зону, так и ламелиподии и филоподии. Эти результаты указывают, что PS1 является одним из ключевых белков КР и вовлечен в процессы формирования и роста нейритов.

Так как ранее было показано, что PS1 связан с актиновым цитоскелетом клеток [Singh et al., 2001], мы предположили, что нарушение миграции эмбриональных нейронов обусловлено аномалиями цитоскелета конусов роста. Поэтому мы исследовали структуру конусов роста в культурах первичных PS1(–/–) нейронов. Как и ожидалось, в этих КР актиновые филаменты цитоскелета не образовывали радиальных элементов, а представляли аморфный материал, расположенный на границе ламеллиподиума и в различных областях конуса роста (рис. 4).

Эти данные играют важную роль в понимании роли PS1 в синаптогенезе. Действительно, хотя в настоящее время не остается сомнений, что PS1 играет значительную роль в дифференцировке нейронов, его функции в образовании нейронных сетей остаются недостаточно изученными. КР, интегральной частью которых является PS1, непосредственно вовлечены в ветвление аксонов и дендритов – процессов, лежащих в основе образования нейронных сетей и синаптических контактов.

Рис. 4 Структура актиновых филаментов конусов роста в культурах PS1(+/+) и PS1(–/–) эмбриональных нейронов (окраска радомин-фаллоидин).

Верхняя панель – PS1(+/+) нейроны, нижняя панель – PS1(–/–) нейроны. Над каждой панелью указаны размеры конусов роста В целом наши данные указывают, что взаимодействие PS1 с цитоскелетом нейронов представляется ключевым процессом в образовании и поддержании структуры КР.

Анализ числа синапсов в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина Если наша гипотеза о том, что PS1 принимает участие в образовании синапсов верна, то мы вправе были ожидать, что в культурах эмбриональных нейронов PS1(–/–), полученных от мышей с нокаутом гена PS1, плотность синапсов будет ниже, чем в культурах нейронов, полученных от мышей дикого типа PS1(+/+). Для определения общей плотности синапсов использовали стандартную иммунофлуоресцентную окраску пресинаптического белка синаптофизина.

И действительно, для единичного нейрона в PS1(–/–) культуре отмечали почти трехкратное снижение числа пресинаптических терминалов, окрашиваемых антителами к синаптофизину (соответственно PS1(+/+)PS1 (–/–) – 78 ± 22 и PS1(–/–) – 24 ± 16). Следует отметить, что в этих экспериментах мы можем говорить лишь о плотности «морфологических синапсов», которые, по сути, отражают присутствие синаптических контактов.

Для получения независимого доказательства участия PS1 в образовании синапсов эмбриональные нейроны были трансфецированы кДНК PS1, включающей последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP). Трансфекция GFP-PS1 кДНК была проведена с помощью FuGENETM6 с такой плотностью посева, чтобы можно было выделить единичный нейрон. Были трансфецированы 3- и 7- дневные нейроны (рис.5А и 5Б), которые сохраняли флуоресцентную метку в течение последующих двух недель культивирования. В этот период для «зрелых» нейронов отмечалось наличие разветвленной синаптической сети. На рис. 5В представлены результаты иммунофлуоресцентной окраски белка синаптофизина, сайты возможных синаптических контактов показаны стрелками. Поскольку трансфекция нейронов была проведена при уже достаточной плотности сформированных синапсов, эти результаты, по меньшей мере, могут означать транспорт GFP-PS1 к пресинаптическому терминалу.

Рис. 5. Трансфекция GFP-PS кДНК в эмбриональные кортикальные нейроны мыши.

А – Трансфекция GFP-PS1 кДНК в трехдневный нейрон;

Б – Трансфекция GFP-PS1 кДНК в семидневный нейрон.

1 – световая микроскопия трансфе- цированных нейронов, 2 – наложение изображений световой и флуорес- центной микроскопии трансфециро- ванных нейронов;

В – колокализация GFP-PS1 и синаптофизина в синапсах трансфе- цированных нейронов. Стрелками показаны сайты колокализации.

Масштаб – 20 мкм;

Г – Образование комплексов GFPPS1-N-кадхерин в трансфециро- ванных нейронах. Вестерн-блотинг с антителами к N-кадхерину: 1) Nкадхерин в экстрактах трансфециро- ванных нейронов, 2) иммунопре- ципитация экстрактов нейронов с GFP антителами Ранее было доказано, что один из основных белков нейроадгезии Nкадхерин образует комплексы с PS1 в синаптических контактах [Parisiadou et al., 2004; Uemura et al., 2007]. При этом PS1, являясь секретазой, вызывает частичный протеолиз N-кадхерина (отщепление Сконцевого фрагмента). В наших экспериментах GFP-иммунопреципитаты экстрактов трансфецированных нейронов содержали N-кадхерин, что доказывало участие GFP-PS1 в образовании синаптических контактов (рис. 5Г).

Анализ эффекта мутаций в гене пресенилина 1, наблюдаемых при семейных формах болезни Альцгеймера, в трансфецированных фибробластах Для доказательства роли PS1 в межклеточных взаимодействиях был использован классический метод идентификации белков клеточной адгезии, разработанный Эдельманом [Edelman et al., 1987]. В основе метода лежит наблюдение, что L-фибробласты, дефектные по межклеточным взаимодействиям, после трансфекции кДНК исследуемого белка, участвующего в клеточной адгезии, образовывают межклеточные контакты и клеточные кластеры различного размера. В наших экспериментах такой кДНК служила GFP-PS1 кДНК. Ожидалось, что после трансфекции GFP-PS1 кДНК дикого типа L-фибробласты будут образовывать межклеточные контакты. При этом, если мутации в PSнарушают его функции в клеточной адгезии, то мы были вправе ожидать нарушение межклеточного взаимодействия и резкого снижения количества агрегированных клеток.

Влияние мутаций в PS1 на клеточную адгезию исследовали методом конфокальной микроскопии в L-клетках с экспрессией GFP-PS1 дикого типа и его мутантные аналоги. В отсутствии индуктора – понастерона А не наблюдалось флуоресценции GFP, свидетельствующей об экспрессии GFP-PS1. При этом L-фибробласты не образовывали клеточных кластеров. Напротив, клетки, экспрессирующие как GFP-PS1 дикого типа, так и мутантные формы, спустя 8 – 12 часов после индукции формировали небольшие кластеры флуоресцентных клеток. В случае экспрессии GFP-PS1 дикого типа кластеры были большего размера и характеризовались в основном присутствием полигональных клеток с четкой границей латеральных доменов контактирующих клеток.

Флуоресцентный сигнал определялся в основном в межклеточных контактах. Экспрессия GFP-PS1, с мутациями, приводящими к аминокислотным заменам G209V и Е318G, и экспрессия GFP-PS1 N288, кодирующая укороченную форму PS1, также вызывала агрегацию клеток и образование клеточных кластеров. Однако их морфология была отличной от наблюдаемой при экспрессии GFP-PS1 дикого типа.

Клеточные кластеры были меньшего размера, содержали значительное число клеток не полигональной формы, GFP-флуоресценция в основном была локализована в цитоплазме. Количественная оценка эффекта мутаций в PS1 на агрегацию трансфецированных фибробластов была проведена по измерению числа агрегатов и единичных клеток в суспензии. Через 16 часов после индукции экспрессии GFP-PSнаблюдалась значительная агрегация клеток, экспрессирующих GFP-PS дикого типа, по сравнению с клетками, экспрессирующими мутанты G209V, Е318G или N288 (рис. 6).

Рис. 6. Количественная оценка агрегации L клеток. НТ – нетрансфецированные L – клетки; ДТ – L-клетки с экспрессией GFP-PSдикого типа; G209V, Е318G и N288 – L-клетки с экспрессией мутантных форм GFP-PS1.

Статистически значимые различия в агрегации определяли согласно критерию Стьюдента (Student’s t-test, p) Мы также исследовали распределение GFP-PS1 и его мутантных аналогов в трансфецированных эпителиальных клетках человека HEp (рис. 7), в которых внутриклеточное распределение мембранных белков происходит по механизмам, наблюдаемых в нейронах [Dotti, Simons, 1990].

Рис. 7. Иммунолокализация GFP-PS1 в трансфецированных эпителиальных клетках HEp2, масштаб 50 мкм. А – экспрессия GFP-PS1 дикого типа; Б – экспрессия GFP-PS1 E318G; В – экспрессия GFP-PS1 G209V; Г – экспрессия GFP-PS1 N288.

В наших экспериментах GFP-PS1 дикого типа концентрировался в межклеточных контактах плазматической мембраны (рис. 7А), в то время как GFP-PS1, содержащий мутации G209V, Е319G или N288 был локализован в основном в цитоплазме клеток (рис. 7 Б – Г).

Проведенные эксперименты показали, что межклеточные взаимодействия происходят при концентрации PS1 в межклеточных контактах. Мутации, вызывающие СБА, подавляют взаимодействие трансфецированных клеток.

Роль гена белка предшественника амилоида в синаптогенезе Моделирование нейропатологии БА в Drosophila melanogaster В большинстве моделей БА, созданных на млекопитающих, гиперэкспрессия АРР, а также его совместная экспрессия с PS1 или PSприводят к увеличению уровня A и накоплению A олигомеров, которые могут вызывать синаптические нарушения и дефицит когнитивных функций [Walsh, Selkoe, 2004]. Хотя гиперэкспрессия АРР и отложения A в трансгенных животных не полностью воспроизводят все аспекты БА, эти модели создают реальные возможности для изучения нейропатологии, связанной с БА. В частности, они помогают объяснить вклад АРР и A в патогенез семейных форм БА. И в этой связи Drosophila melanogaster имеет ряд преимуществ перед другими модельными объектами, поскольку позволяет дифференцировать эффекты APP и A. Во-первых, ген APPL, ортолог АРР у Drosophila, не содержит региона, кодирующего A.

Во-вторых, у Drosophila представлены все компоненты белкового комплекса, ответственного за активность -секретазы, но отсутствует или является необычайно низкой активность -секретазы. Поэтому для генерации А необходимы двойные трансгены, экспрессирующие BACE и полноразмерный АРР человека. Это обстоятельство дает возможность разделения эффектов АРР и А, при котором достаточно сравнить трансгены АРР, содержащие и не содержащие BACE. При замене гена АРР дикого типа на АРР с мутацией, вызывающей семейные формы БА, представляется возможность исследовать эффект мутации. Таким образом, исследования различных АРР-трансгенов на Drosophila позволяют дифференцировать эффекты АРР и А и ответить на вопрос о природе основных патогенетических механизмов БА. Следует сказать, что разделение цитотоксических эффектов А и АРР имеет первостепенное значение для выработки подходов в терапевтическом лечении БА.

Для экспрессии гена АРР человека в нервных клетках Drosophila мы использовали бинарную дрожжевую систему UAS-Gal4 [Brand and Perrimon, 1993]. Мухи, несущие в геноме трансген UAS-APP, в состав которого входит кДНК гена АРР, расположенная за последовательностью UAS, были скрещены с мухами, несущими трансген GAL4-elavc155, который запускает транскрипцию в нервных клетках. Как было показано, в линии elav;APP уровень экспрессии АРР выше, чем его ортолога у Drosophila APPL [Greeve et al., 2004; Merdes et al., 2004]. Использование антител 22С11, распознающих экстраклеточный N-домен АРР, выявило образование полноразмерного АРР в линиях с экспрессией АРР (рис. 8А).

Совместная экспрессия АРР и ВАСЕ приводила к уменьшению количества полноразмерных молекул АРР и образованию мономеров и SDSстабильных олигомеров A, которые были выявлены в белковых экстрактах мозга двухдневных мух методом иммунопреципитации антителами 4G8. В линиях с экспрессией только АРР не детектировалось образование мономеров и олигомеров A. С возрастом происходило отложение агрегатов A в мозге мух, которое мы детектировали с пятнадцатого дня их жизни методом иммуногистохимии на парафиновых срезах. Агрегаты A откладывались в мозге мух в районах расположения нейронов и глиальных клеток только в двойных трансгенах с совместной экспрессией АРР и ВАСЕ (рис. 8 Б).

Рис. 8. Экспрессия АРР человека в нервных клетках Drosophila melanogaster.

A) Определение образования АРР и A методом Вестерн–блоттинга. Для определения АРР были использованы моноклональные антитела 22C11; A был иммунопреципицирован с моноклональными антителами 4G8. Блоты были сканированы, и относительные количества белка на каждой дорожке были определены с помощью программы Image J. Б) Отложения A в мозге Drosophila.

Возраст мух 15 дней. Иммуногистохимия с антителами 4G8. Стрелками показаны поля увеличения. Масштаб 50мкм (a,б), 10 мкм (в,г). В) Определение амилоидных отложений в мозге Drosophila. Стрелками показаны амилоидные отложения. Окраска тиофлавином S. Масштаб 100 мкм (левая колонка), 5 мкм (правая колонка) Чтобы подтвердить, что наблюдаемые отложения имеют амилоидную природу, мы окрасили препараты флуоресцентным красителем тиофлавином S, специфически окрашивающим амилоидные структуры.

На 20 день жизни мух наблюдали отложения, расположенные между клетками только в линиях с совместной экспрессией АРР и ВАСЕ (рис.

8В).

Анализ распределения синаптических белков в мозге мух с экспрессией АРР человека Мы исследовали распределение синаптических белков синаптотагмина 1 (synaptotagmin 1, syt1) и синаптобревина (n-synaptobrevin, n-syb) в линиях с экспрессией АРР. Выбор в качестве маркера синаптотагмина был обусловлен теми обстоятельствами, что его содержание прямо коррелирует как с образованием синаптических везикул, так и с плотностью зрелых синапсов у млекопитающих и насекомых и резко падает в мозге больных со спорадической и с наследственными формами БА [Littleton et al.,1993; Masliah et al., 2001; Yao et al., 2005].

Синаптобревин, один из основных пресинаптических белков, является связующим звеном между синаптическими везикулами и компонентами цитоскелета. Таким образом, распределение этого белка может демонстрировать целостность цитоскелета и указывать на возможные нарушения в синаптической функции.

Мы использовали трансгенные линии Drosophila melanogaster с экспрессией в нервных клетках АРР человека, АРР с мутацией Swedish, укороченные формы АРР (APPNT и APPCT), и пресинаптические маркеры синаптотагмин и синаптобревин, включающие последовательность зеленого флуоресцентного белка.

При экспрессии syt1 и syb в нервных клетках трансгенных линий Drosophila, они обнаруживались преимущественно в составе нейропиля, обогащенного нейрональными синапсами, а именно, в антеннальных долях мозга (antennal lobes), включающих обонятельные центры, и грибовидных телах (mushroom bodies), отвечающих за ассоциативное обучение, память и поведение. Об изменениях синаптогенеза судили по изменению на конфокальных срезах интенсивности флуоресценции GFP и ее распределению в антеннальных долях (АД) и долях (, , ’ и ) грибовидного тела (ГТ) мозга Drosophila. Оценка интенсивности флуоресценции была проведена на микрофотографиях конфокальных срезов в программе ImageJ (version 1.38a for Windows).

На второй день жизни имаго интенсивность сигнала в контрольной линии syt1 практически одинакова в ГТ и АД (рис. 9). Однако в мозге мух этого возраста с экспрессией АРР, АРР-Swedish и APPNT, наблюдается значительное понижение сигнала в структурах ГТ. Несмотря на уменьшение сигнала в - и - долях в линии APPCT оно статистически достоверно не отличается от контроля. В АД двухдневных мух статистически достоверное уменьшение сигнала характерно только для линии АРР-Swedish.

Рис. 9. Интенсивность флуоресцен- ции зеленого белка в структурах грибовидного тела (-, -, ’-, и - долях) и антеннальных долях (АД) мозга двухдневных (столбцы серого цвета ) и тридцатидневных (столбцы черного цвета) мух. 1 – syt1; 2 – syt1;АРР/+; 3 – syt1;АРР-Sw/+; 4 – syt1;АРРNT/+; 5 – syt1;АРРCТ/+; – syt1;ВАСЕ/+;АРР-Sw/+ У тридцатидневных мух наблюдалось снижение интенсивности флуоресцентного сигнала в линии syt1 как в ГТ, так и АД (рис. 9). Оно было также характерно и для линий с экспрессией АРР и его фрагментов.

Однако эффект носил менее выраженный характер, по сравнению с наблюдаемым у двухдневных мух. В то же время следует отметить, что, как и в варианте опыта с двухдневными мухами, наибольшее уменьшение сигнала было характерно для линий АРР, АРР-Swedish и APPNT и статистически не отличалось от такового в линии APPCT в , долях ГТ и АД.

Как и в опыте с синаптотагмином, на второй день жизни имаго интенсивность сигнала в линии syb различается довольно слабо в ГТ и АД (рис. 10).

Рис. 10. Интенсивность флуоресцен- ции зеленого белка в структурах грибовидного тела (-, -, ’-, и - долях) и антеннальных долях мозга двухдневных (столбцы серого цвета) и тридцатидневных (столбцы черного цвета) мух. По оси абсцисс – генотипы линий: 1 – syb; 2 – syb;АРР/+; 3 – syb;АРР-Sw/+; 4 – syb;АРРNT/+; 5 – syb;АРРCT/+; 6 – syb;BACE/+;АРР-Sw/+; 7 – syb;BACE/ АРР Однако в мозге мух этого возраста с экспрессией АРР(АРР-Sw) наблюдается значительное понижение сигнала в структурах ГТ и АД. В линии же с экспрессией APPNT понижение наблюдалась в АД и ГТ кроме + ’-доли ГТ. Уменьшение сигнала в и долях в линии APPCT также статистически неотличимо от контроля. Снижение интенсивности флуоресцентного сигнала в мозге 30-дневных мух в контрольной линии syb наблюдалось в слабой мере как в ГТ, так и АД (рис. 10). Снижение было более характерно для линий с экспрессией АРР и его фрагментов.

Следует отметить, что по, сравнению с контролем, у всех анализируемых линий проявлялось сильное уменьшение сигнала как в ГТ, так и в АД.

Одновременно с исследованием роли АРР в синаптогенезе мы оценивали влияние А на экспрессию и распределение маркерных белков.

В опыте с синаптотагмином на второй день жизни имаго в мозге мух ВАСЕ;APP-Sw наблюдается значительное понижение сигнала во всех структурах ГТ и АД (рис. 9). Однако, несмотря на уменьшение сигнала, оно статистически достоверно только для ’ и долей и АД. У тридцатидневных мух наблюдалось снижение интенсивности флуоресцентного сигнала как в ГТ, так и АД. Однако, как и в вариантах опыта без ВАСЕ, эффект носил менее выраженный характер, по сравнению с наблюдаемым у двухдневных мух, а в АД интенсивность сигнала практически была одинаковой как у двухдневных, так и тридцатидневных мух. В случае синаптобревина как на второй, так и на день в мозге мух с совместной экспрессией АРР (АРР-Sw) и ВАСЕ наблюдается статистически достоверное понижение сигнала во всех структурах ГТ и АД, по сравнению с контрольной линией (рис. 10).

Однако для линии ВАСЕ;АРР-Sw уровень сигнала не отличается от такого в линии с экспрессией только АРР-Sw. В линии ВАСЕ/АРР уровень сигнала был статистически достоверно ниже, чем в линии АРР только в доли ГТ и АД на второй и тридцатый дни.

Таким образом, мы наблюдали уменьшение уровня синаптотагмина и синаптобревина в линиях с экспрессией АРР, начиная с первых дней жизни имаго. Это уменьшение было особенно заметно в линиях с экспрессией полноразмерного АРР или АРР с мутацией. Обращает внимание, что наличие мутации статистически достоверно не изменяло уровень исследованных синаптических белков по сравнению с экспрессией АРР дикого типа. Образование А также понижало уровень флуоресцентного сигнала, но он статистически достоверно не отличался от линий с экспрессией полноразмерного АРР (APP-Sw).

Учитывая тот факт, что прогрессирующее снижение уровня синаптических белков наблюдается уже на самых ранних стадиях БА [Masliah et al., 2001], эти результаты имеют чрезвычайно большое значение для понимания природы дисфункции синапсов. В условиях поставленного эксперимента, когда при экспрессии только АРР (АРР-Sw) А не секретируется в мозге мух, мы вынуждены сделать вывод, что эффект подавления синтеза синаптотагмина и синаптобревина в мозге трансгенных мух обусловлен гиперэкспрессией полноразмерного АРР.

Как нам кажется, существуют три основных подхода в интерпретации эффекта АPP на уровень пресинаптических белков и синаптогенез:

1) APP, являясь интегральной частью цитоскелета клетки, непосредственно вовлечен в образование и функционирование синапсов [Torroja et al., 1999]. Вполне вероятно, что мутантный APP или гиперэкспрессия АРР дикого типа приводят к нарушению целостности цитоскелета, дегенерации синаптического компартмента и, как следствие, уменьшению числа нормальных синапсов.

2) АРР в комплексе с моторным белком кинезином является белком аксонного транспорта синаптических белков и синаптических везикул [Duncan and Goldstein, 2006]. Делеция Appl, ортолога АРР, или экспрессия АРР или АРР-Sw в Drosophila вызывала появление одинаковых фенотипов со сниженной экспрессией двух основных моторных белков аксонного транспорта кинезина и динеина [Goldstein, 2003; Duncan, Goldstein, 2006].

Эти результаты ясно указывают, что нарушения в структуре или экспрессии АРР могут вызывать блокаду транспорта синаптических белков в аксонах, дегенерацию цитоскелета и дисфункцию синапсов.

3) АРР или его фрагменты могут непосредственно влиять на уровень экспрессии синаптических белков Анализ уровня мРНК синаптотагмина 1 при экспрессиии гена АРР человека в нервных клетках Drosophila melanogaster Мы показали, что в синаптических структурах мозга трансгенных Drosophila melanogaster, в нервных клетках которых был экспрессирован ген АРР человека, происходит снижение содержания маркерных белков GFP-синаптотагмина и GFP-синаптобревина уже на вторые сутки жизни мух. Оставалось, однако, неясным, какой механизм определяет столь раннее снижение уровня синаптотагмина в мозге трансгенных Drosophila.

Для этого мы провели анализ уровня мРНК синаптотагмина в мозге мух линий с секрецией А (совместная экспрессия АРР (АРР-Sw) и BACE) и в ее отсутствии (экспрессия только АРР (АРР-Sw)) методом ПЦР в реальном времени. На рис. 11 представлен относительный уровень мРНК гена syt1 в контрольной линии и линиях с экспрессией АРР на второй день жизни имаго.

Рис. 11. Относительный уровень экспрессии мРНК syt1. Представле- ны усредненные данные по четырем повторностям опыта. По оси абцисс – генотипы линий: 1 – ela;, 2 – elav;APP/; 3 – elav;APP/BACE; 4 –elav;APP-Sw/+; – elav;BACE/+;APP-Sw/+. *р < 0,по сравнению с соответствующим показателем в линии elav (one-way ANOVA, Kyplot).

Уровень мРНК в линиях, экспрессирующих АРР, значительно ниже, чем в контрольной линии. Примечательно, что он не отличался как в линиях с генерацией А, так и в линиях, где он не образовывался (рис. 11).

Используя метод иммуноблотинга и программу ImageJ, мы проанализировали уровень белка syt1 на второй день жизни имаго.

Результаты анализа, представленные на рис. 12, показывают резкое снижение количества белка syt1 в линиях с экспрессией гена АРР.

Интересно, что если уровень мРНК гена syt1 был практически одинаков во всех линиях с экспрессией АРР, то секреция А дополнительно снижала количество белка syt1.

Рис. 12. Относительный уровень белка syt1. А – определение sytметодом Вестерн-блота с помощью антител Dsyt-CL1. В – нормализо- ванный по линии elav уровень syt1.

По оси абцисс – генотипы линий: 1 – elav, 2 – elav;BACE/+;APP-Sw/+, 3 – elav; APP/BACE, 4 – elav;APP-Sw/+, 5 – elav;APP/+. * р < 0,05 по сравнению с соответствующим показателем в линии elav (one-way ANOVA, Kyplot) Полученные результаты указывают, что подавление транскрипции гена syt1 обусловлено экспрессией именно гена АРР независимо от секреции А. Этот удивительный результат позволяет взглянуть на изменение синаптогенеза в выбранной нами модели с точки зрения функций АРР.

При экспрессии АРР человека в нервных клетках Drosophila он транспортировался в пресинаптический терминал нейронов и постсинаптические участки нейромышечных контактов [Yagi et al., 2000], конкурируя с Appl. Эта конкуренция может подавлять регуляцию экспрессии синаптических белков через протеинкиназа G-зависимый механизм [Claasen et al., 2009]. Альтернативно фрагменты протеолитического расщепления APP могут влиять на транскрипционную активность генов Drosophila [Mller et al., 2007]. Так, цитоплазматический фрагмент АРР (APP intracellular domain, AICD), генерируемый при протеолизе АРР -секретазой может транслоцироваться в ядро, регулировать генную экспрессию, синаптическую пластичность и память [Cao, Sudhof, 2001; Gao, Pimplikar, 2001; Ma et al., 2007]. Как регулятор транскрипции AICD влияет на ремоделирование хроматина посредством связывания с ацетилтрансферазой гистонов Tip60 [Cao, Sudhof, 2001, 2004]. Примечательно, что трансгенные мыши, с гиперэкспрессией AICD, проявляли нейропатологические черты, характерные для БА, включая гиперфосфорилирование тау, нейродегенерацию, нарушение памяти [Ghosal et al., 2009], что указывает на важность рассмотрения других продуктов АРР в патогенезе БА. В нашей работе секреция А не являлась определяющим фактором в изменении уровня мРНК syt1, хотя и приводила к дальнейшему уменьшению его содержания.

Влияние экспрессии АРР человека на нейродегенерацию в мозге мух Наблюдаемое с возрастом изменение экспрессии синаптических белков сопровождалось нейродегенерацией, которая оценивалась на парафиновых срезах мозга, окрашенных гематоксилином и эозином (рис.

13).

Рис. 13. Нейродегенерация в мозге тридцатидневных мух. А – площадь нейродегенерации, вычисленная в программе ImageJ. Б – фотографии парафиновых срезов мозга. Окраска эозином и гематоксилином. Цифрами указаны генотипы линий: 1 – elav, 2 – elav; APP/+, 3 – elav;APP-Sw/+, 4 – elav;APP/BACE, 5 – elav;BACE/+; APPSw/+. Световая микроскопия, масштаб 50 мкм В первые сутки жизни имаго не наблюдалось нейродегенеративных процессов в мозге мух ни одной из линий. На пятнадцатый - семнадцатый день проведения опыта в мозге мух, с экспрессией АРР, появлялись отдельные небольшие очаги нейродегенерации, число которых возрастало к 30 дню опыта. Вакуоли (участки мозга, в которых отсутствует нервная ткань) различного размера наблюдались в нейропиле мозга и, в меньшей степени, затрагивали оптические доли. В линии дикого типа (линия Canton S) слабо выраженная нейродегенерация в нейропиле и глазах впервые фиксировалась только на 55 – 60 день опыта. Хотя число вакуолей варьировало среди опытных образцов, мы не нашли статистически достоверной разницы между линиями с экспрессией ВАСЕ и без экспрессии ВАСЕ. Во всех линиях, с экспрессией АРР наблюдалось статистически достоверное усиление нейродегенерации (рис. 13).

Исследование способности животных к обучению и запоминанию при экспрессии гена АРР человека Клинически БА проявляется как прогрессирующее снижение когнитивных функций, которое начинается на очень ранних стадиях заболевания. Drosophila имеет хорошо развитую центральную нервную систему и поведенческие реакции, которые делают возможным исследовать нарушение памяти при моделировании нейродегенеративных заболеваний. Именно это обстоятельство позволяет исследовать ранние эффекты, связанные с нарушением памяти при экспрессии в плодовой мушке мутантных генов, вызывающих наследственные формы БА.

Таблица Прогрессирующее с возрастом уменьшение способности к обучению трансгенных мух с экспрессией АРР Возраст животных Генотип 1,2 день 7,8 день 13,14 день 21,22 день 28-30 день elav-GAL4c155* 61,2±5,2 46,8±3,6 38,6±4,6 34,2±2,8 31,2±6,UAS-APP* 58,4±4,7 57,0±6,3 52,7±5,8 44,8±4,4 37,4±7,UAS-APP-Sw* 55,4±4,3 42,5±3,0 33,3±3,6 33,7±2,6 35,3±5,elav;APP 9,8±4,1 9,6±4,3 3,6±2,3 2,5±1,5 2,0±1,elav;APP/BACE 13,6±4,0 9,3±2,9 6,4±1,8 5,3±1,2 3,7±2,elav;APP-Sw 22,4±2,4 15,3±4,8 11,6±4,1 4,9±2,8 4,0±2,elav;BACE;APP-Sw 28,0±4,2 19,3±3,7 13,8±3,7 8,2±3,0 4,2±1, Таблица Прогрессирующее с возрастом уменьшение памяти трансгенных мух с экспрессией АРР Возраст животных Генотип 1,2 день 7,8 день 13,14 день 21,22 день 28-30 день elav-GAL4c155* 57,9±3,5 41,5±2,0 30,2±2,3 27,6±1,4 19,7±2,UAS-APP* 55,1±5,1 44,8±4,1 36,2±3,6 39,7±3,6 23,4±2,UAS-APP-Sw* 53,1±5,7 33,2±3,9 25,0±3,1 28,7±3,4 26,3±3,elav;APP 5,0±3,3 3,9±2,1 3,0±1,6 1,2±0,6 1,0±0,elav;APP/BACE 13,1±3,3 10,4±2,2 7,5±1,5 4,5±1,7 4,9±3,elav;APP-Sw 9,2±1,9 7,0±1,5 7,7±3,1 7,3±2,6 5,2±3,elav;BACE;APP-Sw 14,5±4,8 13,6±2,5 9,1±4,2 3,7±1,8 4,0±2,В таблицах показан индекс обучения и запоминания соответственно.

*отмечены контрольные линии. Статистически значимыми считались различия при p < 0.05 (one-way ANOVA и Tukey-Kramer multiple comparison post hoc test).

Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия по сравнению с контрольными линиями Способность мух с экспрессией АРР (АРР-Sw) к обучению и запоминанию была исследована с помощью широко известного классического теста на выработку условного обонятельного рефлекса Tully и Quinn (Tully and Quinn, 1985). Уже у молодых мух (1,2 дня) всех линий с экспрессией АРР способность к обучению и запоминанию была статистически достоверно ниже (Табл. 2 и 3). Эти нарушения усиливались с возрастом.

Мы также исследовали способность этих мух различать и избегать 3октанол, 4-метил-циклогексанол и электрический ток. Не было обнаружено значительной разницы по этим параметрам у мух контрольных линий и мух с экспрессией АРР. Таким образом, наблюдаемые нарушения обучения и памяти у этих мух не являются следствием нарушения обоняния или нарушением способности чувствовать электрический ток.

Анализ морфологических и функциональных нарушений в нейромышечных контактах Drosophila melanogaster, вызванных экспрессией гена АРР человека Для понимания клеточных механизмов, лежащих в основе наблюдаемых нами при экспрессии АРР эффектов, мы провели анализ морфологического и функционального состояния нейромышечных контактов (НМК) личинок Drosophila при экспрессии АРР или АРР-Sw, а также при совместной экспрессии АРР или АРР-Sw и ВАСЕ человека.

Экспрессия АРР (АРР-Sw) приводила к значительным морфологическим и функциональным изменениям в нейромышечных соединениях, вызывая увеличение количества синаптических бутонов (рис.14А), разрастание аксонов (рис.14Б), а также уменьшение числа митохондрий в пресинаптических терминалах (рис. 14В).

В А Б Рис. 14. Анализ нейромышечных соединений личинок линий с экспрессией АРР. По оси абцисс – генотипы линий, на А и Б: 1 – CD8/+;D42/+, 2 – CD8/+;APP/+;D42/+, 3 – CD8/+;APP/BACE;D42/+, 4 – CD8/+;D42/APP-Sw, 5 – CD8/+;BACE/+;D42/APP-Sw; на В: 1 – mito/+;D42/+, 2 – APP/mito;D42/+, 3 – APP/BACE;D42/mito, 4 – mito/+;D42/APP-Sw, 5 – BACE/mito;D42/APP-Sw.

НМК – нейромышечный контакт, ИФ- интенсивность флуоресценции.

Звездочкой отмечены статистически значимые результаты (р < 0,05).

Влияние экспрессии АРР на функционирование синапсов мы изучили с помощью флуоресцентного красителя FM4-64, позволяющего анализировать синаптический эндо- и экзоцитоз [Verstreken et al., 2008].

А Б Рисунок. 15. Анализ эндо- и экзоцитоза в НМК личинок Drosophila melanogaster, с экспрессией АРР. А – относительный уровень флуоресценции в НМК при эндо- и экзоцитозе. Б – процент высвобождения красителя при экзоцитозе. По оси абцисс – генотипы линий: 1 – CD8/+;D42/+, 2 – CD8/+;APP/+;D42/+, 3 –CD8/+;

APP/BACE;D42/+, 4 – CD8/+;D42/APP-Sw, 5 – CD8/+;BACE/+;D42/APP-Sw.

В контрольной линии после 5-минутной стимуляции 90 mM K+ в присутствии красителя в пресинаптических терминалах наблюдался высокий уровень красителя, что указывало на высокий уровень эндоцитоза FM4-64 (рис. 15 А). Внутри синаптического бутона краситель локализовался по периферии бутона, что соответствует пулу везикул, готовых к высвобождению медиатора [Kuromi and Kidokoro, 1998].

Повторная 1-минутная стимуляция 90 mM K+ без красителя, индуцирующая экзоцитоз, приводила к значительному уменьшению уровня красителя (рис. 15А). Анализ синаптических бутонов НМК личинок с экспрессией АРР показал, что интенсивность флуоресценции красителя и его распределение внутри бутона при эндоцитозе практически не отличалась от контрольных образцов в линиях с экспрессией АРР и АРР-Sw (рис. 15А) в то время, как образование А вызывало, хотя и незначительное, снижение эндоцитоза. Более драматическая ситуация наблюдалась при экзоцитозе. Так, если в синаптических окончаниях личинок контрольной линии за 1 минуту «выгружалась» большая часть красителя, то количество красителя, высвобождающееся из синаптических бутонов в линиях с экспрессией АРР (АРР-Sw) или АРР (АРР-Sw) и ВАСЕ было значительно уменьшено (рис. 15Б). Эти данные показывают, что хотя в линиях с экспрессией АРР имеется достаточный запас готовых к экзоцитозу синаптических везикул, необходимо больше времени для их слияния с синаптической мембраной. Между линиями с экспрессией только АРР или АРР-Sw и линиями, где образовывался А (совместная экспрессия АРР и ВАСЕ и АРР-Sw и ВАСЕ), статистических различий выявлено не было.

Как было отмечено ранее, трансгенные линии Drosophila позволяют разделить эффекты экспрессии АРР и A. Полученные нами результаты показывают, что наблюдаемые структурные и функциональные нарушения НМК обусловлены экспрессией именно гена АРР независимо от секреции А. Хотя наши эксперименты были проведены на трансгенных организмах, в литературе представлены данные о том, что дупликации гена АРР могут приводить к развитию БА (Rovelet-Lecrux et al., 2006; http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations). Мы также наблюдали, что эффект экспрессии мутантной формы АРР-Sw на синаптогенез был значительно слабее, чем экспрессия АРР дикого типа. Подобная картина описана и у трансгенных мышей при экспрессии АРР дикого типа и мутантной формы АРР с мутациями Swedish и Indian [Seeger et al, 2009].

Эти данные дают возможность предположить, что мутации в АРР, связанные с семейными формами БА, вызывают потерю или снижение его синаптической активности.

Анализ нейропротекторных свойств пептидов-миметиков аполипопротеина Е на модели БА на Drosophila melanogaster Транспорт пептидов через гематоэнцефалический барьер Drosophila melanogaster Применение многих существующих лекарственных соединений оказывается низкоэффективным вследствие ограниченного транспорта их из кровотока в мозг и возможности поддержания в нем концентраций препаратов, необходимых для достижения терапевтического эффекта. Эти ограничения обусловлены гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), образуемым эндотелиальными клетками сосудов мозга [Pardridge, 2005]. В целом, ГЭБ является основным барьером для доставки в мозг лекарственных препаратов белковой и пептидной природы, которые могут оказаться эффективными в лечении многих нейрологических заболеваний [Egleton and Davis, 2005; Laskowitz et al., 2006]. Тем не менее, существуют как белки, так и пептиды, способные проникать через ГЭБ.

Мы использовали Drosophila melanogaster как простую и удобную физиологическую модель для анализа препаратов, способных проникать через ГЭБ. Для исследования транспорта пептидов, меченых биотином, через ГЭБ Drosophila мы вводили пептиды непосредственно в абдомен, заполненный гемолимфой, омывающей поверхности внутренних органов насекомого, в частности мозга. При этом мы предполагали, что биотинилированный пептид может обнаруживаться в мозге мух лишь в том случае, если он способен пройти через ГЭБ. Чтобы исключить возможность абсорбции или интернализации пептида в тонком слое клеток ГЭБ, определение пептидов было проведено на срезах мозга. Были исследованы пептиды, проходящие через ГЭБ млекопитающих:

пенетратин (Antp 43-58) – RQIKIWFQNRRMKWKK [Derossi et al., 1994];

Cog133 – LRVRLASHLRKLRKRLL, пептид, имеющий трансдуцирующие свойства; и Cog112, состоящий из последовательности пенетратина и Cog133 [Li et al., 2006]. В качестве контрольных пептидов, не способных проникать через ГЭБ, были использованы Antр 41-55 – WQRQIKIWFQNRRMK [Bolton et al., 2000] и Antp-rev 58-43 – KKWKMRRNQFWIKIQR.

Анализ распределения интенсивности окраски на денситограммах показал, что каждый пептид проникает в мозг мух с различной эффективностью. Максимальное поглощение было отмечено для Cog 133.

В то же время Cog112, оказался наименее чувствительным к деградации в мозге, чем другие исследованные пептиды (рис. 16).

Рис. 16. Динамика накопления пептидов в мозге Drosophila.

1 – Cog112; 2 – Cog 133 ; 3 – пенетратин; 4 – Ant-rev; 5 – Ant 4155. Каждая точка представляет среднюю величину из четырех независимых определений на каждом срезе. Статистически значимыми считали различия при р < 0, Функциональные сходства ГЭБ млекопитающих и ГЭБ дрозофилы подтверждает эксперимент с пептидом, который не пересекает ГЭБ.

Пептид Ant 41-55, который не проходит через ГЭБ крыс [Bolton et al., 2000], в наших экспериментах не проходил и в мозг Drosophila. Такой же эффект наблюдался и при использовании другого контрольного пептида Ant 58-43.

Таким образом, можно предположить, что транспорт различных пептидов в мозг через ГЭБ одинаков для грызунов и для Drosophila. И в этом плане Drosophila представляется одним из очень удобных модельных организмов в разработке новых лекарственных препаратов для лечения заболеваний ЦНС.

Эффект пептидов-миметиков аполипопротеина Е на нейродегенерацию в мозге трансгенных мух Аполипопротеин Е (апоЕ) человека представляет собой полипептид из 299 аминокислотных остатков, основная функция которого заключается в транспорте липидов и липопротеинов. Независимо от своих функций в обмене липидов, апо Е представляет собой основной аполипопротеин центральной нервной системы, регулирующий процессы нейродегенерации и нейропластичности, является модулятором врожденного и приобретенного иммунного ответа in vitro и in vivo.

Последовательность рецептор-связывающего домена апоЕ (133-149, LRVRLASHLRKLRKRLL) была использована для создания его пептидных миметиков. В экспериментах in vitro и in vivo было показано, что пептид-миметик апоЕ Cog133 сохраняет антиоксидантные и противовоспалительные свойства нативного апоЕ [Aono et al., 2002;

Misra et al., 2001; Laskowitz et al., 2001; Lynch et al., 2005]. Более того, Cog133 проявлял выраженные нейропротекторные свойства на моделях черепно-мозговой травмы у млекопитающих даже при однократном введении спустя 30 мин после травмы [Lynch et al., 2005]. И, как мы показали, Cog133 и пептид Cog112 эффективно проходят через ГЭБ Drosophila. Еще более эффективным терапевтическим пептидом оказался укороченный пептидный миметик апоЕ - Cog1410, включающий позиции 138-149 апоЕ и содержащий в позициях 140 и 145 аминоизомасляную кислоту [Laskowitz et al., 2006]. Cog1410 также сохранял антиоксидантные и противовоспалительные свойства интактного холопротеина in vitro и in vivo [Laskowitz et al., 2006; Hoane at al., 2009], но оказался более эффективным нейропротектором, чем его предшественник Cog133 [Hoane at al., 2009]. Мы изучили, как эти пептиды проявляют нейропротекторные свойства на модели БА Drosophila melanogaster. Суммарная площадь регистрируемых вакуолей, отражающая степень нейродегенерации в мозге мух линий elav;APP/BACE и elav;BACE;APP-Sw значительно сокращалась после 7 инъекций Cog112 или Cog133 (Таблица 4).

Защитный эффект пептидов наблюдался уже на 15 – 17 день после четырех инъекций. Наиболее значительный эффект был отмечен в случае применения пептида Cog1410. В контрольных экспериментах инъекции пенетратина в тех же концентрациях не блокировали нейродегенерацию.

Таблица Эффект пептидов-миметиков апоЕ на нейродегенерацию в мозге трансгенных мух Варианты опыта без пептида, инъекции пептида, Генотип % нейродегенерации % нейродегенерации Cog1elav; APP / BACE 20,0 ± 2,8 11,7 ± 2,8* elav; BACE; APP-Sw 18,3 ± 4,6 8,7 ± 0,5* Cog1elav; APP / BACE 20,0 ± 2,8 7,6 ± 1,4* elav; BACE; APP-Sw 18,3 ± 4,6 10,8 ± 1,1* Cog14elav; APP / BACE 20,0 ± 2,8 4,4 ± 0,7* elav; BACE; APP-Sw 18,3 ± 4,6 7,5 ± 0,9* пенетратин elav; APP / BACE 20,0 ± 2,8 16,6 ± 2,elav; BACE; APP-Sw 18,3 ± 4,6 14,8 ± 3,* отмечены статистически значимые результаты (p < 0,05) по сравнению с контрольными вариантами опыта (без добавления пептида), one-way ANOVA и тест Тьюки–Крамера. Концентрации пептидов при инъекциях составляли: 11,µM Cog133, 11,47 µM Cog112, 11,26 µM Cog1410 и 11,71 µM пенетратина.

Эффект пептидов-миметиков аполипопротеина Е на способность животных к обучению и запоминанию Мы исследовали, могут ли пептиды-миметики апоЕ восстанавливать способность животных к обучению и запоминанию в двух линиях с экспрессией АРР: elav;APP/BACE и elav;BACE/APP-Sw. После двух инъекций (возраст мух 7,8 дней) Cog112 или Cog133 не наблюдалось изменений в обучении мух, но наблюдалось улучшение памяти у мух генотипа elav;APP/BACE при обработке Cog112 или Cog133 (Таблица 5).

После трех добавочных инъекций (возраст мух 21,22 дня) наблюдался значительный позитивный эффект на обучение и память мух этого генотипа при применении Cog112 и только на обучение – при инъекциях Cog133. У мух генотипа elav;BACE; APP-Sw наблюдалось статистически достоверное улучшение памяти на 7,8 день.

При изучении эффекта Cog1410 мы добавляли пептид в корм животным. При кормлении мухи сразу же после вылупления переносились и содержались на среде с Cog1410, которая менялась ежедневно. Как видно из представленных в Таблице 5 данных на 7,8 день не наблюдалось статистически достоверного улучшения обучения и памяти ни при применении Cog1410, ни при использовании контрольного пептида. Иная картина наблюдалась на 21,22 день. Индекс обучения и запоминания увеличивался примерно в 2-3 раза у мух обоих генотипов (elav;APP/BACE и elav;BACE;APP-Sw) при содержании их на среде с Cog1410.

Таблица Эффект пептидов-миметиков апоЕ на обучение и память мух линий с экспрессией АРР Генотип Инъекции Индекс обучения, (%) Индекс памяти, (%) пептидов 7,8 день 21,22 день 7,8 день 21,22 день elav;APP/BACE - без пептида 9,3±2,9 5,3±1,2 10,4±2,2 4,7±2,+Сog133 11,6±1,3 9,8±2,5* 18,0±2,6* 6,2±1,+Сog112 10,0±2,7 8,6±1,2* 17,6±1,4* 12,2±2,3* +Cog1410 8,3±3,9 20,0±6,3* 9,3±3,6 18,1±3,7* +пенетратин 6,0±1,1 6,2±1,3 6,1±2,7 3,6±1,elav;BACE;APPSw - без пептида 19,1±4,1 8,2±3,0 13,6±2,5 3,7±1,+Сog133 25,4±1,9 9,3±3,5 19,6±1,2* 3,7±1,+Сog112 21,7±3,1 11,3±1,4 15,3±1,7 5,2±2,+Cog1410 23,1±4,8 21,5±5,7* 16,5±2,8 14,2±4,0* +пенетратин 28,7±6,5 10,7±1,7 10,4±2,1 4,0±1,* отмечены статистически значимые результаты (p < 0,05) по сравнению с контрольными вариантами опыта (без добавления пептида), one-way ANOVA и тест Тьюки–Крамера. Концентрации пептидов при инъекциях составляли: 11,µM Cog133; 11,47 µM Cog112; 11,26 µM Cog1410 и 11,71 µM пенетратина Эффект Cog 112 на отложения А Мы исследовали эффект Cog112 на накопление А в мозге Drosophila.

Мы анализировали эффект Cog112 в линии генотипа elav;APP/BACE, в мозге мух которой наблюдался высокий уровень амилоидных отложений, нейродегенерация, снижение уровня синаптических белков. В качестве контрольного пептида был использован пептид Antp-SH8, который представляет собой составной пептид, состоящий из пенетратина и пептида SH8. Пептид SH8 был выделен при скрининге пептидных библиотек, как ингибитор агрегации А [Schwarzman et al., 2005].

Пептиды добавлялись в среду в следующих концентрациях: 11,47 µM Cog112 и 3,72 µM Antp-SH8. Как видно на рис. 18, значительные амилоидные отложения обнаруживаются в местах расположения нервных клеток. Применение Antp-SH8 заметно уменьшало размер и плотность амилоидных отложений. При применении Cog112 на отдельных препаратах наблюдалось уменьшение размера амилоидных отложений, но возможный эффект трудно оценить из-за значительных вариаций в детектируемых отложениях А.

Рис. 18. Влияние пептидов на образование отложений А в мозге Drosophila. Иммуногистохимия, антитела 4G8. Световая микроскопия.

A) Распределение отложений А в мозге 20-ти дневных мух. Масштаб – 50 мкм. Б) Эффект пептидов на накопление А в мозге Drosophila. Масштаб – 10 мкм Мы также исследовали действие пептида Cog1410 на распределение отложений A в мозге трансгенных мух 30-дневного возраста. Анализ, проведенный на парафиновых срезах мозга, как и при использовании пептида Cog112, не выявил значительных различий в распределении A в контрольных (без пептида) и вариантах после инъекций Cog1410.

Природа нейрозащитных функций пептидных миметиков апоЕ в настоящий момент не ясна и требует дальнейшего изучения. Принимая во внимание наши собственные данные и полученные другими исследователями, мы предполагаем, что эффекты апоЕ миметиков обусловлены прямым или опосредованным взаимодействием последних с агентами, модулирующими в первую очередь воспалительные и нейрозащитные реакции организма.

Полученные результаты позволяют предположить, что пептидымиметики апоЕ являются перспективными агентами для разработки лекарственной терапии БА.

Заключение Идентификация мутаций в генах АРР, PS1 и PS2, вызывающих раннюю аутосомно-доминантную форму БА, отводит им основную роль в патогенезе БА. Вместе с тем функции АРР и пресенилинов в настоящее время изучены недостаточно и, в силу этого обстоятельства, механизм обменных нарушений и физиологических процессов, обусловленный мутациями, остается неясным. Хотя аномальный протеолитический процессинг АРР, наблюдаемый при наследственных формах БА, послужил основой для выдвижения основной патогенетической гипотезы амилоидного каскада, существует целый ряд наблюдений, вызывающих сомнение в ее универсальности. Так, не все известные на сегодняшний день мутации в генах АРР и пресенилинах приводят в повышенному образованию А42 или изменению соотношения А40/А42 [Duering et al., 2005; Walker et al., 2005; Shen and Keller, 2007]. Во-вторых, попытки создания антиамилоидогенной терапии потерпели неудачу. В-третьих, уровень А и его отложения не коррелируют с прогрессией деменции.

Кроме этого, у мышей с гиперэкспрессией АРР человека не обнаруживается нейродегенерация, наблюдаемая у больных БА.

В то же время увеличивается число исследований, свидетельствующих, что нарушения синаптических функций, и связанная с ними потеря памяти в ранней фазе БА происходит значительно раньше процессов нейродегенерации или амилоидоза. В качестве альтернативных гипотез выдвигаются предположения о том, что образование нейротоксических агрегатов А и белка тау представляют собой лишь одни из многих процессов, вносящих вклад в патогенез заболевания. Так, например, целый ряд наблюдений привел к созданию «пресенилиновой гипотезы» патогенеза БА, в основе которой лежит предположение, что частичная потеря функций пресенилина может вызывать нейродегенерацию и нарушения памяти у больных БА [Shen and Keller, 2007].

«Пресенилиновая гипотеза» объясняет существование и природу мутаций в пресенилинах при БА и поддерживается многочисленными исследованиями на животных. Однако она не без труда объясняет мутации в АРР при СБА.

В данной работе показано, что АРР и пресенилин 1 локализованы в пресинаптических терминалах и непосредственно вовлечены в образование и поддержание синапсов. Также показано, что экспрессия гена АРР человека в нервных клетках Drosophila вызывает изменения экспрессии синаптических белков, морфологии грибовидных тел мозга, отвечающих за обучение и память животных, нейродегенерацию и нарушает способность их к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов нейромышечных контактов личинок Drosophila, при этом наблюдаемые эффекты обусловлены именно экспрессией АРР, а не образованием А.

Созданная на Drosophila melanogaster модель БА воспроизводит основные нейроморфологические черты БА, наблюдаемые у людей, а именно, изменение синаптической плотности, нейродегенерацию, образование и отложение А, а также и клинические показатели, как нарушение обучения и памяти. Надо отметить, что хотя большинство семейных форм БА обусловлены мутациями в генах АРР и пресенилинах, в литературе представлены данные о том, что дупликации гена АРР могут приводить к развитию БА. В наших экспериментах эффект экспрессии мутантной формы АРР-Sw был значительно слабее, чем экспрессия АРР дикого типа.

На основе этих данных можно предположить, что мутации в АРР, связанные с семейными формами БА, вызывают потерю или снижение его синаптической активности.

Мы также показали, что пептиды-миметики аполипопротеина Е способны блокировать нейродегенерацию и улучшать когнитивные функции трансгенных Drosophila melanogaster с экспрессией АРР человека. Вопрос разработки стратегии терапевтического лечения не только БА, но и других конформационных болезней в настоящее время остается открытым. Например, для БА в настоящее время не известно ни одного фармакологического препарата, который бы мог, если не предотвратить, то, по крайней мере, замедлить течение этого фатального заболевания. Если бы мы могли разработать препараты, которые ингибировали бы олигомеризацию А и одновременно предотвращали бы развитие клинического синдрома, мы бы лучше поняли и патогенетическую основу заболевания. Таким препаратом мог бы быть нейропротектор, восстанавливающий и синаптические, и когнитивные функции. Поиск соответствующих препаратов – как раз тот случай, когда развитие фундаментальной науки и разработка практических терапевтических подходов представляют собой единое целое. Мы полагаем, что пептидные миметики аполипопротеина Е являются перспективными агентами для разработки лекарственной терапии БА.

Выводы 1. PS1 локализован на поверхности клеточных структур, которые обеспечивают клеточную подвижность и межклеточные контакты:

ламеллиподиуме Т-лимфоцитов и конусах роста нейронов, что свидетельствует о вовлечении этого белка в процессы клеточной адгезии.

2. Нокаут гена PS1 приводит к нарушению структуры конусов роста нейронов, их дегенерации и уменьшению числа синапсов.

3. Мутации в гене PS1 приводят к нарушению механизмов клеточной адгезии, что в конечном итоге может обуславливать нарушение формирования и поддержания синаптической сети.

4. Экспрессия гена АРР человека в нервных клетках Drosophila melanogaster вызывает изменения экспрессии синаптических белков, морфологии грибовидных тел мозга, отвечающих за обучение и память животных, нейродегенерацию, и нарушает способность их к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов нейромышечных контактов личинок Drosophila melanogaser.

5. Выявленные на модели БА на Drosophila melanogaster структурные и функциональные нарушения как центральных синапсов имаго, так и синапсов нейромышечных контактов личинок обусловлены экспрессией АРР, а не образованием А. Образование А приводит к усилению нейропатологических процессов.

6. Пептиды-миметики аполипопротеина Е подавляют нейродегенерацию и улучшают обучение и память у трансгенных Drosophila melanogaster, воспроизводящих основные признаки БА. Эти пептиды могут быть использованы для создания нейропротекторных лекарственных препаратов.

7. Проведенное исследование на культуре эмбриональных нейронов мышей с нокаутом гена PS1 и на культурах эпителиальных клеток с экспрессией мутантного PS1, а также на модели БА на Drosophila melanogaster позволяет предположить, что нарушение нормальных функций генов PS1 и АРР может приводить к ранней дисфункции синапсов при БА.

Список публикаций по материалам диссертации Главы в коллективных монографиях и книгах:

1. Саранцева С.В, Шварцман А.Л. Болезнь Альцгеймера и дисфункция синапсов // Нейродегенеративные заболевания:

фундаментальные и прикладные аспекты / Под ред. академика М.В. Угрюмова. – М.: Наука, 2010. – С. 286–298.

2. Саранцева С.В, Шварцман А.Л. Моделирование нейропатологических процессов при болезни Альцгеймера и методов их коррекции на Drosophila melanogaster // Нейродегенеративные заболевания: фундаментальные и прикладные аспекты / Под ред.

академика М.В. Угрюмова. – М.: Наука, 2010. – С. 350–355.

3. Sarantseva S., Schwarzman A. Modeling amyloid diseases in fruit fly Drosophila melanogaster // Amyloidosis – Mechanisms and Prospects for Therapy / Edited by S. Sarantseva. – Rijeka: Intech, 2011. – P.199–216.

Статьи в журналах, включенных в перечень ВАК РФ:

4. Саранцева С.В., Шварцман А.Л. Болезнь Альцгеймера: амилоидоз или дисфункция синапсов? Уроки моделирования на Drosophila melanogaster // Экологичесая генетика. – 2005. – Т.3. – № 4. – C. 19–25.

5. Шварцман А.Л., Cаранцева С.В., Татищева Ю.А., Рунова О.Л., Талалаева Е.И., Витек М.П. Экспрессия на клеточной поверхности пресенилина1 в мотильных поляризованных клетках // Биофизика. – 2006.

– Т.51. – №4. – С.839–843.

6. Шварцман А.Л., Саранцева С.В., Соловьев К.В., Рунова О.Л., Талалаева Е.И., Витек М.П. Дегенерация конусов роста в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина1 // Биофизика. – 2008. – Т.53. – №6. – С. 1008–1113.

7. Шварцман А.Л, Саранцева С.В., Витек М.П. Дисфункция синапсов и нарушение структуры цитоскелета конусов роста в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина 1 // Технологии живых систем. – 2008. – T.5 – № 5 – 6. С.5–10.

8. Саранцева С.В., Большакова О.И., Тимошенко С.И., Родин Д.И.,Витек М.П., Шварцман А.Л. Изучение патогенеза болезни Альцгеймера на модели Drosophila melanogaster: дефицит синаптического белка синаптотагмина в мозге трансгенных мух с избыточной экспрессией АРР человека // Генетика. – 2009. – Т.45. – №1. – С. 119–126.

9. Саранцева С.В., Большакова О.И., Тимошенко С.И., Колобов А.А., Витек М.П., Шварцман A.Л. Транспорт пептидов, содержащих домены белковой трансдукции, через гематоэнцефалический барьер в Drosophila melanogaster // Биомедицинская химия. – 2009. – T.55. – Вып.1. – C.41–49.

10. Саранцева С.В., Шварцман А.Л. Современные генетические подходы к поиску мишеней для действия лекарственных препаратов // Генетика. – N.45. – №7. – C. 869–880.

11. Sarantseva S., Timoshenko S., Bolshakova O., Karaseva E., Rodin D., Schwarzman A.L., Vitek M.P. Apolipoprotein E-mimetics inhibit neurodegeneration and restore cognitive functions in a transgenic Drosophila model of Alzheimer’s disease // PlosOne. – 2009. – V.4. – №12. – e8191.

12. Шварцман А.Л., Саранцева С.В., Рунова О.В., Талалаева Е.И., Витек М.Р. Мутации в гене пpеcенилина 1, наблюдаемые пpи cемейныx фоpмаx болезни Альцгеймеpа, подавляют межклеточные взаимодейcтвия в тpанcфециpованныx фибpоблаcтаx // Биофизика. – 2010. – T.55. – № 5. – C.862-867.

13. Саранцева С.В., Большакова O.И., Тимошенко С.И., Колобов А.А., Витек М.Р., Шварцман А.Л. Дендример D5 - вектор для транспорта пептидов к клеткам мозга // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – T.150. – №10. – С.402–405.

14. Шварцман А.Л., Саранцева С.В. Компенсаторная функция транстиретина при болезни Альцгеймера // Цитология. – 2011. – Т.53. – №10. – С.16–21.

15. Шварцман А.Л., Саранцева С.В., Витек М.П. Потенциальная роль пресенилина 1 в регуляции синаптической функции // Цитология. –2011. – Т.53. – №12. – С.43 – 51.

16. Саранцева С.В., Родин Д.И., Шварцман А.Л. Экспрессия гена АРР человека в нервных клетках Drosophila melanogaster вызывает снижение уровня мРНК синаптотагмина // ДАН. – 2012. – T.442. – № 2. –C.279–281.

17. Саранцева С.В., Кислик Г.А., Ткаченко Н.А., Васильев А.Н., Шварцман А.Л. Морфологические и функциональные нарушения в нейромышечных контактах Drosophila melanogaster, вызванные гиперэкспрессией гена АРР человека // Цитология. – 2012. – Т. 54. – №5. – С.55–63.

Статьи в научных сборниках и периодических научных изданиях:

18. Cаранцева С.В. Подходы к коррекции нейродегенеративных заболеваний на модели Drosophila melanogaster // Молекулярнобиологические технологии в медицинской практике / Под. ред.

А.Б.Масленникова. – Новосибирск: Альфа Виста, 2005. – Вып.8. – С.76– 84.

19. Саранцева С.В., Шварцман А.Л. Генетический скрининг в создании новых лекарственных препаратов // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под. ред. А.Б.Масленникова.- Новосибирск: Альфа Виста, 2006. – Вып.9. – C. 57–66.

20. Саранцева C.В., Большакова О.И., Кузовкова Е.Ф., Родин Д.И., Тимошенко С.И. Моделирование нейродегенеративных заболеваний человека на трансгенных животных // Бреслеровские чтения – II / Под.

ред. В.А. Ланцова. – ПИЯФ РАН, Гатчина, 2007. – С. 224–235.

21. Саранцева С.В., Большакова О.И., Тимошенко С.И., Родин Д.И., Витек М.П., Шварцман А.Л. Моделирование нейропатологических процессов болезни Альцгеймера на Drosophila melanogaster: дефицит синаптических белков в мозге трансгенныз мух с гиперэкспрессией гена АРР человека Первая международная конференция "Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии". Сборник научных статей. 2008.

С. 57–59.

22. Sarantseva S., Bolshakova O., Timoshenko S., Vitek М., Schwarzman А. Modeling Alzheimer s disease pathology in Drosophila: neurodegeneration and synapse dysfunction - disease of the cytoskeleton. Biological motility.

Achievements and perspectives. International symposium. Pushchino. 2008. P.

262–266.

23. Кислик Г.А., Саранцева С.В. Миметики АроЕ и патогенез болезни Альцгеймера. Вторая международная конференция "Дрозофила в экспериментальной генетики и биологии". Сборник научных статей. 2010.

С. 27–31.

24. Sarantseva S., Bolshakova O., Timoshenko S., Vitek M., Schwarzman А., (2010). Overexpression of human amyloid precursor protein causes neurodegeneration and loss of synaptic proteins in neural cells in transgenic Drosophila. Medimond International Proceedings. ADPD 2009. 245–248.

25. Schwarzman A., Sarantseva S., Solovyev K., Talalaeva E., Runova O., Vitek M.(2010). Presenilin1 mediates cell-cell adhesion in transfected Lfibroblasts. Medimond International Proceedings. ADPD 2009. 245–248.

26. Саранцева С.В., Кислик Г.А. Экспрессия АРР вызывает морфологические нарушения в нейромышечных контактах Drosophila melanogaster. Третья международная конференция "Дрозофила в экспериментальной генетики и биологии". Сборник научных статей.

2012. С. 105–108.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.